Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

קביעה כמותית של סינתזת חומצות שומן דה נובו ברקמת שומן חומה באמצעות תחמוצת דאוטריום

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64219
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2,3,4
1UCD Conway Institute and UCD Institute of Food and Health, School of Agriculture and Food Science, University College Dublin, 2Division of Endocrinology, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 3Division of Developmental Biology, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה כמותית זולה המשתמשת תחמוצת דאוטריום וספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית גז (GCMS) לניתוח של חומצת שומן כוללת דה נובו ליפוגנזה ברקמת שומן חום in vivo.

Abstract

סינתזת חומצות שומן היא מסלול מטבולי מורכב ועתיר אנרגיה עם תפקידים תפקודיים חשובים בשליטה על הומאוסטזיס מטבולי של כל הגוף ותהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים אחרים. בניגוד למסלולים מטבוליים מרכזיים אחרים, כגון סילוק גלוקוז, סינתזת חומצות שומן אינה מוערכת באופן פונקציונלי באופן שגרתי, מה שמוביל לפרשנויות חלקיות של המצב המטבולי. בנוסף, קיים מחסור בפרוטוקולים מפורטים הזמינים לציבור המתאימים למצטרפים חדשים בתחום. במאמר זה אנו מתארים שיטה כמותית זולה המשתמשת בתחמוצת דאוטריום ובספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיית גז (GCMS) לניתוח סינתזת חומצת השומן הכוללת דה נובו ברקמת שומן חומה in vivo. שיטה זו מודדת את הסינתזה של תוצרי חומצת השומן סינתאז ללא תלות במקור פחמן, והיא עשויה להיות שימושית כמעט לכל רקמה, בכל מודל עכברי, ותחת כל הפרעה חיצונית. פרטים על הכנת המדגם עבור GCMS וחישובים במורד הזרם מסופקים. אנו מתמקדים בניתוח של שומן חום בשל רמות גבוהות של סינתזת חומצות שומן דה נובו ותפקידים קריטיים בשמירה על הומאוסטזיס מטבולי.

Introduction

השמנת יתר ומחלות מטבוליות נלוות הן מגיפה המסכנת את הדורות הנוכחיים והעתידיים 1,2. בדרך כלל מפושט כתוצאה של חוסר איזון בין צריכת אנרגיה והוצאה, חוסר הוויסות המטבולי הקשור להשמנת יתר משפיע על מספר רב של מסלולים מטבוליים הנשלטים על ידי גורמים סביבתיים אנדוגניים3. עם זאת, רק מסלולים מעטים נבדקים באופן שגרתי במודלים של בעלי חיים של חוסר ויסות מטבולי.

לדוגמה, סילוק גלוקוז נמדד באופן שגרתי על ידי בדיקות גלוקוז וסבילות לאינסולין, כנראה בשל פשטות השימוש במוניטורים ניידיםלגלוקוז 4. שיעורים יחסיים של גלוקוז וחמצון שומנים בכל הגוף נאמדים גם הם באופן שגרתי בהתבסס על יחס חילופי הנשימה ממבחני קלוריות עקיפים 5,6. עם זאת, רוב ההיבטים האחרים של חילוף החומרים אינם מוערכים באופן שגרתי. זה מוביל לפרשנויות חלקיות של המצב המטבולי ואפשרויות טיפוליות שהוחמצו. אחד המסלולים העיקריים מסוג זה הוא דה נובו ליפוגנזיס.

De novo lipogenesis (DNL) הוא התהליך שבו חומצות שומן חדשות נוצרות ממבשרים. גלוקוז נחשב לקודמן העיקרי התורם ל- DNL7 של כל הגוף, אולם מבשרים אחרים, כגון אצטט, פרוקטוז, לקטט וחומצות אמינו מסועפות שרשרת, הוכחו כמקורות פחמן רלוונטיים באופן מרחבי ותלוי מצב 8,9,10,11,12. DNL הוא תורם מרכזי להומאוסטזיס מטבולי והוא חיוני להתפתחות תקינה13. בנוסף, שינויים ב- DNL נקשרו לסרטן 14,15 ומטבולית 16,17,18 ומחלות לב וכלי דם 19,20.

מסלול DNL מורכב מרכיבי הליבה האנזימטיים ATP ציטראט ליאז (ACLY), אצטיל-CoA קרבוקסילאז (ACC1/2) וחומצת שומן סינתאז (FAS) המייצרים בעיקר פלמיטט, חומצת שומן רוויה בת 16 פחמן. עם זאת, ניתן לייצר גם חומצות שומן מוזרות ומסועפות שרשרת בשיעורים נמוכים יותר9. Elongases ו desaturases לשנות עוד יותר חומצות שומן אלה, יצירת מגוון רחב של מיני חומצות שומן שימושי עבור מגוון רחב של פונקציות (למשל, אחסון אנרגיה לטווח ארוך מניפולציה של נזילות הממברנה).

הביטוי של המנגנון האנזימטי DNL נשלט על ידי מספר קצר של גורמי שעתוק. המתוארים ביותר עד כה כוללים את משפחת החלבון קושר אלמנט רגולטורי סטרול (SREBP), חלבון קושר אלמנט תגובת פחמימות (ChREBP), וקולטן X בכבד (LXR) 21,22,23,24,25,26. למרות חפיפה לכאורה בתפקודם, דווח על תקנות אינדיבידואליות המבוססות על דומיננטיות סוג התא ומצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים 21,22,27,28.

למרבה הפלא, מספר מעכבים לשלבים נבחרים של מסלול DNL אושרו לשימוש קליני או נמצאים בשלבי פיתוח פרה-קליניים או קליניים עבור מספר מחלות, כולל השמנת יתר, מחלת כבד שומני לא אלכוהולי/סטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NAFLD/NASH), ומחלות לב וכלי דם29. מאמצים אלה מדגישים את הרלוונטיות של DNL בבריאות ובמחלות.

בשנים האחרונות, השימוש בשיטות להערכה כמותית של סינתזת חומצות שומן דה נובו גדל30. השיטה הנפוצה ביותר להערכה זו היא שימוש במים מסומנים כבדים (D2O), כאשר המימן המסומן הכבד משולב בשרשראות אציל במהלך הסינתזה הן באופן ישיר והן בעקיפין, באמצעות חילופי דאוטריום עם המימן של מצעי DNL NAPDH, אצטיל-CoA ומלוניל-CoA. למרות שגישה זו צוברת פופולריות, חסרים פרוטוקולים מפורטים הזמינים לציבור המתאימים למצטרפים חדשים בתחום. כאן, אנו מתארים שיטה להערכה כמותית של סינתזת דה נובו של מוצרים של FAS באמצעות D2O וספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיית גז (GCMS), עם חישובים שפותחו בעבר על ידי Lee et al.31. שיטה זו מודדת סינתזת חומצות שומן דה נובו ללא תלות במקור פחמן, והיא עשויה להיות שימושית כמעט לכל רקמה, בכל מודל עכבר, ותחת כל הפרעה חיצונית. כאן, אנו מתמקדים בניתוח של רקמת שומן חום (BAT) בשל רמות גבוהות של DNL ותפקידים קריטיים בשמירה על הומאוסטזיס מטבולי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי.

1. הכנת D2O

הערה: כדי להימנע משינויים ניסיוניים, הכינו תמיסה/מי שתייה מספיקים לכל העכברים למשך הניסוי.

  1. להזרקה תוך צפקית: יש לייצר 0.9% עם מי מלח D 2 O על ידי המסת 9 גרם NaCl לליטר D 2 O. לסנן דרךמסנן לא פירוגני של0.2מיקרומטר כדי לעקר.
  2. לשתיית D 2 O-water: לייצר 8% v/v D2 מים מועשרים O שישמשו כמי שתייה על ידי ערבוב 80 מ"ל של D2O לכל920 מ"ל של מי שתייה רגילים. ניתן לקבל מי שתייה רגילים ממתקן העכבר. יש לסנן דרך מסנן לא פירוגני של 0.2 מיקרומטר לצורך עיקור.

2. אפנון פעילות BAT על ידי אקלום טמפרטורה

  1. הפרידו בין העכברים כך שיהיו שני עכברים בכל כלוב שבועיים לפני תחילת ההסתגלות לטמפרטורה. שנה את אספקת המים לבקבוקי מים כדי שהעכברים יסתגלו וישמרו על כל הכלובים ב -22 מעלות צלזיוס.
  2. הכן את תאי הסביבה של העכבר שבוע לפני תחילת אקלום הטמפרטורה על ידי הגדרת הטמפרטורות המתאימות: 30 ° C עבור thermoneutrality, 22 ° C עבור טמפרטורת החדר, ו 18 ° C עבור חשיפה לקור.
  3. בתחילת אקלום הטמפרטורה יש להחליף את הכלובים בכלובים חדשים ללא העשרה סביבתית (כדי למנוע קינים). העבירו את הכלובים לטמפרטורה המתאימה להם.
    הערה: כלובים שהוקצו לניטרליות תרמית יישארו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 4 שבועות. כלובים שהוקצו לטמפרטורת החדר יישארו ב 22 °C (75 °F) במשך 4 שבועות. כלובים שהוקצו לחשיפה לקור יהפכו קרים יותר ויותר בלוח זמנים שבועי: 18 °C (75 °F) בשבוע הראשון, 14 °C (75 °F) בשבוע השני, 10 °C (75 °F) בשבוע השלישי ו 6 °C (66 °F) בשבוע הרביעי.
  4. החליפו כלובים מלוכלכים מדי שבוע לכל התנאים. בנוסף, החליפו את בקבוקי המזון והמים בחדשים שהותאמו מראש בטמפרטורה המתאימה למשך 24 שעות לפחות.
    הערה: שימו לב לכמויות המזון המתווספות מדי שבוע, במיוחד עבור עכברים בקור, שכן הם יצרכו כמות גדולה משמעותית של מזון בהשוואה לתנאים רגילים. לספק ליביטום.

3. ניהול D2O

  1. הזריקו לכל בעל חיים 0.9% w/v מלוחים-D2O במשקל גוף של 35 μL/g, 12 שעות-3 ימים לפני איסוף הרקמות, באמצעות הזרקה תוך צפקית באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט 26 גרם.
    הערה: עיין בסעיף הדיון לקבלת מידע נוסף על בחירת זמן תיוג מתאים.
  2. החליפו את בקבוקי המים לבקבוקים המכילים 8% מי שתייה מועשרים ב-O V/VD 2.

4. איסוף, עיבוד ואחסון פלזמה ורקמות

  1. בסוף הניסוי, הקריבו את העכברים באמצעות מתודולוגיות מאושרות (למשל, מנת יתר של פחמן דו חמצני ואחריה פריקת צוואר הרחם).
    1. השתמש רפידות חום/קירור או שיטות אחרות כדי למנוע שינויי טמפרטורה פתאומיים לפני המתת חסד שעלולים להשפיע על התוצאות. הרדימו את העכברים בהתאם למתודולוגיות מאושרות. המשך מיד לאיסוף דם ורקמות.
  2. לאסוף דם באמצעות ניקוב לב באמצעות מחט 26 G ולאחסן בצינור איסוף דם חומצה ethylenediaminetetraacetic. שמור את הדם על קרח עד עיבוד נוסף.
  3. פתח את העור לאורך הקו האמצעי של גב העכבר מהאזור התחתון של חלל בית החזה עד לאזור העליון של הצוואר, תוך משיכת העור למעלה כדי למנוע השפעה על רקמות מתחת לעור. ה- BAT interscapular ממוקם בין השכמות מתחת לשכבה דקה של רקמת שומן לבנה, והוא מורכב משתי אונות בצורת פירמידה.
    1. נקו את הרקמה על ידי שטיפה במי מלח חוצצים פוספט קר כקרח (PBS). טפחו על מגבת נייר כדי לסלק נוזלים עודפים, שקלו בקנה מידה אנליטי ואספו במיקרו-צינור.
    2. מיד הבזק להקפיא את הרקמה באמצעות חנקן נוזלי. ניתן לאסוף גם מחסני BAT אחרים.
  4. צנטריפוגה את דגימות הדם ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. לאחר צנטריפוגה, בזהירות לאסוף את הפלזמה מבלי להפריע גלולת תאי הדם האדומים. העבירו אותו למיקרו-צינור חדש וקר כקרח והקפיאו בחנקן נוזלי.
  5. יש לאחסן דגימות שומן חום ופלזמה בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.

5. מיצוי שומנים מרקמת השומן

  1. לפני תחילת החילוץ
    1. הכינו תמיסה של 1 מ"מ של חומצה הקסדצנואית31 במתנול בבקבוקון זכוכית. זה ישמש תקן חומצות שומן פנימי.
    2. קררו מראש את הכמות הנדרשת של כלורופורם (CHCl 3) ומתנול (CH3OH) במקפיא של -80°C, או על קרח יבש.
      הערה: ניתן להוסיף את נוגד החמצון di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) ל-CHCl3 בריכוז של 0.01% w/v (2.5 מ"ג/25 מ"ל) כדי למנוע חמצון של הקשרים הכפולים בחומצות שומן בלתי רוויות.
    3. תיוג מראש של צינורות מיקרוצנטריפוגות עבור כל דגימת רקמה וצינורית נוספת שתשמש לחילוץ ריק.
      אזהרה: CH 3 OH ו-CHCl3הם נדיפים מאוד ורעילים בשאיפה. יש להשתמש רק במנדפים מנדפים.
      הערה: למותגים שונים של צינורות מיקרוצנטריפוגות יש רמות שונות של פלמיטט רקע ויכולות שונות מבחינת מניעת דליפת ממס. אנו ממליצים לבדוק תחילה מגוון צינורות, כדי לוודא שנמנעת דליפת ממס ושיש בצינורות רמות מינימליות של פלמיטט מזהם. ראה Yao et al.32 לדיון נוסף.
  2. מוציאים את הדגימות מהמקפיא ומניחים על קרח יבש.
  3. הניחו את צינור המיקרו-צנטריפוגה המסומן מראש על איזון אנליטי וטשטשו את האיזון. מניחים פינצטה וסכין גילוח אזמל/פלדה על קרח יבש לקירור של 10-20 שניות.
    1. השתמשו בפינצטה כדי להוציא את דגימת הרקמה הקפואה מהצינור והניחו אותה על סירת שקילה מפלסטיק. ניתן להניח את סירת השקילה על גוש שטוח של קרח יבש או על משטח אחר מקורר מראש.
    2. באמצעות אזמל או סכין גילוח פלדה, לנתח חלק קטן של הרקמה, שווה ערך 5-15 מ"ג במשקל. מניחים בצינור המיקרוצנטריפוגה ורושמים את המשקל המדויק. חזור על הפעולה עבור כל דגימה. דגימות ניתן לאחסן במקפיא בשלב זה או ניתן להתקדם לשלבים הבאים עבור מיצוי שומנים.
      הערה: יש לוודא שהאזמל מנוקה כראוי עם 70% אתנול בין הדגימות ונעשה שימוש בסירת שקילה טרייה בין כל דגימה.
  4. הוסף 1 μL/mg של 10 mM hexadecenoic-d 31 (C16: 0-d31) חומצה לכל דגימה.
    זהירות: יש לבצע את השלבים הבאים (5.4 עד 5.8) תחת מכסה אדים בשל סיכון השאיפה של הממסים.
  5. הוסף 250 μL של CH 3 OH, 250 μL של H2O ו- 500 μL של CHCl3לכל דגימה עם שלושה חרוזי נירוסטה 5 מ"מ. הניחו את הצינורות בבלוק מקורר מראש של טחנת טחינה וערבבו את הדגימות בתדר רטט של 25 הרץ למשך 5 דקות, או השתמשו בהנחיות המומלצות על ידי היצרן לדגימות רקמות. מוציאים את החרוזים בעזרת מגנט.
  6. צנטריפוגה הדגימות ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
    הערה: לאחר הצנטריפוגה יש לראות הפרדה דו-פאזית ברורה כאשר השלב המימי העליון מכיל מטבוליטים קוטביים והשלב האורגני התחתון מכיל שומנים וחומצות שומן. אם לא נראית הפרדה, הוסף 250 μL של H2O וחזור על שלבי המערבולת והצנטריפוגה.
  7. באמצעות מיקרופיפטה, לקחת נפח קבוע מהשלב התחתון של כל דגימה לתוך צינורות microcentrifuge מסומן בהתאם.
  8. הוסף 500 μL של CHCl3 למדגם הנותר וחזור על שלבים 5.6-5.7.
  9. הניחו את הדגימות תחת גז חנקן או בוואקום צנטריפוגלי מקוררCHCl עמיד 3 בטמפרטורה של 4°C עד לייבוש מלא. דגימות מיובשות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד מוכן derivatization.
    הערה: ניתן גם לאסוף את השכבה העליונה של כל דגימה בשלב זה ולייבש אותה כמו בשלב 5.9 על מנת לנתח מטבוליטים קוטביים.

6. הכנת אסטרי מתיל חומצות שומן (FAMEs) וניתוח GCMS

  1. אסטריפיקציה וטרנסאסטריפיקציה המזורזת על ידי חומצה להכנת FAMEs
    זהירות: יש לבצע את השלבים הבאים מתחת למכסה אדים בשל סכנת השאיפה של הממסים.
    1. אם הדגימות אוחסנו במקפיא, יבשו תחת חנקן במשך 5 דקות כדי לוודא שאין מים.
    2. באמצעות ממיסים כיתה MS, פיפטה 98 מ"ל של נטול מים CH3OH לתוך בקבוק מדיה זכוכית. הוסיפו באיטיות 2 מ"ל של חומצה גופרתית נטולת מים למכסה האדים כדי ליצור 2% H2SO4 ב- CH3OH. מערבבים על ידי ערבול הבקבוק הסגור.
    3. הוסף 500 μL של 2% H2SO4 בתמיסת CH3OH לכל דגימה ומערבולת לזמן קצר.
    4. לדגור את הדגימות על בלוק חום ב 50 ° C במשך 2 שעות.
    5. הסר את הדגימות מבלוק החום והוסף 100 μL של תמיסת NaCl רוויה ו- 500 μL של הקסאן לכל דגימה.
    6. מערבבים את הדגימות במרץ בטמפרטורת החדר למשך דקה. השאירו את הדגימות לשבת במשך דקה; שני שלבים צריכים להיות ברורים לאחר מכן.
    7. אספו את השלב העליון לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה טרי (ראו הערה בסעיף 5.1.3 לבחירה מתאימה של צינור המיקרוצנטריפוגה).
    8. כדי למקסם את התפוקה, חזור על שלבים 6.1.5-6.1.7, איסוף הדגימה השנייה לאותן שפופרות מסומנות.
    9. יבשו את הדגימות בטמפרטורת החדר תחת גז חנקן.
    10. יש להשהות מחדש את הדגימות ב-20 μL/mg של הקסאן, ביחס למשקל הרקמה המקורי, ולהעביר מיד לבקבוקון זכוכית GC עם תוספת זכוכית.
      הערה: עבוד במהירות בעת העברת דגימות כדי למזער אידוי.
  2. ניתוח GCMS
    1. כדי לקבוע את שפע האיזוטופולוגים של FAME, הזריקו את הדגימות על ספקטרומטר מסה כרומטוגרפי גז מרובע יחיד (GCMS).
      הערה: בעוד שניתן להשתמש בסוגי עמודות רבים כדי לזהות פלמיטט, תוכנית הטמפרטורה הבאה נקבעה עבור עמודת GCMS שפותחה להפרדת חומצות שומן cis/isomers trans, כמפורט בטבלת החומרים. עמוד זה הוא באורך של 50 מ 'עם קוטר פנימי של 0.25 מ"מ.
    2. יש להזריק 1 μL של דגימה בכניסה מפוצלת/מפוצלת בטמפרטורת כניסה של 270°C, תוך שימוש בהליום כגז המוביל, הזורם ב-1 מ"ל/דקה. יש להשתמש בהזרקה ללא פיצול עבור חומצות שומן נמוכות בשפע עם זרימה כוללת של 19 מ"ל/דקה, טיהור מחיצה של 3 מ"ל/דקה, וזרימת טיהור לנביעה מפוצלת של 15 מ"ל/דקה ב-0.75 דקות. השתמש ביחס פיצול של 10:1-40:1 עבור חומצות שומן בשפע גבוה כגון palmitate ו oleate.
    3. השתמש בפרמטרים הבאים של התנור: טמפרטורה התחלתית של 80 מעלות צלזיוס; להגדיל ב 20 ° C / דקות מרווחים ל 170 ° C; להגדיל ב 1 ° C / דקות מרווחים ל 204 ° C; להגדיל ב 20 ° C / דקות מרווחים ל 250 ° C; ולאחר מכן להחזיק ב 250 ° C במשך 10 דקות.
    4. השתמש בפרמטרים הבאים של גלאי מסה סלקטיבי (MSD): מצב יינון פגיעת אלקטרונים של 70 eV וסרוק בטווח של 50-400 m/z במהירות סריקה של 1,562 (u/s) ותדירות של 4.1 סריקות לשנייה. השתמש בקו העברה ב 280 ° C, מקור יונים ב 230 ° C, ו quadrupole ב 150 ° C.
      הערה: ניתן להשתמש בעמודות אחרות, אך תוכנית הטמפרטורה תשתנה.
    5. רצף דגימות: סדר הדגימה של ההזרקה באופן אקראי והזריקו לפחות שניים או שלושה ריקים של הקסאן בתחילת הרצף, אחרי כל דגימה חמישית בתוך הרצף, ושתיים או שלוש בסוף הרצף.
    6. השתמש בתוכנה ספציפית למכשיר, או בתוכנה חופשית בגישה פתוחה כגון Metabolite-Detector33, כדי לשלב את היונים בטבלה 1 עבור כל חומצת שומן מתיל אסטר.
      הערה: תיארנו יונים המכסים איזוטופולוגים M1-M5 בטבלה 1 שמצאנו שמכסים את כמות שילוב הדאוטריום בחלון תיוג זה. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להרחיב זאת אם שטף דה נובו גבוה משמעותית ו / או זמן תיוג ארוך יותר משמש.
    7. השתמש בשפע של כל יון משולב כדי ליצור התפלגות איזוטופומר מסה, שבה ניתן להמיר את עוצמות היונים לשפע חלקי כך שסכום התפלגות איזוטופומר המסה שווה לאחד. עיין בגיליון האלקטרוני לדוגמה בקובץ המשלים.
      הערה: על מנת לקבוע במדויק את שילוב הדאוטריום, יש להשתמש בתיקון של שפע האיזוטופים הטבעיים כדי לאפשר נוכחות של איזוטופים טבעיים כגון 13C, 15N ו- 2H. זה מבוצע על ידי יישום מטריצת תיקון כפי שתואר על ידי פרננדז ואחרים.34,35, ולא ניתן לבצע על ידי חיסור MID של מטבוליט נמדד ללא תווית ממטבוליט מסומן. בפועל, אנו ממליצים להשתמש בתוכנות זמינות באופן חופשי כגון fluxfix 36, polyMID37 או IsoCor38 כדי להפוך נתונים גולמיים ל-MID חלקי, וסיפקנו את הנוסחה לתיקון איזוטופים עבור תוצרי מתיל אסטר של FAS בטבלה 1.
    8. כדי לקבוע את כמות הפלמיטט הקיימת, השתמש בנוסחה הבאה:
      Equation 1 
      כאשר ספירת היונים מתייחסת לסכום כל איזוטולוגי הפלמיטטים המשולבים בטבלה 1 ו-C16:0-d 31 מתייחסת לתקן הפנימי הקסדצנואי-d31. התקן הפנימי מהווה שיא נפרד מזה של הפלמיטט האנדוגני. ניתן לקבוע גם את השפע היחסי של חומצות שומן אחרות, אך ייתכן שיהיה צורך להשתמש בתקנים פנימיים של איזוטופים ספציפיים לחומצות שומן (עם שינויי מסה גדולים יותר מאלה שנצפו משילוב D2O) או בעקומות תקן חיצוניות לצורך כימות מלא. השתמש בדגימה הריקה שחולצה כדי לקבוע את כמות palmitate הרקע וחסר אותה מערך הרקמה הסופי.
    9. חשב את ההעשרה המולרית (ME) של פלמיטט לפי המשוואה הבאה:
      Equation 2
      כאשר Mi הוא השפע החלקי המנורמל של איזוטופולוג פלמיטט, ו- n הוא מספר איזוטופולוגים פלמיטטים אפשריים. לדוגמה, ME של מולקולת פלמיטט עם התפלגות השברים הבאה, M1 = 0.25, M2 = 0.08, M3 = 0.02, הוא: (0.025*1) + (0.08*2) + (0.02*3) = 0.245 (ראה קובץ משלים).

7. החלפת דאוטריום אצטון של דגימות פלזמה לקביעת העשרת מי הגוף

  1. התגובה
    1. הכינו 10 תקנים של דאוטריום במים, הנעים בין 0-9% v/v.
    2. הכינו תמיסת 5% v/v אצטון/אצטוניטריל המאפשרת 4 μL לדגימה, כולל התקנים משלב 5.1.1.
    3. בצינורות מיקרוצנטריפוגות מסומנים עם נעילה בטוחה, יש לשלב 10 μL של כל דגימת פלזמה או תקן, 4 μL של 10 M NaOH ו-4 μL של 5% אצטון/אצטוניטריל. בצע זאת בשלשה עבור כל דגימה.
    4. מערבבים את הדגימות בעדינות על ידי פיפט. תנו לדגימות לדגור בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
  2. חילוץ
    1. לאחר הדגירה, להוסיף 450-550 מ"ג של Na2SO4 לכל דגימה.
    2. במכסה האדים מוסיפים 600 μL שלCHCl 3 לכל צינור ומערבלים במרץ במשך 15 שניות.
    3. צנטריפוגה את הדגימות ב 300 x גרם במשך 2 דקות.
    4. מתחת למכסה המנוע, מעבירים משולש, 80 μL aliquots של supernatant מכל דגימה לתוך בקבוקוני GCMS זכוכית מסומנים עם תוספות זכוכית ומכסה בחוזקה.
  3. ניתוח GCMS
    1. יש להפריד דגימות על עמודה (30 מטר, 0.25 מ"מ i.d, Agilent DB-35MS) ולנתח על ספקטרומטר המסות המצורף.
      1. יש להזריק 1 μL של דגימה בכניסה מפוצלת/מפוצלת, עם יחס פיצול של 40:1, זרימת הליום של 1 מ"ל/דקה וטמפרטורת כניסה של 270°C.
      2. השתמשו בפרמטרים הבאים של התנור: טמפרטורה התחלתית של 60°C, הגדילו במרווחים של 20°C/min ל-100°C, הגדילו במרווחים של 50°C/min ל-220°C ולאחר מכן החזיקו ב-220°C למשך דקה אחת.
      3. השתמש בפרמטרים הבאים של גלאי מסה סלקטיבי (MSD): מצב יינון פגיעת אלקטרונים ב- 70 eV עם ניטור יונים נבחרים של 58 ו- 59 m/z. השתמש בקו העברה ב 280 ° C, מקור יונים ב 230 ° C, ו quadrupole ב 150 ° C.
        הערה: ניתן להשתמש בעמודות אחרות בעלות דממות נמוכות, מלוכדות, מקושרות וקוטביות בינונית, אך תוכנית הטמפרטורה תשתנה.
    2. הגדר את שיטת הדוגם הנוזלי כך שתתחיל בשטיפתCHCl 3 ולאחר מכן רצף אקראי של הדגימות, כולל שלבי שטיפה נוספים של CHCl3 כל שש דגימות.
      הערה: אם אצטון משמש לשטיפת מחטים עבור הדוגם האוטומטי, החלף ב-CHCl 3 או הקסאן והזריק דגימות CHCl3 ריקות מרובות עד ששיא אצטון מזהם כלשהו אינו ניכר עוד בכרומטוגרמה.
    3. בשיטה זו, שיא אצטון מגיע למהירות של כ-1.25 דקות. לשלב את הנתונים ולחשב את שפע השברים של העשרת אצטון לפי שלבים 6.2.6-6.2.7, עם התאמה לניתוח פסגות המכילות יחס m/z של 58-60 כמצוין בטבלה 1.
    4. השתמש בתקנים כדי ליצור עקומה סטנדרטית כדי לקבוע את אחוז העשרת המים בגוף (p) של דגימות הבדיקה, בהתבסס על העשרה חלקית של אצטון.

8. חישובי In vivo de novo lipogenesis

  1. חשב את החלק של חומצות שומן מסונתזות חדשות (FNS) שהן תוצרים ישירים של FAS (כלומר, פלמיטט, חומצות שומן אי-זוגיות שרשרת ו-mmBCFAs) בכל דגימה באמצעות המשוואה הבאה:
    Equation 3
    כאשר ME הוא ההעשרה המולרית הממוצעת של מולקולת פלמיטט (שלב 6.2.9), p הוא העשרת הדאוטריום במים מדגימת הפלזמה המתאימה (שלב 7.3.4), ו-N הוא מספר אטומי המימן הניתנים להחלפה על פלמיטט שבהם ניתן לשלב דאוטריום.
  2. קבע N באמצעות המשוואה שמתחתיה נקבעה על ידי Lee et al.31:
    Equation 4
  3. קבע את הכמות המולרית של חומצות שומן מסונתזות חדשות (MNS) על ידי:
    MNS = FNS x כמות חומצת השומן הכוללת (רקמת nmol/mg).
    הערה: לדוגמה, אם משיגים העשרה מולרית פלמיטטית (ME) של 0.245, העשרת דאוטריום במי גוף (p) של 0.045, ומספר N מחושב של 22, הסינתזה החלקית של פלמיטט היא 0.247. אם כמות הפלמיטט הקיימת ברקמה היא 2 mmol / mg, אז mmol של palmitate מסונתז חדש הוא 0.494 mmol / mg (ראה קובץ משלים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בהתבסס על מינון D 2 O המתואר בשלב 1, אנו מוצאים בדרך כלל שמי הגוף מועשרים בטווח של2.5% עד 6%, וכי רמה בסיסית של העשרת דאוטריום במי הגוף מושגת במהירות תוך שעה אחת ונשמרת למשך המחקר באמצעות מי שתייה מועשרים של 8% (איור 1). העשרת מי גוף במצב יציב רציף היא הנחה של החישובים המשמשים בשלב 6, ולכן אנו ממליצים על תיקוף ניסיוני של הקינטיקה של העשרת מי הגוף במודלים ניסיוניים חדשים.

מצאנו שכמות חומצות השומן המסונתזות דה נובו גדלה בטמפרטורת החדר, יחסית לאלה שבננוטרליות התרמו-נייטרלית ב-BAT (איור 2). התפלגות איזוטופולוג המסה של פלמיטט ב-BAT מעכברים בתרמו-נייטרליות ובטמפרטורת החדר לאחר 3 ימים של מתן D2O מראה העשרה גבוהה יותר של דאוטריום M1 ו-M2 שנמצאה בטמפרטורת החדר (איור 2A). העשרת הטמפרטורה הקרה הזו מתרחשת לא רק בפלמיטט, אלא גם במגוון רחב של חומצות שומן ב-BAT (איור 2B). השפע הכולל של פלמיטטים גדל גם ב-BAT של עכברים בטמפרטורת החדר, ובשילוב של קצב סינתזת השברים עם רמות הפלמיטט הכוללות, מצאנו שסינתזת פלמיטט כוללת גדלה בעכברים בטמפרטורת החדר (איור 2C,D). יש לציין כי העשרת חומצות השומן הכוללת בפלזמה אינה עוקבת אחר אותה מגמה כמו BAT, אלא במקום זאת, העשרת חומצות שומן מוגברת עם ניטרליות תרמית (איור 2E). ספיגה פוטנציאלית מפותלת מסינתזה אנדוגנית אינה אפשרית בגישת נקודת זמן יחידה D2O, כפי שמתואר כאן, אך מגמות מנוגדות אלה מצביעות על כך שדפוס העשרת חומצות השומן ב- BAT אינו מונע על ידי ספיגת חומצות שומן.

Figure 1
איור 1: אחוז העשרת D2 O בפלזמה של עכברים על פני נקודות זמן מרובות, לאחר הזרקה עם 0.035 מ"ל/גרם משקל גוף 0.9% NaCl D 2 O והחלפת מי שתייה במים מועשרים 8% D2O. תרשימי עמודות מייצגים ממוצע ± SD. n = 9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תוצאות מייצגות ברקמת שומן חומה בעכברים לאחר 3 ימים של מתן D 2 O. (A) התפלגות איזוטופולוגית מסה של פלמיטט בעטלף לאחר 3 ימים של מתן D2O בטמפרטורת החדר (RT) ותרמו-נייטרליות (TN). (B) העשרה מולרית BAT של מגוון חומצות שומן לאחר 3 ימים של מתן D2O בטמפרטורת החדר ובתרמו-ניטרליות. (C) שפע כולל והפלמיטט המסונתז (D) דה נובו ברקמת שומן חום לאחר 3 ימים של מתן D 2O בטמפרטורת החדר ובתרמו-ניטרליות. (E) העשרה מולרית פלזמה של מגוון חומצות שומן לאחר 3 ימים של מתן D2O בטמפרטורת החדר ובתרמו-ניטרליות. תרשימי עמודות מייצגים ממוצע ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. n = 6. הניתוח הסטטיסטי נקבע על ידי מבחן t דו-זנבי של סטודנטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרכובת יונים זמן יציאה משוער (דקות) נוסחה לתיקון איזוטופים
ג16:0 270-275 20 ג17ח34O2
C14:0 242-247 16.5 ג15ח30O2
C15:0 256-261 18 ג16ח32O2
ISO-C16:0 270-275 18.9 ג17ח34O2
ISO-C17:0 284-289 21 ג18ח36O2
אנטייסו-C17:0 284-289 21.5 ג18ח36O2
C16 D31 301 19.2 ~
אצטון 58-59 1.5 ג3ח6O

טבלה 1: יוני שבר מורכבים GCMS לשילוב. טבלה זו מכסה מגוון חומצות שומן המיוצרות על-ידי חומצת שומן יונקים סינתאז, אך C16:0 הוא המוצר העיקרי. כל זמני השמירה הם עבור שיטת GCMS המפורטת בשלב 6 למעט אצטון, המפורט בשלב 7.

קובץ משלים: חישוב גיליון אלקטרוני לדוגמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הבנת האיזון והאינטראקציה בין מסלולים מטבוליים מורכבים היא צעד הכרחי לקראת הבנת הבסיס הביולוגי של מחלות הקשורות לחילוף חומרים. כאן, אנו מראים מתודולוגיה לא פולשנית וזולה כדי לקבוע שינויים בסינתזת חומצות שומן דה נובו. שיטה זו מבוססת על שיטות שפורסמו בעבר אשר פיתחו חישובים להערכת שטף סינתזה דה נובו מהעשרת חומצת שומן דאוטריום31 ולשימוש בחילופי דאוטריום-אצטון לקביעת האחוז היחסי של D2O במי גוף39. בשנים האחרונות לקחנו את השיטה המתוארת כאן ויישמנו אותה כדי לחשוף שינויים בסינתזה של חומצות שומן מגוונות במחסני שומן, במוח, בכבד ובגידולים 9,22,40. ישנם מספר שלבים קריטיים והיבטים הניתנים לשינוי של פרוטוקול זה. אלה קשורים לתכנון הניסוי הכולל, כמו גם לגישה האנליטית ולחישובים המשמשים בשיטה זו. גישות חלופיות לחישוב סינתזת חומצות שומן דה נובו מעוקבי איזוטופים יציבים נמצאות גם בשימוש נרחב. אלה כוללים את גישת ניתוח התפלגות איזוטופומר המסה החלופית (MIDA) שפותחה על ידי Hellerstein et al.41,42, ניתוח ספקטרלי איזוטופומר (ISA) שפותחה על ידי Kelleher et al.43,44, וגישות חדשות יותר שפותחו כדי למדל את הסינתזה של חומצות שומן ארוכות שרשרת כגון ניתוח מקור חומצות שומן (FASA)45. היתרון של השיטה כאן הוא שהיא ניתנת ליישום בקלות עם תוכנה זמינה באופן חופשי ושימוש בגיליון אלקטרוני. עם זאת, הוא מוגבל על ידי הצורך בהעשרת מי גוף (BWE) להיות במצב יציב, אזהרות הקשורות לניצול הפרמטר N (נדון להלן), וכי הוא חל רק על מוצרים ישירים של FAS שהוא בעיקר palmitate.

DNL שומן חום והסתגלות לטמפרטורה
DNL זינק כגולם עיקרי של ויסות מטבולי של כל הגוף והוא חיוני להתפתחות תקינה13,29. מחיקה ממוקדת רקמות וניתוח מטבולי איתרו מספר שחקני מפתח אנזימטיים ושעתוק השולטים ב- DNL ברקמת השומן, וכיצד הוא שולט בהצטברות שומן בכל הגוף והומאוסטזיס מטבולי תקין 21,28,46,47,48,49. למרות שהיא פחות מוערכת, BAT היא רקמה פעילה מאוד ב-DNL, עם ביטוי גבוה יותר של מנגנון אנזימי DNL בגוף הליבה (acly, acaca, fasn) מאשר רוב הרקמות האחרות ופעילות ליפוגנית גבוהה יותר 22,50,51,52,53,54,55. עם זאת, BAT הוא ייחודי, במובן זה שהסתגלות לטמפרטורות תת-תרמו-ניטרליות גורמת בו זמנית לפעילות חמצון DNL וחומצות שומן ב-BAT 22,54,56. למרות שהמנגנונים הקשורים אינם ברורים לחלוטין, מקובל כי BAT הוא כיור מטבולי עבור חומרים מזינים, כולל אלה המיועדים DNL עבור סינתזת שומנים, אשר חיוניים לפעילות BAT נורמלית53,55. ככזה, הוא רלוונטי להיות מסוגל להסביר את כל ההכנסות המטבוליות ואת התוצאות של BAT כדי להעריך את רמות הפעילות שלה. עם זאת, DNL נמדד בדרך כלל רק על סמך ביטוי גנים ומוערך תפקודית בהזדמנויות שנספרו. הפרוטוקול המוצע כאן מאפשר הערכה תפקודית של DNL, ומאפשר פרשנות מלאה יותר של המצב המטבולי.

D2O מינון, תזמון ומדידת העשרת מי גוף
אחד השלבים הקריטיים העיקריים בתכנון הוא המינון והתזמון של מתן D2O. בפרוטוקול זה, אנו נוקטים בגישת מינון ומתן (הזרקת בולוס ואחריה העשרת מי שתייה) שמצאנו שמובילה להישגים מהירים ושמירה על BWE במצב יציב. החישובים המשמשים לקביעת סינתזת חומצות שומן מבוססים על ההנחה של מצב יציב BWE; לכן, זה חיוני כי זה מאומת במודלים ניסיוניים חדשים. אם העשרת מצב יציב אינה אפשרית עקב בעיות בשימוש בגישת מינון משולבת זו, הקורא מופנה לפרסומים אחרים שבהם שינויים בחישובים מאפשרים זאת39. מידת השונות מהמצב היציב שניתן לסבול, כאשר משתמשים בגישת מינון שמטרתה להשיג במהירות זאת תלויה בגורמים רבים. אם BWE גדל בעליות מתמשכות מעל הערך המשמש לחישוב, אז על ידי שימוש בגישה כאן, DNL יהיה overestimated. אם BWE נמוך משמעותית מהערך המשמש לחישוב עבור פרקי זמן מתמשכים, DNL יוערך בחסר. בעוד שצפויה שונות קלה סביב הממוצע, הגורם הקריטי ביותר הוא ש-BWE אינו משתנה יותר בקבוצת ניסוי אחת מאשר באחרת, מה שעלול להוביל להבדלים ב-DNL המחושב המונעים על ידי שונות ב-BWE. אם שתי קבוצות הניסוי יציגו שונות קלה אך דומה לאורך זמן, הסיבולת של זה תהיה תלויה בדיוק ובדיוק שבו החוקר דורש את המדידה לבצע, כמו גם את ההבדלים הצפויים בין קבוצות הניסוי. לדוגמה, במקרה של רקמת שומן חומה החשופה לניטרליות תרמית לעומת טמפרטורת החדר, אשר סופקה כדוגמה כאן, ההבדל בכמות חומצת השומן המסונתזת דה נובו נוכח גדול מ -50%; לכן, וריאציות קטנות ב- BWE לא צפויות לטשטש את התוצאות.

בנוסף להתחשבות במצב היציב, היבט נוסף הניתן לשינוי של פרוטוקול זה הוא רמת BWE. BWE מוגבר עשוי לאפשר העברה מוגברת של תוויות לחומצות שומן, ולכן, מאגרי חומצות שומן עם מחזור נמוך יותר עשויים להיות ניתנים לזיהוי בקלות רבה יותר בפרק זמן קצר יותר. זה יכול להיות יתרון במצבים שבהם החוקר מעוניין בתגובות חריפות ב- DNL. עם זאת, עלייה ברמות D2O במי הגוף עלולה לגרום להשפעות פיזיולוגיות לא רצויות, ולכן יש לנקוט משנה זהירות57. מתן רמות נמוכות יותר של D 2 O להשגת רמות BWE בדרך כלל סביב 0.5% משמש בדרך כלל במחקרים בבני אדם בשל העלותהקשורה למתן D2O. במקרה זה, ייתכן שיהיה צורך בשיטות עם רגישות מוגברת כדי לכמת BWE והעשרת חומצות שומן. עבור BWE, ניתן להשיג זאת באמצעות ספקטרומטריית מסה של יחס יונים58 או פרוטוקול חילופי אצטון שונה59. עבור ניתוח חומצות שומן, השימוש במכשיר GCMS ברזולוציה גבוהה הוכח לאחרונה כמגביר את הרגישות של מדידת דאוטריום בחומצות שומן, ובכך מאפשר כימות של DNL לאחר פרקי זמן קצרים מאוד ו / או BWE60 נמוך. ניתן להשתמש בשיטות חלופיות גם כדי להגדיל את התפוקה שבה BWE נמדד, על ידי שימוש בניתוחי headspace של האצטון שנוצר בשלב 7.1.5 במקום לחלץ אותו עם CHCl3 ולבצע הזרקת נוזלים. פעולה זו מקטינה את זמן הפעולה של השיטה ומונעת שלבי העברה מרובים, ובכך מפחיתה את זמן הכנת הדגימה. אם קיימת גישה למזרק headspace, שיטה זו מומלצת מאוד61.

בחירת מאגר חומצות שומן לכימות וגישה אנליטית
בפרוטוקול זה, השיטה נועדה למדוד את מאגר חומצות השומן הכולל ברקמה או בפלזמה, ללא קשר לסוג השומנים. עם זאת, ניתן להפריד בין מחלקות שומנים לפני יצירת FAME, באמצעות שיטות כגון כרומטוגרפיה של שכבה דקה או כרומטוגרפיה נוזלית. בנוסף, בעת ניתוח סרום או פלזמה, שומנים משברים ליפופרוטאין ספציפיים, כגון ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL), עשויים להיות מבודדים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה58. שיטה זו משמשת בדרך כלל במחקרים בבני אדם על מנת לוודא DNL בכבד, אשר עשוי להיות המקור העיקרי של חומצות שומן המיוצרות דה נובו ב- VLDL. ניתן גם לשנות את פרוטוקול מיצוי השומנים והדריבציה כדי לשפר את הבידוד של כיתות ספציפיות62. לבסוף, ניתן למדוד את העשרת הדאוטריום של מימן ליפידי גם באמצעות ספקטרוסקופיית 2H NMR ולא באמצעותספקטרומטריית מסות. למרות ששיטה זו פחות רגישה מטרשת נפוצה ולכן דורשת חומר מוגבר, היתרון שלה הוא שהיא נותנת מידע העשרה מיקום, שניתן להשתמש בו כדי להעריך טוב יותר את שיעורי ההתארכות והרוויה63.

חישוב
החישובים בפרוטוקול זה מבוססים על חישובים קודמים המביאים בחשבון BWE במצב יציב, העשרת חומצות שומן ומספר המימנים הניתנים להחלפה על חומצות השומן31. כמו בכל חישוב, ישנן מספר מגבלות והנחות שיש לקחת בחשבון בעת יישום ופירוש התוצאות מגישה זו. אחד השיקולים העיקריים הוא הערך המשמש ל-N בסעיף 8 לשיטה. במהלך סינתזת חומצות שומן, 2 H מ D 2Oמשולב בשרשרת acyl, כמו גם בעקיפין באמצעות חילופי עם מימן על NADPH, אצטיל-CoA, ו malonyl-CoA64,65. מחקרים קודמים הראו כי חילופי דברים אלה אינם שלמים31,66; לפיכך, החישוב משלב מקדם תיקון (N) כדי לאפשר65 זה. N of 22 נפוץ במחקרים רבים, שכן בעבר נמצא כי זה מתאים למגוון רקמות באמצעות המשוואה המתוארת בשלב 631,66. עם זאת, זה עשוי להשתנות בהתאם להפרעה הניסויית ומודל בעלי חיים65; לכן, אנו קוראים לחוקרים לקחת זאת בחשבון. N נמוך יותר מגדיל את שטף הסינתזה הכולל, ויש לקחת בחשבון את הערך המשמש לפרמטר זה בעת השוואת מדידות בין מחקרים או מעבדות. מגבלה של הגישה המשמשת כאן היא שהיא רלוונטית רק לניתוח תוצרים ישירים של FAS שהוא בעיקר פלמיטט, עם כמויות נמוכות בהרבה של חומצות שומן שרשרת מוזרות וחומצות שומן מסועפות שרשרת מונו-מתיל9. למרות שניתן לזהות העשרת דאוטריום של כל חומצות השומן, הנוסחה המשמשת כאן אינה מתאימה לקביעת הסינתזה של חומצות שומן ארוכות שרשרת, כגון C18:0, מכיוון שהיא אינה מאפשרת ספיגה של חומצות שומן לא מסומנות והתארכות של67 אלה. באופן דומה, שיעורי הרוויה עשויים גם להיות מוערכים בחסר.

מגבלות כלליות
למרות שהשימוש ב- D2O למדידת חומצות שומן יצר תובנה מכרעת לגבי חשיבות ה- DNL בהומאוסטזיס פיזיולוגי, ישנן מספר מגבלות הקשורות למתודולוגיה זו. ראשית, בהתבסס על העיתוי המתואר כאן, לא ניתן להיות בטוחים לחלוטין ברקמת המקור של חומצות השומן המסונתזות החדשות. קל לדמיין תרחיש שבו רקמה מסוימת מייצרת חומצות שומן מ- DNL, ולאחר מכן אלה מועברים לרקמות אחרות. ניסויי קורס זמן משובח לאחר טיפול D2O יכולים להגדיל את הרזולוציה של רקמת המקור עבור חומצות שומן מסונתזות חדשות, הפחתת זיהום רקמות צולבות. נקודת הזמן בת 3 הימים שנוצלה לתוצאות המייצגות תוכננה לזהות העשרת דאוטריום במגוון חומצות שומן הן בתרמו-ניטרליות (כאשר השטף נמוך יותר) והן בטמפרטורת החדר. נקודות זמן קצרות יותר לאחר מתן D2O, כאשר פלמיטט הוא המטרה העיקרית, ממזער את העברת חומצות השומן בין רקמות ולכן עשוי להיות יתרון. נקודות זמן קצרות בהרבה (למשל, 12 שעות) יהיו אידיאליות כאשר בוחנים עכברים בתנאי קור וכאשר ניטרליות תרמית אינה כלולה בתכנון הניסוי. שנית, שיטה זו אינה מספקת מידע על מצע המקור של חומצות השומן החדשות. זיהוי המצעים הספציפיים המשמשים בנסיבות מסוימות יכול להיות שכבת מידע נוספת הנחוצה להבנה מלאה של מפת הרגולציה של DNL. ניתן לעשות זאת עם מצעים המסומנים באיזוטופים יציבים.

היתרונות
יתרון מיוחד של מתודולוגיה זו הוא שבעלי חיים אינם מרוסנים (למעט הזרקה ראשונית של D2O) ומודעים במהלך ההליך, מה שמקדם סביבת לחץ נמוכה לבעלי חיים להתנהג באופן טבעי, כולל אמבולציה רצויה ודפוס האכלה וכמות המאפשרים טיפול תזונתי ספציפי במידת הצורך. D2O הוא גם קל להפליא לניהול. בניגוד לתמיסות נוזליות של עוקבים אחרים (למשל, 13C-U-גלוקוז), ל- D2O אין תכונות טעימות מובהקות העשויות להשפיע על צריכת המים. מעבר לנותבי איזוטופים יציבים, השיטה השנייה הנפוצה ביותר היא רדיואיזוטופים. היתרון הפוטנציאלי של רדיואיזוטופים הוא בחירת ציוד לאיתור. ספקטרומטר מסות נדרש עבור איזוטופים יציבים, בעוד רדיואיזוטופים ניתן לזהות באמצעות מונה scintillation, אשר עשוי להיות נגיש יותר. עם זאת, ישנם מספר חסרונות הקשורים רדיואיזוטופים בשל בעיות בטיחות ואתיקה. בנוסף, הרדיואיזוטופ הוא בדרך כלל על גלוקוז ולכן אינו משקף רק שינויים ב- DNL, אלא שינויים ב- DNL הנגזר מגלוקוז. בנוסף, קביעת הסינתזה של חומצות שומן בודדות אינה אפשרית. D2O מתאזן במהירות רבה יותר בכל הרקמות בהשוואה למצעים ספציפיים עם תוויות איזוטופים68.

DNL הוא מרכיב מרכזי בהומאוסטזיס מטבולי הנשלט על ידי מספר אנזימים וגורמי שעתוק שכל אחד מהם משפיע באופן עצמאי על התפתחות, חילוף חומרים ומצבי מחלה. לפיכך, DNL חייב להיות מסלול מטבולי עיקרי, שיהיה צורך לחקור באופן רחב יותר במחקר ופיתוח טיפול. פרוטוקול זה עשוי לשמש כצעד ראשון קדימה בשילוב ניתוח DNL באופן שגרתי בפנוטיפ מטבולי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לחברי המעבדה של סאנצ'ז-גורמצ'י וואלאס על דיונים חשובים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מאיגוד הלב האמריקאי (18CDA34080527 ל- JSG ו- 19POST34380545 ל- RM), NIH (R21OD031907 ל- JSG), פרס נאמן CCHMC, פרס מרכז CCHMC לגנומיקה של ילדים, ופרס מרכז CCHMC לגנומיקה מנדליאנית וטיפול. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH P30 DK078392 של מרכז הליבה לחקר מחלות עיכול בסינסינטי. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. RT ו- MW נתמכו על ידי מלגת UCD Ad Astra.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 mL Glass Vials Fisher Scientific 14-955-334
0.2 µm filter Olympus Plastic 25-244
26G needeled syringes BD 309597
Acetone Merck 34850
Acetonitrile Merck 900667
Blue GC screw cap with septa Agilent 5190-1599
Centrifuge Eppendorf 5424R
Chloroform Sigma 366927
Deuterium oxide Sigma 151882
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Merck B1378
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Agilent CP7419
EDTA tube Sarstedt 411395105
Ethanol Merck 51976
Hexadecenoic-d31 Acid Larodan 71-1631
Hexane Merck 34859
Methanol Merck 34860
Microcentrifuge tube Olympus Plastic 24-282
Mouse environmental chamber Caron Caron 7001-33
Potasium Chloride Fisher Bioreagents BP366-500
Potasium Phosphate MP Biomedicals 194727
SafeLock microcentrifuge tubes Eppendorf 30120086
Screw top amber GC vial Agilent 5182-0716
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Hydroxide Merck S5881
Sodium Phosphate, dibasic Fisher Bioreagents BP332-500
Sodium Sulfate Merck 239313
Sulfuric Acid Merck 258105
Vial insert Agilent 5183-2088

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. The Lancet, Diabetes Endocrinology. Childhood obesity: a growing pandemic. The Lancet. Diabetes & Endocrinology. 10 (1), 1 (2022).
  2. Gonzalez-Muniesa, P., et al. Obesity. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17034 (2017).
  3. Müller, T. D., Blüher, M., Tschöp, M. H., DiMarchi, R. D. Anti-obesity drug discovery: advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (3), 201-223 (2021).
  4. Virtue, S., Vidal-Puig, A. GTTs and ITTs in mice: simple tests, complex answers. Nature Metabolism. 3 (7), 883-886 (2021).
  5. Müller, T. D., Klingenspor, M., Tschöp, M. H. Revisiting energy expenditure: how to correct mouse metabolic rate for body mass. Nature Metabolism. 3 (9), 1134-1136 (2021).
  6. Virtue, S., Lelliott, C. J., Vidal-Puig, A. What is the most appropriate covariate in ANCOVA when analysing metabolic rate. Nature Metabolism. 3 (12), 1585 (2021).
  7. Hellerstein, M. K. De novo lipogenesis in humans: metabolic and regulatory aspects. European Journal of Clinical Nutrition. 53 Suppl 1, S53-S65 (1999).
  8. Zhao, S., et al. Dietary fructose feeds hepatic lipogenesis via microbiota-derived acetate. Nature. 579 (7800), 586-591 (2020).
  9. Wallace, M., et al. Enzyme promiscuity drives branched-chain fatty acid synthesis in adipose tissues. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1021-1031 (2018).
  10. Zhao, S., et al. ATP-citrate lyase controls a glucose-to-acetate metabolic switch. Cell Reports. 17 (4), 1037-1052 (2016).
  11. Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
  12. Zhang, Z., et al. Serine catabolism generates liver NADPH and supports hepatic lipogenesis. Nature Metabolism. 3 (12), 1608-1620 (2021).
  13. Chirala, S. S., et al. Fatty acid synthesis is essential in embryonic development: fatty acid synthase null mutants and most of the heterozygotes die in utero. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (11), 6358-6363 (2003).
  14. Icard, P., et al. ATP citrate lyase: A central metabolic enzyme in cancer. Cancer Letters. 471, 125-134 (2020).
  15. Fhu, C. W., Ali, A. Fatty acid synthase: an emerging target in cancer. Molecules. 25 (17), 3935 (2020).
  16. Lawitz, E. J., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibitor GS-0976 for 12 weeks reduces hepatic de novo lipogenesis and steatosis in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 16 (12), 1983e3-1991e3 (2018).
  17. Smith, G. I., et al. Insulin resistance drives hepatic de novo lipogenesis in nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of Clinical Investigation. 130 (3), 1453-1460 (2020).
  18. Imamura, F., et al. Fatty acids in the de novo lipogenesis pathway and incidence of type 2 diabetes: A pooled analysis of prospective cohort studies. PLoS Medicine. 17 (6), e1003102 (2020).
  19. Lai, H. T. M., et al. Serial plasma phospholipid fatty acids in the de novo lipogenesis pathway and total mortality, cause-specific mortality, and cardiovascular diseases in the cardiovascular health study. Journal of the American Heart Association. 8 (22), e012881 (2019).
  20. Ference, B. A., et al. Mendelian randomization study of ACLY and cardiovascular disease. The New England Journal of Medicine. 380 (11), 1033-1042 (2019).
  21. Herman, M. A., et al. A novel ChREBP isoform in adipose tissue regulates systemic glucose metabolism. Nature. 484 (7394), 333-338 (2012).
  22. Sanchez-Gurmaches, J., et al. Brown fat AKT2 Is a cold-induced kinase that stimulates ChREBP-mediated de novo lipogenesis to optimize fuel storage and thermogenesis. Cell Metabolism. 27 (1), 195e6-209e6 (2018).
  23. Wang, X., et al. Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter. II. Purification and characterization. The Journal of Biological Chemistry. 268 (19), 14497-14504 (1993).
  24. Briggs, M. R., Yokoyama, C., Wang, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter. I. Identification of the protein and delineation of its target nucleotide sequence. The Journal of Biological Chemistry. 268 (19), 14490-14496 (1993).
  25. Yokoyama, C., et al. SREBP-1, a basic-helix-loop-helix-leucine zipper protein that controls transcription of the low density lipoprotein receptor gene. Cell. 75 (1), 187-197 (1993).
  26. Chen, G., Liang, G., Ou, J., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Central role for liver X receptor in insulin-mediated activation of Srebp-1c transcription and stimulation of fatty acid synthesis in liver. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11245-11250 (2004).
  27. Denechaud, P. D., et al. ChREBP, but not LXRs, is required for the induction of glucose-regulated genes in mouse liver. The Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 956-964 (2008).
  28. Crewe, C., et al. SREBP-regulated adipocyte lipogenesis is dependent on substrate availability and redox modulation of mTORC1. JCI Insight. 5 (15), e129397 (2019).
  29. Batchuluun, B., Pinkosky, S. L., Steinberg, G. R. Lipogenesis inhibitors: therapeutic opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (4), 283-305 (2022).
  30. Wallace, M., Metallo, C. M. Tracing insights into de novo lipogenesis in liver and adipose tissues. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 65-71 (2020).
  31. Lee, W. N., et al. In vivo measurement of fatty acids and cholesterol synthesis using D2O and mass isotopomer analysis. The American Journal of Physiology. 266 (5 Pt 1), E699-E708 (1994).
  32. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, 143 (2016).
  33. Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
  34. Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. Journal of Mass Spectrometry. 31 (3), 255-262 (1996).
  35. Midani, F. S., Wynn, M. L., Schnell, S. The importance of accurately correcting for the natural abundance of stable isotopes. Analytical Biochemistry. 520, 27-43 (2017).
  36. Trefely, S., Ashwell, P., Snyder, N. W. FluxFix: automatic isotopologue normalization for metabolic tracer analysis. BMC Bioinformatics. 17 (1), 485 (2016).
  37. Jeong, H., et al. Correcting for naturally occurring mass isotopologue abundances in stable-isotope tracing experiments with PolyMID. Metabolites. 11 (5), 310 (2021).
  38. Millard, P., et al. IsoCor: isotope correction for high-resolution MS labeling experiments. Bioinformatics. 35 (21), 4484-4487 (2019).
  39. Brunengraber, D. Z., et al. Influence of diet on the modeling of adipose tissue triglycerides during growth. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolsim. 285 (4), E917-E925 (2003).
  40. Svensson, R. U., et al. Inhibition of acetyl-CoA carboxylase suppresses fatty acid synthesis and tumor growth of non-small-cell lung cancer in preclinical models. Nature Medicine. 22 (10), 1108-1119 (2016).
  41. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis: a technique for measuring biosynthesis and turnover of polymers. The American Journal of Physiology. 263 (5 Pt 1), E988-E1001 (1992).
  42. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic, and experimental considerations. The American Journal of Physiology. 276 (6), E1146-E1170 (1999).
  43. Kelleher, J. K., Masterson, T. M. Model equations for condensation biosynthesis using stable isotopes and radioisotopes. The American Journal of Physiology. 262 (1 Pt 1), E118-E125 (1992).
  44. Kelleher, J. K., Nickol, G. B. Isotopomer spectral analysis: utilizing nonlinear models in isotopic flux studies. Methods in Enzymology. 561, 303-330 (2015).
  45. Argus, J. P., et al. Development and application of FASA, a model for quantifying fatty acid metabolism using stable isotope labeling. Cell Reports. 25 (10), 2919.e8-2934.e8 (2018).
  46. Guilherme, A., et al. Control of adipocyte thermogenesis and lipogenesis through β3-adrenergic and thyroid hormone signal integration. Cell Reports. 31 (5), 107598 (2020).
  47. Guilherme, A., et al. Neuronal modulation of brown adipose activity through perturbation of white adipocyte lipogenesis. Molecular Metabolism. 16, 116-125 (2018).
  48. Guilherme, A., et al. Adipocyte lipid synthesis coupled to neuronal control of thermogenic programming. Molecular Metabolism. 6 (8), 781-796 (2017).
  49. Lodhi, I. J., et al. Inhibiting adipose tissue lipogenesis reprograms thermogenesis and PPARgamma activation to decrease diet-induced obesity. Cell Metabolism. 16 (2), 189-201 (2012).
  50. McCormack, J. G., Denton, R. M. Evidence that fatty acid synthesis in the interscapular brown adipose tissue of cold-adapted rats is increased in vivo by insulin by mechanisms involving parallel activation of pyruvate dehydrogenase and acetyl-coenzyme A carboxylase. The Biochemistry Journal. 166 (3), 627-630 (1977).
  51. Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Letters. 104 (1), 13-16 (1979).
  52. Negron, S. G., Ercan-Sencicek, A. G., Freed, J., Walters, M., Lin, Z. Both proliferation and lipogenesis of brown adipocytes contribute to postnatal brown adipose tissue growth in mice. Science Reports. 10 (1), 20335 (2020).
  53. Schlein, C., et al. Endogenous fatty acid synthesis drives brown adipose tissue involution. Cell Reports. 34 (2), 108624 (2021).
  54. Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. Journal of Lipid Research. 55 (11), 2276-2286 (2014).
  55. Adlanmerini, M., et al. Circadian lipid synthesis in brown fat maintains murine body temperature during chronic cold. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (37), 18691-18699 (2019).
  56. Yu, X. X., Lewin, D. A., Forrest, W., Adams, S. H. Cold elicits the simultaneous induction of fatty acid synthesis and beta-oxidation in murine brown adipose tissue: prediction from differential gene expression and confirmation in vivo. FASEB Journal. 16 (2), 155-168 (2002).
  57. Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 77 (2), 79-88 (1999).
  58. Diraison, F., Pachiaudi, C., Beylot, M. Measuring lipogenesis and cholesterol synthesis in humans with deuterated water: use of simple gas chromatographic/mass spectrometric techniques. Journal of Mass Spectrometry. 32 (1), 81-86 (1997).
  59. Yang, D., et al. Assay of low deuterium enrichment of water by isotopic exchange with [U-13C3]acetone and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 258 (2), 315-321 (1998).
  60. Fu, X., et al. Measurement of lipogenic flux by deuterium resolved mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 3756 (2021).
  61. Shah, V., Herath, K., Previs, S. F., Hubbard, B. K., Roddy, T. P. Headspace analyses of acetone: a rapid method for measuring the 2H-labeling of water. Analytical Biochemistry. 404 (2), 235-237 (2010).
  62. Argus, J. P., Yu, A. K., Wang, E. S., Williams, K. J., Bensinger, S. J. An optimized method for measuring fatty acids and cholesterol in stable isotope-labeled cells. Journal of Lipid Research. 58 (2), 460-468 (2017).
  63. Belew, G. D., Jones, J. G. De novo lipogenesis in non-alcoholic fatty liver disease: Quantification with stable isotope tracers. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), e13733 (2022).
  64. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  65. Belew, G. D., et al. Transfer of glucose hydrogens via acetyl-CoA, malonyl-CoA, and NADPH to fatty acids during de novo lipogenesis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2050-2056 (2019).
  66. Diraison, F., Pachiaudi, C., Beylot, M. In vivo measurement of plasma cholesterol and fatty acid synthesis with deuterated water: determination of the average number of deuterium atoms incorporated. Metabolism. 45 (7), 817-821 (1996).
  67. Ajie, H. O., et al. In vivo study of the biosynthesis of long-chain fatty acids using deuterated water. The American Journal of Physiology. 269 (2 Pt 1), E247-E252 (1995).
  68. Schloerb, P. R., Friis-Hansen, B. J., Edelman, I. S., Solomon, A. K., Moore, F. D. The measurement of total body water in the human subject by deuterium oxide dilution; with a consideration of the dynamics of deuterium distribution. The Journal of Clinical Investigation. 29 (10), 1296-1310 (1950).

Tags

ביולוגיה גיליון 195 רקמת שומן חום תחמוצת דאוטריום מסלול מטבולי תפקידים פונקציונליים הומאוסטזיס מטבולי לכל הגוף תהליכים פיזיולוגיים תהליכים פתולוגיים סילוק גלוקוז הערכה תפקודית פרוטוקולים מפורטים שיטה כמותית ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיית גז (GCMS) סינתזת חומצת שומן דה נובו מקור פחמן הכנת דגימה חישובים במורד הזרם שומן חום הומאוסטזיס מטבולי
קביעה כמותית של סינתזת חומצות שומן <em>דה נובו</em> ברקמת שומן חומה באמצעות תחמוצת דאוטריום
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Turner, R., Mukherjee, R., Wallace,… More

Turner, R., Mukherjee, R., Wallace, M., Sanchez-Gurmaches, J. Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide. J. Vis. Exp. (195), e64219, doi:10.3791/64219 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter