Summary
Описан метод, сочетающий иммуномагнитные шарики и флуоресцентно-активированную сортировку клеток для выделения и анализа определенных субпопуляций иммунных клеток мононуклеарных клеток периферической крови (моноцитов, CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, В-клеток и естественных клеток-киллеров). С помощью этого метода магнитные и флуоресцентно меченые клетки могут быть очищены и проанализированы.
Abstract
Инфекционный мононуклеоз (IM) является острым синдромом, в основном связанным с первичной инфекцией вируса Эпштейна-Барра (EBV). Основные клинические симптомы включают нерегулярную лихорадку, лимфаденопатию и значительное повышение лимфоцитов в периферической крови. Патогенный механизм ИМ до сих пор неясен; для него не существует эффективного метода лечения, в основном доступна симптоматическая терапия. Основной вопрос в иммунобиологии ВЭБ заключается в том, почему только у небольшой подгруппы инфицированных людей проявляются тяжелые клинические симптомы и даже развиваются злокачественные новообразования, связанные с ВЭБ, в то время как большинство людей бессимптомны на всю жизнь с вирусом.
В-клетки впервые участвуют в IM, потому что рецепторы EBV представлены на их поверхности. Естественные клетки-киллеры (NK) являются цитотоксическими врожденными лимфоцитами, которые важны для уничтожения клеток, инфицированных EBV. Доля CD4 + Т-клеток уменьшается, в то время как доля CD8 + Т-клеток резко расширяется во время острой инфекции EBV, и персистенция CD8 + Т-клеток важна для пожизненного контроля IM. Эти иммунные клетки играют важную роль в IM, и их функции должны быть идентифицированы отдельно. Для этого моноциты отделяют сначала от мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) им-особей с помощью микрошариков CD14, колонки и магнитного сепаратора.
Остальные PBMCs окрашивают перидинин-хлорофилл-белком (PerCP)/цианином 5.5 анти-CD3, аллофикоцианином (APC)/цианином 7 анти-CD4, фикоэритрином (PE) анти-CD8, флуоресцеином изотиоцианатом (FITC) анти-CD19, APC анти-CD56 и APC анти-CD16 антителами для сортировки CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, В-клеток и NK-клеток с использованием проточного цитометра. Кроме того, было проведено секвенирование транскриптома пяти субпопуляций для изучения их функций и патогенных механизмов в IM.
Introduction
Вирус Эпштейна-Барра (EBV), γ-герпесвирус, также известный как вирус герпеса человека типа 4, повсеместно распространен в человеческой популяции и устанавливает пожизненную латентную инфекцию у более чем 90% взрослого населения1. Большинство первичных инфекций ВЭБ происходит в детском и подростковом возрасте, причем у части пациентов проявляется инфекционный мононуклеоз (IM)2, демонстрируя характерную иммунопатологию, включая активированный иммунный ответ с CD8 + Т-клетками в крови и преходящую пролиферацию инфицированных ВЭБ В клеток в ротоглотке3. Курс ВМ может длиться 2–6 недель и большинство пациентов хорошо выздоравливают4. Тем не менее, у некоторых людей развиваются стойкие или рецидивирующие IM-подобные симптомы с высокой заболеваемостью и смертностью, которые классифицируются как хроническая активная инфекция ВЭБ (CAEBV)5. Кроме того, ВЭБ является важным онкогенным вирусом, который тесно связан с различными злокачественными новообразованиями, включая эпителиоидные и лимфоидные злокачественные новообразования, такие как аназофарингеальная карцинома, лимфома Беркитта, лимфома Ходжкина (HL) и Т/NK-клеточная лимфома6. Хотя ВЭБ изучается уже более 50 лет, его патогенез и механизм, с помощью которого он индуцирует пролиферацию лимфоцитов, не были полностью выяснены.
В нескольких исследованиях изучались молекулярные сигнатуры иммунопатологии ВЭБ-инфекции путем секвенирования транскриптома. Zhong et al. проанализировали профилирование цельного транскриптома мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) у китайских детей с IM или CAEBV, чтобы обнаружить, что cd8 + Т-клеточная экспансия была преимущественно обнаружена в группе IM7, предполагая, что CD8 + Т-клетки могут играть важную роль в IM. Аналогичным образом, другое исследование обнаружило более низкие пропорции специфичных для ВЭБ цитотоксических Т- и CD19+ В-клеток и более высокий процент CD8+ Т-клеток у пациентов с ВМ, вызванных первичной инфекцией ВЭБ, чем у пациентов с ВМ, вызванной как реактивацией ВЭБ, так и другими агентами8. В-клетки впервые участвуют в IM, потому что рецепторы EBV представлены на их поверхности. Al Tabaa et al. обнаружили, что В-клетки были поликлонально активированными и дифференцированными интоплазмабластами (CD19+, CD27+ и CD20− и CD138− клетками) и плазматическими клетками (CD19+, CD27+ и CD20− и CD138+) во время IM9. Кроме того, Zhong et al. обнаружили, что моноцитарные маркеры CD14 и CD64 были повышены в CAEBV, предполагая, что моноциты могут играть важную роль в клеточном иммунном ответе CAEBV через антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и гиперактивный фагоцитоз7. Alka et al. охарактеризовали транскриптом MACS,отсортированных CD56dim CD16 + NK-клеток от четырех пациентов IM или HL и обнаружили, что NK-клетки как из IM, так и из HL имели сниженный врожденный иммунитет и сигнальные гены хемокина, которые могут быть ответственны за гипочувствительность NK-клеток10. Кроме того, Greenough et al. проанализировали экспрессию генов отсортированных CD8+ Т-клеток из 10 PBMCs людей с IM. Они сообщили, что большая часть CD8+ Т-клеток в IM была вирус-специфичной, активированной, делящейся и праймированной для оказания эффекторной активности11. Как Т-клеточно-опосредованные, специфические для ВЭБ ответы, так и NK-клеточные, неспецифические ответы играют важную роль во время первичной инфекции ВЭБ. Однако в этих исследованиях изучались только результаты транскриптома разнообразной смеси иммунных клеток или только определенной субпопуляции лимфоцитов, чего недостаточно для всестороннего сравнения молекулярных характеристик и функций различных субпопуляций иммунных клеток у детей с ВМ в одном и том же болезненном состоянии.
В данной статье описывается метод, который сочетает в себе иммуномагнитные шарики и флуоресцентно-активированную сортировку клеток (FACS) для выделения и анализа определенных субпопуляций иммунных клеток PBMCs (моноциты, CD4 + Т-клетки, CD8 + Т-клетки , В-клетки и NK-клетки). Используя этот метод, магнитные и флуоресцентно меченые клетки могут быть очищены с помощью магнитного сепаратора и FACS или проанализированы с помощью проточной цитометрии. РНК может быть извлечена из очищенных клеток для секвенирования транскриптома. Этот метод позволит характеризовать и экспрессию генов различных иммунных клеток в одних и тех же состояниях заболевания людей с IM, что расширит наше понимание иммунопатологии инфекции EBV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы крови были получены у пациентов с ВМ (n = 3), здоровых носителей ВЭБ (n = 3) и детей, не инфицированных ВЭБ (n = 3). Добровольцы были набраны из Пекинской детской больницы, Столичного медицинского университета, и все исследования были этически одобрены. Этическое одобрение было получено Комитетом по этике Пекинской детской больницы Столичного медицинского университета (номер одобрения: [2021]-E-056-Y). Информированное согласие пациентов было отменено, поскольку в исследовании использовались только оставшиеся образцы для клинического тестирования. Все данные были полностью деидентифицированы и анонимизированы для защиты конфиденциальности пациентов.
1. Выделение ПБМК из периферической крови
- Собирать свежую периферическую кровь (2 мл) у пациентов с в/м в пробиркиК3ЭДТА стандартным венипунктурой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс должен быть быстрым для поддержания жизнеспособности клеток. - Разжижают периферическую кровь до двойного объема фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и наслаивают ее поверх среды разделения лимфоцитов человека (плотность: 1,077 ± 0,001 г/мл) в центрифужной трубке объемом 15 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемное соотношение крови, PBS и разделительной среды составило 1:1:1. Медленно добавляйте кровь в разделительную среду и немедленно центрифугируйте, чтобы кровь не оседала в разделительной среде. - Центрифуга при 800 × г в течение 20 мин при комнатной температуре. Перенесите средний слой (обогащенные НБМК) на другую 15 мл центрифужную трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования в нижней части трубки находятся эритроциты, средний слой - разделительная среда, верхний слой - плазма, а между плазменным слоем и разделяющим жидким слоем находятся НБМК (включая лимфоциты и моноциты). - Промыть НБМК 10 мл ПБС и центрифугу при 800 × г в течение 20 мин при комнатной температуре; осторожно выбросьте супернатант.
- Повторите промывку и центрифугирование (шаг 1.4) 2 x. Повторно суспендируйте НБМК с 1 мл PBS в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл и подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика на основе трипан-синего цвета.
2. Выделение CD14 + моноцитов из PBMCs с использованием микрошариков CD14
- Готовят буферный раствор, содержащий 0,5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 2 мМ ЭДТА в PBS (рН 7,2). Держите буфер холодным (2−8 °C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Дегазировать буфер перед использованием, так как пузырьки воздуха могут блокировать колонну. Держите клетки холодными, чтобы предотвратить закрытие антител на поверхности клеток и неспецифическую маркировку клеток. - Центрифугируйте НБМК при 300 × г в течение 10 мин при комнатной температуре. Осторожно выбросьте супернатант. Повторное суспендирование клеток с 80 мкл буфера. Добавьте 20 мкл микрогранул CD14 в клеточную суспензию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть ≤107 NBMC, используйте объем, указанный выше. При наличии >107 МПК, пропорционально увеличьте все объемы реагентов и общий объем. - Хорошо смешайте микрошарики CD14 и клетки в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл и инкубируйте в течение 15 минут в холодильнике с температурой 4 °C. Промывайте НБМК 1 мл буфера и центрифуги при 300 × г в течение 10 мин при комнатной температуре. Полностью отбросьте супернатант. Повторное суспендирование клеток с 500 мкл буфера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть ≤108 NBMC, используйте объем, указанный выше. При наличии >108 НБМК, пропорционально увеличьте объем буфера. - Магнитная сепарация с колоннами:
- Поставьте колонну на магнитный сепаратор бусин и промыть колонну 3 мл буфера. Добавьте суспензию ячейки (из шага 2.3) в столбец.
- Соберите немаркированные ячейки, которые проходят через колонну, в центрифужную трубку объемом 15 мл и промыть колонну 3 мл буфера. Вымойте колонку буфером размером 3 х 3 мл. Соберите общий объем сточных вод в трубе центрифуги объемом 15 мл.
- Поместите колонну в новую центрифужную трубку объемом 15 мл. Добавьте 5 мл буфера в столбец. Плотно вставьте плунжер в колонну, чтобы немедленно смыть магнитно меченые ячейки в центрифужную трубку объемом 15 мл.
- Центрифугируют магнитно меченые ячейки при 300 × г в течение 5 мин и удаляют супернатант. Повторное суспендирование клеток в 500 мкл PBS в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл для использования в последующем секвенировании транскриптома.
3. Отделение популяций лимфоцитов от PBMCs путем флуоресцентно меченого окрашивания антителами и FACS
- Центрифугируют немаркированные ячейки (стадия 2.4.2) при 300 × г в течение 5 мин и удаляют супернатант. Повторное суспендирование клеток в 100 мкл PBS в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл.
- Добавьте 2 мкл каждого меченого антитела (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) к 100 мкл клеточной суспензии (объемы и конъюгированная флуорофорная информация антител приведены в таблице 1), инкубируйте на льду в течение 30 мин и защищайте от света.
- Промыть ячейки 2 х путем добавления 1 мл PBS и центрифугирования при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторное суспендирование клеток в 500 мкл PBS в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл. Осторожно вращайте суспензию ячейки перед получением данных на цитометре сортировщика проточных ячеек.
4. Настройка параметров проточной цитометрии
- Возьмите 100 мкл клеточной суспензии (см. раздел 1) в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл по мере необходимости и создайте отрицательный контрольный образец, образец CD3 с одним окрашиванием, образец CD4 с одним окрашиванием, образец CD8 с одним окрашиванием, образец с одним окрашиванием CD19 и образец окрашивания CD56 / CD16.
- Добавьте 2 мкл соответствующего флуоресцентно меченого антитела на 100 мкл клеточной суспензии и вихря. Инкубировать на льду в течение 30 мин в темноте. Центрифуга в течение 5 мин при 300 × г и аспирация супернатанта. Повторное суспендирование гранул с 500 мкл PBS и вихря.
- Включите сортировочный поток и задержите капли с помощью флуоресцентных шариков следующим образом:
- Откройте систему сортировки ячеек, запустите программу включения питания, установите сопло 85 мкм и откройте поток сортировки. Установите напряжение сортировки на 4 500 В, а freq на 47.
- Регулировка параметров в основном путем регулировки точки разрыва основной капли потока и задержки капли в соответствии с инструкциямипроизводителя 12. Установите первую позицию точки останова дроплета (Drop1) на 275, а зазор на 8 в окне Breakoff . Включите режим автоматической сортировки Sweet Spot , чтобы позволить цитометрии автоматически определять значение амплитуды капель для стабилизации потока.
- Отрегулируйте задержку капель до 30,31 в окне Side Stream , загрузив флуоресцентные шарики, гарантируя, что шарики достигают отклонения бокового потока >99% в начальном или тонком режиме настройки.
- Обратитесь к стратегии gating, показанной на рисунке 1 , чтобы выполнить gating следующим образом:
- Используя точечный график прямой области рассеяния (FSC-A) / боковой области рассеяния (SSC-A), нарисуйте полигональный затвор (P1) для идентификации интактной популяции лимфоцитов .
- Используя точечный график высотой FSC-A/FSC (FSC-H), нарисуйте полигональный затвор (P2) для идентификации одиночных ячеек и исключения дублетов (рисунок 1A).
- Используя точечный график CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A, нарисуйте прямоугольный затвор (P3) для выбора CD3+ Т-клеток и CD19+ В-ячеек (рисунок 1A,B).
- Используя точечный график CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A, нарисуйте прямоугольный затвор для выбора CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток (ячеек с высокой флуоресценцией для этих маркеров соответственно).
- Используя точечный график CD56/CD16 APC-A/SSC-A, нарисуйте прямоугольный затвор для выбора NK-ячеек CD56+/CD16+ (рисунок 1C).
- Настройте инструментальные параметры с помощью отрицательного контрольного образца:
- Установите отрицательную управляющую трубку на загрузочный порт и нажмите кнопку Загрузить на панели управления приобретением. Выберите Настройки цитометра в программном обеспечении.
- В окне Инспектор перейдите на вкладку Параметры и отрегулируйте напряжение FSC, SSC и различных флуоресцентных красителей; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-цианин 7: 824, FITC: 555, PerCP-цианин 5,5: 663.
- Отрегулируйте компенсацию с помощью одноокрашенных образцов13.
- Загрузите одноокрашенные трубки на цитометрию последовательно и выберите Настройки цитометра в программном обеспечении. Перейдите на вкладку Компенсация , чтобы настроить компенсацию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Компенсационная ссылка проточной цитометрии приведена в таблице 2.
- Загрузите одноокрашенные трубки на цитометрию последовательно и выберите Настройки цитометра в программном обеспечении. Перейдите на вкладку Компенсация , чтобы настроить компенсацию.
5. Сортировка и сбор данных клеток с помощью проточной цитометрии
- Вихрь клеточной суспензии (разделенных МПК в соответствии с разделами 1–3) ненадолго для повторного суспендирования клеток перед загрузкой трубки в цитометр. Держите оставшиеся трубки на льду.
- Добавьте 200 мкл FBS в четыре проточные трубки сбора, чтобы избежать прилипания отсортированных клеток к стенке трубки, и поместите их в камеру сбора цитометра.
- Соберите CD3 + CD4 + Т-клетки, CD3 + CD8 + Т-клетки, CD3−CD19 + В-клетки и CD3− CD56 + / CD16 + NK-клетки отдельно от образца пациента с IM в четырех проточных трубках (рисунок 2A).
- Центрифугируют разделенные ячейки при 300 × г в течение 5 мин и удаляют надосадочный агент. Добавьте 200 мкл реагента выделения РНК в клетки для секвенирования транскриптома.
- Отделите субпопуляции иммунных клеток образцов от здоровых носителей ВЭБ и детей, не инфицированных ВЭБ, в соответствии с вышеуказанными шагами (рисунок 2B, C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ссылка на стратегию гатинга
Стратегия гатинга, используемая для сортировки четырех субпопуляций лимфоцитов, показана на рисунке 1. Вкратце, лимфоциты выбираются (P1) на точечном графике, показывающем гранулированность (SSC-A) по сравнению с размером (FSC-A). Затем выделяются одиночные ячейки (P2) на точечной диаграмме, показывающей размер (FSC-A) и прямой разброс (FSC-H), в то время как ячейки дублета исключаются. CD3+ Т-клетки (P3) и CD19+ В-клетки (рисунок 1B) выбираются отдельно на точечной диаграмме, показывающей CD3 PerCP-Cy5.5-A по сравнению с CD19 FITC-A. CD8+ Т-клетки и CD4+ Т-клетки выбираются отдельно на точечной диаграмме, показывающей CD8 PE-A против CD4 APC-Cy7-A из P3. Ячейки CD16+/CD56+ NK выбираются на точечном графике, показывающем CD56/CD16 APC-A против SSC-A из P4 (рисунок 1C).
Репрезентативные результаты четырех клеточных субпопуляций, отсортированных из выборок пациентов с ВМ описанным методом, показаны на рисунке 2А. Мы также провели сортировку клеток образцов от здоровых носителей ВЭБ и детей, не инфицированных ВЭБ, в качестве контрольных групп, чтобы подтвердить осуществимость этого эксперимента. Репрезентативные результаты клеточных субпопуляций, отделенных от образца здорового носителя ВЭБ, показаны на рисунке 2B. Репрезентативный результат клеточных субпопуляций, отсортированных из выборки детей, не инфицированных ВЭБ, показан на рисунке 2C. Как показано на рисунке 2, P1 был закрыт для идентификации лимфоцитов, а дублетные клетки были исключены через P2; P3 был закрыт для выбора CD3 + Т-клеток, а P5 был закрыт для выбора CD19 + B-клеток; CD3+ CD8+ Т-клетки (P6) и CD3+ CD4+ Т-клетки (P7) были выбраны отдельно от P3; CD16+/CD56+ NK-клетки (P8) были выбраны из P4. Каждая из этих субпопуляций может быть индивидуально отсортирована и собрана для последующих экспериментов. Эта система использовалась для анализа экспрессии генов посредством экстракции РНК и секвенирования транскриптома.
Как сообщается в таблице 3, увеличение CD3+ CD8+ Т-клеток наблюдалось у пациентов с ВМ по сравнению как со здоровыми носителями ВЭБ, так и с детьми, не инфицированными ВЭБ (46,5 ± 4,0 против 27,0 ± 0,1 и 46,5 ± 4,0 против 24,7 ± 2,9, % CD3+ CD8+ Т-клеток на общие лимфоциты); Снижение пропорций CD3+ CD4+ Т-клеток и CD19+ В-клеток наблюдалось у пациентов с ВМ по сравнению со здоровыми носителями ВЭБ и неинфицированными ВЭБ детьми (13,4 ± 1,5 против 19,3 ± 1,5 и 13,4 ± 1,5 против 23,6 ± 3,2, % CD3 + CD4 + Т-клеток на общие лимфоциты; 1,4 ± 0,3 против 7,6 ± 0,7 и 1,4 ± 0,3 против 9,0 ± 1,5, % CD19 + В-клеток на общие лимфоциты). Снижение пропорций CD16+/CD56+ NK-клеток наблюдалось у пациентов с в/м по сравнению с EBV-неинфицированными детьми (7,5 ± 0,5 против 10,7 ± 0,4, % CD16+/CD56+ NK-клеток на общие лимфоциты). Эти результаты подтвердили эффективность этого протокола сортировки и продемонстрировали, что пропорции подмножеств лимфоцитов различны у пациентов с в/м и ВЭБ-неинфицированными детьми.
Рисунок 1: Общая стратегия гатинга, используемая для сортировки субпопуляций иммунных клеток от PBMCs. (A) Фильтр PerCP-Cy5.5 использовался для разделения CD3 + Т-клеток. CD8+ Т-клетки и CD4+ Т-клетки были выбраны отдельно на точечном графике, показывающем CD8 PE-A против CD4 APC-Cy7-A из P3. (B) Фильтр FITC использовался для идентификации CD19+ В-клеток. (C) Фильтр APC использовался для отделения CD16+/CD56+ NK-клеток от P4. Сокращения: PBMCs = мононуклеарные клетки периферической крови; FSC-A = прямая площадь рассеяния; SSC-A = площадь бокового рассеяния; FSC-H = прямая высота рассеяния; PerCP = перидин-хророфилл-белок; ПЭ = фикоэритрин; APC = аллофикоцианин; FITC = изотиоцианат флуоресцеина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные результаты четырех клеточных субпопуляций, успешно выделенных описанным методом. (A) Репрезентативная сортировка клеток из образца периферической крови пациента с IM. (B) Репрезентативные цифры сортировки клеток из образца периферической крови здорового носителя ВЭБ. (C) Репрезентативные показатели сортировки клеток из образца периферической крови детей, не инфицированных ВЭБ. P1, точечный участок ворот для идентификации лимфоцитов; P2, точечный затвор для выбора одиночных ячеек; P3, точечный затвор для выбора CD3+ Т-ячеек; P4, точечный контур ворот для идентификации CD3-CD19-лимфоцитов; P5, точечный затвор для выбора CD19+ B-ячеек; P6, точечный затвор для выбора CD3+ CD8+ Т-ячеек из P3; P7, точечный затвор для выбора CD3+ CD4+ Т-ячеек из P3; P8, точечный затвор для выбора CD16+/CD56+ NK ячеек из P4. Сокращения: EBV = вирус Эпштейна-Барра; ВМ = инфекционный мононуклеоз; FSC-A = прямая площадь рассеяния; SSC-A = площадь бокового рассеяния; FSC-H = прямая высота рассеяния; PerCP = перидин-хророфилл-белок; ПЭ = фикоэритрин; APC = аллофикоцианин; FITC = изотиоцианат флуоресцеина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Мишень антител | Конъюгированный флуорофор | Дозировка | Клон | Изотип |
| СД3 | ПерЦП/Цианин5.5 | 2 мкл | СК7 | Мышь IgG1, κ |
| СД4 | БТР/Цианин7 | 2 мкл | СК3 | Мышь IgG1, κ |
| СД8 | ЧП | 2 мкл | СК1 | Мышь IgG1, κ |
| СД19 | ФИТК | 2 мкл | ХИБ19 | Мышь IgG1, κ |
| СД56 | БТР | 2 мкл | 5.1Х11 | Мышь IgG1, κ |
| СД16 | БТР | 2 мкл | 3Г8 | Мышь IgG1, κ |
Таблица 1: Антитела, используемые для проточной цитометрии. Сокращения: PerCP = перидинин-хророфилл-белок; ПЭ = фикоэритрин; APC = аллофикоцианин; FITC = изотиоцианат флуоресцеина.
| Компенсационная референс проточной цитометрии (%) | |||||
| ЧП | БТР | БТР-Сай7 | ФИТК | Перцп-Cy5.5 | |
| ЧП | 100 | 0 | 0 | 0.8 | 4.1 |
| БТР | 0 | 100 | 30.1 | 0 | 0.9 |
| БТР-Сай7 | 0 | 1.8 | 100 | 0 | 0 |
| ФИТК | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 |
| Перцп-Cy5.5 | 0 | 1.8 | 10 | 0 | 100 |
Таблица 2: Компенсационная справка по проточной цитометрии. Сокращения: PerCP = перидинин-хророфилл-белок; ПЭ = фикоэритрин; APC = аллофикоцианин; FITC = изотиоцианат флуоресцеина.
| Доля лимфоцитов различных субпопуляций в общем количестве отсортированных лимфоцитов (%) | |||
| субпопуляция лимфоцитов | Мгновенные сообщения | здоровые носители ВЭБ | Дети, не инфицированные ВЭБ |
| CD3+ Т-клетки | 80,5 ± 1,8 | 70.2 ± 2.3 | 66.1 ± 2.1 |
| CD3 + CD8 + Т-клетки | 46.5 ± 4.0 | 27.0 ± 0.1 | 24.7 ± 2.9 |
| CD3 + CD4 + Т-клетки | 13.4 ± 1.5 | 19.3 ± 1.5 | 23.6 ± 3.2 |
| CD16+/CD56+ NK ячейки | 7.5 ± 0.5 | 2.2 ± 0.1 | 10.7 ± 0.4 |
| CD3- CD19 + В-клетки | 1.4 ± 0.3 | 7.6 ± 0.7 | 9.0 ± 1.5 |
Таблица 3: Доля отсортированных лимфоцитов разных групп. Сокращения: EBV = вирус Эпштейна-Барра; ВМ = инфекционный мононуклеоз; NK = природный убийца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол представляет собой эффективный способ сортировки субпопуляций иммунных клеток периферической крови. В этом исследовании образцы венозной крови пациентов с ВМ, здоровых носителей ВЭБ и детей, не инфицированных ВЭБ, были выбраны в качестве цели исследования. Эта работа с использованием периферической крови пациентов IM в основном фокусируется на анализе и определении пропорций различных подмножеств клеток с помощью многоцветной проточной цитометрии. Секвенирование транскриптома в основном используется для выявления и анализа определенной субпопуляции лимфоцитов, что было недостаточно для всестороннего и специфического сравнения молекулярных характеристик и функций различных субпопуляций иммунных клеток у детей с ВМ в одном и том же болезненном состоянии. Таким образом, сортировка нескольких типов клеток из периферической крови и выполнение секвенирования транскриптома для сравнения различий в генах экспрессии и функциях этих иммунных клеток может дать значительные данные для изучения патогенеза IM.
Сортировка FACS имеет дополнительное преимущество, заключающееся в возможности обработки живых, фракционированных клеток для дальнейших экспериментов in vitro или in vivo 14. Поддержание жизнеспособности клеток жизненно важно для последующих экспериментов. Мы оптимизировали этап сортировки для повышения жизнеспособности клеток в этом протоколе - экспериментальные манипуляции были выполнены на льду или в холодильнике с температурой 4 °C. Правильная скорость и время центрифугирования также имеют решающее значение для изоляции клеток. Выход отсортированных клеток также является основным ограничением в этом методе, и использование трубок с покрытием FBS во время сортировки может значительно уменьшить потерю клеток, которые прилипают к трубкам. Обеспечение надлежащих настроек для сортировщика FACS может повысить общую эффективность сортировки, избегая закупорки клеток или перекрестного загрязнения в коллекторной трубке. Благодаря оптимизации экспериментальных шагов и настроек этот протокол может быть экстраполирован на сортировку других иммунных клеток путем замены магнитных или флуоресцентных меток. Однако из-за специфичности детских образцов (низкий объем сбора крови) мы исследовали только основные популяции иммунных клеток (моноциты, CD4 + Т-клетки, CD8 + Т-клетки, В-клетки и NK-клетки), не приступая к сортировке субпопуляций из-за ограничения канала сортировки потока. Это исследование показало, что образцы периферической крови у иммунокомпетентных детей и образцы из IM могут успешно сортировать эти пять групп иммунных клеток; однако образцы крови пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями (например, лейкемией, лимфомой), лимфопролиферативными расстройствами (например, посттрансплантационными лимфопролиферативными расстройствами, CAEBV) или синдромом первичного иммунодефицита /синдрома приобретенного иммунодефицита могут быть не успешно отсортированы в соответствии с этим протоколом.
IM считается самоограничивающимся заболеванием, и иммунные клетки, такие как γδ Т-клетки, NKT-клетки и NK-клетки, играют значительную роль в противовирусном иммунном ответе15. EBV-специфические CD8 + Т-клетки в значительной степени дифференцированы в сторону эффекторного фенотипа10,16, и происходит сокращение поздней эффекторной памяти и эффекторных клеток от IM до реконвалесценции17. Между тем, NK-клетки в IM, по-видимому, функционально дефектны, включая отсутствие активации клеток10, потерю сигналов активирующих рецепторов и дегрануляцию18. Некоторые исследования показали, что CD4 + Т-клетки могут не только помочь CD8 + Т-клеткам убивать и устранять инфицированные EBV В-клетки, но также ингибировать пролиферацию В-клеток путем секреции цитокинов и даже непосредственно играть убивающую роль во время инфекции EBV19,20. Как показано в этом исследовании, повышенная доля CD3 + CD8 + Т-клеток наблюдалась у пациентов с ВМ по сравнению как со здоровыми носителями ВЭБ, так и с детьми, не инфицированными ВЭБ. Напротив, снижение пропорций CD3 + CD4 + Т-клеток, CD19 + В-клеток и CD16 + / CD56 + NK-клеток наблюдалось у пациентов с IM по сравнению с EBV-неинфицированными детьми. Однако функция и экспрессия генов этих различных подтипов иммунных клеток в одном и том же болезненном состоянии IM остаются неясными. Дальнейший анализ профилей экспрессии генов специфических подмножеств иммунных клеток в IM может помочь получить представление о патогенном механизме IM.
Мы предлагаем стратегию, которая сочетает в себе иммуномагнитную сортировку шариков и FACS для выделения и анализа определенных субпопуляций иммунных клеток в PBMCs. Моноциты сначала отделяются с помощью микрошариков CD14, а остальные PBMC окрашиваются соответствующими флуоресцентно мечеными антителами для сортировки CD4 + Т-клеток, CD8 + Т-клеток, В-клеток и NK-клеток через FACS. Мы также использовали эти отсортированные клетки для экстракции РНК и секвенирования транскриптома, чтобы охарактеризовать функцию и экспрессию генов различных иммунных клеток в иммунопатологии IM. Чистота и выход отсортированных клеток, как правило, были достаточными для проведения исследований экспрессии генов (данные не показаны). Таким образом, метод сортировки отдельных субпопуляций иммунных клеток может быть использован для дальнейшего изучения EBV-ассоциированных лимфопролиферативных расстройств, таких как CAEBV, посттрансплантационное лимфопролиферативное расстройство для обнаружения патогенных генов, патогенных белков и потенциальных терапевтических целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82002130), Пекинским фондом естественных наук (7222059) и Инновационным фондом медицинских наук CAMS (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
- Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
- Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
- Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
- Luzuriaga, K., Sullivan, J. L.
- Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
- Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
- Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
- Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
- Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
- M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
- Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
- Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
- Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
- Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
- Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
- Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).
