Summary
Nous décrivons une méthode combinant des billes immunomagnétiques et le tri cellulaire activé par fluorescence pour isoler et analyser des sous-populations de cellules immunitaires définies de cellules mononucléaires du sang périphérique (monocytes, lymphocytes T CD4+, lymphocytes T CD8+, lymphocytes B et cellules tueuses naturelles). En utilisant cette méthode, les cellules marquées magnétiquement et par fluorescence peuvent être purifiées et analysées.
Abstract
La mononucléose infectieuse (MI) est un syndrome aigu principalement associé à une infection primaire par le virus d’Epstein-Barr (EBV). Les principaux symptômes cliniques comprennent une fièvre irrégulière, une lymphadénopathie et une augmentation significative des lymphocytes dans le sang périphérique. Le mécanisme pathogène de la MI n’est pas encore clair; Il n’existe pas de méthode de traitement efficace, principalement des thérapies symptomatiques. La principale question en immunobiologie du VEB est de savoir pourquoi seul un petit sous-ensemble d’individus infectés présente des symptômes cliniques graves et développe même des tumeurs malignes associées au VEB, alors que la plupart des individus sont asymptomatiques à vie avec le virus.
Les lymphocytes B sont d’abord impliqués dans la MI parce que les récepteurs EBV sont présentés à leur surface. Les cellules tueuses naturelles (NK) sont des lymphocytes innés cytotoxiques qui sont importants pour tuer les cellules infectées par le VEB. La proportion de lymphocytes T CD4+ diminue tandis que celle des lymphocytes T CD8+ augmente considérablement pendant l’infection aiguë par le VEB, et la persistance des lymphocytes T CD8+ est importante pour le contrôle à vie de la MI. Ces cellules immunitaires jouent un rôle important dans la MI et leurs fonctions doivent être identifiées séparément. À cette fin, les monocytes sont d’abord séparés des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) des individus IM à l’aide de microbilles CD14, d’une colonne et d’un séparateur magnétique.
Les autres PBMC sont colorés avec de la péridinine-chlorophylle-protéine (PerCP)/cyanine 5.5 anti-CD3, de l’allophycocyanine (APC)/cyanine 7 anti-CD4, de la phycoérythrine (PE) anti-CD8, de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) anti-CD19, de l’APC anti-CD56 et des anticorps APC anti-CD16 pour trier les lymphocytes T CD4+, les lymphocytes T CD8+, les lymphocytes B et les lymphocytes NK à l’aide d’un cytomètre en flux. De plus, le séquençage du transcriptome de cinq sous-populations a été effectué pour explorer leurs fonctions et leurs mécanismes pathogènes dans la MI.
Introduction
Le virus d’Epstein-Barr (EBV), un γ-herpèsvirus également connu sous le nom de virus de l’herpès humain de type 4, est omniprésent dans la population humaine et établit une infection latente à vie chez plus de 90% de la population adulte1. La plupart des infections primaires par le VEB surviennent pendant l’enfance et l’adolescence, avec une fraction des patients se manifestant par une mononucléose infectieuse (IM)2, présentant une immunopathologie caractéristique, y compris une réponse immunitaire activée avec des lymphocytes T CD8+ dans le sang et une prolifération transitoire de cellules B infectées par le VEB dans l’oropharynx3. L’évolution de l’IM peut durer de 2 à 6 semaines et la majorité des patients se rétablissent bien4. Cependant, certaines personnes développent des symptômes persistants ou récurrents semblables à ceux de la MI avec une morbidité et une mortalité élevées, ce qui est classé comme une infection chronique active par le VEB (ACEB)5. De plus, le VEB est un virus oncogène important, qui est étroitement lié à diverses tumeurs malignes, y compris les tumeurs malignes épithélioïdes et lymphoïdes telles que le carcinome nasopharyngé, le lymphome de Burkitt, le lymphome hodgkinien (LH) et le lymphome à cellules T/NK6. Bien que le VEB soit étudié depuis plus de 50 ans, sa pathogenèse et le mécanisme par lequel il induit la prolifération des lymphocytes n’ont pas été entièrement élucidés.
Plusieurs études ont étudié les signatures moléculaires de l’immunopathologie de l’infection par le VEB par séquençage du transcriptome. Zhong et coll. ont analysé le profilage du transcriptome entier des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) d’enfants chinois atteints de MI ou de CAEBV pour constater que l’expansion des lymphocytes T CD8+ était principalement observée dansle groupe 7 de la MI, ce qui suggère que les lymphocytes T CD8+ pourraient jouer un rôle majeur dans la MI. De même, une autre étude a révélé des proportions plus faibles de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques du VEB et de lymphocytes B CD19+ et des pourcentages plus élevés de lymphocytes T CD8+ chez les patients atteints de MI causée par une infection primaire par le VEB que chez les patients atteints d’IM causée à la fois par la réactivation du VEB et d’autres agents8. Les lymphocytes B sont d’abord impliqués dans la MI parce que les récepteurs EBV sont présentés à leur surface. Al Tabaa et coll. ont constaté que les lymphocytes B étaient activés polyclonalement et différenciés en plasmoblastes (CD19+, CD27+ et CD20−, et cellules CD138−) et plasmocytaires (CD19+, CD27+ et CD20−, et CD138+) pendant la MI9. De plus, Zhong et al. ont constaté que les marqueurs monocytaires CD14 et CD64 étaient régulés à la hausse dans le CAEBV, ce qui suggère que les monocytes peuvent jouer un rôle important dans la réponse immunitaire cellulaire du CAEBV par cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) et phagocytose hyperactive7. Alka et coll. ont caractérisé le transcriptome des cellules NK CD16+ CD16+ CD56 triées par MACStriées de quatre patients atteints de MI ou de LH et ont constaté que les cellules NK de IM et de LH avaient des gènes d’immunité innée et de signalisation de chimiokine, ce qui pourrait être responsable de l’hyporéactivité des cellules NK10. De plus, Greenough et coll. ont analysé l’expression génique de lymphocytes T CD8+ triés à partir de 10 PBMC de personnes atteintes de MI. Ils ont signalé qu’une grande proportion des lymphocytes T CD8+ dans la MI étaient spécifiques au virus, activés, se divisant et prêts à exercer des activités effectrices11. Les réponses spécifiques à médiation par les lymphocytes T et les réponses non spécifiques à médiation par les cellules NK jouent un rôle essentiel lors de la primo-infection par le VEB. Cependant, ces études n’ont examiné que les résultats du transcriptome du mélange diversifié de cellules immunitaires ou seulement d’une certaine sous-population de lymphocytes, ce qui n’est pas suffisant pour la comparaison complète des caractéristiques moléculaires et des fonctions de différentes sous-populations de cellules immunitaires chez les enfants atteints de MI dans le même état pathologien.
Cet article décrit une méthode qui combine des billes immunomagnétiques et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour isoler et analyser des sous-populations de cellules immunitaires définies de PBMC (monocytes, cellules T CD4+, cellules T CD8+, cellules B et cellules NK). En utilisant cette méthode, les cellules marquées magnétiquement et par fluorescence peuvent être purifiées à l’aide d’un séparateur magnétique et de FACS ou analysées par cytométrie en flux. L’ARN peut être extrait des cellules purifiées pour le séquençage du transcriptome. Cette méthode permettra la caractérisation et l’expression génique de différentes cellules immunitaires dans les mêmes états de maladie des personnes atteintes de MI, ce qui élargira notre compréhension de l’immunopathologie de l’infection par le VEB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Des échantillons de sang ont été prélevés chez des patients atteints d’IM (n = 3), des porteurs sains du VEB (n = 3) et des enfants non infectés par le VEB (n = 3). Des volontaires ont été recrutés à l’hôpital pour enfants de Pékin, à la Capital Medical University, et toutes les études ont été approuvées sur le plan éthique. L’approbation éthique a été obtenue par le Comité d’éthique de l’Hôpital pour enfants de Beijing, Capital Medical University (Numéro d’approbation : [2021]-E-056-Y). Le consentement éclairé des patients a été levé car l’étude n’a utilisé que les échantillons restants pour les essais cliniques. Toutes les données ont été entièrement anonymisées et anonymisées pour protéger la vie privée des patients.
1. Isolement des PBMC du sang périphérique
- Prélever du sang périphérique frais (2 mL) de patients atteints d’IM dans des tubes K3EDTA par ponction veineuse standard.
REMARQUE: Le processus doit être rapide pour maintenir la viabilité cellulaire. - Diluer le sang périphérique jusqu’à doubler le volume avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et le déposer sur le milieu de séparation des lymphocytes humains (densité : 1,077 ± 0,001 g/mL) dans un tube à centrifuger de 15 mL.
REMARQUE: Le rapport volumique du sang, du PBS et du milieu de séparation était de 1: 1: 1. Ajouter le sang lentement dans le milieu de séparation et centrifuger immédiatement pour éviter que le sang ne se dépose dans le milieu de séparation. - Centrifuger à 800 × g pendant 20 min à température ambiante. Transférer la couche intermédiaire (PBMC enrichis) dans un autre tube centrifuge de 15 mL.
NOTE: Après centrifugation, au fond du tube se trouvent les érythrocytes, la couche intermédiaire est le milieu de séparation, la couche supérieure est le plasma, et entre la couche plasmatique et la couche liquide de séparation se trouvaient les PBMC (y compris les lymphocytes et les monocytes). - Laver les PBMC avec 10 mL de PBS et centrifuger à 800 × g pendant 20 min à température ambiante; Jetez soigneusement le surnageant.
- Répétez le lavage et la centrifugation (étape 1.4) 2 x. Remettez en suspension les PBMC avec 1 mL de PBS dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL et comptez les cellules avec un compteur automatisé à base de trypan bleu.
2. Isolement des monocytes CD14 + des PBMC à l’aide de microbilles CD14
- Préparer une solution tampon contenant 0,5 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 2 mM d’EDTA dans du PBS (pH 7,2). Conserver le tampon au froid (2−8 °C).
REMARQUE: Dégazez le tampon avant utilisation car des bulles d’air pourraient bloquer la colonne. Gardez les cellules froides pour éviter le bouchage des anticorps à la surface de la cellule et le marquage cellulaire non spécifique. - Centrifuger les PBMC à 300 × g pendant 10 min à température ambiante. Jetez soigneusement le surnageant. Remettez les cellules en suspension avec 80 μL de tampon. Ajouter 20 μL de microbilles CD14 à la suspension cellulaire.
REMARQUE: S’il y a ≤107 PBMC, utilisez le volume indiqué ci-dessus. S’il y a >107 PBMC, augmenter proportionnellement tous les volumes de réactifs et le volume total. - Bien mélanger les microbilles CD14 et les cellules dans le tube de microcentrifugation de 1,5 mL et incuber pendant 15 min dans un réfrigérateur à 4 °C. Laver les PBMC avec 1 mL de tampon et centrifuger à 300 × g pendant 10 min à température ambiante. Jetez complètement le surnageant. Remettez les cellules en suspension avec 500 μL de tampon.
REMARQUE: S’il y a ≤108 PBMC, utilisez le volume indiqué ci-dessus. S’il y a >108 PBMC, augmentez proportionnellement le volume de tampon. - Séparation magnétique avec colonnes:
- Placez la colonne sur le séparateur de billes magnétiques et lavez la colonne avec 3 ml de tampon. Ajoutez la suspension de cellule (à partir de l’étape 2.3) à la colonne.
- Recueillir les cellules non marquées qui traversent la colonne dans un tube à centrifuger de 15 mL et laver la colonne avec 3 mL de tampon. Laver la colonne avec 3 x 3 ml de tampon. Recueillir l’effluent total dans le tube à centrifuger de 15 mL.
- Placer la colonne dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL. Ajouter 5 mL de tampon à la colonne. Poussez fermement le piston dans la colonne pour évacuer immédiatement les cellules marquées magnétiquement dans le tube à centrifuger de 15 mL.
- Centrifuger les cellules marquées magnétiquement à 300 × g pendant 5 min et retirer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 500 μL de PBS dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL pour une utilisation dans le séquençage ultérieur du transcriptome.
3. Séparation des populations lymphocytaires des PBMC par coloration par anticorps marqués par fluorescence et FACS
- Centrifuger les cellules non marquées (étape 2.4.2) à 300 × g pendant 5 min et retirer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 100 μL de PBS dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
- Ajouter 2 μL de chaque anticorps marqué (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) aux 100 μL de suspension cellulaire (les volumes et l’information fluorophore conjuguée des anticorps sont indiqués dans le tableau 1), incuber sur de la glace pendant 30 minutes et protéger de la lumière.
- Laver les cellules 2 x en ajoutant 1 mL de PBS et en centrifugeant à 300 × g pendant 5 min à température ambiante. Resuspendre les cellules dans 500 μL de PBS dans le tube microcentrifuge de 1,5 mL. Vortex doucement la suspension cellulaire avant d’acquérir des données sur un cytomètre de trieur de cellules de flux.
4. Réglage des paramètres de cytométrie en flux
- Prélever 100 μL de la suspension cellulaire (voir rubrique 1) dans des tubes à microcentrifugeuses de 1,5 mL au besoin, et constituer un échantillon témoin négatif, un échantillon de CD3 à coloration unique, un échantillon à coloration unique CD4, un échantillon à coloration unique CD8, un échantillon à coloration unique CD19 et un échantillon de coloration CD56/CD16.
- Ajouter 2 μL de l’anticorps marqué par fluorescence correspondant par 100 μL de suspension cellulaire et de vortex. Incuber sur la glace pendant 30 minutes dans l’obscurité. Centrifuger pendant 5 min à 300 × g et aspirer le surnageant. Remettez les pastilles en suspension avec 500 μL de PBS et de vortex.
- Mettez en service le flux de tri et retardez les gouttelettes à l’aide des billes fluorescentes comme suit :
- Ouvrez le système de tri des cellules, exécutez le programme de mise sous tension, installez la buse de 85 μm et ouvrez le flux de tri. Réglez la tension de tri sur 4 500 V et la fréquence sur 47.
- Ajustez les paramètres principalement en ajustant le point de rupture de gouttelettes de débit principal et le retard de gouttelettes conformément aux instructions du fabricant12. Définissez la position du premier point d’arrêt de gouttelette (Drop1) sur 275 et l’écart à 8 dans la fenêtre Breakoff . Activez le mode de tri automatique Sweet Spot pour permettre à la cytométrie de déterminer automatiquement la valeur d’amplitude des gouttelettes pour stabiliser le flux.
- Ajustez le délai de gouttelettes à 30,31 dans la fenêtre Side Stream en chargeant les billes fluorescentes, en veillant à ce que les billes atteignent une déviation du flux latéral de >99 % en mode initial ou réglage fin.
- Reportez-vous à la stratégie de contrôle illustrée à la figure 1 pour effectuer les points de contrôle comme suit :
- À l’aide d’un diagramme de points de zone de diffusion directe (FSC-A)/zone de diffusion latérale (SSC-A), dessinez la porte polygonale (P1) pour identifier la population de lymphocytes intacts .
- À l’aide d’un diagramme à points FSC-A/FSC-height (FSC-H), dessinez la porte polygonale (P2) pour identifier les cellules individuelles et exclure les doublets (Figure 1A).
- À l’aide d’un diagramme à points CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A, dessinez la porte rectangulaire (P3) pour sélectionner les lymphocytes T CD3+ et les lymphocytes B CD19+ (figure 1A,B).
- À l’aide d’un diagramme à points CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A, dessinez une porte rectangulaire pour sélectionner les lymphocytes T CD4+ et les lymphocytes T CD8+ (cellules à fluorescence élevée pour ces marqueurs, respectivement).
- À l’aide d’un diagramme à points CD56/CD16 APC-A/SSC-A, dessinez une porte rectangulaire pour sélectionner les cellules NK CD56+/CD16+ (Figure 1C).
- Ajustez les paramètres instrumentaux à l’aide de l’échantillon de contrôle négatif :
- Installez le tube de contrôle négatif sur le port de chargement et cliquez sur Charger dans le tableau de bord d’acquisition. Sélectionnez les paramètres du cytomètre dans le logiciel.
- Dans la fenêtre Inspecteur, cliquez sur l’onglet Paramètres et ajustez les tensions de FSC, SSC et différents colorants fluorescents ; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Cyanine 7: 824, FITC: 555, PerCP-Cyanine 5.5: 663.
- Ajuster la compensation à l’aide des échantillons à coloration unique13.
- Chargez séquentiellement les tubes à coloration simple sur la cytométrie et sélectionnez Paramètres du cytomètre dans le logiciel. Cliquez sur l’onglet Compensation pour ajuster la compensation.
REMARQUE : La référence de compensation de la cytométrie en flux est indiquée dans le tableau 2.
- Chargez séquentiellement les tubes à coloration simple sur la cytométrie et sélectionnez Paramètres du cytomètre dans le logiciel. Cliquez sur l’onglet Compensation pour ajuster la compensation.
5. Tri cellulaire et collecte de données par cytométrie en flux
- Vortex de la suspension cellulaire (PBMC séparés selon les sections 1 à 3) brièvement pour remettre les cellules en suspension avant de charger le tube dans le cytomètre. Gardez les tubes restants sur la glace.
- Ajouter 200 μL de FBS à quatre tubes d’écoulement de collecte pour éviter de coller les cellules triées à la paroi du tube et les placer dans la chambre de collecte du cytomètre.
- Prélever séparément les lymphocytes T CD3+CD4+, les lymphocytes T CD3+CD8+, les lymphocytes T CD3−CD19+ et les lymphocytes NK CD3− CD56+/CD16+ séparément de l’échantillon d’un patient atteint de MI dans les quatre tubes d’écoulement (figure 2A).
- Centrifuger les cellules séparées à 300 × g pendant 5 min et retirer le surnageant. Ajouter 200 μL de réactif d’isolement d’ARN aux cellules pour le séquençage du transcriptome.
- Séparer les sous-populations de cellules immunitaires des échantillons des porteurs sains du VEB et des enfants non infectés par le VEB selon les étapes ci-dessus (Figure 2B, C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Référence de la stratégie d’établissement de points de contrôle
La stratégie de contrôle utilisée pour trier les quatre sous-populations de lymphocytes est illustrée à la figure 1. Brièvement, les lymphocytes sont sélectionnés (P1) sur un graphique à points montrant la granulosité (SSC-A) en fonction de la taille (FSC-A). Ensuite, les cellules simples sont sélectionnées (P2) sur un graphique à points montrant la taille (FSC-A) par rapport à la diffusion vers l’avant (FSC-H), tandis que les cellules doublet sont exclues. Les lymphocytes T CD3+ (P3) et les lymphocytes T CD19+ B (figure 1B) sont sélectionnés séparément sur un diagramme à points montrant le CD3 PerCP-Cy5.5-A par rapport au CD19 FITC-A. Les lymphocytes T CD8+ et les lymphocytes T CD4+ sont sélectionnés séparément sur un diagramme à points montrant CD8 PE-A par rapport à CD4 APC-Cy7-A de P3. Les cellules NK CD16+/CD56+ sont sélectionnées sur un diagramme en points montrant l’APC-A CD56/CD16 par rapport à la SSC-A de P4 (figure 1C).
Les résultats représentatifs de quatre sous-populations cellulaires triées à partir d’échantillons de patients atteints de MI par la méthode décrite sont présentés à la figure 2A. Nous avons également effectué un tri cellulaire sur des échantillons de porteurs sains du VEB et d’enfants non infectés par le VEB en tant que groupes témoins pour confirmer la faisabilité de cette expérience. Les résultats représentatifs des sous-populations cellulaires séparées de l’échantillon d’un porteur sain du VEB sont présentés à la figure 2B. Le résultat représentatif des sous-populations cellulaires triées à partir de l’échantillon d’enfants non infectés par le VEB est présenté à la figure 2C. Comme le montre la figure 2, P1 a été fermé pour identifier les lymphocytes et les cellules doublets ont été exclues par P2; P3 a été fermé pour sélectionner les lymphocytes T CD3+ et P5 a été fermé pour sélectionner les lymphocytes T CD19+; Les lymphocytes T CD3+ CD8+ (P6) et les lymphocytes T CD3+ CD4+ (P7) ont été sélectionnés séparément de P3; Les cellules NK CD16+/CD56+ (P8) ont été sélectionnées parmi P4. Chacune de ces sous-populations peut être triée individuellement et recueillie pour des expériences en aval. Ce système a été utilisé pour analyser l’expression des gènes par extraction d’ARN et séquençage du transcriptome.
Comme indiqué dans le tableau 3, une augmentation des lymphocytes T CD3+ CD8+ a été observée chez les patients atteints de MI par rapport aux porteurs sains du VEB et aux enfants non infectés par le VEB (46,5 ± 4,0 vs 27,0 ± 0,1 et 46,5 ± 4,0 vs 24,7 ± 2,9, % de lymphocytes T CD3+ CD8+ par lymphocytes totaux); Une diminution des proportions de lymphocytes T CD4+ CD4+ et de lymphocytes B CD19+ a été observée chez les patients atteints de MI par rapport aux porteurs sains du VEB et aux enfants non infectés par le VEB (13,4 ± 1,5 vs 1,3 ± 1,5 et 13,4 ± 1,5 vs 23,6 ± 3,2, % de lymphocytes T CD3+ CD4+ par lymphocytes totaux; 1,4 ± 0,3 vs 7,6 ± 0,7 et 1,4 ± 0,3 vs 9,0 ± 1,5, % de lymphocytes B CD19+ par lymphocytes totaux). Une diminution des proportions de cellules NK CD16+/CD56+ a été observée chez les patients atteints de MI par rapport aux enfants non infectés par le VEB (7,5 ± 0,5 vs 10,7 ± 0,4, % de cellules NK CD16+/CD56+ par lymphocytes totaux). Ces résultats ont validé l’efficacité de ce protocole de tri et démontré que les proportions de sous-ensembles de lymphocytes sont différentes chez les patients atteints d’enfants non infectés par IM et EBV.
Figure 1 : Stratégie globale de contrôle utilisée pour trier les sous-populations de cellules immunitaires des PBMC. (A) Le filtre PerCP-Cy5.5 a été utilisé pour séparer les lymphocytes T CD3+. Les lymphocytes T CD8+ et les lymphocytes T CD4+ ont été sélectionnés séparément sur un diagramme à points montrant CD8 PE-A versus CD4 APC-Cy7-A de P3. (B) Le filtre FITC a été utilisé pour identifier les cellules CD19+ B. (C) Le filtre APC a été utilisé pour séparer les cellules NK CD16+/CD56+ de P4. Abréviations : PBMC = cellules mononucléées du sang périphérique; FSC-A = zone de diffusion vers l’avant; SSC-A = zone de diffusion latérale; FSC-H = hauteur de diffusion vers l’avant; PerCP = péridinine-protéine chrorophylle; PE = phycoérythrine; APC = allophycocyanine; FITC = isothiocyanate de fluorescéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Résultats représentatifs de quatre sous-populations cellulaires isolées avec succès par la méthode décrite. (A) Chiffres représentatifs de tri cellulaire à partir de l’échantillon de sang périphérique du patient atteint d’IM. (B) Chiffres représentatifs de tri cellulaire à partir de l’échantillon de sang périphérique du porteur sain du VEB. (C) Des chiffres représentatifs de tri cellulaire à partir de l’échantillon de sang périphérique d’enfants non infectés par le VEB. P1, porte de tracé de points pour identifier les lymphocytes; P2, porte de tracé de points pour sélectionner des cellules individuelles; P3, porte de tracé de points pour sélectionner les lymphocytes T CD3+; P4, porte de tracé de points pour identifier les lymphocytes CD3- CD19-; P5, porte de tracé de points pour sélectionner les cellules B CD19+; P6, porte de tracé de points pour sélectionner les lymphocytes T CD3+ CD8+ de P3; P7, porte de tracé de points pour sélectionner les lymphocytes T CD3+ CD4+ de P3; P8, porte de tracé de points pour sélectionner les cellules NK CD16+/CD56+ de P4. Abréviations : VEB = virus d’Epstein-Barr; IM = mononucléose infectieuse; FSC-A = zone de diffusion vers l’avant; SSC-A = zone de diffusion latérale; FSC-H = hauteur de diffusion vers l’avant; PerCP = péridinine-protéine chrorophylle; PE = phycoérythrine; APC = allophycocyanine; FITC = isothiocyanate de fluorescéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Anticorps cible | Fluorophore conjugué | Dosage | Clone | Isotype |
| CD3 | PerCP/Cyanine5.5 | 2 μL | SK7 | Souris IgG1, κ |
| CD4 | APC/Cyanine7 | 2 μL | SK3 | Souris IgG1, κ |
| CD8 | PE | 2 μL | SK1 | Souris IgG1, κ |
| CD19 | FITC | 2 μL | HIB19 | Souris IgG1, κ |
| DC56 | APC | 2 μL | 5.1H11 | Souris IgG1, κ |
| DC16 | APC | 2 μL | 3G8 | Souris IgG1, κ |
Tableau 1 : Anticorps utilisés pour la cytométrie en flux. Abréviations : PerCP = péridinine-protéine chrorophylle; PE = phycoérythrine; APC = allophycocyanine; FITC = isothiocyanate de fluorescéine.
| Compensation de référence de la cytométrie de flux (%) | |||||
| PE | APC | APC-Cy7 | FITC | PerCP-Cy5.5 | |
| PE | 100 | 0 | 0 | 0.8 | 4.1 |
| APC | 0 | 100 | 30.1 | 0 | 0.9 |
| APC-Cy7 | 0 | 1.8 | 100 | 0 | 0 |
| FITC | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 |
| PerCP-Cy5.5 | 0 | 1.8 | 10 | 0 | 100 |
Tableau 2 : Référence de compensation de la cytométrie en flux. Abréviations : PerCP = péridinine-protéine chrorophylle; PE = phycoérythrine; APC = allophycocyanine; FITC = isothiocyanate de fluorescéine.
| Proportion de lymphocytes de différentes sous-populations dans le total des lymphocytes triés (%) | |||
| Sous-population lymphocytes | IM | porteurs de VEB en bonne santé | Enfants non infectés par le VEB |
| Lymphocytes T CD3+ | 80,5 ± 1,8 | 70,2 ± 2,3 | 66,1 ± 2,1 |
| Lymphocytes T CD3+ CD8+ | 46,5 ± 4,0 | 27,0 ± 0,1 | 24,7 ± 2,9 |
| Lymphocytes T CD3+ CD4+ | 13,4 ± 1,5 | 19,3 ± 1,5 | 23,6 ± 3,2 |
| cellules NK CD16+/CD56+ | 7,5 ± 0,5 | 2,2 ± 0,1 | 10,7 ± 0,4 |
| CD3- Lymphocytes B CD19+ | 1,4 ± 0,3 | 7,6 ± 0,7 | 9,0 ± 1,5 |
Tableau 3 : La proportion de lymphocytes triés de différents groupes. Abréviations : VEB = virus d’Epstein-Barr; IM = mononucléose infectieuse; NK = tueur naturel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole représente un moyen efficace de trier les sous-populations de cellules immunitaires du sang périphérique. Dans cette étude, des échantillons de sang veineux provenant de patients atteints de MI, de porteurs sains du VEB et d’enfants non infectés par le VEB ont été choisis comme objectif de recherche. Ce travail utilisant le sang périphérique de patients IM se concentre principalement sur l’analyse et la détermination des proportions de différents sous-ensembles cellulaires grâce à la cytométrie en flux multicolore. Le séquençage du transcriptome est principalement utilisé pour la détection et l’analyse d’une certaine sous-population de lymphocytes qui était insuffisante pour les comparaisons complètes et spécifiques des caractéristiques moléculaires et des fonctions de différentes sous-populations de cellules immunitaires chez les enfants atteints de MI dans le même état pathologiques. Par conséquent, le tri de plusieurs types de cellules du sang périphérique et la réalisation du séquençage du transcriptome pour comparer les différences dans les gènes d’expression et les fonctions de ces cellules immunitaires pourraient fournir des données significatives pour l’étude de la pathogenèse de la MI.
Le tri FACS présente l’avantage supplémentaire de pouvoir traiter des cellules vivantes fractionnées pour d’autres expériences in vitro ou in vivo 14. Le maintien de la viabilité cellulaire est vital pour les expériences ultérieures. Nous avons optimisé l’étape de tri pour améliorer la viabilité cellulaire dans ce protocole - des manipulations expérimentales ont été effectuées sur glace ou dans un réfrigérateur à 4 °C. Une vitesse et un temps de centrifugation appropriés sont également essentiels pour l’isolement cellulaire. Le rendement des cellules triées est également la principale contrainte de cette méthode, et l’utilisation de tubes revêtus de FBS lors du tri peut réduire considérablement la perte de cellules qui adhèrent aux tubes. Fournir les réglages appropriés pour le trieur FACS peut améliorer l’efficacité globale du tri en évitant le blocage des cellules ou la contamination croisée dans le tube de collecte. Grâce à l’optimisation des étapes et des paramètres expérimentaux, ce protocole peut être extrapolé au tri d’autres cellules immunitaires en remplaçant les marqueurs magnétiques ou fluorescents. Cependant, en raison de la spécificité des échantillons des enfants (faible volume de collecte de sang), nous n’avons étudié que les principales populations de cellules immunitaires (monocytes, lymphocytes T CD4+, lymphocytes T CD8+, lymphocytes B et cellules NK) sans procéder au tri des sous-populations en raison de la restriction du canal de tri par flux. Cette étude a démontré que des échantillons de sang périphérique d’enfants immunocompétents et des échantillons d’IM pouvaient trier avec succès ces cinq groupes de cellules immunitaires; cependant, les échantillons de sang de patients atteints d’hémopathies malignes (p. ex. leucémie, lymphome), de troubles lymphoprolifératifs (p. ex. troubles lymphoprolifératifs posttransplantés, CAEBV) ou d’immunodéficience primaire/syndrome d’immunodéficience acquise peuvent ne pas être triés avec succès conformément à ce protocole.
La MI est considérée comme une maladie spontanément résolutive, et les cellules immunitaires telles que les cellules T γδ, les cellules NKT et les cellules NK jouent un rôle important dans la réponse immunitaire antivirale15. Les lymphocytes T CD8+ spécifiques du VEB sont largement différenciés en un phénotype effecteur10,16, et il y a contraction de la mémoire effectrice tardive et des cellules effectrices de la MI à la convalescence 17. Pendant ce temps, les cellules NK dans la MI semblent être fonctionnellement défectueuses, y compris l’absence d’activation cellulaire10, la perte de signalisation du récepteur d’activation et la dégranulation18. Certaines études ont montré que les lymphocytes T CD4+ peuvent non seulement aider les lymphocytes T CD8+ à tuer et à éliminer les lymphocytes B infectés par le VEB, mais aussi inhiber la prolifération des lymphocytes B en sécrétant des cytokines et même jouer directement un rôle meurtrier lors de l’infection par le VEB19,20. Comme le montre cette étude, une proportion accrue de lymphocytes T CD3+ CD8+ a été observée chez les patients atteints de MI par rapport aux porteurs sains du VEB et aux enfants non infectés par le VEB. En revanche, une diminution des proportions de lymphocytes T CD4+ CD3+, de lymphocytes B CD19+ et de cellules NK CD16+/CD56+ a été observée chez les patients atteints de MI par rapport aux enfants non infectés par le VEB. Cependant, la fonction et l’expression génique de ces différents sous-types de cellules immunitaires dans le même état pathologique de la MI restent incertaines. Une analyse plus approfondie des profils d’expression génique de sous-ensembles de cellules immunitaires spécifiques dans la MI peut aider à mieux comprendre le mécanisme pathogène de la MI.
Nous fournissons une stratégie qui combine le tri des billes immunomagnétiques et le FACS pour isoler et analyser des sous-populations de cellules immunitaires définies dans les PBMC. Les monocytes sont d’abord séparés à l’aide de microbilles CD14, et les PBMC restants sont colorés avec des anticorps marqués par fluorescence correspondants pour trier les lymphocytes T CD4+, les lymphocytes T CD8+, les lymphocytes B et les lymphocytes NK par FACS. Nous avons ensuite utilisé ces cellules triées pour l’extraction de l’ARN et le séquençage du transcriptome afin de caractériser la fonction et l’expression génique de différentes cellules immunitaires dans l’immunopathologie de la MI. La pureté et le rendement des cellules triées étaient généralement suffisants pour mener des études d’expression génique (données non présentées). Par conséquent, la méthode de tri de sous-populations de cellules immunitaires distinctes peut être utilisée pour explorer davantage les troubles lymphoprolifératifs associés au VEB tels que le CAEBV, le trouble lymphoprolifératif post-transplantation afin de détecter les gènes pathogènes, les protéines pathogènes et les cibles thérapeutiques potentielles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82002130), la Fondation des sciences naturelles de Beijing (7222059) et le Fonds d’innovation CAMS pour les sciences médicales (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
- Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
- Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
- Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
- Luzuriaga, K., Sullivan, J. L.
- Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
- Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
- Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
- Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
- Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
- M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
- Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
- Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
- Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
- Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
- Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
- Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).
