Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantitativ bestämning av de novo-fettsyrasyntes i brun fettvävnad med hjälp av deuteriumoxid

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64219
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2,3,4
1UCD Conway Institute and UCD Institute of Food and Health, School of Agriculture and Food Science, University College Dublin, 2Division of Endocrinology, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 3Division of Developmental Biology, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi en billig kvantitativ metod som använder deuteriumoxid och gaskromatografi masspektrometri (GCMS) för analys av total fettsyra de novo lipogenes i brun fettvävnad in vivo.

Abstract

Fettsyrasyntes är en komplex och mycket energikrävande metabolisk väg med viktiga funktionella roller i kontrollen av hela kroppens metaboliska homeostas och andra fysiologiska och patologiska processer. I motsats till andra viktiga metaboliska vägar, såsom glukosbortskaffande, utvärderas inte fettsyrasyntesen rutinmässigt funktionellt, vilket leder till ofullständiga tolkningar av metabolisk status. Dessutom saknas det allmänt tillgängliga detaljerade protokoll som är lämpliga för nykomlingar på området. Här beskriver vi en billig kvantitativ metod som använder deuteriumoxid och gaskromatografi masspektrometri (GCMS) för analys av total fettsyra de novo-syntes i brun fettvävnad in vivo. Denna metod mäter syntesen av produkterna av fettsyrasyntas oberoende av en kolkälla, och den är potentiellt användbar för praktiskt taget vilken vävnad som helst, i vilken musmodell som helst och under alla yttre störningar. Information om provberedningen för GCMS och nedströmsberäkningar tillhandahålls. Vi fokuserar på analys av brunt fett på grund av dess höga nivåer av de novo-fettsyrasyntes och kritiska roller för att upprätthålla metabolisk homeostas.

Introduction

Fetma och relaterade metabola sjukdomar är en pandemi som utgör en fara för nuvarande och kommande generationer 1,2. Den metabola dysreglering som är förknippad med fetma, som vanligtvis förenklas som en följd av obalansen mellan energiintag och energiförbrukning, påverkar ett stort antal metaboliska vägar som styrs av miljömässiga och endogena faktorer3. Endast ett fåtal vägar testas dock rutinmässigt i djurmodeller av metabol dysreglering.

Som ett exempel mäts glukosbortskaffande rutinmässigt med glukos- och insulintoleranstester, förmodligen på grund av enkelheten att använda bärbara glukosmätare4. Relativa hastigheter för glukos och lipidoxidation i hela kroppen uppskattas också rutinmässigt baserat på andningsutbytesförhållandet från indirekta kalorimetrianalyser 5,6. Majoriteten av alla andra aspekter av metabolismen bedöms dock inte rutinmässigt funktionellt. Detta leder till ofullständiga tolkningar av den metabola statusen och missade behandlingsalternativ. En av de viktigaste sådana vägarna är de novo lipogenes.

De novo lipogenes (DNL) är den process genom vilken nya fettsyror genereras från prekursorer. Glukos anses vara den viktigaste prekursorn som bidrar till helkropps-DNL7, men andra prekursorer, såsom acetat, fruktos, laktat och grenade aminosyror, har visat sig vara relevanta kolkällor på ett rumsligt och tillståndsberoende sätt 8,9,10,11,12. DNL är en viktig bidragsgivare till metabolisk homeostas och är avgörande för normal utveckling13. Dessutom har förändringar i DNL associerats med cancer 14,15 och metabola 16,17,18 och kardiovaskulära sjukdomar 19,20.

DNL-vägen består av de enzymatiska kärnkomponenterna ATP-citratlyas (ACLY), acetyl-CoA-karboxylas (ACC1/2) och fettsyrasyntas (FAS) som främst producerar palmitat, en mättad fettsyra med 16 kolatomer. Men udda och grenade fettsyror kan också produceras i lägre doser9. Elongaser och desaturas modifierar dessa fettsyror ytterligare, vilket skapar ett brett utbud av fettsyraarter som är användbara för en mängd olika funktioner (t.ex. långsiktig energilagring och manipulering av membranfluiditet).

Uttrycket av det enzymatiska DNL-maskineriet styrs av ett kort antal transkriptionsfaktorer. De mest välbeskrivna hittills inkluderar SREBP-familjen (Sterol Regulatory Element Binding Protein), Carb Response Element Binding Protein (ChREBP) och lever X-receptor (LXR)21,22,23,24,25,26. Trots en uppenbar överlappning i deras funktioner har individuella regleringar baserade på celltypsdominans och fysiologiska eller patologiska tillstånd rapporterats21,22,27,28.

Anmärkningsvärt är att ett antal inhibitorer för utvalda steg i DNL-signalvägen har godkänts för klinisk användning eller befinner sig i prekliniska eller kliniska utvecklingsstadier för ett antal sjukdomar, inklusive fetma, icke-alkoholisk fettleversjukdom/icke-alkoholisk steatohepatit (NAFLD/NASH) och kardiovaskulär sjukdom29. Dessa insatser belyser relevansen av DNL för hälsa och sjukdom.

Under de senaste åren har användningen av metoder för att kvantitativt bedöma de novo-fettsyrasyntesen ökat30. Den vanligaste metoden för att bedöma detta är användning av tungmärkt vatten (D2O), där det tungt märkta vätet inkorporeras i acylkedjor under syntesen både direkt och indirekt, via deuteriumutbyte med vätena i DNL-substraten NAPDH, acetyl-CoA och malonyl-CoA. Även om detta tillvägagångssätt blir allt populärare, finns det en brist på offentligt tillgängliga detaljerade protokoll som är lämpliga för nykomlingar inom området. Här skisserar vi en metod för kvantitativ bedömning av de novo-syntesen av FAS-produkter med hjälp av D2O och gaskromatografi masspektrometri (GCMS), med beräkningar som tidigare utvecklats av Lee et al.31. Denna metod mäter de novo-fettsyrasyntesen oberoende av en kolkälla, och den är potentiellt användbar för praktiskt taget vilken vävnad som helst, i vilken musmodell som helst och under alla yttre störningar. Här fokuserar vi på analysen av brun fettvävnad (BAT) på grund av dess höga nivåer av DNL och kritiska roller för att upprätthålla metabolisk homeostas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Cincinnati Children's Hospital Medical Center.

1. Beredning av D2O

OBS: För att undvika experimentell variation, förbered tillräckligt med lösning/dricksvatten för alla möss under hela experimentet.

  1. För intraperitoneal injektion: generera 0,9 % w/v koksaltlösning D 2 O genom att lösa upp 9 g NaCl per liter D 2 O. Filtrera genom etticke-pyrogent0,2μm filter för att sterilisera.
  2. För att dricka D2 O-vatten: generera 8 % v/v D 2 O-berikat vatten för användning som dricksvatten genom att blanda 80 ml D2O per 920 ml vanligt dricksvatten. Vanligt dricksvatten kan erhållas från musanläggningen. Filtrera genom ett icke-pyrogent 0,2 μm filter för att sterilisera.

2. Modulering av BAT-aktivitet genom temperaturacklimatisering

  1. Separera mössen så att det finns två möss per bur 2 veckor innan temperaturacklimatiseringen börjar. Byt vattentillförsel till vattenflaskor för mössen för att anpassa sig till och hålla alla burar vid 22 °C.
  2. Förbered musens miljökammare 1 vecka innan du påbörjar temperaturacklimatiseringen genom att ställa in lämpliga temperaturer: 30 °C för termoneutralitet, 22 °C för rumstemperatur och 18 °C för kall exponering.
  3. I början av temperaturacklimatiseringen, byt ut burarna mot nya utan miljöberikning (för att undvika bon). Flytta burarna till sina respektive temperaturer.
    OBS: Burar som är tilldelade termoneutralitet kommer att hålla sig vid 30 °C i 4 veckor. Burar som tilldelats rumstemperatur kommer att hålla en temperatur på 22 °C i 4 veckor. Burar som utsätts för kyla blir gradvis kallare enligt veckoschemat: 18 °C under den första veckan, 14 °C under den andra veckan, 10 °C under den tredje veckan och 6 °C under den fjärde veckan.
  4. Byt smutsiga burar varje vecka för alla förhållanden. Byt dessutom ut mat- och vattenflaskor mot nya som är föranpassade till lämplig temperatur i minst 24 timmar.
    OBS: Var uppmärksam på de matmängder som tillsätts varje vecka, särskilt för möss i kyla, eftersom de kommer att konsumera en betydligt större mängd mat jämfört med normala förhållanden. Ge mat ad libitum.

3. Administrering av D2O

  1. Injicera varje djur med 0,9 % vikt/volym koksaltlösning-D2 O vid 35 μL/g kroppsvikt,12h-3 dagar före vävnadsinsamling, via intraperitoneal injektion med en 1 ml spruta och 26 G nål.
    OBS: Se diskussionsavsnittet för mer information om hur du väljer en lämplig märkningstid.
  2. Byt ut vattenflaskorna till flaskor som innehåller 8 % v/v D2O-berikat dricksvatten.

4. Insamling, bearbetning och förvaring av plasma och vävnad

  1. I slutet av experimentet offras mössen med hjälp av godkända metoder (t.ex. överdosering av koldioxid följt av cervikal luxation).
    1. Använd värme-/kylkuddar eller andra metoder för att undvika plötsliga temperaturförändringar före avlivning som kan påverka resultaten. Avliva mössen enligt godkända metoder. Fortsätt omedelbart med blod- och vävnadsinsamling.
  2. Samla upp blod genom hjärtpunktion med hjälp av en 26 G nål och förvara i ett etylendiamintetraättiksyrabloduppsamlingsrör. Håll blodet på is tills vidare bearbetning.
  3. Skär upp huden längs musryggens mittlinje från den nedre delen av brösthålan upp till den övre delen av halsen, samtidigt som du drar upp huden för att undvika att påverka vävnader under huden. Den interskapulära BAT är belägen mellan skulderbladen under ett tunt lager vit fettvävnad och består av två pyramidformade lober.
    1. Rengör vävnaden genom att tvätta i iskall fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Dutta på en pappershandduk för att eliminera överflödig vätska, väg på en analysvåg och samla upp i ett mikrorör.
    2. Snabbfrys omedelbart vävnaden med flytande kväve. Andra BAT-depåer kan också samlas in.
  4. Centrifugera blodproverna vid 10 000 x g i 10 minuter vid 4 °C. Efter centrifugeringen ska plasman försiktigt samlas upp utan att störa pelleten av de röda blodkropparna. Överför den till ett nytt iskallt mikrorör och snabbfrys i flytande kväve.
  5. Förvara brunfetts- och plasmaprover vid -80 °C fram till användning.

5. Lipidextraktion från fettvävnad

  1. Innan extraktionen påbörjas
    1. Bered en 1 mM lösning av hexadekensyra-d31 i metanol i en injektionsflaska av glas. Detta kommer att fungera som den interna fettsyrastandarden.
    2. Kyl den erforderliga mängden kloroform (CHCl 3) och metanol (CH3OH) i en frys på -80 °C eller på torris.
      OBS: Antioxidanten di-tert-butyl-4-metylfenol (BHT) kan tillsättas CHCl3 i en koncentration av 0,01 % vikt/volym (2,5 mg/25 ml) för att förhindra oxidation av dubbelbindningarna i omättade fettsyror.
    3. Mikrocentrifugrör för varje vävnadsprov och ett extra rör som ska användas för en blindextraktion.
      VARNING: CH 3 OHoch CHCl3 är mycket flyktiga och giftiga vid inandning. Använd endast i dragskåp.
      OBS: Olika märken av mikrocentrifugrör har olika nivåer av bakgrundspalmitat och förmåga när det gäller att förhindra lösningsmedelsläckage. Vi rekommenderar att en mängd olika rör testas först, för att säkerställa att lösningsmedelsläckage förhindras och att rören har minimala nivåer av förorenande palmitat. Se Yao et al.32 för vidare diskussion.
  2. Ta ut proverna ur frysen och lägg dem på torris.
  3. Placera det förmärkta mikrocentrifugröret på en analysvåg och tarera vågen. Placera en pincett och ett skalpell/rakblad av stål på torris i 10-20 s för att svalna.
    1. Använd pincetten för att ta ut det frysta vävnadsprovet ur röret och placera det på en plastvågsbåt. Vågbåten kan placeras på ett platt block av torris eller annan förkyld yta.
    2. Använd skalpellen eller rakbladet av stål och dissekera en liten del av vävnaden, motsvarande 5-15 mg i vikt. Placera i mikrocentrifugröret och registrera den exakta vikten. Upprepa för varje prov. Prover kan förvaras i frysen vid denna tidpunkt eller kan avancera till stegen nedan för lipidextraktion.
      OBS: Se till att skalpellen är ordentligt rengjord med 70 % etanol mellan proverna och att en ny vågbåt används mellan varje prov.
  4. Tillsätt 1 μL/mg 10 mM hexadekensyra-d 31(C16:0-d31) till varje prov.
    VARNING: Följande steg (5.4 till 5.8) bör utföras under dragskåp på grund av inandningsrisken med lösningsmedlen.
  5. Tillsätt 250 μlCH3OH, 250 μL H2O och 500 μL CHCl3 till varje prov med tre 5 mm pärlor av rostfritt stål. Placera rören i ett förkylt block i en kvarn och blanda proverna med en vibrationsfrekvens på 25 Hz i 5 minuter, eller använd riktlinjer som rekommenderas av tillverkaren för vävnadsprover. Ta bort pärlorna med hjälp av en magnet.
  6. Centrifugera proverna vid 12 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
    OBS: Efter centrifugeringen bör en tydlig bifasisk separation observeras med den övre vattenfasen som innehåller polära metaboliter och den nedre organiska fasen som innehåller lipider och fettsyror. Om ingen separation ses, tillsätt 250 μL H2O och upprepa virvel- och centrifugeringsstegen.
  7. Använd en mikropipett och ta en fast volym från bottenfasen av varje prov i motsvarande märkta mikrocentrifugrör.
  8. Tillsätt 500 μl CHCl3 till det återstående provet och upprepa steg 5.6–5.7.
  9. Placera proverna under kvävgas eller i ett CHCl3-resistent kylt centrifugalvakuum vid 4 °C tills det är helt torrt. Torkade prover kan förvaras vid -20 °C tills de är redo för derivatisering.
    OBS: Det översta lagret av varje sample kan också samlas in vid denna tidpunkt och torkas som i steg 5.9 för att analysera polära metaboliter.

6. Beredning av fettsyrametylestrar (FAME) och GCMS-analys

  1. Syrakatalyserad förestring och transesterifiering för att framställa FAME
    VARNING: Följande steg bör utföras under ett dragskåp på grund av inandningsrisken för lösningsmedlen.
    1. Om proverna har förvarats i frysen, torka under kväve i 5 minuter för att säkerställa att det inte finns något vatten.
    2. Använd lösningsmedel av MS-kvalitet och pipettera 98 ml vattenfri CH3OH i en glasmediaflaska. Tillsätt långsamt 2 ml vattenfri svavelsyra i dragskåpet för att göra 2 % H2SO4 i CH3OH. Blanda genom att snurra den stängda flaskan.
    3. Tillsätt 500 μl 2% H2SO4 i CH3OH-lösning till varje prov och virvla kort.
    4. Inkubera proverna på ett värmeblock vid 50 °C i 2 timmar.
    5. Ta bort proverna från värmeblocket och tillsätt 100 μl mättad NaCl-lösning och 500 μL hexan till varje prov.
    6. Snurra proverna kraftigt i rumstemperatur i 1 min. Låt proverna sitta i 1 min; Två faser bör vara uppenbara efter detta.
    7. Samla upp den övre fasen i ett nytt mikrocentrifugrör (se anmärkning i avsnitt 5.1.3 för lämpligt val av mikrocentrifugrör).
    8. För att maximera utbytet, upprepa steg 6.1.5-6.1.7 och samla upp det andra provet i samma märkta rör.
    9. Torka proverna i rumstemperatur under kvävgas.
    10. Återsuspendera proverna i 20 μL/mg hexan, i förhållande till den ursprungliga vävnadsvikten, och överför omedelbart till GC-injektionsflaska av glas med en glasinsats.
      OBS: Arbeta snabbt när du överför samples för att minimera avdunstning.
  2. GCMS-analys
    1. För att bestämma förekomsten av FAME-isotopologer, injicera proverna på en enda kvadrupolgaskromatografimasspektrometer (GCMS).
      OBS: Även om många kolonntyper kan användas för att detektera palmitat, upprättades följande temperaturprogram för en GCMS-kolonn som har utvecklats för separation av fettsyra-cis/trans-isomerer, som beskrivs i materialtabellen. Denna pelare har en längd på 50 m med en innerdiameter på 0,25 mm.
    2. Injicera 1 μl prov i ett inlopp utan delning/delning vid en inloppstemperatur på 270 °C, med helium som bärgas, med en strömföring på 1 ml/min. Använd en splitless injektion för fettsyror med låg förekomst av fettsyror med ett totalt flöde på 19 ml/min, en septumrening på 3 ml/min och ett reningsflöde till spaltventilen på 15 ml/min vid 0,75 min. Använd ett delningsförhållande på 10:1-40:1 för rikligt förekommande fettsyror som palmitat och oleat.
    3. Använd följande ugnsparametrar: en initial temperatur på 80 °C; öka med 20 °C/min till 170 °C; öka med 1 °C/min till 204 °C; öka med 20 °C/min till 250 °C; och håll sedan vid 250 °C i 10 min.
    4. Använd följande parametrar för massselektiv detektor (MSD): ett elektronstötjoniseringsläge på 70 eV och skanna över intervallet 50-400 m/z med en skanningshastighet på 1 562 (u/s) och en frekvens på 4,1 skanningar/s. Använd en överföringsledning vid 280 °C, en jonkälla vid 230 °C och en kvadrupol vid 150 °C.
      OBS: Andra kolumner kan användas, men temperaturprogrammet kommer att variera.
    5. Provsekvens: Slumpa provordningen för injektion och injicera minst två eller tre hexanämnen i början av sekvensen, efter var femte sample inom sekvensen och två eller tre i slutet av sekvensen.
    6. Använd instrumentspecifik programvara, eller fri programvara med öppen tillgång, t.ex. Metabolite-Detector33, för att integrera jonerna i tabell 1 för varje fettsyrametylester.
      OBS: Vi har beskrivit joner som täcker M1-M5-isotopologer i tabell 1 som vi har funnit täcker mängden deuteriuminkorporering med detta märkningsfönster. Detta kan dock behöva utvidgas om de novo-flussen är betydligt högre och/eller om en längre märkningstid används.
    7. Använd överflödet av varje integrerad jon för att generera en massisotopomerfördelning, där jonintensiteterna kan omvandlas till fraktionell förekomst så att summan av massisotopomerfördelningen är lika med ett. Se exempelkalkylbladet i tilläggsfilen.
      OBS: För att korrekt bestämma deuteriuminkorporeringen måste korrigering av den naturliga isotopförekomsten användas för att ta hänsyn till förekomsten av naturligt förekommande isotoper såsom 13C, 15N och 2H. Detta utförs genom att tillämpa en korrigeringsmatris som beskrivs av Fernandez et al.34,35, och kan inte utföras genom att subtrahera MID för en omärkt uppmätt metabolit från en märkt metabolit. I praktiken rekommenderar vi användning av fritt tillgänglig programvara som fluxfix 36, polyMID37 eller IsoCor38 för att omvandla rådata till fraktionerade MID, och vi har tillhandahållit formeln för isotopkorrigering för metylesterprodukterna av FAS i tabell 1.
    8. För att bestämma mängden palmitat som finns, använd följande formel:
      Equation 1 
      där jonantalet avser summan av alla palmitatisotopologer som är integrerade i tabell 1 och C16:0-d 31 avser den interna standarden hexadekenoisk-d31. Den interna standarden bildar en separat topp till den för det endogena palmitatet. Den relativa förekomsten av andra fettsyror kan också bestämmas, men fettsyraspecifika isotoper av interna standarder (med massförskjutningar som är större än de som observerats vid D2O-inblandning) eller externa standardkurvor kan behöva användas för fullständig kvantifiering. Använd det blanka extraherade provet för att bestämma mängden bakgrundspalmitat och subtrahera detta från det slutliga vävnadsvärdet.
    9. Beräkna molanrikningen (ME) av palmitat med följande ekvation:
      Equation 2
      där Mi är den normaliserade, fraktionella förekomsten av en palmitatisotopolog, och n är antalet möjliga palmitatisotopologer. Till exempel är ME för en palmitatmolekyl med följande fraktionella fördelning, M1 = 0,25, M2 = 0,08, M3 = 0,02: (0,025*1) + (0,08*2) + (0,02*3) = 0,245 (se tilläggsfil).

7. Deuteriumacetonutbyte av plasmaprover för bestämning av vattenanrikning i kroppen

  1. Reaktion
    1. Förbered 10 standarder av deuterium i vatten, från 0-9% v/v.
    2. Bered en aceton/acetonitrillösning på 5 % v/v som tillåter 4 μL per prov, inklusive standarderna från steg 5.1.1.
    3. I märkta, säkra mikrocentrifugrör, kombinera 10 μL av varje plasmasample eller standard, 4 μL 10 M NaOH och 4 μL 5 % aceton/acetonitril. Utför detta i tre exemplar för varje prov.
    4. Blanda proverna försiktigt genom att pipettera. Låt proverna inkuberas i rumstemperatur över natten.
  2. Extraktion
    1. Efter inkubationen tillsätts 450–550 mg Na2SO4 till varje prov.
    2. Tillsätt 600 μL CHCl3 till varje rör i dragskåpet och virvla kraftigt i 15 s.
    3. Centrifugera proverna vid 300 x g i 2 minuter.
    4. Överför tre alikvoter av supernatanten från varje prov under ett dragskåp till märkta GCMS-flaskor av glas med glasinsatser och tät lock.
  3. GCMS-analys
    1. Separera prover på en kolonn (30 m, 0,25 mm id, Agilent DB-35MS) och analysera på den bifogade masspektrometern.
      1. Injicera 1 μl prov i ett inlopp utan delning/delning, med ett delningsförhållande på 40:1, ett heliumflöde på 1 ml/min och en inloppstemperatur på 270 °C.
      2. Använd följande ugnsparametrar: en initial temperatur på 60 °C, öka i steg om 20 °C/min till 100 °C, öka i steg om 50 °C/min till 220 °C och håll sedan vid 220 °C i 1 min.
      3. Använd följande parametrar för massselektiv detektor (MSD): elektronstötjoniseringsläge vid 70 eV med utvald jonövervakning på 58 och 59 m/z. Använd en överföringsledning vid 280 °C, en jonkälla vid 230 °C och en kvadrupol vid 150 °C.
        OBS: Andra lågutfallande, bundna, tvärbundna, mittpolaritetskolumner kan användas, men temperaturprogrammet kommer att variera.
    2. Ställ in vätskesampmetoden så att den börjar med en CHCl 3-tvätt och sedan en slumpmässig sekvens av samples, inklusive ytterligare CHCl3-tvättsteg var sjätte samples.
      OBS: Om aceton används som nåltvätt för autosamplern, byt ut mot CHCl 3 eller hexan och injicera flera tomma CHCl3 samples tills någon kontaminerande acetontopp inte längre är uppenbar i kromatogrammet.
    3. Med denna metod elueras en acetontopp efter cirka 1,25 minuter. Integrera data och beräkna den fraktionella förekomsten av acetonanrikning enligt steg 6.2.6-6.2.7, med en justering för att analysera toppar som innehåller ett m/z-förhållande på 58-60 enligt tabell 1.
    4. Använd standarderna för att generera en standardkurva för att bestämma procentandelen kroppsvattenanrikning (p) i testproverna, baserat på fraktionerad anrikning av aceton.

8. Beräkningar av lipogenes in vivo de novo

  1. Beräkna andelen nysyntetiserade fettsyror (FNS) som är direkta produkter av FAS (dvs. palmitat, udda fettsyror och mmBCFA) i varje prov med följande ekvation:
    Equation 3
    där ME är den genomsnittliga molära anrikningen av en palmitatmolekyl (steg 6.2.9), p är deuteriumanrikningen i vatten från motsvarande plasmaprov (steg 7.3.4), och N är antalet utbytbara väteatomer på palmitat där ett deuterium kan inkorporeras.
  2. Bestäm N med hjälp av ekvationen nedan som fastställdes av Lee et al.31:
    Equation 4
  3. Bestäm molmängden nysyntetiserade fettsyror (MNS) genom att:
    MNS = FNS x total mängd fettsyror (nmol/mg vävnad).
    OBS: Till exempelample, om man erhåller en palmitatmolär anrikning (ME) på 0,245, en deuteriumanrikning i kroppsvatten (p) på 0,045 och ett beräknat N-tal på 22, är den fraktionerade syntesen av palmitat 0,247. Om mängden palmitat som finns i vävnaden är 2 mmol/mg, är mmol för nysyntetiserat palmitat 0,494 mmol/mg (se tilläggsfilen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Baserat på doseringen av D 2 O som beskrivs i steg 1 finner vi vanligtvis att kroppsvatten anrikas i intervallet2,5% till 6 % och att en baslinjenivå av deuteriumanrikning i kroppsvatten snabbt uppnås på 1 timme och bibehålls under hela studien via 8 % berikat dricksvatten (figur 1). Kontinuerlig vattenanrikning i stabilt tillstånd är ett antagande av beräkningarna som används i steg 6, och därför rekommenderar vi experimentell validering av kinetiken för vattenanrikning i nya experimentella modeller.

Vi har funnit att mängden de novo-syntetiserade fettsyror ökar vid rumstemperatur jämfört med de fettsyror som är termoneutrala i BAT (figur 2). Massisotopologfördelningen av palmitat i BAT från möss vid termoneutralitet och rumstemperatur efter 3 dagars administrering av D2O visar en högre anrikning av M1 och M2 deuterium vid rumstemperatur (figur 2A). Denna kallare temperaturanrikning sker inte bara i palmitat, utan även i ett brett spektrum av fettsyror i BAT (figur 2B). Den totala palmitathalten ökar också i BAT hos möss vid rumstemperatur, och genom att kombinera fraktioneringssyntesen med de totala palmitatnivåerna fann vi att den totala palmitatsyntesen ökade hos möss vid rumstemperatur (figur 2C,D). Noterbart är att den totala fettsyraanrikningen i plasma inte följer samma trend som BAT, utan i stället ökar fettsyraanrikningen med termoneutralitet (figur 2E). Det är inte möjligt att minska det potentiella upptaget från endogen syntes med en D2O enkel tidpunktsmetod, som beskrivs här, men dessa motsatta trender tyder på att fettsyraanrikningsmönstret i BAT inte drivs av fettsyraupptag.

Figure 1
Figur 1: Procentuell anrikning av D 2 O i plasma hos möss vid flera tidpunkter, efter injektion med 0,035 ml/g kroppsvikt 0,9 % NaCl D 2 O och ersättning av dricksvatten med 8 %D2O berikat vatten. Stapeldiagram representerar medelvärde ± SD. n = 9. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Representativa resultat i möss brun fettvävnad efter 3 dagars administrering av D 2 O. A) Massfördelning av isotopolog av palmitat i BAT efter 3 dagars administrering av D2O vid rumstemperatur (RT) och termoneutralitet (TN). B) BAT-molärt anrikning av en rad fettsyror efter 3 dagars administrering av D2O vid rumstemperatur och termoneutralitet. (C) Total abundans och (D) de novo-syntetiserat palmitat i brun fettvävnad efter 3 dagars administrering av D 2O vid rumstemperatur och termoneutralitet. E) Molär anrikning i plasma av en rad fettsyror efter 3 dagars administrering av D2O vid rumstemperatur och termoneutralitet. Stapeldiagram representerar medelvärdet ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 6. Den statistiska analysen bestämdes med tvåsidiga Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Förening Joner Beräknad elueringstid (minuter) Formel för isotopkorrigering
C16:0 270-275 20 C17H34O2
C14:0 242-247 16.5 C15H30O2
C15:0 256-261 18 C16H32O2
iso-C16:0 270-275 18.9 C17H34O2
iso-C17:0 284-289 21 C18H36O2
Anteiso-C17:0 284-289 21.5 C18H36O2
C16 D31 301 19.2 ~
Aceton 58-59 1.5 C3H6O

Tabell 1: GCMS-sammansatta fragmentjoner som ska integreras. Denna tabell täcker en rad fettsyror som produceras av däggdjursfettsyrasyntas, men C16:0 är den primära produkten. Alla retentionstider gäller för GCMS-metoden som beskrivs i steg 6 förutom aceton, som beskrivs i steg 7.

Tilläggsfil: Exempel på kalkylarksberäkning. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Att förstå balansen och interaktionen mellan komplexa metaboliska vägar är ett oumbärligt steg mot att förstå den biologiska grunden för metabolt relaterade sjukdomar. Här visar vi en icke-invasiv och billig metod för att bestämma förändringar i de novo-fettsyrasyntesen. Denna metod är anpassad från tidigare publicerade metoder som utvecklade beräkningar för att uppskatta de novo-syntesflödet från fettsyradeuteriumanrikning31 och för att använda deuterium-acetonutbyte för att bestämma den relativa procentandelen D2O i kroppsvatten39. Under de senaste åren har vi tagit den metod som beskrivs här och tillämpat den för att avslöja förändringar i syntesen av olika fettsyror i fettdepåer, hjärnan, levern och tumörer 9,22,40. Det finns ett antal kritiska steg och modifierbara aspekter av detta protokoll. Dessa är relaterade till den övergripande experimentella designen samt det analytiska tillvägagångssättet och beräkningarna som används i denna metod. Alternativa metoder för att beräkna de novo-fettsyrasyntes från stabila isotopspårämnen används också i stor utsträckning. Dessa inkluderar MIDA-metoden (Alternate Mass Isotopomer Distribution Analysis) som utvecklats av Hellerstein et al.41,42, isotopomerspektralanalys (ISA) som utvecklats av Kelleher et al.43,44 och nyare metoder som har utvecklats för att modellera syntesen av långkedjiga fettsyror såsom fettsyrakällanalys (FASA)45. Fördelen med metoden här är att den är lätt att implementera med fritt tillgänglig programvara och användning av ett kalkylblad. Den begränsas dock av behovet av att kroppsvattenberikning (BWE) ska vara i ett stabilt tillstånd, förbehåll i samband med användningen av N-parametern (diskuteras nedan), och att den endast är tillämplig på direkta produkter av FAS som främst är palmitat.

Brunt fett DNL och temperaturacklimatisering
DNL har ökat som en viktig knöl i hela kroppens metaboliska reglering och är avgörande för normal utveckling13,29. Vävnadsriktad deletion och metabolomisk analys har identifierat flera viktiga enzymatiska och transkriptionella aktörer som kontrollerar DNL i fettvävnad, och hur det kontrollerar ansamling av helkroppsfett och normal metabolisk homeostas 21,28,46,47,48,49. Även om BAT är mindre uppskattat är det en mycket aktiv vävnad i DNL, med ett högre uttryck av kärnkroppens DNL-enzymmaskineri (acly, acaca, fasn) än de flesta andra vävnader och högre lipogena aktiviteter 22,50,51,52,53,54,55. BAT är dock unik i den meningen att acklimatisering till subtermoneutrala temperaturer samtidigt inducerar DNL och oxidationsaktivitet av fettsyror i BAT 22,54,56. Även om de därmed sammanhängande mekanismerna inte är helt klarlagda, godtas det att BAT är en metabolisk sänka för näringsämnen, inklusive sådana som är avsedda för DNL för lipidsyntes, som är avgörande för normal BAT-aktivitet53,55. Det är därför relevant att kunna redogöra för alla metaboliska inkomster och resultat av bästa tillgängliga teknik för att bedöma dess aktivitetsnivåer. DNL mäts dock vanligtvis endast baserat på genuttryck och bedöms funktionellt vid räknade tillfällen. Det protokoll som föreslås här möjliggör funktionell bedömning av DNL, vilket möjliggör en mer fullständig tolkning av metabolisk status.

D2O dos, tidpunkt och mätning av vattenanrikning i kroppen
Ett av de primära kritiska stegen i designen är dosen och tidpunkten för administreringen av D2O. I detta protokoll använder vi en dos- och administreringsmetod (bolusinjektion följt av dricksvattenberikning) som vi har funnit leder till snabb uppnående och upprätthållande av steady state BWE. Beräkningarna som används för att bestämma fettsyrasyntesen är baserade på antagandet om steady state BWE; Därför är det avgörande att detta valideras i nya experimentella modeller. Om steady state-anrikning inte är möjlig på grund av problem med att använda denna kombinerade doseringsmetod, hänvisas läsaren till andra publikationer där ändringar av beräkningarna tillåter detta39. Graden av variation från steady state som kan tolereras vid användning av en doseringsmetod som syftar till att snabbt uppnå detta beror på många faktorer. Om BWE ökas i varaktiga toppar över det värde som används för beräkningen, kommer DNL att överskattas genom att använda metoden här. Om BWE är betydligt lägre än det värde som används för beräkning av varaktig tid kommer DNL att underskattas. Även om en viss liten variation kring genomsnittet förväntas, är den mest kritiska faktorn att BWE inte varierar mer i en experimentgrupp än i den andra, vilket kan leda till att skillnader i den beräknade DNL drivs av variation i BWE. Om båda försöksgrupperna uppvisar en liten men likartad variation över tiden, beror toleransen för detta på den noggrannhet och precision med vilken försöksledaren kräver att mätningen ska utföras, samt de förväntade skillnaderna mellan försöksgrupperna. Till exempel, när det gäller brun fettvävnad som utsätts för termoneutralitet kontra rumstemperatur, vilket gavs som ett exempel här, är skillnaden i mängden närvarande de novo-syntetiserade fettsyror större än 50%; Det är därför osannolikt att små variationer i BWE skymmer resultaten.

Förutom att ta hänsyn till steady state är en annan modifierbar aspekt av detta protokoll nivån på BWE. Ökad BWE möjliggör potentiellt ökad etikettöverföring till fettsyror, och därmed kan fettsyrapooler med lägre omsättning lättare upptäckas på kortare tid. Detta kan vara en fördel i situationer där forskaren är intresserad av akuta svar vid DNL. Ökade D2O-nivåer i kroppsvatten kan dock orsaka oönskade fysiologiska effekter, och därför bör försiktighet iakttas57. Administrering av lägre nivåer av D 2 O för att uppnå BWE-nivåer, vanligtvis runt 0,5 % används vanligtvis i studier på människor på grund av kostnaden isamband med D2O-administrering. I detta fall kan metoder med ökad känslighet behövas för att kvantifiera BWE och fettsyraanrikning. För BWE kan detta uppnås med hjälp av masspektrometri med jonförhållande58 eller ett modifierat acetonutbytesprotokoll59. För fettsyraanalys har användningen av ett högupplösande GCMS-instrument nyligen visat sig öka känsligheten för mätning av deuterium i fettsyror, och därmed möjliggöra kvantifiering av DNL efter mycket korta tidsperioder och/eller låg BWE60. Alternativa metoder kan också användas för att öka genomströmningen med vilken BWE mäts, genom att använda headspace-analyser av acetonet som genererades i steg 7.1.5 istället för att extrahera det med CHCl3 och utföra vätskeinjektion. Detta minskar metodens körtid och undviker flera överföringssteg, vilket minskar provförberedelsetiden. Om tillgång till en headspace-injektor är tillgänglig rekommenderas denna metod starkt61.

Val av fettsyrapool för kvantifiering och analytisk metod
I detta protokoll är metoden utformad för att mäta den totala fettsyrapoolen i vävnaden eller plasman, oavsett lipidklass. Lipidklasser kan dock separeras innan FAME genereras, via metoder som tunnskiktskromatografi eller vätskekromatografi. Vid analys av serum eller plasma kan dessutom lipider från specifika lipoproteinfraktioner, såsom lipoprotein med mycket låg densitet (VLDL), isoleras via ultracentrifugering58. Denna metod används ofta i studier på människor för att fastställa lever-DNL, som sannolikt är den primära källan till de novo-bildade fettsyror i VLDL. Protokollet för extraktion och derivatisering av lipider kan också ändras för att förbättra isoleringen av specifika klasser62. Slutligen kan deuteriumanrikning av lipidväten också mätas med 2H NMR-spektroskopi snarare än masspektrometri. Även om denna metod är mindre känslig än MS och därför kräver mer material, är dess fördel att den ger positionsanrikningsinformation, som kan användas för att bättre uppskatta töjnings- och desaturationshastigheter63.

Beräkning
Beräkningarna i detta protokoll är baserade på tidigare beräkningar som tar hänsyn till steady state BWE, fettsyraanrikning och antalet utbytbara väten på fettsyrorna31. Som med alla beräkningar finns det ett antal begränsningar och antaganden som bör beaktas när man tillämpar och tolkar resultaten från detta tillvägagångssätt. En av de viktigaste faktorerna är det värde som används för N i avsnitt 8 i metoden. Under fettsyrasyntesen inkorporeras 2 H frånD 2O i acylkedjan, såväl som indirekt via utbyte med väten på NADPH, acetyl-CoA och malonyl-CoA64,65. Tidigare studier har visat att detta utbyte är ofullständigt31,66; Beräkningen innehåller därför en korrektionsfaktor (N) för att ta hänsyn till detta65. Ett N på 22 används ofta för många studier, eftersom det tidigare har visat sig att detta är lämpligt för en rad vävnader med hjälp av ekvationen som beskrivs i steg 631,66. Detta kan dock variera beroende på experimentell störning och djurmodell65; Därför uppmanar vi utredare att ta hänsyn till detta. Ett lägre N ökar det totala syntesflödet, och det värde som används för denna parameter bör beaktas när mätningar jämförs mellan studier eller laboratorier. En begränsning med den metod som används här är att den endast är relevant för analys av direkta produkter av FAS som huvudsakligen är palmitat, med mycket lägre mängder av udda fettsyror och monometylgrenade fettsyror9. Även om deuteriumanrikning av alla fettsyror kan detekteras, är den formel som används här inte lämplig för att bestämma syntesen av långkedjiga fettsyror, såsom C18:0, eftersom den inte tillåter upptag av omärkta fettsyror och förlängning av dessa67. På samma sätt kan desaturationshastigheten också underskattas.

Allmänna begränsningar
Även om användningen av D2O för att mäta fettsyror har genererat avgörande insikt i betydelsen av DNL i fysiologisk homeostas, finns det ett antal begränsningar förknippade med denna metod. För det första, baserat på den tidpunkt som beskrivs här, är det inte möjligt att vara helt säker på ursprungsvävnaden för de nysyntetiserade fettsyrorna. Det är lätt att föreställa sig ett scenario där en viss vävnad genererar fettsyror från DNL, och sedan transporteras dessa till andra vävnader. Fintidsförloppsförsök efter D2O-behandling kan öka upplösningen av ursprungsvävnaden för nysyntetiserade fettsyror, vilket minskar kontaminering mellan vävnader. Den 3-dagarstidpunkt som användes för de representativa resultaten var utformad för att detektera deuteriumanrikning i en rad fettsyror vid både termoneutralitet (när flödet är lägre) och rumstemperatur. Kortare tidpunkter efter administrering av D2O, där palmitat är det primära målet, minimerar transporten av fettsyror mellan vävnader och kan därför vara fördelaktigt. Mycket kortare tidpunkter (t.ex. 12 timmar) skulle vara idealiska när man överväger möss under kalla förhållanden och när termoneutralitet inte ingår i den experimentella designen. För det andra ger denna metod ingen information om de nya fettsyrornas ursprungssubstrat. Att identifiera de specifika substrat som används under särskilda omständigheter kan vara ytterligare ett lager av information som är nödvändig för en fullständig förståelse av den regulatoriska kartan över DNL. Detta kan göras med substrat märkta med stabila isotoper.

Fördelar
En särskild fördel med denna metod är att djuren är ohämmade (med undantag för den första injektionen av D2O) och vid medvetande under försöket, vilket främjar en miljö med låg stress för djuren att bete sig naturligt, inklusive önskad förflyttning och ett utfodringsmönster och en mängd som möjliggör specifik kostbehandling vid behov. D2O är också anmärkningsvärt lätt att administrera. Till skillnad från flytande lösningar av andra spårämnen (t.ex. 13C-U-glukos) har D2O inga tydliga välsmakande egenskaper som kan påverka vattenförbrukningen. Förutom spårämnen för stabila isotoper är radioisotoper den andra vanligaste metoden. Den potentiella fördelen med radioisotoper är valet av utrustning för detektion. En masspektrometer krävs för stabila isotoper, medan radioisotoper kan detekteras med hjälp av en scintillationsräknare, som kan vara mer lättillgänglig. Det finns dock ett antal nackdelar med radioisotoper på grund av säkerhets- och etiska frågor. Dessutom är radioisotopen i allmänhet på glukos och återspeglar därför inte enbart förändringar i DNL, utan snarare förändringar i glukoshärledd DNL. Dessutom är det inte möjligt att bestämma syntesen av enskilda fettsyror. D2O utjämnas snabbare över alla vävnader jämfört med specifika substrat med isotopetiketter68.

DNL är en nyckelkomponent i metabolisk homeostas som styrs av ett antal enzymer och transkriptionsfaktorer som var och en oberoende påverkar utveckling, metabolism och sjukdomstillstånd. Således kommer DNL att vara en viktig metabolisk väg, som kommer att behöva undersökas bredare i forskning och terapiutveckling. Detta protokoll kan användas som ett första steg framåt för att rutinmässigt införliva DNL-analys i metabolisk fenotypning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Sanchez-Gurmaches och Wallaces labbmedlemmar för värdefulla diskussioner. Detta arbete stöddes av anslag från American Heart Association (18CDA34080527 till JSG och 19POST34380545 till RM), NIH (R21OD031907 till JSG), en CCHMC Trustee Award, en CCHMC Center for Pediatric Genomics Award och en CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award. Detta arbete stöddes delvis av NIH P30 DK078392 vid Digestive Diseases Research Core Center i Cincinnati. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis National Institutes of Healths officiella åsikter. RT och MW stöddes av ett UCD Ad Astra Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 mL Glass Vials Fisher Scientific 14-955-334
0.2 µm filter Olympus Plastic 25-244
26G needeled syringes BD 309597
Acetone Merck 34850
Acetonitrile Merck 900667
Blue GC screw cap with septa Agilent 5190-1599
Centrifuge Eppendorf 5424R
Chloroform Sigma 366927
Deuterium oxide Sigma 151882
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Merck B1378
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Agilent CP7419
EDTA tube Sarstedt 411395105
Ethanol Merck 51976
Hexadecenoic-d31 Acid Larodan 71-1631
Hexane Merck 34859
Methanol Merck 34860
Microcentrifuge tube Olympus Plastic 24-282
Mouse environmental chamber Caron Caron 7001-33
Potasium Chloride Fisher Bioreagents BP366-500
Potasium Phosphate MP Biomedicals 194727
SafeLock microcentrifuge tubes Eppendorf 30120086
Screw top amber GC vial Agilent 5182-0716
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Hydroxide Merck S5881
Sodium Phosphate, dibasic Fisher Bioreagents BP332-500
Sodium Sulfate Merck 239313
Sulfuric Acid Merck 258105
Vial insert Agilent 5183-2088

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. The Lancet, Diabetes Endocrinology. Childhood obesity: a growing pandemic. The Lancet. Diabetes & Endocrinology. 10 (1), 1 (2022).
  2. Gonzalez-Muniesa, P., et al. Obesity. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17034 (2017).
  3. Müller, T. D., Blüher, M., Tschöp, M. H., DiMarchi, R. D. Anti-obesity drug discovery: advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (3), 201-223 (2021).
  4. Virtue, S., Vidal-Puig, A. GTTs and ITTs in mice: simple tests, complex answers. Nature Metabolism. 3 (7), 883-886 (2021).
  5. Müller, T. D., Klingenspor, M., Tschöp, M. H. Revisiting energy expenditure: how to correct mouse metabolic rate for body mass. Nature Metabolism. 3 (9), 1134-1136 (2021).
  6. Virtue, S., Lelliott, C. J., Vidal-Puig, A. What is the most appropriate covariate in ANCOVA when analysing metabolic rate. Nature Metabolism. 3 (12), 1585 (2021).
  7. Hellerstein, M. K. De novo lipogenesis in humans: metabolic and regulatory aspects. European Journal of Clinical Nutrition. 53 Suppl 1, S53-S65 (1999).
  8. Zhao, S., et al. Dietary fructose feeds hepatic lipogenesis via microbiota-derived acetate. Nature. 579 (7800), 586-591 (2020).
  9. Wallace, M., et al. Enzyme promiscuity drives branched-chain fatty acid synthesis in adipose tissues. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1021-1031 (2018).
  10. Zhao, S., et al. ATP-citrate lyase controls a glucose-to-acetate metabolic switch. Cell Reports. 17 (4), 1037-1052 (2016).
  11. Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
  12. Zhang, Z., et al. Serine catabolism generates liver NADPH and supports hepatic lipogenesis. Nature Metabolism. 3 (12), 1608-1620 (2021).
  13. Chirala, S. S., et al. Fatty acid synthesis is essential in embryonic development: fatty acid synthase null mutants and most of the heterozygotes die in utero. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (11), 6358-6363 (2003).
  14. Icard, P., et al. ATP citrate lyase: A central metabolic enzyme in cancer. Cancer Letters. 471, 125-134 (2020).
  15. Fhu, C. W., Ali, A. Fatty acid synthase: an emerging target in cancer. Molecules. 25 (17), 3935 (2020).
  16. Lawitz, E. J., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibitor GS-0976 for 12 weeks reduces hepatic de novo lipogenesis and steatosis in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 16 (12), 1983e3-1991e3 (2018).
  17. Smith, G. I., et al. Insulin resistance drives hepatic de novo lipogenesis in nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of Clinical Investigation. 130 (3), 1453-1460 (2020).
  18. Imamura, F., et al. Fatty acids in the de novo lipogenesis pathway and incidence of type 2 diabetes: A pooled analysis of prospective cohort studies. PLoS Medicine. 17 (6), e1003102 (2020).
  19. Lai, H. T. M., et al. Serial plasma phospholipid fatty acids in the de novo lipogenesis pathway and total mortality, cause-specific mortality, and cardiovascular diseases in the cardiovascular health study. Journal of the American Heart Association. 8 (22), e012881 (2019).
  20. Ference, B. A., et al. Mendelian randomization study of ACLY and cardiovascular disease. The New England Journal of Medicine. 380 (11), 1033-1042 (2019).
  21. Herman, M. A., et al. A novel ChREBP isoform in adipose tissue regulates systemic glucose metabolism. Nature. 484 (7394), 333-338 (2012).
  22. Sanchez-Gurmaches, J., et al. Brown fat AKT2 Is a cold-induced kinase that stimulates ChREBP-mediated de novo lipogenesis to optimize fuel storage and thermogenesis. Cell Metabolism. 27 (1), 195e6-209e6 (2018).
  23. Wang, X., et al. Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter. II. Purification and characterization. The Journal of Biological Chemistry. 268 (19), 14497-14504 (1993).
  24. Briggs, M. R., Yokoyama, C., Wang, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter. I. Identification of the protein and delineation of its target nucleotide sequence. The Journal of Biological Chemistry. 268 (19), 14490-14496 (1993).
  25. Yokoyama, C., et al. SREBP-1, a basic-helix-loop-helix-leucine zipper protein that controls transcription of the low density lipoprotein receptor gene. Cell. 75 (1), 187-197 (1993).
  26. Chen, G., Liang, G., Ou, J., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Central role for liver X receptor in insulin-mediated activation of Srebp-1c transcription and stimulation of fatty acid synthesis in liver. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11245-11250 (2004).
  27. Denechaud, P. D., et al. ChREBP, but not LXRs, is required for the induction of glucose-regulated genes in mouse liver. The Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 956-964 (2008).
  28. Crewe, C., et al. SREBP-regulated adipocyte lipogenesis is dependent on substrate availability and redox modulation of mTORC1. JCI Insight. 5 (15), e129397 (2019).
  29. Batchuluun, B., Pinkosky, S. L., Steinberg, G. R. Lipogenesis inhibitors: therapeutic opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (4), 283-305 (2022).
  30. Wallace, M., Metallo, C. M. Tracing insights into de novo lipogenesis in liver and adipose tissues. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 65-71 (2020).
  31. Lee, W. N., et al. In vivo measurement of fatty acids and cholesterol synthesis using D2O and mass isotopomer analysis. The American Journal of Physiology. 266 (5 Pt 1), E699-E708 (1994).
  32. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, 143 (2016).
  33. Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
  34. Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. Journal of Mass Spectrometry. 31 (3), 255-262 (1996).
  35. Midani, F. S., Wynn, M. L., Schnell, S. The importance of accurately correcting for the natural abundance of stable isotopes. Analytical Biochemistry. 520, 27-43 (2017).
  36. Trefely, S., Ashwell, P., Snyder, N. W. FluxFix: automatic isotopologue normalization for metabolic tracer analysis. BMC Bioinformatics. 17 (1), 485 (2016).
  37. Jeong, H., et al. Correcting for naturally occurring mass isotopologue abundances in stable-isotope tracing experiments with PolyMID. Metabolites. 11 (5), 310 (2021).
  38. Millard, P., et al. IsoCor: isotope correction for high-resolution MS labeling experiments. Bioinformatics. 35 (21), 4484-4487 (2019).
  39. Brunengraber, D. Z., et al. Influence of diet on the modeling of adipose tissue triglycerides during growth. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolsim. 285 (4), E917-E925 (2003).
  40. Svensson, R. U., et al. Inhibition of acetyl-CoA carboxylase suppresses fatty acid synthesis and tumor growth of non-small-cell lung cancer in preclinical models. Nature Medicine. 22 (10), 1108-1119 (2016).
  41. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis: a technique for measuring biosynthesis and turnover of polymers. The American Journal of Physiology. 263 (5 Pt 1), E988-E1001 (1992).
  42. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic, and experimental considerations. The American Journal of Physiology. 276 (6), E1146-E1170 (1999).
  43. Kelleher, J. K., Masterson, T. M. Model equations for condensation biosynthesis using stable isotopes and radioisotopes. The American Journal of Physiology. 262 (1 Pt 1), E118-E125 (1992).
  44. Kelleher, J. K., Nickol, G. B. Isotopomer spectral analysis: utilizing nonlinear models in isotopic flux studies. Methods in Enzymology. 561, 303-330 (2015).
  45. Argus, J. P., et al. Development and application of FASA, a model for quantifying fatty acid metabolism using stable isotope labeling. Cell Reports. 25 (10), 2919.e8-2934.e8 (2018).
  46. Guilherme, A., et al. Control of adipocyte thermogenesis and lipogenesis through β3-adrenergic and thyroid hormone signal integration. Cell Reports. 31 (5), 107598 (2020).
  47. Guilherme, A., et al. Neuronal modulation of brown adipose activity through perturbation of white adipocyte lipogenesis. Molecular Metabolism. 16, 116-125 (2018).
  48. Guilherme, A., et al. Adipocyte lipid synthesis coupled to neuronal control of thermogenic programming. Molecular Metabolism. 6 (8), 781-796 (2017).
  49. Lodhi, I. J., et al. Inhibiting adipose tissue lipogenesis reprograms thermogenesis and PPARgamma activation to decrease diet-induced obesity. Cell Metabolism. 16 (2), 189-201 (2012).
  50. McCormack, J. G., Denton, R. M. Evidence that fatty acid synthesis in the interscapular brown adipose tissue of cold-adapted rats is increased in vivo by insulin by mechanisms involving parallel activation of pyruvate dehydrogenase and acetyl-coenzyme A carboxylase. The Biochemistry Journal. 166 (3), 627-630 (1977).
  51. Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Letters. 104 (1), 13-16 (1979).
  52. Negron, S. G., Ercan-Sencicek, A. G., Freed, J., Walters, M., Lin, Z. Both proliferation and lipogenesis of brown adipocytes contribute to postnatal brown adipose tissue growth in mice. Science Reports. 10 (1), 20335 (2020).
  53. Schlein, C., et al. Endogenous fatty acid synthesis drives brown adipose tissue involution. Cell Reports. 34 (2), 108624 (2021).
  54. Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. Journal of Lipid Research. 55 (11), 2276-2286 (2014).
  55. Adlanmerini, M., et al. Circadian lipid synthesis in brown fat maintains murine body temperature during chronic cold. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (37), 18691-18699 (2019).
  56. Yu, X. X., Lewin, D. A., Forrest, W., Adams, S. H. Cold elicits the simultaneous induction of fatty acid synthesis and beta-oxidation in murine brown adipose tissue: prediction from differential gene expression and confirmation in vivo. FASEB Journal. 16 (2), 155-168 (2002).
  57. Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 77 (2), 79-88 (1999).
  58. Diraison, F., Pachiaudi, C., Beylot, M. Measuring lipogenesis and cholesterol synthesis in humans with deuterated water: use of simple gas chromatographic/mass spectrometric techniques. Journal of Mass Spectrometry. 32 (1), 81-86 (1997).
  59. Yang, D., et al. Assay of low deuterium enrichment of water by isotopic exchange with [U-13C3]acetone and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 258 (2), 315-321 (1998).
  60. Fu, X., et al. Measurement of lipogenic flux by deuterium resolved mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 3756 (2021).
  61. Shah, V., Herath, K., Previs, S. F., Hubbard, B. K., Roddy, T. P. Headspace analyses of acetone: a rapid method for measuring the 2H-labeling of water. Analytical Biochemistry. 404 (2), 235-237 (2010).
  62. Argus, J. P., Yu, A. K., Wang, E. S., Williams, K. J., Bensinger, S. J. An optimized method for measuring fatty acids and cholesterol in stable isotope-labeled cells. Journal of Lipid Research. 58 (2), 460-468 (2017).
  63. Belew, G. D., Jones, J. G. De novo lipogenesis in non-alcoholic fatty liver disease: Quantification with stable isotope tracers. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), e13733 (2022).
  64. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  65. Belew, G. D., et al. Transfer of glucose hydrogens via acetyl-CoA, malonyl-CoA, and NADPH to fatty acids during de novo lipogenesis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2050-2056 (2019).
  66. Diraison, F., Pachiaudi, C., Beylot, M. In vivo measurement of plasma cholesterol and fatty acid synthesis with deuterated water: determination of the average number of deuterium atoms incorporated. Metabolism. 45 (7), 817-821 (1996).
  67. Ajie, H. O., et al. In vivo study of the biosynthesis of long-chain fatty acids using deuterated water. The American Journal of Physiology. 269 (2 Pt 1), E247-E252 (1995).
  68. Schloerb, P. R., Friis-Hansen, B. J., Edelman, I. S., Solomon, A. K., Moore, F. D. The measurement of total body water in the human subject by deuterium oxide dilution; with a consideration of the dynamics of deuterium distribution. The Journal of Clinical Investigation. 29 (10), 1296-1310 (1950).

Tags

Biologi utgåva 195 brun fettvävnad deuteriumoxid metabolisk väg funktionella roller metabolisk homeostas i hela kroppen fysiologiska processer patologiska processer glukosbortskaffande funktionsbedömning detaljerade protokoll kvantitativ metod gaskromatografimasspektrometri (GCMS) total fettsyra de novo-syntes kolkälla provberedning nedströmsberäkningar brunt fett metabolisk homeostas
Kvantitativ bestämning av <em>de</em> novo-fettsyrasyntes i brun fettvävnad med hjälp av deuteriumoxid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Turner, R., Mukherjee, R., Wallace,… More

Turner, R., Mukherjee, R., Wallace, M., Sanchez-Gurmaches, J. Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide. J. Vis. Exp. (195), e64219, doi:10.3791/64219 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter