Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kahverengi Yağ Dokusunda De Novo Yağ Asidi Sentezinin Döteryum Oksit Kullanılarak Kantitatif Tayini

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64219
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2,3,4
1UCD Conway Institute and UCD Institute of Food and Health, School of Agriculture and Food Science, University College Dublin, 2Division of Endocrinology, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 3Division of Developmental Biology, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Burada, in vivo kahverengi yağ dokusunda toplam yağ asidi de novo lipogenezinin analizi için döteryum oksit ve gaz kromatografisi kütle spektrometrisi (GCMS) kullanan ucuz bir kantitatif yöntem sunuyoruz.

Abstract

Yağ asidi sentezi, tüm vücut metabolik homeostazının ve diğer fizyolojik ve patolojik süreçlerin kontrolünde önemli fonksiyonel rollere sahip karmaşık ve yüksek enerji gerektiren bir metabolik yoldur. Glikoz imhası gibi diğer önemli metabolik yolların aksine, yağ asidi sentezi rutin olarak işlevsel olarak değerlendirilmez ve bu da metabolik durumun eksik yorumlanmasına yol açar. Buna ek olarak, bu alanda yeni gelenler için uygun, kamuya açık ayrıntılı protokollerin eksikliği vardır. Burada, in vivo kahverengi yağ dokusunda toplam yağ asidi de novo sentezinin analizi için döteryum oksit ve gaz kromatografisi kütle spektrometrisi (GCMS) kullanan ucuz bir kantitatif yöntemi açıklıyoruz. Bu yöntem, bir karbon kaynağından bağımsız olarak yağ asidi sentaz ürünlerinin sentezini ölçer ve herhangi bir fare modelinde ve herhangi bir dış bozulma altında hemen hemen her doku için potansiyel olarak yararlıdır. GCMS için numune hazırlama ve sonraki hesaplamalar ile ilgili ayrıntılar verilmiştir. Yüksek seviyelerde de novo yağ asidi sentezi ve metabolik homeostazın korunmasındaki kritik rolleri nedeniyle kahverengi yağın analizine odaklanıyoruz.

Introduction

Obezite ve buna bağlı metabolik hastalıklar, şimdiki ve gelecek nesilleri tehlikeye atan bir salgındır 1,2. Enerji alımı ve harcaması arasındaki dengesizliğin bir sonucu olarak yaygın olarak basitleştirilen obezite ile ilişkili metabolik düzensizlik, çevresel ve endojen faktörler tarafından kontrol edilen çok sayıda metabolik yolu etkiler3. Bununla birlikte, metabolik düzensizliğin hayvan modellerinde sadece birkaç yol rutin olarak test edilir.

Örnek olarak, glikoz imhası, muhtemelen taşınabilir glikoz monitörlerinin kullanımının basitliği nedeniyle, rutin olarak glikoz ve insülin tolerans testleri ile ölçülür4. Tüm vücut glukoz ve lipid oksidasyon nispi oranları da dolaylı kalorimetri testlerinden 5,6 elde edilen solunum değişim oranına dayalı olarak rutin olarak tahmin edilmektedir. Bununla birlikte, metabolizmanın diğer tüm yönlerinin çoğunluğu rutin olarak işlevsel olarak değerlendirilmez. Bu, metabolik durumun eksik yorumlanmasına ve terapötik seçeneklerin kaçırılmasına yol açar. Bu tür ana yollardan biri de novo lipogenezdir.

De novo lipogenez (DNL), öncüllerden yeni yağ asitlerinin üretildiği süreçtir. Glikoz, tüm vücut DNL7'ye katkıda bulunan ana öncü olarak kabul edilir, ancak asetat, fruktoz, laktat ve dallı zincirli amino asitler gibi diğer öncülerin, mekansal ve duruma bağlı bir şekilde ilgili karbon kaynakları olduğu gösterilmiştir 8,9,10,11,12. DNL, metabolik homeostaza önemli bir katkıda bulunur ve normal gelişim için gereklidir13. Ek olarak, DNL'deki değişiklikler kanser 14,15 ve metabolik 16,17,18 ve kardiyovasküler hastalıklar 19,20 ile ilişkilendirilmiştir.

DNL yolu, esas olarak 16 karbonlu doymuş bir yağ asidi olan palmitat üreten çekirdek enzimatik bileşenler ATP sitrat liyaz (ACLY), asetil-CoA karboksilaz (ACC1/2) ve yağ asidi sentazdan (FAS) oluşur. Bununla birlikte, tek zincirli ve dallı zincirli yağ asitleri de daha düşük oranlarda üretilebilir9. Uzamalar ve desatürazlar, bu yağ asitlerini daha da değiştirerek, çeşitli işlevler için yararlı olan çok çeşitli yağ asitleri türleri yaratır (örneğin, uzun süreli enerji depolama ve membran akışkanlığının manipülasyonu).

DNL enzimatik mekanizmasının ekspresyonu, kısa sayıda transkripsiyon faktörü tarafından kontrol edilir. Bugüne kadar en iyi tanımlananlar arasında sterol düzenleyici element bağlayıcı protein (SREBP) ailesi, karbonhidrat yanıt elemanı bağlayıcı protein (ChREBP) ve karaciğer X reseptörü (LXR)21,22,23,24,25,26 bulunur. İşlevlerinde belirgin bir örtüşmeye rağmen, hücre tipi baskınlığına ve fizyolojik veya patolojik koşullara dayalı bireysel düzenlemeler bildirilmiştir21,22,27,28.

Dikkat çekici bir şekilde, DNL yolunun seçilen adımları için bir dizi inhibitör klinik kullanım için onaylanmıştır veya obezite, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı / alkolsüz steatohepatit (NAFLD / NASH) ve kardiyovasküler hastalık dahil olmak üzere bir dizi hastalık için klinik öncesi veya klinik gelişim aşamalarındadır29. Bu çabalar, DNL'nin sağlık ve hastalıkla olan ilişkisini vurgulamaktadır.

Son yıllarda, de novo yağ asidi sentezini kantitatif olarak değerlendirmek için yöntemlerin kullanımı artmıştır30. Bunu değerlendirmek için en yaygın yöntem, ağır etiketli hidrojenin sentez sırasında hem doğrudan hem de dolaylı olarak, DNL substratları NAPDH, asetil-CoA ve malonil-CoA'nın hidrojenleri ile döteryum değişimi yoluyla asil zincirlerine dahil edildiği ağır etiketli suyun (D2O) kullanılmasıdır. Bu yaklaşım popülerlik kazanmasına rağmen, bu alanda yeni gelenler için uygun, kamuya açık ayrıntılı protokollerin eksikliği vardır. Burada, daha önce Lee ve ark.31 tarafından geliştirilen hesaplamalarla, D2Ove gaz kromatografisi kütle spektrometrisi (GCMS) kullanarak FAS ürünlerinin de novo sentezini nicel olarak değerlendirmek için bir yöntemin ana hatlarını çiziyoruz. Bu yöntem, bir karbon kaynağından bağımsız olarak de novo yağ asidi sentezini ölçer ve herhangi bir fare modelinde ve herhangi bir dış bozulma altında hemen hemen her doku için potansiyel olarak yararlıdır. Burada, yüksek DNL seviyeleri ve metabolik homeostazın korunmasındaki kritik rolleri nedeniyle kahverengi yağ dokusunun (BAT) analizine odaklanıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneyler, Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

1. D2O'nun Hazırlanması

NOT: Deneysel varyasyonu önlemek için, deney süresince tüm fareler için yeterli çözelti/içme suyu hazırlayın.

  1. İntraperitoneal enjeksiyon için: D2O litresi başına 9 g NaCl çözerek% 0.9 w / v salin D 2 O üretin Sterilize etmek için pirojenik olmayan0.2μm filtreden süzün.
  2. D 2 O-su içmek için: 920 mL normal içme suyuna 80 mL D2O karıştırarak içme suyu olarak kullanılmak üzere %8 v / v D2O ile zenginleştirilmiş su üretir. Fare tesisinden düzenli içme suyu elde edilebilir. Sterilize etmek için pirojenik olmayan 0,2 μm filtreden süzün.

2. BAT aktivitesinin sıcaklık iklimlendirmesi ile modülasyonu

  1. Fareleri, sıcaklık alıştırmasının başlamasından 2 hafta önce kafes başına iki fare olacak şekilde ayırın. Farelerin uyum sağlaması ve tüm kafesleri 22 °C'de tutması için su beslemesini su şişeleriyle değiştirin.
  2. Uygun sıcaklıkları ayarlayarak sıcaklığa alışmaya başlamadan 1 hafta önce fare çevre odalarını hazırlayın: termonötralite için 30 °C, oda sıcaklığı için 22 °C ve soğuğa maruz kalma için 18 °C.
  3. Sıcaklık iklimlendirmesinin başlangıcında, kafesleri çevresel zenginleştirme olmadan yenileriyle değiştirin (yuvaları önlemek için). Kafesleri ilgili sıcaklıklara getirin.
    NOT: Termonötraliteye atanan kafesler 4 hafta boyunca 30 °C'de kalacaktır. Oda sıcaklığına atanan kafesler 4 hafta boyunca 22 °C'de kalacaktır. Soğuğa maruz kalmaya atanan kafesler haftalık bir programda giderek daha soğuk hale gelecektir: ilk hafta 18 °C, ikinci hafta 14 °C, üçüncü hafta 10 °C ve dördüncü hafta 6 °C.
  4. Tüm koşullar için kirli kafesleri haftalık olarak değiştirin. Ek olarak, yiyecek ve su şişelerini en az 24 saat boyunca uygun sıcaklıkta önceden uyarlanmış yenileriyle değiştirin.
    NOT: Normal koşullara kıyasla önemli ölçüde daha fazla miktarda yiyecek tüketeceklerinden, özellikle soğuktaki fareler için her hafta eklenen yiyecek miktarlarına dikkat edin. Yiyecek ad libitum sağlayın.

3. D2O'nun Yönetimi

  1. Her hayvana, 1 mL şırınga ve 26 G iğne kullanarak intraperitoneal enjeksiyon yoluyla, doku toplamadan 12 saat-3 gün önce, 35 μL / g vücut ağırlığında% 0.9 w / v salin-D2O enjekte edin.
    NOT: Uygun bir etiketleme süresinin seçilmesi hakkında daha fazla bilgi için lütfen tartışma bölümüne bakın.
  2. Su şişelerini %8 v/v D2O ile zenginleştirilmiş içme suyu içeren şişelerle değiştirin.

4. Plazma ve doku toplama, işleme ve depolama

  1. Deneyin sonunda, onaylanmış metodolojileri kullanarak fareleri feda edin (örneğin, aşırı dozda karbondioksit ve ardından servikal çıkık).
    1. Ötenaziden önce sonuçları etkileyebilecek ani sıcaklık değişikliklerini önlemek için ısıtma/soğutma pedleri veya başka yöntemler kullanın. Onaylanmış metodolojileri izleyerek farelere ötenazi yapın. Hemen kan ve doku alımına geçin.
  2. 26 G'lik bir iğne kullanarak kardiyak ponksiyon yoluyla kan toplayın ve bir etilendiamintetraasetik asit kan alma tüpünde saklayın. Daha fazla işlenene kadar kanı buz üzerinde tutun.
  3. Derinin altındaki dokuları etkilememek için cildi yukarı çekerken, farenin sırtının orta çizgisi boyunca cildi göğüs boşluğunun alt bölgesinden boynun üst bölgesine kadar kesin. İnterskapular BAT, ince bir beyaz yağ dokusu tabakası altında omuz bıçakları arasında bulunur ve iki piramidal şekilli lobdan oluşur.
    1. Buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yıkayarak dokuyu temizleyin. Fazla sıvıyı gidermek için bir kağıt havluya sürün, analitik bir ölçekte tartın ve bir mikrotüpte toplayın.
    2. Sıvı nitrojen kullanarak dokuyu hemen dondurun. Diğer BAT depoları da toplanabilir.
  4. Kan örneklerini 10.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, kırmızı kan hücresi peletini bozmadan plazmayı dikkatlice toplayın. Yeni bir buz gibi soğuk mikrotüpe aktarın ve sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun.
  5. Kahverengi yağ ve plazma örneklerini kullanana kadar -80 °C'de saklayın.

5. Yağ dokusundan lipit ekstraksiyonu

  1. Ekstraksiyona başlamadan önce
    1. Bir cam şişede metanol içinde 1 mM'lik bir hekzadekenoik-d31 asit çözeltisi hazırlayın. Bu, iç yağ asidi standardı olarak hizmet edecektir.
    2. Gerekli miktarda kloroform (CHCl3) ve metanolü (CH3OH) -80 °C'lik bir dondurucuda veya kuru buzda önceden soğutun.
      NOT: Antioksidan di-tert-butil-4-metilfenol (BHT), doymamış yağ asitlerinde çift bağların oksidasyonunu önlemek için %0.01 w/v (2.5 mg/25 mL)konsantrasyonda CHCl3'e eklenebilir.
    3. Her doku örneği için önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüpleri ve boş ekstraksiyon için kullanılacak ekstra bir tüp.
      DİKKAT:CH3OHveCHCl3 solunduğunda oldukça uçucu ve toksiktir. Sadece çeker ocaklarda kullanın.
      NOT: Farklı marka mikrosantrifüj tüpleri, solvent sızıntısını önleme açısından farklı seviyelerde arka plan palmitat ve yeteneklere sahiptir. Solvent sızıntısının önlendiğinden ve tüplerin minimum düzeyde kirletici palmitat içerdiğinden emin olmak için önce çeşitli tüplerin test edilmesini öneririz. Daha fazla tartışma için lütfen Yao ve ark.32'ye bakın.
  2. Numuneleri dondurucudan çıkarın ve kuru buz üzerine koyun.
  3. Önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüpünü bir analitik teraziye yerleştirin ve terazinin darasını alın. Cımbız ve neşter/çelik tıraş bıçağını soğuması için 10-20 saniye kuru buz üzerine yerleştirin.
    1. Dondurulmuş doku örneğini tüpten çıkarmak için cımbız kullanın ve plastik bir tartım teknesine yerleştirin. Kantar, düz bir kuru buz bloğuna veya önceden soğutulmuş başka bir yüzeye yerleştirilebilir.
    2. Neşter veya çelik tıraş bıçağı kullanarak, dokunun 5-15 mg ağırlığa eşdeğer küçük bir kısmını inceleyin. Mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve tam ağırlığı kaydedin. Her örnek için tekrarlayın. Numuneler bu noktada dondurucuda saklanabilir veya lipid ekstraksiyonu için aşağıdaki adımlara ilerletilebilir.
      NOT: Numuneler arasında neşterin %70 etanol ile uygun şekilde temizlendiğinden ve her numune arasında yeni bir tartım teknesi kullanıldığından emin olun.
  4. Her numuneye 1 μL/mg 10 mM heksadekenoik-d 31(C16:0-d31) asit ekleyin.
    DİKKAT: Çözücülerin solunması riski nedeniyle aşağıdaki adımlar (5.4 ila 5.8) çeker ocak altında gerçekleştirilmelidir.
  5. Üç adet 5 mm paslanmaz çelik boncuk ile her numuneye 250 μLCH3OH, 250 μLH2Ove 500 μLCHCl3 ekleyin. Tüpleri bir öğütme değirmeninin önceden soğutulmuş bir bloğuna yerleştirin ve numuneleri 5 dakika boyunca 25 Hz'lik bir titreşim frekansında karıştırın veya doku numuneleri için üretici tarafından önerilen yönergeleri kullanın. Bir mıknatıs kullanarak boncukları çıkarın.
  6. Numuneleri 12.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Santrifüjlemeden sonra, polar metabolitleri içeren üst sulu faz ve lipitleri ve yağ asitleri içeren alt organik faz ile net bir bifazik ayrım gözlenmelidir. Herhangi bir ayrılma görülmezse, 250 μLH2Oekleyin ve vorteks ve santrifüjleme adımlarını tekrarlayın.
  7. Bir mikropipet kullanarak, her numunenin alt fazından uygun şekilde etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine sabit bir hacim alın.
  8. Kalan örneğe 500 μL CHCl3 ekleyin ve 5.6-5.7 adımlarını tekrarlayın.
  9. Numuneleri nitrojen gazı altına veya tamamen kuruyana kadar 4 °C'de CHCl3'e dayanıklı soğutmalı santrifüj vakuma yerleştirin. Kurutulmuş numuneler, türevlendirmeye hazır olana kadar -20 °C'de saklanabilir.
    NOT: Polar metabolitleri analiz etmek için her numunenin üst tabakası da bu noktada toplanabilir ve adım 5.9'daki gibi kurutulabilir.

6. Yağ asidi metil esterlerinin (FAME'ler) hazırlanması ve GCMS analizi

  1. FAME'leri hazırlamak için asit katalizli esterleştirme ve transesterifikasyon
    DİKKAT: Solventlerin solunma riski nedeniyle aşağıdaki adımlar çeker ocak altında gerçekleştirilmelidir.
    1. Numuneler dondurucuda saklanmışsa, su bulunmadığından emin olmak için nitrojen altında 5 dakika kurutun.
    2. MS sınıfı çözücüler kullanarak, 98 mL susuzCH3OH'yi bir cam ortam şişesine pipetleyin. CH3 OH'de%2 H 2S04yapmak için çeker ocakta yavaşça 2 mL susuz sülfürik asit ekleyin. Kapalı şişeyi döndürerek karıştırın.
    3. Her numuneye 500 μL %2H2S04CH3OHçözeltisi ekleyin ve kısaca vorteksleyin.
    4. Numuneleri bir ısı bloğunda 50 °C'de 2 saat inkübe edin.
    5. Numuneleri ısı bloğundan çıkarın ve her numuneye 100 μL doymuş NaCl çözeltisi ve 500 μL heksan ekleyin.
    6. Numuneleri oda sıcaklığında 1 dakika kuvvetlice vorteksleyin. Numuneleri 1 dakika bekletin; Bundan sonra iki aşama belirgin olmalıdır.
    7. Üst fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın (mikrosantrifüj tüpünün uygun seçimi için bölüm 5.1.3'teki nota bakın).
    8. Verimi en üst düzeye çıkarmak için, ikinci numuneyi aynı etiketli tüplere toplayarak 6.1.5-6.1.7 adımlarını tekrarlayın.
    9. Numuneleri oda sıcaklığında nitrojen gazı altında kurutun.
    10. Numuneleri orijinal doku ağırlığına göre 20 μL/mg hekzan içinde yeniden süspanse edin ve hemen bir cam insert ile cam GC şişesine aktarın.
      NOT: Buharlaşmayı en aza indirmek için numuneleri aktarırken hızlı çalışın.
  2. GCMS analizi
    1. FAME izotopologlarının bolluğunu belirlemek için, numuneleri tek bir dört kutuplu gaz kromatografisi kütle spektrometresine (GCMS) enjekte edin.
      NOT: Palmitatı tespit etmek için birçok kolon tipi kullanılabilirken, Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, yağ asidi cis/trans izomerlerinin ayrılması için geliştirilmiş bir GCMS kolonu için aşağıdaki sıcaklık programı oluşturulmuştur. Bu kolon 50 m uzunluğa ve 0,25 mm iç çapa sahiptir.
    2. Taşıyıcı gaz olarak helyum kullanarak, 1 mL/dk'da akan 270 °C'lik bir giriş sıcaklığında bölünmüş/ayrılmamış bir girişe 1 μL numune enjekte edin. Toplam akışı 19 mL/dk, septum tahliyesi 3 mL/dk ve 0,75 dk'da 15 mL/dk'lık ayrık havalandırmaya temizleme akışı ile düşük bol miktarda yağ asitleri için bölünmemiş bir enjeksiyon kullanın. Palmitat ve oleat gibi yüksek miktarda yağ asitleri için 10: 1-40: 1'lik bir bölme oranı kullanın.
    3. Aşağıdaki fırın parametrelerini kullanın: 80 °C'lik bir başlangıç sıcaklığı; 20 °C/dk'lık artışlarla 170 °C'ye çıkarmak; 1 °C/dk'lık artışlarla 204 °C'ye çıkarmak; 20 °C/dk'lık artışlarla 250 °C'ye çıkarmak; ve ardından 250 °C'de 10 dakika tutun.
    4. Aşağıdaki kütle seçici dedektör (MSD) parametrelerini kullanın: 70 eV'lik bir elektron darbeli iyonizasyon modu ve 1.562 (u/s) tarama hızı ve 4,1 tarama/s frekansı ile 50-400 m/z aralığında tarama. 280 °C'de bir transfer hattı, 230 °C'de bir iyon kaynağı ve 150 °C'de bir dört kutuplu kullanın.
      NOT: Diğer sütunlar kullanılabilir, ancak sıcaklık programı değişiklik gösterecektir.
    5. Numune dizisi: Enjeksiyon numune sırasını rastgele hale getirin ve dizinin başında, dizi içindeki her beşinci numuneden sonra ve dizinin sonunda iki veya üç heksan boşluğu enjekte edin.
    6. Her bir yağ asidi metil esteri için Tablo 1'deki iyonları entegre etmek için cihaza özel yazılım veya Metabolit-Dedektör33 gibi ücretsiz açık erişimli yazılım kullanın.
      NOT: Tablo 1'de M1-M5 izotopologlarını kapsayan iyonları özetledik ve bu etiketleme penceresi ile döteryum dahil etme miktarını kapsadığını bulduk. Bununla birlikte, de novo akı önemli ölçüde daha yüksekse ve/veya daha uzun bir etiketleme süresi kullanılıyorsa, bunun genişletilmesi gerekebilir.
    7. İyon yoğunluklarının kesirli bolluğa dönüştürülebildiği bir kütle izotopomer dağılımı oluşturmak için her entegre iyonun bolluğunu kullanın, böylece kütle izotopomer dağılımının toplamı bire eşittir. Lütfen Ek Dosya'daki örnek elektronik tabloya bakın.
      NOT: Döteryum katılımını doğru bir şekilde belirlemek için, 13C, 15N ve 2H gibi doğal olarak oluşan izotopların varlığına izin vermek için doğal izotop bolluğunun düzeltilmesi kullanılmalıdır. Bu, Fernandez ve ark.34,35 tarafından belirtildiği gibi bir düzeltme matrisi uygulanarak gerçekleştirilir ve etiketli bir metabolitten etiketlenmemiş ölçülen bir metabolitin MID'sinin çıkarılmasıyla gerçekleştirilemez. Uygulamada, ham verileri fraksiyonel MID'lere dönüştürmek için fluxfix36, polyMID 37 veya IsoCor38 gibi ücretsiz olarak temin edilebilen yazılımların kullanılmasını öneriyoruz ve Tablo 1'de FAS'ın metil ester ürünleri için izotop düzeltmesi formülünü sağladık.
    8. Mevcut palmitat miktarını belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın:
      Equation 1 
      iyon sayısı, Tablo 1 ve C16: 0-d 31'e entegre edilmiş tüm palmitat izotopologlarının toplamını ifade ederken, dahili standart hekzadekenoik-d31'i ifade eder. İç standart, endojen palmitatınkinden ayrı bir tepe oluşturur. Diğer yağ asitlerinin nispi bolluğu da belirlenebilir, ancak tam kantitasyon için yağ asidine özgü izotop iç standartlarının (D2Odahil edilmesinden gözlemlenenden daha büyük kütle kaymaları ile) veya harici standart eğrilerin kullanılması gerekebilir. Arka plan palmitat miktarını belirlemek için boş ekstrakte edilmiş numuneyi kullanın ve bunu nihai doku değerinden çıkarın.
    9. Palmitatın molar zenginleşmesini (ME) aşağıdaki denklemle hesaplayın:
      Equation 2
      buradaM, bir palmitat izotopologunun normalleştirilmiş, kesirli bolluğudur ve n, olası palmitat izotopologlarının sayısıdır. Örneğin, aşağıdaki fraksiyonel dağılıma sahip bir palmitat molekülünün ME'si, M1 = 0.25, M2 = 0.08, M3 = 0.02, şöyledir: (0.025 * 1) + (0.08 * 2) + (0.02 * 3) = 0.245 ( Ek Dosyaya Bakınız).

7. Vücut suyu zenginleştirmesini belirlemek için plazma örneklerinin döteryum aseton değişimi

  1. Tepkime
    1. Suda% 0-9 v / v arasında değişen 10 döteryum standardı hazırlayın.
    2. Adım 5.1.1'deki standartlar da dahil olmak üzere, numune başına 4 μL'ye izin veren %5 v/v aseton/asetonitril çözeltisi hazırlayın.
    3. Etiketli, güvenli kilitli mikrosantrifüj tüplerinde, her plazma örneğinden veya standarttan 10 μL, 4 μL 10 M NaOH ve 4 μL %5 aseton/asetonitril'i birleştirin. Bunu her örnek için üç kopya halinde gerçekleştirin.
    4. Numuneleri pipetleme ile nazikçe karıştırın. Numunelerin gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edilmesine izin verin.
  2. Çıkarma
    1. İnkübasyondan sonra, her numuneye 450-550 mgNa2S04ekleyin.
    2. Çeker ocakta, her tüpe 600 μL CHCl3 ekleyin ve 15 saniye boyunca kuvvetlice girdap yapın.
    3. Numuneleri 300 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
    4. Bir çeker ocak altında, her numuneden süpernatantın üç kopyalı, 80 μL'lik alikotlarını cam ekleri ve kapağı olan etiketli, cam GCMS şişelerine aktarın.
  3. GCMS analizi
    1. Numuneleri bir kolon üzerinde (30 m, 0,25 mm i.d, Agilent DB-35MS) ayırın ve ekli kütle spektrometresinde analiz edin.
      1. 40:1 bölme oranı, 1 mL/dak helyum akışı ve 270 °C giriş sıcaklığı ile bölünmüş/bölmesiz bir girişe 1 μL numune enjekte edin.
      2. Aşağıdaki fırın parametrelerini kullanın: 60 °C'lik bir başlangıç sıcaklığı, 20 °C/dk'lık artışlarla 100 °C'ye, 50 °C/dk'lık artışlarla 220 °C'ye yükseltin ve ardından 220 °C'de 1 dakika tutun.
      3. Aşağıdaki kütle seçici dedektör (MSD) parametrelerini kullanın: 58 ve 59 m/z seçili iyon izleme ile 70 eV'de elektron darbeli iyonizasyon modu. 280 °C'de bir transfer hattı, 230 °C'de bir iyon kaynağı ve 150 °C'de bir dört kutuplu kullanın.
        NOT: Diğer düşük boşaltmalı, yapıştırılmış, çapraz bağlı, orta polariteli sütunlar kullanılabilir, ancak sıcaklık programı değişecektir.
    2. Sıvı örnekleyici yöntemini, birCHCl 3 yıkaması ve ardından her altı örnekte bir ek CHCl3 yıkama adımları da dahil olmak üzere rastgele bir numune dizisi ile başlayacak şekilde ayarlayın.
      NOT: Otomatik numune alma cihazı için iğne yıkama olarak aseton kullanılıyorsa, CHCl 3 veya hekzan ile değiştirin ve kromatogramda herhangi bir kirletici aseton zirvesi artık belirgin olmayana kadar birden fazla boşCHCl 3 numunesi enjekte edin.
    3. Bu yöntemi kullanarak, bir aseton zirvesi yaklaşık 1.25 dakikada yükselir. Tablo 1'de gösterildiği gibi 58-60'lık bir m/z oranı içeren tepe noktalarını analiz etmek için bir ayarlama ile 6.2.6-6.2.7 adımlarını izleyerek verileri entegre edin ve aseton zenginleştirmesinin kesirli bolluğunu hesaplayın.
    4. Asetonun fraksiyonel zenginleşmesine dayalı olarak, test numunelerinin vücut suyu zenginleştirme (p) yüzdesini belirlemek için standart bir eğri oluşturmak için standartları kullanın.

8. İn vivo de novo lipogenez hesaplamaları

  1. Her numunede FAS'ın doğrudan ürünleri olan yeni sentezlenmiş yağ asitlerinin (FNS) fraksiyonunu (yani, palmitat, tek zincirli yağ asitleri ve mmBCFA'lar) aşağıdaki denklemle hesaplayın:
    Equation 3
    burada ME, bir palmitat molekülünün ortalama molar zenginleşmesidir (adım 6.2.9), p, karşılık gelen plazma örneğinden sudaki döteryum zenginleştirmesidir (adım 7.3.4) ve N, bir döteryumun dahil edilebileceği palmitat üzerindeki değiştirilebilir hidrojen atomlarının sayısıdır.
  2. Lee ve ark.31 tarafından kurulan aşağıdaki denklemi kullanarak N'yi belirleyin:
    Equation 4
  3. Yeni sentezlenen yağ asitlerinin (MNS) molar miktarını şu şekilde belirleyin:
    MNS = FNS x toplam yağ asidi miktarı (nmol/mg doku).
    NOT: Örneğin, 0.245'lik bir palmitat molar zenginleştirme (ME), 0.045'lik bir vücut suyunda (p) bir döteryum zenginleştirmesi ve hesaplanan bir N sayısı 22 elde edilirse, palmitatın fraksiyonel sentezi 0.247'dir. Dokuda bulunan palmitat miktarı 2 mmol / mg ise, yeni sentezlenen palmitatın mmol 0.494 mmol / mg'dır (Ek Dosyaya bakınız).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Adım 1'de açıklananD2Odozuna dayanarak, tipik olarak vücut suyunun %2,5 ila %6 aralığında zenginleştirildiğini ve vücut suyunda temel bir döteryum zenginleştirme seviyesinin 1 saat içinde hızla elde edildiğini ve çalışma süresince %8 zenginleştirilmiş içme suyu ile korunduğunu bulduk (Şekil 1). Sürekli kararlı durum vücut suyu zenginleştirme, 6. adımda kullanılan hesaplamaların bir varsayımıdır ve bu nedenle yeni deneysel modellerde vücut suyu zenginleştirme kinetiğinin deneysel olarak doğrulanmasını öneriyoruz.

De novo sentezlenen yağ asitlerinin miktarının, BAT'deki termonötraliteye göre oda sıcaklığında arttığını bulduk (Şekil 2). 3 günlükD2Ouygulamasından sonra termonötralite ve oda sıcaklığında farelerden BAT'de palmitatın kütle izotopolog dağılımı, oda sıcaklığında bulunan daha yüksek bir M1 ve M2 döteryum zenginleşmesi gösterir (Şekil 2A). Bu daha soğuk sıcaklık zenginleşmesi sadece palmitatta değil, aynı zamanda BAT'ta çok çeşitli yağ asitlerinde de meydana gelir (Şekil 2B). Oda sıcaklığında farelerin BAT'sinde toplam palmitat bolluğu da artar ve fraksiyonel sentez oranını toplam palmitat seviyeleri ile birleştirerek, oda sıcaklığında farelerde toplam palmitat sentezinin arttığını bulduk (Şekil 2C, D). Özellikle, plazma toplam yağ asidi zenginleştirmesi BAT ile aynı eğilimi izlemez, bunun yerine termonötralite ile yağ asidi zenginleştirmesi artar (Şekil 2E). Burada açıklandığı gibi, endojen sentezden potansiyel alımın dekonvolüsyon edilmesi, birD2Otek zaman noktası yaklaşımıyla mümkün değildir, ancak bu karşıt eğilimler, BAT'deki yağ asidi zenginleştirme modelinin yağ asidi alımı tarafından yönlendirilmediğini göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: 0.035 ml / g vücut ağırlığı% 0.9 NaClD2Oile enjeksiyonu ve içme suyunun% 8 D 2 O ile zenginleştirilmiş su ile değiştirilmesini takiben, farelerin plazmasında birden fazla zaman noktasında D2O zenginleştirme yüzdesi. Çubuk grafikler ortalama ± SD'yi temsil eder. n = 9. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: 3 günlük D2O uygulamasından sonra farelerde kahverengi yağ dokusunda temsili sonuçlar. (A) Oda sıcaklığında (RT) ve termonötritede (TN) 3 günlükD2Ouygulamasından sonra BAT'de palmitatın kütle izotopolog dağılımı. (B) Oda sıcaklığında ve termonötritede 3 günlükD2Ouygulamasından sonra bir dizi yağ asidinin BAT molar zenginleştirilmesi. (C) Toplam bolluk ve (D) de novo oda sıcaklığında ve termonötritede 3 günlükD2Ouygulamasından sonra kahverengi yağ dokusunda palmitat sentezlendi. (E) Oda sıcaklığında ve termonötritede 3 günlükD2Ouygulamasından sonra bir dizi yağ asidinin plazma molar zenginleştirilmesi. Çubuk grafikler ortalama ± SD'yi temsil eder. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. n = 6 olur. İstatistiksel analiz iki kuyruklu Student t-testi ile belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bileşik Iyon Tahmini elüsyon süresi (dakika) İzotop düzeltmesi için formül
C16:0 270-275 20 C17H34O2
C14:0 242-247 16.5 C15H30O2
C15:0 256-261 18 C16H32O2
ISO-C16:0 270-275 18.9 C17H34O2
ISO-C17:0 284-289 21 C18H36O2
Anteiso-C17:0 284-289 21.5 C18H36O2
C16 D31 301 19.2 ~
Aseton 58-59 1.5 C3H6O

Tablo 1: Entegre edilecek GCMS bileşik parça iyonları. Bu tablo, memeli yağ asidi sentazı tarafından üretilen bir dizi yağ asidini kapsar, ancak birincil ürün C16:0'dır. Tüm bekletme süreleri, 7. adımda ayrıntılı olarak açıklanan aseton dışında 6. adımda ayrıntılı olarak açıklanan GCMS yöntemi içindir.

Ek Dosya: Örnek elektronik tablo hesaplaması. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Karmaşık metabolik yolaklar arasındaki dengeyi ve etkileşimi anlamak, metabolik ilişkili hastalıkların biyolojik temelini anlamak için vazgeçilmez bir adımdır. Burada, de novo yağ asidi sentezindeki değişiklikleri belirlemek için invaziv olmayan ve ucuz bir metodoloji gösteriyoruz. Bu yöntem, yağ asidi döteryum zenginleştirmesinden31 de novo sentez akısını tahmin etmek ve vücut suyundakiD2O'nunnispi yüzdesini belirlemek için döteryum-aseton değişimini kullanmak için hesaplamalar geliştiren daha önce yayınlanmış yöntemlerdenuyarlanmıştır 39. Son yıllarda, burada açıklanan yöntemi aldık ve yağ depolarında, beyinde, karaciğerde ve tümörlerdeçeşitli yağ asitlerinin sentezindeki değişiklikleri ortaya çıkarmak için uyguladık 9,22,40. Bu protokolün bir dizi kritik adımı ve değiştirilebilir yönü vardır. Bunlar, genel deneysel tasarımın yanı sıra bu yöntemde kullanılan analitik yaklaşım ve hesaplamalarla ilgilidir. Kararlı izotop izleyicilerden de novo yağ asidi sentezini hesaplamak için alternatif yaklaşımlar da yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunlar arasında Hellerstein ve ark.41,42 tarafından geliştirilen alternatif kütle izotopomer dağılım analizi (MIDA) yaklaşımı, Kelleher ve ark.43,44 tarafından geliştirilen izotopomer spektral analizi (ISA) ve yağ asidi kaynak analizi (FASA) gibi daha uzun zincirli yağ asitlerinin sentezini modellemek için geliştirilen daha yeni yaklaşımlar yer almaktadır45. Buradaki yöntemin yararı, ücretsiz olarak kullanılabilen yazılım ve bir elektronik tablo kullanımı ile kolayca uygulanabilir olmasıdır. Bununla birlikte, vücut suyu zenginleştirmesinin (BWE) sabit bir durumda olması ihtiyacı, N parametresinin kullanımıyla ilgili uyarılar (aşağıda tartışılmıştır) ve yalnızca esas olarak palmitat olan FAS'ın doğrudan ürünleri için geçerli olması ile sınırlıdır.

Kahverengi yağ DNL ve sıcaklık iklimlendirme
DNL, tüm vücut metabolik regülasyonunun ana nodülü olarak yükselmiştir ve normal gelişim için gereklidir13,29. Doku hedefli delesyon ve metabolomik analiz, yağ dokusunda DNL'yi kontrol eden birkaç önemli enzimatik ve transkripsiyonel oyuncuyu ve tüm vücut yağ birikimini ve normal metabolik homeostazı nasıl kontrol ettiğini belirlemiştir 21,28,46,47,48,49. Daha az takdir edilmesine rağmen, BAT, diğer dokuların çoğundan daha yüksek çekirdek vücut DNL enzim mekanizmasının (acly, acaca, fasn) ekspresyonu ve daha yüksek lipojenik aktiviteleri ile DNL'de oldukça aktif bir dokudur 22,50,51,52,53,54,55. Bununla birlikte, BAT, alt termonötr sıcaklıklara alışmanın aynı anda BAT 22,54,56'da DNL ve yağ asidi oksidasyon aktivitesini indüklemesi anlamında benzersizdir. İlişkili mekanizmalar tam olarak açık olmamakla birlikte, BAT'ın, normal BAT aktivitesi53,55 için gerekli olan lipid sentezi için DNL'ye yönelik olanlar da dahil olmak üzere besinler için metabolik bir lavabo olduğu kabul edilmektedir. Bu nedenle, aktivite seviyelerini değerlendirmek için BAT'ın tüm metabolik gelirlerini ve sonuçlarını hesaba katabilmek önemlidir. Bununla birlikte, DNL genellikle sadece gen ekspresyonuna dayalı olarak ölçülür ve sayılan durumlarda işlevsel olarak değerlendirilir. Burada önerilen protokol, metabolik durumun daha eksiksiz bir şekilde yorumlanmasına izin vererek DNL'nin fonksiyonel değerlendirmesine izin verir.

D2O dozu, zamanlama ve vücut suyu zenginleştirme ölçümü
Tasarımdaki birincil kritik adımlardan biri, D2O uygulamasının dozu ve zamanlamasıdır. Bu protokolde, kararlı durum BWE'nin hızlı bir şekilde elde edilmesine ve sürdürülmesine yol açtığını bulduğumuz bir doz ve uygulama yaklaşımı (bolus enjeksiyonu ve ardından içme suyu zenginleştirme) kullanıyoruz. Yağ asidi sentezini belirlemek için kullanılan hesaplamalar, kararlı durum BWE varsayımına dayanmaktadır; Bu nedenle, bunun yeni deneysel modellerde doğrulanması çok önemlidir. Bu kombine dozlama yaklaşımının kullanılmasıyla ilgili sorunlar nedeniyle kararlı durum zenginleştirmesi mümkün değilse, okuyucu, hesaplamalardaki değişikliklerin buna izin verdiği diğer yayınlara yönlendirilir39. Bunun hızlı bir şekilde başarılmasını amaçlayan bir dozlama yaklaşımı kullanıldığında tolere edilebilecek kararlı durumdan sapma derecesi birçok faktöre bağlıdır. BWE, hesaplama için kullanılan değerin üzerinde sürekli ani artışlarda artırılırsa, buradaki yaklaşım kullanılarak DNL fazla tahmin edilecektir. BWE, sürekli süreler için hesaplama için kullanılan değerden önemli ölçüde düşükse, DNL hafife alınacaktır. Ortalama etrafında bazı küçük farklılıklar beklense de, en kritik faktör, BWE'nin bir deney grubunda diğerinden daha fazla farklılık göstermemesidir, bu da hesaplanan DNL'de BWE'deki varyasyon tarafından yönlendirilen farklılıklara yol açabilir. Her iki deney grubu da zaman içinde küçük ama benzer farklılıklar gösteriyorsa, bunun toleransı, araştırmacının ölçümün gerçekleştirmesini istediği doğruluk ve kesinliğin yanı sıra deney grupları arasında beklenen farklılıklara bağlı olacaktır. Örneğin, burada örnek olarak verilen oda sıcaklığına karşı termonötraliteye maruz kalan kahverengi yağ dokusu durumunda, mevcut de novo sentezlenmiş yağ asidi miktarındaki fark %50'den fazladır; bu nedenle, BWE'deki küçük değişikliklerin sonuçları gizlemesi olası değildir.

Kararlı durumun dikkate alınmasına ek olarak, bu protokolün bir başka değiştirilebilir yönü de BWE seviyesidir. Artan BWE, potansiyel olarak yağ asitleri üzerinde daha fazla etiket transferine izin verir ve bu nedenle, daha düşük cirolu yağ asidi havuzları daha kısa sürede daha kolay tespit edilebilir. Bu, araştırmacının DNL'deki akut yanıtlarla ilgilendiği durumlarda bir avantaj olabilir. Bununla birlikte, vücut suyundaki artanD2Oseviyeleri istenmeyen fizyolojik etkilere neden olabilir ve bu nedenle dikkatli olunmalıdır57. Tipik olarak yaklaşık% 0.5 civarında BWE seviyelerine ulaşmak için daha düşük D2O seviyelerinin uygulanması, D2O uygulamasıyla ilişkili maliyet nedeniyle insan çalışmalarında yaygın olarak kullanılır. Bu durumda, BWE ve yağ asidi zenginleştirmesini ölçmek için artan duyarlılığa sahip yöntemlere ihtiyaç duyulabilir. BWE için bu, iyon oranı kütle spektrometrisi58 veya modifiye edilmiş bir aseton değişim protokolü59 ile elde edilebilir. Yağ asidi analizi için, yüksek çözünürlüklü bir GCMS cihazının kullanılmasının son zamanlarda yağ asitlerinde döteryum ölçümünün hassasiyetini arttırdığı ve böylece çok kısa zaman periyotları ve/veya düşük BWE60'ın ardından DNL'nin miktarının belirlenmesine izin verdiği gösterilmiştir. CHCl3 ile ekstrakte etmek ve sıvı enjeksiyonu yapmak yerine, adım 7.1.5'te üretilen asetonun üst boşluk analizlerini kullanarak, BWE'nin ölçüldüğü verimi artırmak için alternatif yöntemler de kullanılabilir. Bu, metot çalışma süresini azaltır ve birden fazla transfer adımını önler, böylece numune hazırlama süresini azaltır. Bir tepe boşluğu enjektörüne erişim varsa, bu yöntem şiddetle tavsiye edilir61.

Miktar tayini için yağ asidi havuzu seçimi ve analitik yaklaşım
Bu protokolde yöntem, lipid sınıfından bağımsız olarak doku veya plazmadaki toplam yağ asidi havuzunu ölçmek için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, lipid sınıfları, FAME üretiminden önce, ince tabaka kromatografisi veya sıvı kromatografisi gibi yöntemlerle ayrılabilir. Ek olarak, serum veya plazma analiz edilirken, çok düşük yoğunluklu lipoprotein (VLDL) gibi spesifik lipoprotein fraksiyonlarından lipitler ultrasantrifüjleme yoluyla izole edilebilir58. Bu yöntem, VLDL'de de novo yapılan yağ asitlerinin birincil kaynağı olması muhtemel olan hepatik DNL'yi tespit etmek için insan çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Lipid ekstraksiyonu ve türevlendirme protokolü, belirli sınıfların62 izolasyonunu arttırmak için de değiştirilebilir. Son olarak, lipid hidrojenlerin döteryum zenginleşmesi, kütle spektrometrisi yerine 2H NMR spektroskopisi kullanılarak da ölçülebilir. Bu yöntem MS'den daha az hassas olmasına ve bu nedenle daha fazla malzeme gerektirmesine rağmen, avantajı, uzama ve desatürasyon oranlarını daha iyi tahmin etmek için kullanılabilecek konumsal zenginleştirme bilgisi vermesidir63.

Hesaplama
Bu protokoldeki hesaplamalar, kararlı durum BWE'yi, yağ asidi zenginleştirmesini ve yağ asitleri31 üzerindeki değiştirilebilir hidrojen sayısını hesaba katan önceki hesaplamalara dayanmaktadır. Herhangi bir hesaplamada olduğu gibi, bu yaklaşımdan elde edilen sonuçları uygularken ve yorumlarken göz önünde bulundurulması gereken bir takım sınırlamalar ve varsayımlar vardır. Dikkat edilmesi gereken birincil noktalardan biri, yöntemin 8. bölümünde N için kullanılan değerdir. Yağ asidi sentezi sırasında,D2O'dan 2H, asil zincirine dahil edilir ve ayrıca dolaylı olarak NADPH, asetil-CoA ve malonil-CoA64,65 üzerindeki hidrojenlerle değişim yoluyla. Önceki çalışmalar bu değişimin eksik olduğunu göstermiştir31,66; bu nedenle, hesaplama bu65'e izin vermek için bir düzeltme faktörü (N) içerir. 22'nin N'si birçok çalışma için yaygın olarak kullanılır, çünkü daha önce bunun adım 6 31,66'da özetlenen denklemi kullanan bir dizi doku için uygun olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte, bu, deneysel pertürbasyona ve hayvan modeline bağlı olarak değişebilir65; Bu nedenle, araştırmacıları bunu dikkate almaya çağırıyoruz. Daha düşük bir N, toplam sentez akısını arttırır ve çalışmalar veya laboratuvarlar arasındaki ölçümleri karşılaştırırken bu parametre için kullanılan değer dikkate alınmalıdır. Burada kullanılan yaklaşımın bir sınırlaması, yalnızca çok daha düşük miktarlarda tek zincirli yağ asitleri ve mono-metil dallı zincirli yağ asitleri9 ile esas olarak palmitat olan FAS'ın doğrudan ürünlerinin analizi ile ilgili olmasıdır. Tüm yağ asitlerinin döteryumla zenginleştirilmesi tespit edilebilse de, burada kullanılan formül, etiketlenmemiş yağ asidinin alımına ve bu67'nin uzamasına izin vermediğinden, C18:0 gibi daha uzun zincirli yağ asitlerinin sentezini belirlemek için uygun değildir. Benzer şekilde, desatürasyon oranları da hafife alınabilir.

Genel sınırlamalar
Yağ asitlerini ölçmek içinD2O'nunkullanılması, fizyolojik homeostazda DNL'nin önemi hakkında önemli bilgiler sağlamış olsa da, bu metodoloji ile ilişkili bir takım sınırlamalar vardır. İlk olarak, burada özetlenen zamanlamaya dayanarak, yeni sentezlenen yağ asitlerinin menşe dokusundan tamamen emin olmak mümkün değildir. Belirli bir dokunun DNL'den yağ asitleri ürettiği ve daha sonra bunların diğer dokulara taşındığı bir senaryo hayal etmek kolaydır. D2Otedavisinden sonra yapılan ince zaman seyri deneyleri, yeni sentezlenen yağ asitleri için orijin dokusunun çözünürlüğünü artırabilir ve dokular arası kontaminasyonu azaltabilir. Temsili sonuçlar için kullanılan 3 günlük zaman noktası, hem termonötritede (akı daha düşük olduğunda) hem de oda sıcaklığında bir dizi yağ asidinde döteryum zenginleşmesini tespit etmek için tasarlanmıştır. Palmitatın birincil hedef olduğu D2O uygulamasından sonra daha kısa zaman noktaları, dokular arası yağ asidi taşınmasını en aza indirir ve bu nedenle avantajlı olabilir. Çok daha kısa zaman noktaları (örneğin, 12 saat), soğuk koşullarda fareler düşünüldüğünde ve termonötralite deneysel tasarıma dahil edilmediğinde ideal olacaktır. İkincisi, bu yöntem yeni yağ asitlerinin menşe substratı hakkında bilgi sağlamaz. Belirli durumlarda kullanılan belirli alt tabakaların tanımlanması, DNL'nin düzenleyici haritasının tam olarak anlaşılması için gerekli olan ek bir bilgi katmanı olabilir. Bu, kararlı izotoplarla etiketlenmiş substratlarla yapılabilir.

Fayda -ları
Bu metodolojinin özel bir yararı, hayvanların prosedür sırasında kısıtlanmamış (ilk D2O enjeksiyonu hariç) ve bilinçli olmaları, hayvanların doğal olarak davranması için düşük stresli bir ortamı teşvik etmesi, istenen ambulasyon ve gerekirse spesifik diyet tedavisine izin veren bir beslenme düzeni ve miktarı da dahil olmak üzere olmasıdır. D2O'nun uygulanması da oldukça kolaydır. Diğer izleyicilerin sıvı çözeltilerinin aksine (örneğin, 13C-U-glikoz),D2O, su tüketimini etkilemesi muhtemel belirgin lezzetli özelliklere sahip değildir. Kararlı izotop izleyicilerinin ötesinde, en yaygın kullanılan diğer yöntem radyoizotoplardır. Radyoizotopların potansiyel avantajı, tespit için ekipman seçimidir. Kararlı izotoplar için bir kütle spektrometresi gerekirken, radyoizotoplar daha kolay erişilebilen bir sintilasyon sayacı kullanılarak tespit edilebilir. Bununla birlikte, güvenlik ve etik sorunlar nedeniyle radyoizotoplarla ilişkili bir takım dezavantajlar vardır. Ek olarak, radyoizotop genellikle glikoz üzerindedir ve bu nedenle yalnızca DNL'deki değişiklikleri değil, glikozdan türetilen DNL'deki değişiklikleri yansıtır. Ek olarak, tek tek yağ asitlerinin sentezinin belirlenmesi mümkün değildir. D2O, izotop etiketli spesifik substratlara kıyasla tüm dokularda daha hızlı dengelenir68.

DNL, her biri gelişim, metabolizma ve hastalık durumlarını bağımsız olarak etkileyen bir dizi enzim ve transkripsiyon faktörü tarafından kontrol edilen metabolik homeostazın önemli bir bileşenidir. Bu nedenle, DNL, araştırma ve tedavi geliştirmede daha geniş bir şekilde sorgulanması gereken önemli bir metabolik yol olmaya mahkumdur. Bu protokol, DNL analizinin metabolik fenotiplemeye rutin olarak dahil edilmesinde ilk adım olarak kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgments

Değerli tartışmalar için Sanchez-Gurmaches ve Wallace laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (18CDA34080527'den JSG'ye ve 19POST34380545'ten RM'ye), NIH (JSG'ye R21OD031907), CCHMC Mütevelli Ödülü, CCHMC Pediatrik Genomik Merkezi Ödülü ve CCHMC Mendel Genomik ve Terapötik Merkezi Ödülü'nden alınan hibelerle desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen Cincinnati'deki Sindirim Hastalıkları Araştırma Çekirdek Merkezi'nin NIH P30 DK078392 tarafından desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmeyebilir. RT ve MW, UCD Ad Astra Bursu tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 mL Glass Vials Fisher Scientific 14-955-334
0.2 µm filter Olympus Plastic 25-244
26G needeled syringes BD 309597
Acetone Merck 34850
Acetonitrile Merck 900667
Blue GC screw cap with septa Agilent 5190-1599
Centrifuge Eppendorf 5424R
Chloroform Sigma 366927
Deuterium oxide Sigma 151882
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Merck B1378
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Agilent CP7419
EDTA tube Sarstedt 411395105
Ethanol Merck 51976
Hexadecenoic-d31 Acid Larodan 71-1631
Hexane Merck 34859
Methanol Merck 34860
Microcentrifuge tube Olympus Plastic 24-282
Mouse environmental chamber Caron Caron 7001-33
Potasium Chloride Fisher Bioreagents BP366-500
Potasium Phosphate MP Biomedicals 194727
SafeLock microcentrifuge tubes Eppendorf 30120086
Screw top amber GC vial Agilent 5182-0716
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Hydroxide Merck S5881
Sodium Phosphate, dibasic Fisher Bioreagents BP332-500
Sodium Sulfate Merck 239313
Sulfuric Acid Merck 258105
Vial insert Agilent 5183-2088

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. The Lancet, Diabetes Endocrinology. Childhood obesity: a growing pandemic. The Lancet. Diabetes & Endocrinology. 10 (1), 1 (2022).
  2. Gonzalez-Muniesa, P., et al. Obesity. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17034 (2017).
  3. Müller, T. D., Blüher, M., Tschöp, M. H., DiMarchi, R. D. Anti-obesity drug discovery: advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (3), 201-223 (2021).
  4. Virtue, S., Vidal-Puig, A. GTTs and ITTs in mice: simple tests, complex answers. Nature Metabolism. 3 (7), 883-886 (2021).
  5. Müller, T. D., Klingenspor, M., Tschöp, M. H. Revisiting energy expenditure: how to correct mouse metabolic rate for body mass. Nature Metabolism. 3 (9), 1134-1136 (2021).
  6. Virtue, S., Lelliott, C. J., Vidal-Puig, A. What is the most appropriate covariate in ANCOVA when analysing metabolic rate. Nature Metabolism. 3 (12), 1585 (2021).
  7. Hellerstein, M. K. De novo lipogenesis in humans: metabolic and regulatory aspects. European Journal of Clinical Nutrition. 53 Suppl 1, S53-S65 (1999).
  8. Zhao, S., et al. Dietary fructose feeds hepatic lipogenesis via microbiota-derived acetate. Nature. 579 (7800), 586-591 (2020).
  9. Wallace, M., et al. Enzyme promiscuity drives branched-chain fatty acid synthesis in adipose tissues. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1021-1031 (2018).
  10. Zhao, S., et al. ATP-citrate lyase controls a glucose-to-acetate metabolic switch. Cell Reports. 17 (4), 1037-1052 (2016).
  11. Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
  12. Zhang, Z., et al. Serine catabolism generates liver NADPH and supports hepatic lipogenesis. Nature Metabolism. 3 (12), 1608-1620 (2021).
  13. Chirala, S. S., et al. Fatty acid synthesis is essential in embryonic development: fatty acid synthase null mutants and most of the heterozygotes die in utero. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (11), 6358-6363 (2003).
  14. Icard, P., et al. ATP citrate lyase: A central metabolic enzyme in cancer. Cancer Letters. 471, 125-134 (2020).
  15. Fhu, C. W., Ali, A. Fatty acid synthase: an emerging target in cancer. Molecules. 25 (17), 3935 (2020).
  16. Lawitz, E. J., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibitor GS-0976 for 12 weeks reduces hepatic de novo lipogenesis and steatosis in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 16 (12), 1983e3-1991e3 (2018).
  17. Smith, G. I., et al. Insulin resistance drives hepatic de novo lipogenesis in nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of Clinical Investigation. 130 (3), 1453-1460 (2020).
  18. Imamura, F., et al. Fatty acids in the de novo lipogenesis pathway and incidence of type 2 diabetes: A pooled analysis of prospective cohort studies. PLoS Medicine. 17 (6), e1003102 (2020).
  19. Lai, H. T. M., et al. Serial plasma phospholipid fatty acids in the de novo lipogenesis pathway and total mortality, cause-specific mortality, and cardiovascular diseases in the cardiovascular health study. Journal of the American Heart Association. 8 (22), e012881 (2019).
  20. Ference, B. A., et al. Mendelian randomization study of ACLY and cardiovascular disease. The New England Journal of Medicine. 380 (11), 1033-1042 (2019).
  21. Herman, M. A., et al. A novel ChREBP isoform in adipose tissue regulates systemic glucose metabolism. Nature. 484 (7394), 333-338 (2012).
  22. Sanchez-Gurmaches, J., et al. Brown fat AKT2 Is a cold-induced kinase that stimulates ChREBP-mediated de novo lipogenesis to optimize fuel storage and thermogenesis. Cell Metabolism. 27 (1), 195e6-209e6 (2018).
  23. Wang, X., et al. Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter. II. Purification and characterization. The Journal of Biological Chemistry. 268 (19), 14497-14504 (1993).
  24. Briggs, M. R., Yokoyama, C., Wang, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter. I. Identification of the protein and delineation of its target nucleotide sequence. The Journal of Biological Chemistry. 268 (19), 14490-14496 (1993).
  25. Yokoyama, C., et al. SREBP-1, a basic-helix-loop-helix-leucine zipper protein that controls transcription of the low density lipoprotein receptor gene. Cell. 75 (1), 187-197 (1993).
  26. Chen, G., Liang, G., Ou, J., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Central role for liver X receptor in insulin-mediated activation of Srebp-1c transcription and stimulation of fatty acid synthesis in liver. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11245-11250 (2004).
  27. Denechaud, P. D., et al. ChREBP, but not LXRs, is required for the induction of glucose-regulated genes in mouse liver. The Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 956-964 (2008).
  28. Crewe, C., et al. SREBP-regulated adipocyte lipogenesis is dependent on substrate availability and redox modulation of mTORC1. JCI Insight. 5 (15), e129397 (2019).
  29. Batchuluun, B., Pinkosky, S. L., Steinberg, G. R. Lipogenesis inhibitors: therapeutic opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (4), 283-305 (2022).
  30. Wallace, M., Metallo, C. M. Tracing insights into de novo lipogenesis in liver and adipose tissues. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 65-71 (2020).
  31. Lee, W. N., et al. In vivo measurement of fatty acids and cholesterol synthesis using D2O and mass isotopomer analysis. The American Journal of Physiology. 266 (5 Pt 1), E699-E708 (1994).
  32. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, 143 (2016).
  33. Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
  34. Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. Journal of Mass Spectrometry. 31 (3), 255-262 (1996).
  35. Midani, F. S., Wynn, M. L., Schnell, S. The importance of accurately correcting for the natural abundance of stable isotopes. Analytical Biochemistry. 520, 27-43 (2017).
  36. Trefely, S., Ashwell, P., Snyder, N. W. FluxFix: automatic isotopologue normalization for metabolic tracer analysis. BMC Bioinformatics. 17 (1), 485 (2016).
  37. Jeong, H., et al. Correcting for naturally occurring mass isotopologue abundances in stable-isotope tracing experiments with PolyMID. Metabolites. 11 (5), 310 (2021).
  38. Millard, P., et al. IsoCor: isotope correction for high-resolution MS labeling experiments. Bioinformatics. 35 (21), 4484-4487 (2019).
  39. Brunengraber, D. Z., et al. Influence of diet on the modeling of adipose tissue triglycerides during growth. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolsim. 285 (4), E917-E925 (2003).
  40. Svensson, R. U., et al. Inhibition of acetyl-CoA carboxylase suppresses fatty acid synthesis and tumor growth of non-small-cell lung cancer in preclinical models. Nature Medicine. 22 (10), 1108-1119 (2016).
  41. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis: a technique for measuring biosynthesis and turnover of polymers. The American Journal of Physiology. 263 (5 Pt 1), E988-E1001 (1992).
  42. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic, and experimental considerations. The American Journal of Physiology. 276 (6), E1146-E1170 (1999).
  43. Kelleher, J. K., Masterson, T. M. Model equations for condensation biosynthesis using stable isotopes and radioisotopes. The American Journal of Physiology. 262 (1 Pt 1), E118-E125 (1992).
  44. Kelleher, J. K., Nickol, G. B. Isotopomer spectral analysis: utilizing nonlinear models in isotopic flux studies. Methods in Enzymology. 561, 303-330 (2015).
  45. Argus, J. P., et al. Development and application of FASA, a model for quantifying fatty acid metabolism using stable isotope labeling. Cell Reports. 25 (10), 2919.e8-2934.e8 (2018).
  46. Guilherme, A., et al. Control of adipocyte thermogenesis and lipogenesis through β3-adrenergic and thyroid hormone signal integration. Cell Reports. 31 (5), 107598 (2020).
  47. Guilherme, A., et al. Neuronal modulation of brown adipose activity through perturbation of white adipocyte lipogenesis. Molecular Metabolism. 16, 116-125 (2018).
  48. Guilherme, A., et al. Adipocyte lipid synthesis coupled to neuronal control of thermogenic programming. Molecular Metabolism. 6 (8), 781-796 (2017).
  49. Lodhi, I. J., et al. Inhibiting adipose tissue lipogenesis reprograms thermogenesis and PPARgamma activation to decrease diet-induced obesity. Cell Metabolism. 16 (2), 189-201 (2012).
  50. McCormack, J. G., Denton, R. M. Evidence that fatty acid synthesis in the interscapular brown adipose tissue of cold-adapted rats is increased in vivo by insulin by mechanisms involving parallel activation of pyruvate dehydrogenase and acetyl-coenzyme A carboxylase. The Biochemistry Journal. 166 (3), 627-630 (1977).
  51. Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Letters. 104 (1), 13-16 (1979).
  52. Negron, S. G., Ercan-Sencicek, A. G., Freed, J., Walters, M., Lin, Z. Both proliferation and lipogenesis of brown adipocytes contribute to postnatal brown adipose tissue growth in mice. Science Reports. 10 (1), 20335 (2020).
  53. Schlein, C., et al. Endogenous fatty acid synthesis drives brown adipose tissue involution. Cell Reports. 34 (2), 108624 (2021).
  54. Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. Journal of Lipid Research. 55 (11), 2276-2286 (2014).
  55. Adlanmerini, M., et al. Circadian lipid synthesis in brown fat maintains murine body temperature during chronic cold. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (37), 18691-18699 (2019).
  56. Yu, X. X., Lewin, D. A., Forrest, W., Adams, S. H. Cold elicits the simultaneous induction of fatty acid synthesis and beta-oxidation in murine brown adipose tissue: prediction from differential gene expression and confirmation in vivo. FASEB Journal. 16 (2), 155-168 (2002).
  57. Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 77 (2), 79-88 (1999).
  58. Diraison, F., Pachiaudi, C., Beylot, M. Measuring lipogenesis and cholesterol synthesis in humans with deuterated water: use of simple gas chromatographic/mass spectrometric techniques. Journal of Mass Spectrometry. 32 (1), 81-86 (1997).
  59. Yang, D., et al. Assay of low deuterium enrichment of water by isotopic exchange with [U-13C3]acetone and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 258 (2), 315-321 (1998).
  60. Fu, X., et al. Measurement of lipogenic flux by deuterium resolved mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 3756 (2021).
  61. Shah, V., Herath, K., Previs, S. F., Hubbard, B. K., Roddy, T. P. Headspace analyses of acetone: a rapid method for measuring the 2H-labeling of water. Analytical Biochemistry. 404 (2), 235-237 (2010).
  62. Argus, J. P., Yu, A. K., Wang, E. S., Williams, K. J., Bensinger, S. J. An optimized method for measuring fatty acids and cholesterol in stable isotope-labeled cells. Journal of Lipid Research. 58 (2), 460-468 (2017).
  63. Belew, G. D., Jones, J. G. De novo lipogenesis in non-alcoholic fatty liver disease: Quantification with stable isotope tracers. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), e13733 (2022).
  64. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  65. Belew, G. D., et al. Transfer of glucose hydrogens via acetyl-CoA, malonyl-CoA, and NADPH to fatty acids during de novo lipogenesis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2050-2056 (2019).
  66. Diraison, F., Pachiaudi, C., Beylot, M. In vivo measurement of plasma cholesterol and fatty acid synthesis with deuterated water: determination of the average number of deuterium atoms incorporated. Metabolism. 45 (7), 817-821 (1996).
  67. Ajie, H. O., et al. In vivo study of the biosynthesis of long-chain fatty acids using deuterated water. The American Journal of Physiology. 269 (2 Pt 1), E247-E252 (1995).
  68. Schloerb, P. R., Friis-Hansen, B. J., Edelman, I. S., Solomon, A. K., Moore, F. D. The measurement of total body water in the human subject by deuterium oxide dilution; with a consideration of the dynamics of deuterium distribution. The Journal of Clinical Investigation. 29 (10), 1296-1310 (1950).

Tags

Biyoloji Sayı 195 Kahverengi Yağ Dokusu Döteryum Oksit Metabolik Yolak Fonksiyonel Roller Tüm Vücut Metabolik Homeostazı Fizyolojik Süreçler Patolojik Süreçler Glukoz İmhası Fonksiyonel Değerlendirme Ayrıntılı Protokoller Kantitatif Yöntem Gaz Kromatografisi Kütle Spektrometresi (GCMS) Toplam Yağ Asidi De Novo Sentezi Karbon Kaynağı Örnek Hazırlama Downstream Hesaplamaları Kahverengi Yağ Metabolik Homeostaz
Kahverengi Yağ <em>Dokusunda De Novo</em> Yağ Asidi Sentezinin Döteryum Oksit Kullanılarak Kantitatif Tayini
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Turner, R., Mukherjee, R., Wallace,… More

Turner, R., Mukherjee, R., Wallace, M., Sanchez-Gurmaches, J. Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide. J. Vis. Exp. (195), e64219, doi:10.3791/64219 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter