Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantitativ bestemmelse af de novo fedtsyresyntese i brunt fedtvæv under anvendelse af deuteriumoxid

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64219
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2,3,4
1UCD Conway Institute and UCD Institute of Food and Health, School of Agriculture and Food Science, University College Dublin, 2Division of Endocrinology, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 3Division of Developmental Biology, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en billig kvantitativ metode, der anvender deuteriumoxid og gaskromatografi massespektrometri (GCMS) til analyse af total fedtsyre de novo lipogenese i brunt fedtvæv in vivo.

Abstract

Fedtsyresyntese er en kompleks og meget energikrævende metabolisk vej med vigtige funktionelle roller i styringen af helkropsmetabolisk homeostase og andre fysiologiske og patologiske processer. I modsætning til andre vigtige metaboliske veje, såsom glukosebortskaffelse, vurderes fedtsyresyntese ikke rutinemæssigt funktionelt, hvilket fører til ufuldstændige fortolkninger af metabolisk status. Derudover mangler der offentligt tilgængelige detaljerede protokoller, der er egnede til nytilkomne på området. Her beskriver vi en billig kvantitativ metode, der anvender deuteriumoxid og gaskromatografi massespektrometri (GCMS) til analyse af total fedtsyre de novo-syntese i brunt fedtvæv in vivo. Denne metode måler syntesen af produkterne af fedtsyresyntase uafhængigt af en kulstofkilde, og den er potentielt nyttig for stort set ethvert væv, i enhver musemodel og under enhver ekstern forstyrrelse. Der gives nærmere oplysninger om prøveforberedelsen til GCMS og downstream-beregninger. Vi fokuserer på analysen af brunt fedt på grund af dets høje niveauer af de novo fedtsyresyntese og kritiske roller i opretholdelsen af metabolisk homeostase.

Introduction

Fedme og tilknyttede metaboliske sygdomme er en pandemi, der bringer nuværende og fremtidige generationeri fare 1,2. Almindeligvis forenklet som følge af ubalancen mellem energiindtag og udgifter påvirker den metaboliske dysregulering forbundet med fedme et stort antal metaboliske veje, der styres af miljømæssige og endogene faktorer3. Imidlertid testes kun få veje rutinemæssigt i dyremodeller for metabolisk dysregulering.

Som et eksempel måles glukosebortskaffelse rutinemæssigt ved glukose- og insulintolerancetest, sandsynligvis på grund af enkelheden ved at bruge bærbare glukosemonitorer4. Helkropsglukose- og lipidoxidationsrelative hastigheder estimeres også rutinemæssigt baseret på respirationsudvekslingsforholdet fra indirekte kalorimetriassays 5,6. Imidlertid vurderes størstedelen af alle andre aspekter af stofskiftet ikke rutinemæssigt funktionelt. Dette fører til ufuldstændige fortolkninger af metabolisk status og savnede terapeutiske muligheder. En af de vigtigste sådanne veje er de novo lipogenese.

De novo lipogenese (DNL) er den proces, hvorved nye fedtsyrer genereres fra prækursorer. Glukose anses for at være den vigtigste forløber, der bidrager til DNL7 i hele kroppen, men andre forløbere, såsom acetat, fruktose, lactat og forgrenede aminosyrer, har vist sig at være relevante kulstofkilder på en rumlig og tilstandsafhængig måde 8,9,10,11,12. DNL er en vigtig bidragyder til metabolisk homeostase og er afgørende for normal udvikling13. Derudover har ændringer i DNL været forbundet med kræft 14,15 og metabolisk 16,17,18 og hjerte-kar-sygdomme 19,20.

DNL-vejen består af de centrale enzymatiske komponenter ATP-citratlyase (ACLY), acetyl-CoA-carboxylase (ACC1/2) og fedtsyresyntase (FAS), der primært producerer palmitat, en 16-carbonmættet fedtsyre. Imidlertid kan ulige kæde og forgrenede fedtsyrer også produceres ved lavere hastigheder9. Elongasser og desaturaser modificerer yderligere disse fedtsyrer og skaber en bred vifte af fedtsyrer, der er nyttige til en række funktioner (f.eks. Langsigtet energilagring og manipulation af membranfluiditet).

Ekspressionen af DNL enzymatiske maskiner styres af et kort antal transkriptionsfaktorer. De mest velbeskrevne til dato omfatter sterol regulatorisk element bindende protein (SREBP) familie, kulhydrat respons element bindende protein (ChREBP), og lever X-receptor (LXR) 21,22,23,24,25,26. På trods af en tilsyneladende overlapning i deres funktioner er individuelle regler baseret på celletypedominans og fysiologiske eller patologiske tilstande blevet rapporteret21,22,27,28.

Bemærkelsesværdigt nok er en række hæmmere for udvalgte trin i DNL-vejen blevet godkendt til klinisk brug eller er i de prækliniske eller kliniske udviklingsstadier for en række sygdomme, herunder fedme, ikke-alkoholisk fedtleversygdom / ikke-alkoholisk steatohepatitis (NAFLD / NASH) og hjerte-kar-sygdom29. Disse bestræbelser fremhæver DNL's relevans for sundhed og sygdom.

I de senere år er anvendelsen af metoder til kvantitativ vurdering af de novo fedtsyresyntese steget30. Den mest almindelige metode til vurdering af dette er brugen af tungt mærket vand (D2O), hvor det tungt mærkede brint inkorporeres i acylkæder under syntese både direkte og indirekte via deuteriumudveksling med hydrogenerne fra DNL-substraterne NAPDH, acetyl-CoA og malonyl-CoA. Selvom denne tilgang vinder popularitet, mangler der offentligt tilgængelige detaljerede protokoller, der passer til nyankomne på området. Her skitserer vi en metode til kvantitativ vurdering af de novo-syntesen af produkter af FAS ved hjælp af D2O og gaskromatografi massespektrometri (GCMS) med beregninger, der tidligere er udviklet af Lee et al.31. Denne metode måler de novo fedtsyresyntese uafhængigt af en kulstofkilde, og den er potentielt nyttig for stort set ethvert væv, i enhver musemodel og under enhver ekstern forstyrrelse. Her fokuserer vi på analysen af brunt fedtvæv (BAT) på grund af dets høje niveauer af DNL og kritiske roller i opretholdelsen af metabolisk homeostase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee på Cincinnati Children's Hospital Medical Center.

1. Fremstilling af D2O

BEMÆRK: For at undgå eksperimentel variation skal du forberede tilstrækkelig opløsning/drikkevand til alle mus i løbet af eksperimentet.

  1. Til intraperitoneal injektion: generer 0,9% w / v saltvand D 2 O ved at opløse 9 g NaCl pr. Liter D 2 O.Filtrer gennem et ikke-pyrogent0,2μm filter for at sterilisere.
  2. Til drikkevand D 2 O-vand: generer 8% v/v D2 O-beriget vand, der skal bruges som drikkevand, ved at blande 80 ml D2O pr. 920 ml almindeligt drikkevand. Regelmæssigt drikkevand kan fås fra museanlægget. Filtrer gennem et ikke-pyrogent 0,2 μm filter for at sterilisere.

2. Modulering af BAT-aktivitet ved temperaturakklimatisering

  1. Adskil musene, så der er to mus pr. bur 2 uger før starten af temperaturakklimatiseringen. Skift vandforsyningen til vandflasker, så musene kan tilpasse sig og vedligeholde alle burene ved 22 °C.
  2. Klargør musens miljøkamre 1 uge før temperaturakklimatiseringen påbegyndes ved at indstille de passende temperaturer: 30 °C for termoneutralitet, 22 °C for stuetemperatur og 18 °C for kuldeeksponering.
  3. I starten af temperaturakklimatiseringen skal du udskifte burene med nye uden miljøberigelse (for at undgå reden). Flyt burene til deres respektive temperaturer.
    BEMÆRK: Bure tildelt termoneutralitet forbliver ved 30 °C i 4 uger. Bure tildelt stuetemperatur forbliver på 22 °C i 4 uger. Bure, der udsættes for kulde, bliver gradvist koldere på ugentlig plan: 18 °C i den første uge, 14 °C i den anden uge, 10 °C i den tredje uge og 6 °C i den fjerde uge.
  4. Skift snavsede bure ugentligt for alle forhold. Udskift desuden mad- og vandflasker med nye, der er fortilpasset ved den passende temperatur i mindst 24 timer.
    BEMÆRK: Vær opmærksom på de fodermængder, der tilsættes hver uge, især for mus i kulden, da de vil indtage en betydeligt større mængde mad sammenlignet med normale forhold. Giv mad ad libitum.

3. Administration af D2O

  1. Hvert dyr injiceres med 0,9 % w/v saltvand-D2O ved 35 μL/g legemsvægt 12 timer-3 dage før vævsopsamling via intraperitoneal injektion ved hjælp af en 1 ml sprøjte og 26 G kanyle.
    BEMÆRK: Se diskussionsafsnittet for at få flere oplysninger om valg af et passende mærkningstidspunkt.
  2. Skift vandflaskerne ud med flasker, der indeholder 8% v/v D2O-beriget drikkevand.

4. Opsamling, behandling og opbevaring af plasma og væv

  1. Ved afslutningen af eksperimentet ofres musene ved hjælp af godkendte metoder (f.eks. Overdosis af kuldioxid efterfulgt af cervikal dislokation).
    1. Brug varme / kølepuder eller andre metoder til at undgå pludselige temperaturændringer før eutanasi, der kan påvirke resultaterne. Aflive musene efter godkendte metoder. Fortsæt straks til blod- og vævsindsamling.
  2. Opsaml blod gennem hjertepunktur ved hjælp af en 26 G nål og opbevar i et ethylendiamintetraeddikesyreblodopsamlingsrør. Hold blodet på is indtil videre behandling.
  3. Skær huden op langs den midterste linje af musens bagside fra det nedre område af brysthulen op til det øverste område af nakken, mens du trækker huden op for at undgå at påvirke væv under huden. Den interscapulære BAT er placeret mellem skulderbladene under et tyndt lag hvidt fedtvæv, og det består af to pyramideformede lapper.
    1. Rens vævet ved vask i iskold fosfatbufret saltvand (PBS). Dup på et papirhåndklæde for at fjerne overskydende væske, veje på en analytisk skala og samle i et mikrorør.
    2. Straks flash fryse vævet ved hjælp af flydende nitrogen. Andre BAT-depoter kan også afhentes.
  4. Blodprøverne centrifugeres ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Efter centrifugering opsamles plasmaet forsigtigt uden at forstyrre den røde blodpille. Overfør det til et nyt iskoldt mikrorør og lynfrysning i flydende nitrogen.
  5. Opbevar prøver af brunt fedt og plasma ved -80 °C indtil brug.

5. Lipidekstraktion fra fedtvæv

  1. Før ekstraktionen påbegyndes
    1. Forbered en 1 mM opløsning af hexadecensyre-d31 syre i methanol i et hætteglas. Dette vil tjene som den interne fedtsyrestandard.
    2. Den nødvendige mængde chloroform (CHCl3) og methanol (CH3OH) afkølesi en fryser til -80 °C eller på tøris.
      BEMÆRK: Antioxidanten di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) kan tilsættes CHCl3 i en koncentration på 0,01% w/v (2,5 mg/25 ml) for at forhindre oxidation af dobbeltbindingerne i umættede fedtsyrer.
    3. Præetiketterede mikrocentrifugeglas til hver vævsprøve og et ekstra glas til blindprøveekstraktion.
      FORSIGTIG:CH3OHog CHCl3 er meget flygtige og giftige ved indånding. Må kun anvendes i stinkskabe.
      BEMÆRK: Forskellige mærker af mikrocentrifugerør har forskellige niveauer af baggrundspalmitat og muligheder med hensyn til at forhindre lækage af opløsningsmidler. Vi anbefaler, at en række rør testes først for at sikre, at lækage af opløsningsmidler forhindres, og at rørene har minimale niveauer af kontaminerende palmitat. Se Yao et al.32 for yderligere diskussion.
  2. Tag prøverne ud af fryseren og læg dem på tøris.
  3. Det formærkede mikrocentrifugeglas anbringes på en analysevægt, og vægten taraføres. Læg pincet og et skalpel-/stålbarberblad på tøris i 10-20 sek. for at køle af.
    1. Brug pincetten til at tage den frosne vævsprøve ud af røret og læg den på en plastvejebåd. Vejebåden kan placeres på en flad blok tøris eller en anden forkølet overflade.
    2. Brug skalpellen eller stålbarberbladet til at dissekere en lille del af vævet, svarende til 5-15 mg i vægt. Anbring i mikrocentrifugerøret og registrer den nøjagtige vægt. Gentag for hver prøve. Prøver kan opbevares i fryseren på dette tidspunkt eller kan avancerede til nedenstående trin for lipidekstraktion.
      BEMÆRK: Sørg for, at skalpellen rengøres korrekt med 70% ethanol mellem prøverne, og at der anvendes en frisk vejebåd mellem hver prøve.
  4. Der tilsættes 1 μL/mg 10 mM hexadecenoic-d 31(C16:0-d31)syre til hver prøve.
    FORSIGTIG: Følgende trin (5.4 til 5.8) skal udføres under en stinkhætte på grund af risikoen for indånding af opløsningsmidlerne.
  5. Der tilsættes 250 μLCH3OH, 250 μL H2O og 500 μL CHCl3 til hver prøve med tre 5 mm perler af rustfrit stål. Anbring rørene i en forkølet blok på et slibeværk, og bland prøverne med en vibrationsfrekvens på 25 Hz i 5 minutter, eller følg de retningslinjer, der anbefales af producenten for vævsprøver. Fjern perlerne ved hjælp af en magnet.
  6. Prøverne centrifugeres ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    BEMÆRK: Efter centrifugering skal der observeres en klar bifasisk adskillelse med den øvre vandige fase indeholdende polære metabolitter og den nedre organiske fase indeholdende lipider og fedtsyrer. Hvis der ikke ses nogen adskillelse, tilsættes 250 μLH2O, og hvirvel- og centrifugeringstrinnene gentages.
  7. Brug en mikropipette til at udtage et fast volumen fra den nederste fase af hver prøve i tilsvarende mærkede mikrocentrifugeglas.
  8. Der tilsættes 500 μL CHCl3 til den resterende prøve, og trin 5.6-5.7 gentages.
  9. Prøverne anbringes under nitrogengas eller i et CHCl3-resistent nedkølet centrifugalvakuum ved 4 °C, indtil de er helt tørre. Tørrede prøver kan opbevares ved -20 °C, indtil de er klar til derivatisering.
    BEMÆRK: Det øverste lag af hver prøve kan også indsamles på dette tidspunkt og tørres som i trin 5.9 for at analysere polære metabolitter.

6. Fremstilling af fedtsyremethylestere (FAME'er) og GCMS-analyse

  1. Syrekatalyseret esterificering og transesterificering til fremstilling af FAME'er
    FORSIGTIG: Følgende trin skal udføres under en damphætte på grund af opløsningsmidlernes indåndingsrisiko.
    1. Hvis prøverne har været opbevaret i fryser, tørres de under nitrogen i 5 minutter for at sikre, at der ikke er vand til stede.
    2. Ved hjælp af opløsningsmidler af MS-kvalitet pipetteres 98 ml vandfriCH3OHi en glasmedieflaske. Tilsæt langsomt 2 ml vandfri svovlsyre i damphætten for at gøre 2%H2SO4 iCH3OH. Bland ved at hvirvle den lukkede flaske.
    3. Der tilsættes 500 μL 2%H2SO4 iCH3OH-opløsningtil hver prøve og hvirvel kort.
    4. Prøverne inkuberes på en varmeblok ved 50 °C i 2 timer.
    5. Prøverne fjernes fra varmeblokken, og der tilsættes 100 μL mættet NaCl-opløsning og 500 μL hexan til hver prøve.
    6. Vortex prøverne kraftigt ved stuetemperatur i 1 min. Lad prøverne sidde i 1 min; To faser skal være tydelige efter dette.
    7. Den øverste fase samles i et frisk mikrocentrifugeglas (se bemærkningen i punkt 5.1.3 for passende valg af mikrocentrifugeglas).
    8. For at maksimere udbyttet gentages trin 6.1.5-6.1.7, idet den anden prøve samles i de samme mærkede glas.
    9. Prøverne tørres ved stuetemperatur under nitrogengas.
    10. Resuspender prøverne i 20 μL/mg hexan i forhold til den oprindelige vævsvægt, og overfør straks til GC-hætteglas med en glasindsats.
      BEMÆRK: Arbejd hurtigt, mens du overfører prøver for at minimere fordampning.
  2. GCMS-analyse
    1. For at bestemme overflod af FAME-isotopologer injiceres prøverne på et enkelt quadrupolgaskromatografimassespektrometer (GCMS).
      BEMÆRK: Mens mange kolonnetyper kan bruges til at detektere palmitat, blev følgende temperaturprogram etableret for en GCMS-kolonne, der er udviklet til adskillelse af fedtsyre cis/trans-isomerer, som beskrevet i materialetabellen. Denne søjle har en længde på 50 m med en indvendig diameter på 0,25 mm.
    2. Der indsprøjtes 1 μL prøve i et split/splitless indtag ved en indgangstemperatur på 270 °C med helium som bæregas, der flyder med 1 ml/min. Brug en splitfri injektion til fedtsyrer med lavt rigelige indhold med et samlet flow på 19 ml / min, en septumrensning på 3 ml / min og et rensningsflow til delt udluftning på 15 ml / min ved 0,75 min. Brug et splitforhold på 10: 1-40: 1 for fedtsyrer med højt rigelige fedtsyrer såsom palmitat og oleat.
    3. Brug følgende ovnparametre: en starttemperatur på 80 °C; øges med trin på 20 °C/min til 170 °C øges med trin på 1 °C/min til 204 °C øges med trin på 20 °C/min til 250 °C og hold derefter ved 250 °C i 10 minutter.
    4. Brug følgende masseselektive detektorparametre (MSD): en elektronpåvirkningsioniseringstilstand på 70 eV og scan over området 50-400 m/z med en scanningshastighed på 1.562 (u/s) og en frekvens på 4,1 scanninger/s. Brug en overførselsledning ved 280 °C, en ionkilde ved 230 °C og en quadrupol ved 150 °C.
      BEMÆRK: Andre kolonner kan bruges, men temperaturprogrammet varierer.
    5. Prøvesekvens: Randomiser prøverækkefølgen for injektion og injicer mindst to eller tre hexanblindprøver i begyndelsen af sekvensen, efter hver femte prøve i sekvensen og to eller tre i slutningen af sekvensen.
    6. Brug instrumentspecifik software eller gratis software med åben adgang, såsom Metabolite-Detector33, til at integrere ionerne i tabel 1 for hver fedtsyremethylester.
      BEMÆRK: Vi har skitseret ioner, der dækker M1-M5 isotopologer i tabel 1 , som vi har fundet dækker mængden af deuteriuminkorporering med dette mærkningsvindue. Det kan dog være nødvendigt at udvide dette, hvis de novo-fluxen er betydeligt højere, og/eller der anvendes en længere mærkningstid.
    7. Brug mængden af hver integreret ion til at generere en masseisotopomerfordeling, hvor ionintensiteterne kan konverteres til fraktioneret tæthed, så summen af masseisotopomerfordelingen er lig med en. Se eksempelregnearket i den supplerende fil.
      BEMÆRK: For nøjagtigt at bestemme deuteriuminkorporering skal korrektion af den naturlige isotopoverflod derefter anvendes for at tillade tilstedeværelsen af naturligt forekommende isotoper såsom 13C, 15N og 2H. Dette udføres ved at anvende en korrektionsmatrix som beskrevet af Fernandez et al.34,35 og kan ikke udføres ved at trække MID for en umærket målt metabolit fra en mærket metabolit. I praksis anbefaler vi brugen af frit tilgængelig software såsom fluxfix 36, polyMID37 eller IsoCor38 til at omdanne rådata til fraktionerede MID'er, og vi har leveret formlen for isotopkorrektion for methylesterprodukterne af FAS i tabel 1.
    8. For at bestemme mængden af palmitat til stede, bruge følgende formel:
      Equation 1 
      hvor iontal refererer til summen af alle palmitatisotopologer integreret i tabel 1, og C16:0-d 31 henviser til den interne standard hexadecenoic-d31. Den interne standard danner en separat top til den for det endogene palmitat. Den relative forekomst af andre fedtsyrer kan også bestemmes, men interne standarder for fedtsyrespecifikke isotoper (med masseforskydninger større end dem, der observeres ved inkorporering af D2O) eller eksterne standardkurver skal muligvis anvendes til fuld kvantificering. Brug den blindprøve, der ekstraheres, til at bestemme mængden af baggrundspalmitat og trække dette fra den endelige vævsværdi.
    9. Palmitats molære berigelse (ME) beregnes ved hjælp af følgende ligning:
      Equation 2
      hvor Mi er den normaliserede, fraktionerede overflod af en palmitatisotopolog, og n er antallet af mulige palmitatisotopologer. For eksempel er ME af et palmitatmolekyle med følgende fraktioneret fordeling, M1 = 0,25, M2 = 0,08, M3 = 0,02: (0,025*1) + (0,08*2) + (0,02*3) = 0,245 (Se supplerende fil).

7. Deuteriumacetoneudveksling af plasmaprøver til bestemmelse af kropsvandberigelse

  1. Reaktion
    1. Forbered 10 standarder for deuterium i vand, der spænder fra 0-9% v / v.
    2. Der fremstilles en 5 % v/v acetone/acetonitrilopløsning, der giver mulighed for 4 μL pr. prøve, inklusive standarderne fra trin 5.1.1.
    3. I mærkede, sikre mikrocentrifugeglas kombineres 10 μL af hver plasmaprøve eller standard, 4 μL 10 M NaOH og 4 μL 5 % acetone/acetonitril. Udfør dette i tre eksemplarer for hver prøve.
    4. Prøverne blandes forsigtigt ved pipettering. Lad prøverne inkubere ved stuetemperatur natten over.
  2. Ekstraktion
    1. Efter inkubation tilsættes 450-550 mgNa2SO4 til hver prøve.
    2. I damphætten tilsættes 600 μL CHCl3 til hvert rør og hvirvler kraftigt i 15 s.
    3. Prøverne centrifugeres ved 300 x g i 2 min.
    4. Under en stinkhætte overføres 80 μL alikvoter af supernatanten fra hver prøve til mærkede GCMS-hætteglas af glas med glasindsatser og hætte tæt.
  3. GCMS-analyse
    1. Adskil prøver på en søjle (30 m, 0,25 mm i.d, Agilent DB-35MS) og analyser på det vedhæftede massespektrometer.
      1. Der indsprøjtes 1 μL prøve i et split/splitless indtag med et splitforhold på 40:1, et heliumflow på 1 ml/min og en indgangstemperatur på 270 °C.
      2. Brug følgende ovnparametre: en starttemperatur på 60 °C, stigning med trin på 20 °C/min til 100 °C, stigning med trin på 50 °C/min til 220 °C, og hold den derefter ved 220 °C i 1 min.
      3. Brug følgende masseselektive detektorparametre (MSD): elektronpåvirkningsioniseringstilstand ved 70 eV med selektiv ionovervågning på 58 og 59 m/z. Brug en overførselsledning ved 280 °C, en ionkilde ved 230 °C og en quadrupol ved 150 °C.
        BEMÆRK: Andre kolonner med lav blødning, bundet, tværbundet midtpolaritet kan bruges, men temperaturprogrammet varierer.
    2. Indstil væskeprøveudtagermetoden til at begynde med en CHCl 3-vask og derefter en randomiseret sekvens af prøverne, herunder yderligere CHCl3-vasketrin for hver sjette prøve.
      BEMÆRK: Hvis acetone anvendes som nålevask til autosampleren, udskiftes med CHCl 3 eller hexan, og der injiceres flere tomme CHCl3-prøver, indtil en kontaminerende acetonetop ikke længere er tydelig i kromatogrammet.
    3. Ved hjælp af denne metode elueres en acetonetop omkring 1,25 min. Dataene integreres, og den fraktionelle mængde acetoneberigelse beregnes efter trin 6.2.6-6.2.7 med en justering for at analysere toppe, der indeholder et m/z-forhold på 58-60 som angivet i tabel 1.
    4. Brug standarderne til at generere en standardkurve til bestemmelse af procentdelen af kropsvandsberigelse (p) af testprøverne baseret på fraktioneret berigelse af acetone.

8. In vivo de novo lipogenese beregninger

  1. Beregn fraktionen af nyligt syntetiserede fedtsyrer (FNS), der er direkte produkter af FAS (dvs. palmitat, ulige kædede fedtsyrer og mmBCFA'er) i hver prøve med følgende ligning:
    Equation 3
    hvor ME er den gennemsnitlige molære berigelse af et palmitatmolekyle (trin 6.2.9), p er deuteriumberigelsen i vand fra den tilsvarende plasmaprøve (trin 7.3.4), og N er antallet af udskiftelige hydrogenatomer på palmitat, hvor et deuterium kan inkorporeres.
  2. Bestem N ved hjælp af nedenstående ligning, som blev etableret af Lee et al.31:
    Equation 4
  3. Bestem den molære mængde af nyligt syntetiserede fedtsyrer (MNS) ved:
    MNS = FNS x total fedtsyremængde (nmol/mg væv).
    BEMÆRK: For eksempel, hvis der opnås en palmitat molær berigelse (ME) på 0,245, en deuteriumberigelse i kropsvand (p) på 0,045 og et beregnet N-tal på 22, er fraktioneret syntese af palmitat 0,247. Hvis mængden af palmitat til stede i vævet er 2 mmol / mg, så mmol af nyligt syntetiseret palmitat er 0,494 mmol / mg (se supplerende fil).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Baseret på D 2 O-doseringen beskrevet i trin 1 finder vi typisk, at kropsvand beriges i området2,5% til 6%, og at et baselineniveau for deuteriumberigelse i kropsvand hurtigt opnås på 1 time og opretholdes i undersøgelsens varighed via 8% beriget drikkevand (figur 1). Kontinuerlig steady state kropsvandberigelse er en antagelse af de beregninger, der anvendes i trin 6, og derfor anbefaler vi eksperimentel validering af kinetikken for kropsvandsberigelse i nye eksperimentelle modeller.

Vi har fundet ud af, at mængden af de novo-syntetiserede fedtsyrer øges ved stuetemperatur i forhold til dem ved termoneutralitet i BAT (figur 2). Masseisotopfordelingen af palmitat i BAT fra mus ved termoneutralitet og stuetemperatur efter 3 dages administration af D2O viser en højere M1 og M2 deuteriumberigelse fundet ved stuetemperatur (figur 2A). Denne koldere temperaturberigelse sker ikke kun i palmitat, men også i en bred vifte af fedtsyrer i BAT (figur 2B). Den samlede palmitatoverflod øges også i BAT hos mus ved stuetemperatur, og ved at kombinere den fraktionerede syntesehastighed med de samlede palmitatniveauer fandt vi, at den samlede palmitatsyntese blev øget hos mus ved stuetemperatur (figur 2C, D). Især plasma total fedtsyreberigelse følger ikke den samme tendens som BAT, men i stedet øges fedtsyreberigelsen med termoneutralitet (figur 2E). Dekonvoluerende potentiel optagelse fra endogen syntese er ikke mulig med en D2O-tilgang med et enkelt tidspunkt, som beskrevet her, men disse modsatrettede tendenser indikerer, at fedtsyreberigelsesmønsteret i BAT ikke drives af fedtsyreoptagelse.

Figure 1
Figur 1: Procentdel af D 2 O-berigelse i plasma hos mus over flere tidspunkter efter injektion med 0,035 ml/g legemsvægt 0,9% NaCl D 2 O og erstatning af drikkevandmed 8% D2O-beriget vand. Søjlediagrammer repræsenterer middelværdien ± SD. n = 9. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative resultater i mus brunt fedtvæv efter 3 dages D 2 O-administration. (A) Masseisotopfordeling af palmitat i BAT efter 3 dages D2O-administration ved stuetemperatur (RT) ogtermoneutralitet (TN). B) BAT molær berigelse af en række fedtsyrer efter 3 dages D2O administration ved stuetemperatur og termoneutralitet. (C) Total forekomst og (D) de novo syntetiseret palmitat i brunt fedtvæv efter 3 dages D 2O administration ved stuetemperatur og termoneutralitet. E) Molær plasmaberigelse af en række fedtsyrer efter 3 dages administration af D2O ved stuetemperatur og termoneutralitet. Søjlediagrammer repræsenterer middelværdien ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 6. Statistisk analyse blev bestemt af to-tailed studerende t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.

Forbindelse Ioner Anslået elueringstid (minutter) Formel til isotopkorrektion
C16:0 270-275 20 C17H34O2
C14:0 242-247 16.5 C15H30O2
C15:0 256-261 18 C16H32O2
ISO-C16:0 270-275 18.9 C17H34O2
ISO-C17:0 284-289 21 C18H36O2
Anteiso-C17:0 284-289 21.5 C18H36O2
C16 D31 301 19.2 ~
Acetone 58-59 1.5 C3H6O

Tabel 1: GCMS-sammensatte fragmentioner til integration. Denne tabel dækker en række fedtsyrer produceret af pattedyrs fedtsyresyntase, men C16:0 er det primære produkt. Alle retentionstider er for GCMS-metoden, der er beskrevet i trin 6, undtagen acetone, som er beskrevet i trin 7.

Supplerende fil: Eksempel på regnearksberegning. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forståelse af balancen og interaktionen mellem komplekse metaboliske veje er et uundværligt skridt i retning af at forstå det biologiske grundlag for metaboliske relaterede sygdomme. Her viser vi en ikke-invasiv og billig metode til at bestemme ændringer i de novo fedtsyresyntese. Denne metode er tilpasset fra tidligere offentliggjorte metoder, der udviklede beregninger til estimering af de novo-synteseflux fra fedtsyredeuteriumberigelse31 og til anvendelse af deuterium-acetoneudveksling til bestemmelse af den relative procentdel af D2O i kropsvand39. I de senere år har vi taget metoden beskrevet her og anvendt den til at afdække ændringer i syntesen af forskellige fedtsyrer i fedtdepoter, hjernen, leveren og tumorer 9,22,40. Der er en række kritiske trin og modificerbare aspekter af denne protokol. Disse er relateret til det overordnede eksperimentelle design samt den analytiske tilgang og beregninger, der anvendes i denne metode. Alternative metoder til beregning af de novo fedtsyresyntese fra stabile isotopsporstoffer anvendes også i vid udstrækning. Disse omfatter MIDA-metoden (alternate mass isotopomer distribution analysis) udviklet af Hellerstein et al.41,42, isotopomerspektralanalyse (ISA) udviklet af Kelleher et al.43,44 og nyere tilgange, der er udviklet til at modellere syntesen af langkædede fedtsyrer såsom fedtsyrekildeanalyse (FASA)45. Fordelen ved metoden her er, at den let kan implementeres med frit tilgængelig software og brug af et regneark. Det er imidlertid begrænset af behovet for, at kropsvandsberigelse (BWE) skal være i en stabil tilstand, forbehold forbundet med udnyttelsen af N-parameteren (diskuteret nedenfor), og at den kun gælder for direkte produkter af FAS, som primært er palmitat.

Brunt fedt DNL og temperaturakklimatisering
DNL er steget kraftigt som en hovedknude i metabolisk regulering af hele kroppen og er afgørende for normal udvikling 13,29. Vævsmålrettet deletion og metabolomisk analyse har identificeret flere vigtige enzymatiske og transkriptionelle spillere, der styrer DNL i fedtvæv, og hvordan det styrer hele kroppens fedtforøgelse og normal metabolisk homeostase 21,28,46,47,48,49. Selvom BAT er mindre værdsat, er det et meget aktivt væv i DNL med en højere ekspression af kernekroppens DNL-enzymmaskiner (acly, acaca, fasn) end de fleste andre væv og højere lipogene aktiviteter 22,50,51,52,53,54,55. BAT er imidlertid unik i den forstand, at akklimatisering til subtermoneutrale temperaturer samtidig inducerer DNL- og fedtsyreoxidationsaktivitet i BAT 22,54,56. Selvom de tilknyttede mekanismer ikke er helt klare, accepteres det, at BAT er et metabolisk dræn for næringsstoffer, herunder dem, der er bestemt til DNL til lipidsyntese, som er afgørende for normal BAT-aktivitet53,55. Som sådan er det relevant at kunne redegøre for alle metaboliske indkomster og resultater af BAT for at vurdere dets aktivitetsniveauer. DNL måles dog normalt kun baseret på genekspression og vurderes funktionelt ved tællede lejligheder. Den her foreslåede protokol giver mulighed for funktionel vurdering af DNL, hvilket muliggør en mere fuldstændig fortolkning af metabolisk status.

D2O dosis, timing og måling af kropsvandsberigelse
Et af de primære kritiske trin i designet er dosis og timing af D2O-administrationen. I denne protokol anvender vi en dosis- og administrationsmetode (bolusinjektion efterfulgt af drikkevandsberigelse), som vi har fundet fører til hurtig opnåelse og vedligeholdelse af steady state BWE. De beregninger, der anvendes til bestemmelse af fedtsyresyntese, er baseret på antagelsen om steady state BWE; Derfor er det afgørende, at dette valideres i nye eksperimentelle modeller. Hvis steady state-berigelse ikke er mulig på grund af problemer med at anvende denne kombinerede doseringsmetode, henvises læseren til andre publikationer, hvor ændringer i beregningerne muliggør dette39. Graden af variation fra steady state, der kan tolereres, når der anvendes en doseringsmetode, der sigter mod hurtig opnåelse af dette, afhænger af mange faktorer. Hvis BWE øges i vedvarende stigninger over den værdi, der bruges til beregning, vil DNL blive overvurderet ved at bruge metoden her. Hvis BWE er betydeligt lavere end den værdi, der anvendes til beregning for vedvarende tidsmængder, vil DNL blive undervurderet. Mens der forventes en lille variation omkring gennemsnittet, er den mest kritiske faktor, at BWE ikke varierer mere i den ene eksperimentelle gruppe end den anden, hvilket kan føre til, at forskelle i den beregnede DNL drives af variation i BWE. Hvis begge eksperimentelle grupper udviser en lille, men lignende variation over tid, vil tolerancen for dette afhænge af den nøjagtighed og præcision, hvormed investigator kræver, at målingen udføres, samt de forventede forskelle mellem eksperimentelle grupper. For eksempel i tilfælde af brunt fedtvæv udsat for termoneutralitet versus stuetemperatur, som blev givet som et eksempel her, er forskellen i mængden af de novo-syntetiseret fedtsyre, der er til stede, større end 50%; derfor er det usandsynligt, at små variationer i BWE vil skjule resultaterne.

Ud over overvejelse af steady state er et andet modificerbart aspekt af denne protokol niveauet for BWE. Øget BWE giver potentielt mulighed for øget etiketoverførsel til fedtsyrer, og dermed kan fedtsyrepuljer med lavere omsætning lettere påvises på kortere tid. Dette kan være en fordel i situationer, hvor forskeren er interesseret i akutte reaktioner i DNL. Forhøjede D2O-niveauer i kropsvand kan imidlertid forårsage uønskede fysiologiske virkninger, og der bør derfor udvises forsigtighed57. Administration af lavere niveauer af D2 O for at opnå BWE-niveauer, typisk omkring 0,5%, anvendes almindeligvis i humane undersøgelser på grund af omkostningerne forbundet med D2O-administration. I dette tilfælde kan metoder med øget følsomhed være nødvendige for at kvantificere BWE og fedtsyreberigelse. For BWE kan dette opnås via ionforholdsmassespektrometri58 eller en modificeret acetoneudvekslingsprotokol59. Til fedtsyreanalyse har brugen af et GCMS-instrument med høj opløsning for nylig vist sig at øge følsomheden af måling af deuterium i fedtsyrer og dermed muliggøre kvantificering af DNL efter meget korte tidsperioder og/eller lav BWE60. Alternative metoder kan også bruges til at øge gennemstrømningen, hvormed BWE måles, ved at anvende headspace-analyser af acetonen genereret i trin 7.1.5 i stedet for at ekstrahere den med CHCl3 og udføre væskeinjektion. Dette reducerer metodens kørselstid og undgår flere overførselstrin, hvilket reducerer prøveforberedelsestiden. Hvis der er adgang til en headspace-injektor, anbefales denne metode stærkt61.

Valg af fedtsyrepulje til kvantificering og analytisk tilgang
I denne protokol er metoden designet til at måle den samlede fedtsyrepulje i vævet eller plasmaet, uanset lipidklasse. Imidlertid kan lipidklasser adskilles før FAME-generering via metoder som tyndtlagskromatografi eller væskekromatografi. Derudover kan lipider fra specifikke lipoproteinfraktioner, såsom lipoprotein med meget lav densitet (VLDL), isoleres via ultracentrifugering58 ved analyse af serum eller plasma. Denne metode anvendes almindeligvis i humane undersøgelser for at fastslå hepatisk DNL, som sandsynligvis er den primære kilde til de novo-fremstillede fedtsyrer i VLDL. Lipidekstraktions- og derivatiseringsprotokollen kan også ændres for at øge isoleringen af specifikke klasser62. Endelig kan deuteriumberigelse af lipidhydrogener også måles ved hjælp af 2H NMR-spektroskopi snarere end massespektrometri. Selv om denne metode er mindre følsom end MS og derfor kræver øget materiale, er dens fordel, at den giver positionsberigelsesoplysninger, som kan bruges til bedre at estimere forlængelses- og desaturationshastigheder63.

Beregning
Beregningerne i denne protokol er baseret på tidligere beregninger, der tager højde for steady state BWE, fedtsyreberigelse og antallet af udskiftelige hydrogener på fedtsyrerne31. Som med alle beregninger er der en række begrænsninger og antagelser, der bør overvejes, når resultaterne fra denne tilgang anvendes og fortolkes. En af de primære overvejelser er den værdi, der anvendes for N i metodens afsnit 8. Under fedtsyresyntese inkorporeres 2 Hfra D 2O i acylkæden såvel som indirekte via udveksling med hydrogener på NADPH, acetyl-CoA og malonyl-CoA64,65. Tidligere undersøgelser har vist, at denne udveksling er ufuldstændig 31,66; beregningen indeholder således en korrektionsfaktor (N) for at tage højde for disse65. En N på 22 er almindeligt anvendt til mange undersøgelser, da det tidligere har vist sig, at dette er hensigtsmæssigt for en række væv ved hjælp af ligningen skitseret i trin 631,66. Dette kan dog variere afhængigt af den eksperimentelle forstyrrelse og dyremodel65; Derfor opfordrer vi efterforskerne til at tage dette i betragtning. Et lavere N øger den samlede synteseflux, og den værdi, der anvendes til denne parameter, bør overvejes, når man sammenligner målinger på tværs af undersøgelser eller laboratorier. En begrænsning ved den her anvendte fremgangsmåde er, at den kun er relevant for analysen af direkte produkter af FAS, som primært er palmitat, med meget lavere mængder ulige kædede fedtsyrer og monomethylforgrenede fedtsyrer9. Selv om deuteriumberigelse af alle fedtsyrer kan påvises, er den formel, der anvendes her, ikke egnet til bestemmelse af syntesen af langkædede fedtsyrer, såsom C18:0, da den ikke tillader optagelse af umærket fedtsyre og forlængelse af disse67. På samme måde kan desaturationsraterne også undervurderes.

Generelle begrænsninger
Selvom brugen af D2O til måling af fedtsyrer har skabt afgørende indsigt i DNL's betydning for fysiologisk homeostase, er der en række begrænsninger forbundet med denne metode. For det første, baseret på den timing, der er skitseret her, er det ikke muligt at være helt sikker på oprindelsesvævet for de nyligt syntetiserede fedtsyrer. Det er let at forestille sig et scenarie, hvor et bestemt væv genererer fedtsyrer fra DNL, og derefter transporteres de til andre væv. Fine tidsforløbsforsøg efter D2O-behandling kunne øge opløsningen af oprindelsesvævet for nyligt syntetiserede fedtsyrer, hvilket reducerer tværvævsforurening. Det 3-dages tidspunkt, der blev brugt til de repræsentative resultater, var designet til at detektere deuteriumberigelse i en række fedtsyrer ved både termoneutralitet (når flux er lavere) og stuetemperatur. Kortere tidspunkter efter administration af D2O, hvor palmitat er det primære mål, minimerer fedtsyretransport på tværs af væv og kan derfor være fordelagtigt. Meget kortere tidspunkter (f.eks. 12 timer) ville være ideelle, når man overvejer mus under kolde forhold, og når termoneutralitet ikke er inkluderet i det eksperimentelle design. For det andet giver denne metode ikke oplysninger om de nye fedtsyrers oprindelsessubstrat. Identifikation af de specifikke substrater, der anvendes under særlige omstændigheder, kan være et yderligere lag af information, der er nødvendigt for fuld forståelse af DNL's lovgivningsmæssige kort. Dette kan gøres med substrater mærket med stabile isotoper.

Fordele
En særlig fordel ved denne metode er, at dyrene er uhæmmede (bortset fra den første injektion af D2O) og bevidste under forsøget, hvilket fremmer et miljø med lav stress, hvor dyrene kan opføre sig naturligt, herunder ønsket ambulation og et fodringsmønster og en mængde, der giver mulighed for specifik diætbehandling, hvis det er nødvendigt. D2O er også bemærkelsesværdigt let at administrere. I modsætning til flydende opløsninger af andre sporstoffer (f.eks. 13C-U-glucose) har D2O ikke særlige spiselige egenskaber, der sandsynligvis påvirker vandforbruget. Ud over stabile isotopsporere er den anden mest almindeligt anvendte metode radioisotoper. Den potentielle fordel ved radioisotoper er valg af udstyr til detektion. Der kræves et massespektrometer til stabile isotoper, mens radioisotoper kan detekteres ved hjælp af en scintillationstæller, som kan være lettere tilgængelig. Der er dog en række ulemper forbundet med radioisotoper på grund af sikkerhedsmæssige og etiske spørgsmål. Derudover er radioisotopen generelt på glukose og afspejler således ikke kun ændringer i DNL, men snarere ændringer i glukoseafledt DNL. Derudover er bestemmelse af syntesen af individuelle fedtsyrer ikke mulig. D2O hurtigere ekvilibrer på tværs af alle væv sammenlignet med specifikke substrater med isotopetiketter68.

DNL er en nøglekomponent i metabolisk homeostase kontrolleret af en række enzymer og transkriptionsfaktorer, der hver især uafhængigt påvirker udvikling, metabolisme og sygdomstilstande. DNL er således bundet til at være en vigtig metabolisk vej, der skal undersøges mere bredt i forskning og terapiudvikling. Denne protokol kan bruges som et første skridt fremad i inkorporering af DNL-analyse rutinemæssigt i metabolisk fænotypning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Sanchez-Gurmaches og Wallace laboratoriets medlemmer for værdifulde diskussioner. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra American Heart Association (18CDA34080527 til JSG og 19POST34380545 til RM), NIH (R21OD031907 til JSG), en CCHMC Trustee Award, en CCHMC Center for Pediatric Genomics Award og en CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award. Dette arbejde blev delvist støttet af NIH P30 DK078392 fra Digestive Diseases Research Core Center i Cincinnati. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health. RT og MW blev støttet af et UCD Ad Astra Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 mL Glass Vials Fisher Scientific 14-955-334
0.2 µm filter Olympus Plastic 25-244
26G needeled syringes BD 309597
Acetone Merck 34850
Acetonitrile Merck 900667
Blue GC screw cap with septa Agilent 5190-1599
Centrifuge Eppendorf 5424R
Chloroform Sigma 366927
Deuterium oxide Sigma 151882
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Merck B1378
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Agilent CP7419
EDTA tube Sarstedt 411395105
Ethanol Merck 51976
Hexadecenoic-d31 Acid Larodan 71-1631
Hexane Merck 34859
Methanol Merck 34860
Microcentrifuge tube Olympus Plastic 24-282
Mouse environmental chamber Caron Caron 7001-33
Potasium Chloride Fisher Bioreagents BP366-500
Potasium Phosphate MP Biomedicals 194727
SafeLock microcentrifuge tubes Eppendorf 30120086
Screw top amber GC vial Agilent 5182-0716
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Hydroxide Merck S5881
Sodium Phosphate, dibasic Fisher Bioreagents BP332-500
Sodium Sulfate Merck 239313
Sulfuric Acid Merck 258105
Vial insert Agilent 5183-2088

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. The Lancet, Diabetes Endocrinology. Childhood obesity: a growing pandemic. The Lancet. Diabetes & Endocrinology. 10 (1), 1 (2022).
  2. Gonzalez-Muniesa, P., et al. Obesity. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17034 (2017).
  3. Müller, T. D., Blüher, M., Tschöp, M. H., DiMarchi, R. D. Anti-obesity drug discovery: advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (3), 201-223 (2021).
  4. Virtue, S., Vidal-Puig, A. GTTs and ITTs in mice: simple tests, complex answers. Nature Metabolism. 3 (7), 883-886 (2021).
  5. Müller, T. D., Klingenspor, M., Tschöp, M. H. Revisiting energy expenditure: how to correct mouse metabolic rate for body mass. Nature Metabolism. 3 (9), 1134-1136 (2021).
  6. Virtue, S., Lelliott, C. J., Vidal-Puig, A. What is the most appropriate covariate in ANCOVA when analysing metabolic rate. Nature Metabolism. 3 (12), 1585 (2021).
  7. Hellerstein, M. K. De novo lipogenesis in humans: metabolic and regulatory aspects. European Journal of Clinical Nutrition. 53 Suppl 1, S53-S65 (1999).
  8. Zhao, S., et al. Dietary fructose feeds hepatic lipogenesis via microbiota-derived acetate. Nature. 579 (7800), 586-591 (2020).
  9. Wallace, M., et al. Enzyme promiscuity drives branched-chain fatty acid synthesis in adipose tissues. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1021-1031 (2018).
  10. Zhao, S., et al. ATP-citrate lyase controls a glucose-to-acetate metabolic switch. Cell Reports. 17 (4), 1037-1052 (2016).
  11. Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
  12. Zhang, Z., et al. Serine catabolism generates liver NADPH and supports hepatic lipogenesis. Nature Metabolism. 3 (12), 1608-1620 (2021).
  13. Chirala, S. S., et al. Fatty acid synthesis is essential in embryonic development: fatty acid synthase null mutants and most of the heterozygotes die in utero. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (11), 6358-6363 (2003).
  14. Icard, P., et al. ATP citrate lyase: A central metabolic enzyme in cancer. Cancer Letters. 471, 125-134 (2020).
  15. Fhu, C. W., Ali, A. Fatty acid synthase: an emerging target in cancer. Molecules. 25 (17), 3935 (2020).
  16. Lawitz, E. J., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibitor GS-0976 for 12 weeks reduces hepatic de novo lipogenesis and steatosis in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 16 (12), 1983e3-1991e3 (2018).
  17. Smith, G. I., et al. Insulin resistance drives hepatic de novo lipogenesis in nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of Clinical Investigation. 130 (3), 1453-1460 (2020).
  18. Imamura, F., et al. Fatty acids in the de novo lipogenesis pathway and incidence of type 2 diabetes: A pooled analysis of prospective cohort studies. PLoS Medicine. 17 (6), e1003102 (2020).
  19. Lai, H. T. M., et al. Serial plasma phospholipid fatty acids in the de novo lipogenesis pathway and total mortality, cause-specific mortality, and cardiovascular diseases in the cardiovascular health study. Journal of the American Heart Association. 8 (22), e012881 (2019).
  20. Ference, B. A., et al. Mendelian randomization study of ACLY and cardiovascular disease. The New England Journal of Medicine. 380 (11), 1033-1042 (2019).
  21. Herman, M. A., et al. A novel ChREBP isoform in adipose tissue regulates systemic glucose metabolism. Nature. 484 (7394), 333-338 (2012).
  22. Sanchez-Gurmaches, J., et al. Brown fat AKT2 Is a cold-induced kinase that stimulates ChREBP-mediated de novo lipogenesis to optimize fuel storage and thermogenesis. Cell Metabolism. 27 (1), 195e6-209e6 (2018).
  23. Wang, X., et al. Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter. II. Purification and characterization. The Journal of Biological Chemistry. 268 (19), 14497-14504 (1993).
  24. Briggs, M. R., Yokoyama, C., Wang, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter. I. Identification of the protein and delineation of its target nucleotide sequence. The Journal of Biological Chemistry. 268 (19), 14490-14496 (1993).
  25. Yokoyama, C., et al. SREBP-1, a basic-helix-loop-helix-leucine zipper protein that controls transcription of the low density lipoprotein receptor gene. Cell. 75 (1), 187-197 (1993).
  26. Chen, G., Liang, G., Ou, J., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Central role for liver X receptor in insulin-mediated activation of Srebp-1c transcription and stimulation of fatty acid synthesis in liver. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11245-11250 (2004).
  27. Denechaud, P. D., et al. ChREBP, but not LXRs, is required for the induction of glucose-regulated genes in mouse liver. The Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 956-964 (2008).
  28. Crewe, C., et al. SREBP-regulated adipocyte lipogenesis is dependent on substrate availability and redox modulation of mTORC1. JCI Insight. 5 (15), e129397 (2019).
  29. Batchuluun, B., Pinkosky, S. L., Steinberg, G. R. Lipogenesis inhibitors: therapeutic opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (4), 283-305 (2022).
  30. Wallace, M., Metallo, C. M. Tracing insights into de novo lipogenesis in liver and adipose tissues. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 65-71 (2020).
  31. Lee, W. N., et al. In vivo measurement of fatty acids and cholesterol synthesis using D2O and mass isotopomer analysis. The American Journal of Physiology. 266 (5 Pt 1), E699-E708 (1994).
  32. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, 143 (2016).
  33. Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
  34. Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. Journal of Mass Spectrometry. 31 (3), 255-262 (1996).
  35. Midani, F. S., Wynn, M. L., Schnell, S. The importance of accurately correcting for the natural abundance of stable isotopes. Analytical Biochemistry. 520, 27-43 (2017).
  36. Trefely, S., Ashwell, P., Snyder, N. W. FluxFix: automatic isotopologue normalization for metabolic tracer analysis. BMC Bioinformatics. 17 (1), 485 (2016).
  37. Jeong, H., et al. Correcting for naturally occurring mass isotopologue abundances in stable-isotope tracing experiments with PolyMID. Metabolites. 11 (5), 310 (2021).
  38. Millard, P., et al. IsoCor: isotope correction for high-resolution MS labeling experiments. Bioinformatics. 35 (21), 4484-4487 (2019).
  39. Brunengraber, D. Z., et al. Influence of diet on the modeling of adipose tissue triglycerides during growth. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolsim. 285 (4), E917-E925 (2003).
  40. Svensson, R. U., et al. Inhibition of acetyl-CoA carboxylase suppresses fatty acid synthesis and tumor growth of non-small-cell lung cancer in preclinical models. Nature Medicine. 22 (10), 1108-1119 (2016).
  41. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis: a technique for measuring biosynthesis and turnover of polymers. The American Journal of Physiology. 263 (5 Pt 1), E988-E1001 (1992).
  42. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic, and experimental considerations. The American Journal of Physiology. 276 (6), E1146-E1170 (1999).
  43. Kelleher, J. K., Masterson, T. M. Model equations for condensation biosynthesis using stable isotopes and radioisotopes. The American Journal of Physiology. 262 (1 Pt 1), E118-E125 (1992).
  44. Kelleher, J. K., Nickol, G. B. Isotopomer spectral analysis: utilizing nonlinear models in isotopic flux studies. Methods in Enzymology. 561, 303-330 (2015).
  45. Argus, J. P., et al. Development and application of FASA, a model for quantifying fatty acid metabolism using stable isotope labeling. Cell Reports. 25 (10), 2919.e8-2934.e8 (2018).
  46. Guilherme, A., et al. Control of adipocyte thermogenesis and lipogenesis through β3-adrenergic and thyroid hormone signal integration. Cell Reports. 31 (5), 107598 (2020).
  47. Guilherme, A., et al. Neuronal modulation of brown adipose activity through perturbation of white adipocyte lipogenesis. Molecular Metabolism. 16, 116-125 (2018).
  48. Guilherme, A., et al. Adipocyte lipid synthesis coupled to neuronal control of thermogenic programming. Molecular Metabolism. 6 (8), 781-796 (2017).
  49. Lodhi, I. J., et al. Inhibiting adipose tissue lipogenesis reprograms thermogenesis and PPARgamma activation to decrease diet-induced obesity. Cell Metabolism. 16 (2), 189-201 (2012).
  50. McCormack, J. G., Denton, R. M. Evidence that fatty acid synthesis in the interscapular brown adipose tissue of cold-adapted rats is increased in vivo by insulin by mechanisms involving parallel activation of pyruvate dehydrogenase and acetyl-coenzyme A carboxylase. The Biochemistry Journal. 166 (3), 627-630 (1977).
  51. Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Letters. 104 (1), 13-16 (1979).
  52. Negron, S. G., Ercan-Sencicek, A. G., Freed, J., Walters, M., Lin, Z. Both proliferation and lipogenesis of brown adipocytes contribute to postnatal brown adipose tissue growth in mice. Science Reports. 10 (1), 20335 (2020).
  53. Schlein, C., et al. Endogenous fatty acid synthesis drives brown adipose tissue involution. Cell Reports. 34 (2), 108624 (2021).
  54. Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. Journal of Lipid Research. 55 (11), 2276-2286 (2014).
  55. Adlanmerini, M., et al. Circadian lipid synthesis in brown fat maintains murine body temperature during chronic cold. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (37), 18691-18699 (2019).
  56. Yu, X. X., Lewin, D. A., Forrest, W., Adams, S. H. Cold elicits the simultaneous induction of fatty acid synthesis and beta-oxidation in murine brown adipose tissue: prediction from differential gene expression and confirmation in vivo. FASEB Journal. 16 (2), 155-168 (2002).
  57. Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 77 (2), 79-88 (1999).
  58. Diraison, F., Pachiaudi, C., Beylot, M. Measuring lipogenesis and cholesterol synthesis in humans with deuterated water: use of simple gas chromatographic/mass spectrometric techniques. Journal of Mass Spectrometry. 32 (1), 81-86 (1997).
  59. Yang, D., et al. Assay of low deuterium enrichment of water by isotopic exchange with [U-13C3]acetone and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 258 (2), 315-321 (1998).
  60. Fu, X., et al. Measurement of lipogenic flux by deuterium resolved mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 3756 (2021).
  61. Shah, V., Herath, K., Previs, S. F., Hubbard, B. K., Roddy, T. P. Headspace analyses of acetone: a rapid method for measuring the 2H-labeling of water. Analytical Biochemistry. 404 (2), 235-237 (2010).
  62. Argus, J. P., Yu, A. K., Wang, E. S., Williams, K. J., Bensinger, S. J. An optimized method for measuring fatty acids and cholesterol in stable isotope-labeled cells. Journal of Lipid Research. 58 (2), 460-468 (2017).
  63. Belew, G. D., Jones, J. G. De novo lipogenesis in non-alcoholic fatty liver disease: Quantification with stable isotope tracers. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), e13733 (2022).
  64. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  65. Belew, G. D., et al. Transfer of glucose hydrogens via acetyl-CoA, malonyl-CoA, and NADPH to fatty acids during de novo lipogenesis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2050-2056 (2019).
  66. Diraison, F., Pachiaudi, C., Beylot, M. In vivo measurement of plasma cholesterol and fatty acid synthesis with deuterated water: determination of the average number of deuterium atoms incorporated. Metabolism. 45 (7), 817-821 (1996).
  67. Ajie, H. O., et al. In vivo study of the biosynthesis of long-chain fatty acids using deuterated water. The American Journal of Physiology. 269 (2 Pt 1), E247-E252 (1995).
  68. Schloerb, P. R., Friis-Hansen, B. J., Edelman, I. S., Solomon, A. K., Moore, F. D. The measurement of total body water in the human subject by deuterium oxide dilution; with a consideration of the dynamics of deuterium distribution. The Journal of Clinical Investigation. 29 (10), 1296-1310 (1950).

Tags

Biologi udgave 195 Brunt fedtvæv Deuteriumoxid Metabolisk vej Funktionelle roller Helkropsmetabolisk homeostase Fysiologiske processer Patologiske processer Bortskaffelse af glukose Funktionel vurdering Detaljerede protokoller Kvantitativ metode Gaskromatografi massespektrometri (GCMS) Total fedtsyre de novo-syntese kulstofkilde prøveforberedelse nedstrømsberegninger brunt fedt metabolisk homeostase
Kvantitativ bestemmelse af <em>de novo</em> fedtsyresyntese i brunt fedtvæv under anvendelse af deuteriumoxid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Turner, R., Mukherjee, R., Wallace,… More

Turner, R., Mukherjee, R., Wallace, M., Sanchez-Gurmaches, J. Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide. J. Vis. Exp. (195), e64219, doi:10.3791/64219 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter