Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Sebrafisk larver som en modell for å evaluere potensielle radiosensibilisatorer eller beskyttere

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/64233
Automatic Translation
*1,3, *1,3, 1,4, 2,3, 2, 1
1Tumor microenvironment and animal models lab, Institute of Life Sciences, 2Vascular Biology lab, Institute of Life Sciences, 3Regional Centre for Biotechnology, 4School of Biotechnology, KIIT University
* These authors contributed equally

Summary

Sebrafisken har nylig blitt utnyttet som en modell for å validere potensielle strålingsmodifikatorer. Denne protokollen beskriver de detaljerte trinnene for å bruke sebrafiskembryoer til strålingsbaserte screeningeksperimenter og noen observasjonsmetoder for å evaluere effekten av ulike behandlinger og stråling.

Abstract

Sebrafisk er mye brukt i flere typer forskning fordi de er en av de lett vedlikeholdte virveldyrmodellene og viser flere funksjoner i et unikt og praktisk modellsystem. Siden svært proliferative celler er mer utsatt for strålingsindusert DNA-skade, er sebrafiskembryoer en frontlinje in vivo-modell i strålingsforskning. I tillegg projiserer denne modellen effekten av stråling og ulike medikamenter i løpet av kort tid, sammen med store biologiske hendelser og tilhørende responser. Flere kreftstudier har brukt sebrafisk, og denne protokollen er basert på bruk av strålemodifikatorer i sammenheng med strålebehandling og kreft. Denne metoden kan lett brukes til å validere effekten av forskjellige legemidler på bestrålte og kontrollembryoer (ikke-bestrålt), og dermed identifisere stoffer som radiosensibiliserende eller beskyttende stoffer. Selv om denne metoden brukes i de fleste narkotikascreeningseksperimenter, er detaljene i forsøket og toksisitetsvurderingen med bakgrunn av røntgenstrålingseksponering begrenset eller bare kort adressert, noe som gjør det vanskelig å utføre. Denne protokollen løser dette problemet og diskuterer prosedyren og toksisitetsevalueringen med en detaljert illustrasjon. Prosedyren beskriver en enkel tilnærming for bruk av sebrafiskembryoer til strålestudier og strålebasert legemiddelscreening med stor pålitelighet og reproduserbarhet.

Introduction

Sebrafisk (Danio rerio) er en velkjent dyremodell som har vært mye brukt i forskning de siste 3 tiårene. Det er en liten ferskvannsfisk som er lett å oppdrette og avle under laboratorieforhold. Sebrafisken har vært mye brukt i ulike utviklings- og toksikologiske studier 1,2,3,4,5,6,7,8. Sebrafisken har høy fruktbarhet og kort embryonal generasjon; Embryoene er egnet for å spore forskjellige utviklingsstadier, er visuelt gjennomsiktige og er mottagelige for varianter av genetisk manipulasjon og screeningsplattformermed høy gjennomstrømning 9,10,11,12,13,14. Dessuten gir sebrafisken in toto og levende bildebehandling for hvilken dens utviklingsprosess og forskjellige deformiteter i nærvær av forskjellige giftige stoffer eller faktorer lett kan studeres ved hjelp av stereo eller fluorescerende mikroskopi 7,15,16.

Strålebehandling er en av de viktigste terapeutiske modusene som brukes i behandling av kreft 17,18,19,20,21,22,23,24. Imidlertid krever kreftstrålebehandling potensielle radioprotektorer for å beskytte normale friske celler mot å dø mens de dreper ondartede celler eller beskytter menneskers helse under behandling som involverer høyenergistrålinger 25,26,27,28,29. Omvendt blir potente radiosensibilisatorer også undersøkt for å øke effektiviteten av stråling for å drepe ondartede celler, spesielt i målrettede og presisjonsterapier30,31,32,33. Derfor, for å validere potente radioprotektorer og sensibilisatorer, er en modell egnet for semi-high-throughput medikamentscreening og målbart utstilling av strålingseffekter svært etterspurt. Flere tilgjengelige modeller brukes i strålestudier og er involvert i narkotikascreeningsforsøk. Imidlertid er høyere vertebrater og til og med den mest brukte in vivo-modellen, mus, uegnet for storskala legemiddelscreening fordi det er tidkrevende, kostbart og utfordrende å designe slike screeningseksperimenter med disse modellene. På samme måte er cellekulturmodeller ideelle for varianter av narkotikascreeningseksperimenter med høy gjennomstrømning34,35. Imidlertid er eksperimenter som involverer cellekultur ikke alltid pragmatiske, svært reproduserbare eller pålitelige, da celler i kultur kan markert endre deres oppførsel i henhold til vekstbetingelsene og kinetikken. Også varianter av celletyper viser differensiell strålingssensibilisering. Spesielt representerer 2D- og 3D-cellekultursystemer ikke hele organismescenariet, og dermed kan de oppnådde resultatene ikke rekapitulere det faktiske nivået av radiotoksisitet36,37. I denne forbindelse gir sebrafisken flere fordeler ved screening for nye radiosensibilisatorer og radioprotektorer. Den enkle håndteringen, stor clutchstørrelse, kort levetid, rask embryonal utvikling, embryogjennomsiktighet og liten kroppsstørrelse gjør sebrafisken til en egnet modell for storskala legemiddelscreening. På grunn av de ovennevnte fordelene kan eksperimenter lett gjentas på kort tid, og effekten kan lett observeres under et dissekerende mikroskop i flerbrønnsplater. Derfor blir sebrafisken stadig mer populær i narkotikascreeningsforskning som involverer strålingsstudier38,39.

Potensialet til sebrafisk som en bonafide modell for å skjerme strålingsmodifikatorer har blitt demonstrert i ulike studier 40,41,42,43,44,45. Den radiobeskyttende effekten av potensielle radiomodifikatorer, som nanopartikkel DF1, amifostin (WR-2721), DNA-reparasjonsproteiner KU80 og ATM, og transplanterte hematopoietiske stamceller, og effekten av radiosensibilisatorer, som flavopiridol og AG1478, i sebrafiskmodellen er rapportert 19,41,42,43,44,45,46 . Ved hjelp av det samme systemet ble den radioprotektive effekten av DF-1 (fullerene nanopartikkel) vurdert både på systemisk og organspesifikt nivå, og også bruken av sebrafiskembryoer for radioprotektorscreening ble videre utforsket47. Nylig ble Kelulut-honningen rapportert som en radiobeskytter i sebrafiskembryoer og ble funnet å øke embryooverlevelsen og forhindre organspesifikk skade, cellulær DNA-skade og apoptose48.

På samme måte ble de radioprotektive effektene av polymerer generert via Hantzschs reaksjon kontrollert på sebrafiskembryoer i en høy gjennomstrømningsscreening, og beskyttelsen ble hovedsakelig gitt ved å beskytte celler mot DNA-skade49. I en av de tidligere studiene ble det lipofile statinfluvastatinet funnet som en potensiell radiosensibilisator ved bruk av sebrafiskmodellen med denne tilnærmingen50. Tilsvarende anses gull nanopartikler å være en ideell radiosensibilisator og har blitt brukt i mange studier51,52.

Den embryonale utviklingen i sebrafisk innebærer spaltning i de første 3 timene hvor en encellet zygote deler seg for å danne 2 celler, 4 celler, 8 celler, 16 celler, 32 celler og 64 celler som lett identifiseres med et stereomikroskop. Deretter oppnår den blastulastadiet med 128 celler (2,25 timer etter befruktning, hpf), hvor cellene dobles hvert 15. minutt og fortsetter gjennom følgende stadier: 256 celler (2,5 hpf), 512 celler (2,75 hpf) og når 1000+ celler på bare 3 timer (figur 1). Ved 4 timer oppnår egget kuletrinnet, etterfulgt av dannelsen av en kuppelform i embryonalmassen 7,53,54. Gastruleringen i sebrafisk starter fra 5,25 hpf54, hvor den når skjoldstadiet. Skjoldet indikerer tydelig den raske konvergensbevegelsen av cellene til den ene siden av kimringen (figur 1) og er en fremtredende og distinkt fase av gastrulaterende embryoer som lett kan identifiseres53,54. Selv om strålingseksponering for embryoer kan gjøres på et hvilket som helst stadium av utviklingen, kan strålingseksponering under gastrulering ha tydeligere morfologiske endringer som muliggjør bedre avlesninger av strålingsinduserte toksisiteter55; På samme måte kan administrasjon av legemidler til embryoer startes så tidlig som 2 HPF54.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien ble gjennomført med forhåndsgodkjenning fra og etter retningslinjene fra Institutional Animal Ethical Committee, Institute of Life Sciences, Bhubaneswar. Alt vedlikehold og avl av sebrafisk ble utført ved et omgivende fiskekulturanlegg ved 28,5 °C, og embryoene ble opprettholdt i en biologisk oksygenbehov (BOD) inkubator ved en temperatur på 28,5 °C. Her ble sebrafiskens AB-stamme brukt, og iscenesettelsen ble utført i henhold til Kimmel et al.54. Røntgenstråling ble gitt ved 6 hpf (skjoldstadium), og forskjellige fenotyper ble observert til 120 hpf.

1. Avlsoppsett og embryoinnsamling

  1. Sett avlstankene (består av polykarbonat, kapasitet 1 L, se materialtabell). Hell systemvann (pH, 6,8-7,5; konduktivitet, 500 μS; og temperatur, 28,5 °C) i avlstankene som dekker nesten 40% av volumet. Plasser skillelinjen i tanken for å lage to kamre, en for kvinner og den andre for menn.
  2. Fra foreldretankene samler du forsiktig to friske hunner og en frisk hann ved hjelp av et nett, legger dem i sine respektive halvdeler og holder dem i mørket over natten (minimum 10 timer) ved 28,5 °C.
  3. Neste morgen, fjern skillelinjen og la fiskene pare seg uten å forstyrre avlstanker.
    MERK: Hunnene begynner å gyte, og eggene vil bli sett liggende på bunnen av tanken innen 10-15 min etter at fiskene har fått lov til å pareseg 56,57,58.
  4. Returner fiskene til tankene etter gyting, samle embryoene fra avlstanken ved hjelp av en sil, vask dem ordentlig med systemvannet, og hold de oppsamlede eggene i en petriskål med E-3-medier (4,94 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,43 mM CaCl2, 0,85 mM MgCl2-salter, 1% w / v metylenblå, se Materialfortegnelse).
  5. Vær oppmerksom på eggene under et dissekerende mikroskop, fjern de ubefruktede eller døde embryoene ved hjelp av en Pasteur-pipette, og hold petriskplatene som inneholder befruktede egg i E-3-mediet ved 28,5 ° C i en inkubator for riktig vekst og vedlikehold.
    MERK: Unfertilized egg kan identifiseres med et melkehvitt utseende med en koagulert korion eller med ruptured celler inne i korionen. Sammen med ubefruktede egg må egg som ikke gjennomgår spaltning og egg med deformiteter som uregelmessigheter under spaltning, for eksempel asymmetri, vesikkeldannelse eller skader på korionen, eller ikke aktivt utvikle, kasseres for å holde de innsamlede embryoene sunne og for å holde mediet rent 7,56.

2. Overvåking av embryoer og seleksjon for stråleforsøk

  1. Overvåk de voksende embryoene under dissekeringsmikroskopet, identifiser riktig stadium 7,54, og fjern eventuelle døde eller usunne embryoer. Sørg for tilstrekkelig embryo staging som stråling og medikament doser vil bli gitt på et bestemt gastrulasjonsstadium.
    MERK: Sjekk hver dag nivået og kvaliteten på mediene i kulturrettene. Bytt media hver 24. time, sammen med fjerning av døde embryoer. Pasteurpipetter foretrekkes å brukes til å plukke embryoer eller bytte medier.
  2. Før du starter forsøket, fordel forsiktig de sunne embryoene i eksperimentelle plater ved hjelp av en Pasteur-pipette. For hver eksperimentell gruppe, ta 15-20 embryoer.
    MERK: Plasser bare friske embryoer av de ønskede utviklingsstadiene i forsøksplaten. Anta at medikamentell behandling må gjøres med embryoer ved 6 hpf, og begynn deretter å så dem i eksperimentelle plater minst 30-60 minutter tidligere.

3. Narkotikabehandling

  1. Tilsett legemidler med ønsket konsentrasjon til sebrafiskembryoene. Forbered det stoffholdige E-3-mediet i god tid. Sørg for at stamløsningen av legemidlet ikke har noe uoppløst legemiddel før du klargjør arbeidsmediet for behandling av sebrafiskembryoer.
  2. Før du legger til et legemiddel til et medium for strålingsscreening, kontroller den cytotoksiske effekten av legemidlet med karakterene av konsentrasjoner av legemidlet. Følg OECDs retningslinjer for å evaluere LC 50 av legemidlene som er under evaluering 59,60,61.
    MERK: Vær forsiktig når du flytter tallerkener og tallerkener under bestrålings- eller observasjonstiden. Det er mange sjanser for at platene vil bli forstyrret under denne håndteringen, noe som får media til å lekke ut av brønnene eller embryoene til å spyle ut av sine respektive brønner, potensielt forurense nærliggende brønner og ødelegge eksperimentet.

4. Røntgenbestråling

  1. Mens du setter opp et strålingseksperiment, inkluderer du en kontroll / ikke-bestrålt og en strålingsgruppe. På samme måte, mens du utfører en narkotikascreening, inkluderer en annen gruppe hvor stoffene vil bli gitt med samme konsentrasjon som de som administreres i screeningseksperimentet sammen med stråling.
    MERK: Merk både lokket og bunnen på brønnplater eller kulturfat slik at lokkene ikke blir feilplassert.
  2. Fordel embryoene i en brønnplate hvis stråleskjoldene kan dekke og beskytte de ekstra brønnene mot stråling mens de andre brønnene utsettes for en bestemt stråledose; Ellers bruk individuelle plater eller plater for å frø embryoene per stråledose.
  3. Slå på røntgenbestrålermaskinen (se materialfortegnelse), og start maskinens initialisering og oppvarming.
    MERK: Avstandsverdien fra kilde til emne (SSD) må være 50 cm. man kan bruke forskjellige SSD-er igjen, noe som krever standardisering.
  4. Plasser eksperimentplaten under bestråleren inne i maskinen i midten, sørg for at platen er rett under røntgenkilden, og sett deretter dosen (f.eks. 5 GY) og start røntgenstrålen.
    MERK: Forsegl platene med parafinfilm for å unngå uønsket søl eller forurensning under transport av platene fra inkubatoren til bestråleren og tilbake.
  5. Etter ferdigstillelse av bestråling, ta ut platene, slå av maskinprogrammet, slå av maskinen og kontroller platene under mikroskopet umiddelbart etter stråling. Fjern de døde embryoene og returner platene til inkubatoren ved 28,5 °C. Registrer antall døde embryoer etter å ha evaluert dem under dissekeringsmikroskopet.
    MERK: Bestråle de forskjellige gruppene av embryoer med utpekte stråledoser uten mye forsinkelse mellom individuelle grupper, da effekten av stråling kan bli betydelig påvirket av forskjellen i utviklingsstadiet.
    FORSIKTIG: Ta riktige beskyttelsestiltak mens du bruker røntgenmaskinen.

5. Datainnsamling, avbildning og analyse

  1. Samle inn data med forhåndsbestemte tidsintervaller, for eksempel hver 24. time etter at strålingen er gitt. Registrer alle mulige observasjoner som overlevelse, klekkeeffektivitet, utviklingsstadium, antall hjerteslag, kropps- og halekrumning, perikardial ødem, forlengelse av eggeplommesekken, mikrocefali, svømmeblæreutvikling, generell motilitet eller aktivitet, etc.62,63,64.
  2. For å ta bilder, velg representative embryoer på et rent lysbilde, sjekk embryoene under mikroskopet, orienter dem i en bestemt retning og klikk på bilder. Gi nytt navn til bildefilene i henhold til gruppe og tid.
    MERK: Den samme forstørrelsen og belysningen må brukes når du tar bilder med forskjellige tidsintervaller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den generelle utformingen av protokollen er vist i figur 2. Effekten av stråling og karakteriseringen på en doseavhengig måte ble evaluert med følgende analyser.

Vurdering av røntgenindusert toksisitet
Ved hjelp av et stereomikroskop ble følgende abnormiteter vurdert og karakterisert etter medikamentell behandling og / eller stråling. I henhold til OECDs retningslinjer 61, for toksisitetsevaluering hos fisk, ble fire store apikale endepunkter, inkludert koagulering av embryoer, deformiteter i somittdannelse, ikke-løsrivelse av halen fra eggeplommesekken og reduksjon eller fravær av hjerteslag, inkludert for å analysere den totale toksisiteten61. Den akutte toksisiteten ble bestemt basert på et positivt utfall i noen av de ovennevnte abnormiteter. I tillegg til disse fire hovedendepunktene ble det også utført morfologisk observasjon for ryggrads- eller halebøying, hodemisdannelse og mikrokefali, utviklingsdefekter, perikardødem, eggeplommesekkdeformiteter, svømmeblæredeformiteter og endringer i øyestruktur (figur 3C og figur 4). Skåringen for radiotoksisitet kunne baseres på overlevelsesprosent og/eller skåring av forskjellige morfologiske abnormiteter.

Overlevelsesprosent og overlevelseskurve
Overlevelsesprosenten ble beregnet ved å dele de totale levende embryoene med det totale antall embryoer som opprinnelig ble tatt i en gruppe og multiplisere resultatet med 100 38,50,65. Deretter ble verdiene som tilsvarer forskjellige tidspunkter og forskjellige eksperimentelle grupper plottet for å oppnå overlevelseskurven. Denne studien gir overlevelseskurven for embryoer bestrålt ved 6 hpf (figur 3A).

Store avvik assosiert med strålingsindusert toksisitet (figur 3 og figur 4)
Krumning av kropp og halebøyning
Dette er en av de vanligste parameterne for å vurdere eventuelle toksisitetsinduserte deformiteter i sebrafiskembryoer 50,65,66. Kroppskurvaturdeformiteter kan ses i forskjellige mønstre som spenner fra lav til moderat, til alvorlig, med bøyning i posthepatisk haleregion eller i hovedkroppsaksen eller til og med med en helt halvcirkelformet ryggrad eller mer enn en bøyning i kroppsaksen og i halen. Ved lavere stråledoser kan det hende at bøyningen ikke vises i alle embryoene, men kan utvikle seg i de fleste embryoene. Med en økning i dose øker alvorlighetsgraden av bøyning også og påvirker alle individer. I denne studien ble disse deformitetene observert i embryoene behandlet med en 10 GY dose stråling.

Perikardial og hjerteødem
Embryoer behandlet med giftige eksponeringer som stråling og legemidler utover tolerable områder eller i giftige doser utvikler også perikardial ødem65,66. Embryoer utsatt for røntgenstråling viser perikardial og hjerteødem, hvor væske akkumuleres i perikardialhulen og hjertet, noe som resulterer i et hovent perikard og hjerte.

Eggeplomme sac ødem, fortykning av eggeplommen og eggeplomme sac innsnevring
Etter røntgeneksponeringen ser man at eggeplommesekken i noen fisk blir tykkere eller beholdt, noe som antyder toksisiteten av røntgenstråling. I noen tilfeller kan man også se generell innsnevring av eggeplommesekken, hvor eggeplommeforlengelsen er kort, eller ødemutvikling i eggeplommeområdet.

Reduksjon i hodestørrelse (mikrocefali)
Et forventet resultat av tung stråling er reduksjonen i størrelsen på hodet, eller mikrocefali, som kan identifiseres når behandlede embryoer sammenlignes med embryoene i kontrollgruppen.

Svøm blære deformiteter
Etter bestråling ser man at svømmeblæren er redusert eller kompromittert hos noen få embryoer, og svømmeblærens deformitet er større når det gjelder embryoer utsatt for høyere stråledoser, noe som kan bidra til lav bevegelse eller redusert svømmeevne hos embryoer utsatt for høye røntgendoser.

Endring i øyestruktur
Stråling kan forårsake enorme DNA-skader og proteinendringer, som til slutt forårsaker celledød og reduksjon i celletall eller død av spesifikke celletyper65. Øyet kan påvirkes av intense stråledoser, og liten øyestørrelse og en reduksjon i cellelagene har blitt observert55.

Hjerteslag per minutt (bpm)
Hjerteslagene per minutt ble talt ved å observere embryoene under stereomikroskopet. Når stråledosen øker, har bpm en tendens til å synke (figur 3B). Fem larver ble vurdert til å beregne bpm på hvert tidspunkt per gruppe. En reduksjon i antall hjerteslag kan indikere hjertedysfunksjon66.

Ved hjelp av denne protokollen var røntgenstråledosen på 10 GY synlig giftig i sebrafiskembryoer bestrålt ved 6 hpf. I kontrollgruppen og embryoer eksponert for 2 GY og 5 GY var det ingen signifikant død hos embryoer (figur 3A). På samme måte antydet hjerteslagene per minutt at hjertefrekvensen ble redusert enormt med økte doser røntgenstråling. I kontrollgruppen, ved hvert 24-timers intervall, ble hjertefrekvensen sett å øke (figur 3B). Men på hvert tidspunkt sank hjertefrekvensen med en økt stråledose. Imidlertid viste embryoene utsatt for 5 GY og 10 GY ingen signifikante forskjeller før dag 5 etter befruktning. Alvorlig kardiovaskulær deformasjon mistenkes hos embryoer utsatt for 15 GY og 20 GY stråling da hjerteslaget falt enormt (figur 3B). Som diskutert tidligere, er forskjellige fenotypiske og utviklingsdefekter avbildet og evaluert for embryoer utsatt for varierende doser stråling på forskjellige tidspunkter (figur 3C og figur 4).

Figure 1
Figur 1: Stadier av sebrafiskembryoutvikling. Representative bilder av ulike stadier av tidlig sebrafiskutvikling. Stadier opptil 75% epiboly (8 hpf) er dekket. Embryoer på skjoldstadiet; 6 HPF (grønn farge) brukes til strålingsstandardisering. Skala bar = 276,4 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Generell oversikt over protokollen . (A) Avl, innsamling av embryoer og iscenesettelse. (B) Eksperimentelt oppsett: såing av embryoer i brønnplater og medikamentell behandling. (C) Embryoer av nødvendige stadier utsatt for stråling og fenotypiske endringer observert etter stråling. (D) En oversikt over røntgenmaskinen og dens oppsett. (E) Observasjoner, datainnsamling og avbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Effekt av ulike doser røntgenbestråling på 6 hpf sebrafiskembryoer. (A) Overlevelseskurve som viser total overlevelsesfraksjon av sebrafiskembryoer eksponert for individuelle stråledoser fra 2 GY til 20 GY. (B) Antall hjerteslag per minutt av sebrafiskembryoer utsatt for forskjellige doser røntgenstråling ved 6 hpf på påfølgende dager med befruktning. (C) Representative bilder av sebrafiskembryoer utsatt for varierende stråledoser (fra 2 GY til 20 GY), bestrålt ved 6 hpf. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4 Representasjon av ulike morfologiske avvik forårsaket av strålingsindusert toksisitet. (A) A kontrollerte sebrafiskembryoer ved 72 hpf og (B) utstrålte embryoer ved 72 hpf; Det øvre embryoet viser moderate deformiteter, mens det nedre embryoet har alvorlige deformiteter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sebrafisk brukes som verdifulle modeller i mange studier, inkludert flere typer kreftforskning. Denne modellen gir en nyttig plattform for storskala narkotikascreening67,68. Som enhver annen toksisitetsevalueringsmetode er den kvantitative evalueringen av de store biologiske endringene ved stråling og / eller medikamentell behandling den mest avgjørende delen av denne protokollen. I slike studier må overlevelse ikke være det eneste kriteriet for å observere toksisitet; Det må støttes med evaluering av fysiske eller utviklingsmessige defekter ved riktig poengsystem. I dette tilfellet, også opp til 72 hpf, er overlevelsen i embryoer ikke mye forskjellig blant gruppene der embryoer blir utsatt for røntgenstråledoser på 5 GY, 10 GY og 20 GY; Men når den generelle morfologien og fenotypene til embryoene kontrolleres ved disse spesielle dosene, er det klart at røntgentoksisiteten er mer alvorlig enn det ser ut gjennom overlevelsesgrafen. Alvorlighetsgraden av morfologisk deformitet i embryoer ved disse dosene er svært høy, noe som gjenspeiler endringer i deres totale kroppsstørrelse, utviklingsfeil, misdannelse av vitale organer og endringer i deres generelle aktivitet. Selv i gruppen på 15 GY og 20 GY kan embryoene ikke engang klekkes ut av korionen og viser rikelig med deformiteter på en doseavhengig måte. For å evaluere effekten av giftige stoffer, inkludert svært dødelig røntgenstråling, må derfor skåringen av morfologiske, utviklingsmessige og fysiologiske defekter inkluderes på alle mulige måter, og det bør brukes til å evaluere den samlede responsen til sebrafiskembryoer eller forskjellige legemidler administrert i løpet av forsøket.

Selv om det ikke finnes noen definitive skåringssystemer for å evaluere radiotoksisitet i sebrafiskembryomodellen spesifikt, har total overlevelse og/eller morfologiske endringer som bøyning i kroppen, perikardødem, endringer i eggeplommesekken, mikrocefali, endringer i svømmeblæren og øyet, hjerterytmeendringer og bevegelsesdefekter blitt tatt i betraktning i ulike studier62, 63,64. Overlevelsen til embryoer kan evalueres basert på hjerteslag eller evaluering av apikale endepunkter som beskrevet i OECDs retningslinjer. Samtidig kunne de morfologiske abnormitetene observert i slike eksperimenter skåres individuelt; For eksempel har skåringen av halebøying blitt vedtatt av flere etterforskere61.

Når man arbeider med sebrafisk og gjennomfører denne protokollen, må man være forsiktig med visse hensyn. Disse inkluderer avlsgruppen, som alltid må tilhøre samme stamme av fisk. Alle forsøk må involvere en forhåndsdefinert stamme av sebrafiskembryo. En annen viktig faktor er embryostadiet; Man må være nøye med utviklingsstadiet der embryoene bestråles fordi en liten endring i timing eller stadium vil føre til forskjellige resultater. Noen legemidler kan påvirke utviklingen eller forårsake alvorlig skade på embryoene når de administreres på et tidlig stadium av utviklingen, som 2 hpf. I så fall må den riktige subletale dosen av legemidlet bestemmes, og deretter kan screeningen utføres.

Røntgenbestrålingsparametrene må være ensartede for alle utførte eksperimenter. De tre viktige aspektene ved en standard røntgenbestråler er filtertypen, stråledosen og bestrålingsmønsteret, og avstanden mellom røntgenkilden og objektet. Det er primært to typer filtre som brukes til å generere røntgenstråler: aluminiumsfiltre og kobberfiltre; Imidlertid brukes filtre med varierende kombinasjoner av kobber og aluminium eller andre metaller også til å generere røntgenstråler i andre tilfeller69. For sebrafiskembryoer brukes kupperfilteret her til å produsere røntgenstråler. Avstanden fra røntgenkilden til forsøkspersonen betegnes som kilde til subjektavstand (SSD). I denne studien ble SSD satt til å være 50 cm. Røntgenstrålingen ble gitt ved hjelp av et 0,3 mm Cu-filter. En enkelteksponering av ønsket dose ble gitt med en doserate på 140,32 cGY/min innenfor bølgelengdeområdet 0,01-10 nm. Før du utfører et radiologisk eksperiment, bør stråledosen som er egnet for forsøket og målet standardiseres. Formålet med studien, tidspunktet for bestråling og stråledosen er de tre hovedkriteriene for standardisering av stråledose. Tidspunktet for stråling vil omfatte både på hvilket stadium av embryoutviklingen strålingen skal gis og tidsperioden som embryoet vil bli utsatt for stråling av en bestemt dose. Det er velkjent at i tidlige utviklingsstadier maksimeres effekten av stråling. I denne protokollen ble embryoene bestrålt i et utviklingsstadium på 6 hpf med forskjellige stråledoser (2 GY, 5 GY, 10 GY, 15 GY og 20 GY) og observert i 5 dager etter befruktning. Eventuelle avvik fra den vanlige protokollen bør være klart definert og standardisert.

Denne modellen har flere fordeler for å studere effekten av radiosensibilisatorer eller beskyttere i en nesten longitudinell studie, for eksempel evnen til å skaffe flere embryoer fra individuell avl, å avle hver uke fra en enkelt foreldretank, å plassere et betydelig antall embryoer i eksperimentelle grupper, for å observere fenotypiske effekter om noen dager etter behandling, og å se et spekter av fenotypiske variabler etter behandlinger. Denne modellen kan gjenspeile virkningen av stråling nesten på alle systemer i embryoet, og flere stoffer kan testes om gangen i brønnplateformater. Denne tilnærmingen står imidlertid også overfor visse begrensninger. For eksempel kan denne modellen ikke rekapitulere alle deformiteter vist av strålinger hos høyere dyr og mennesker. I tillegg er mange proteinbaserte eller mekanistiske studier i disse fiskene begrenset på grunn av problemer med reagenstilgjengelighet, for eksempel med antistoffer. Til tross for disse begrensningene viser sebrafisken seg imidlertid å være en utmerket modell for radiologiske studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke erklært noen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

SSs laboratorium og RKSs laboratorium er finansiert av tilskudd fra DBT og SERB, India. APM er mottaker av ICMR-stipendet, Government of India. DP er mottaker av CSIR-fellesskapet, Government of India. FN er mottaker av DST-Inspire fellowship, Government of India. Figur 2 ble generert ved hjelp av Biorender (https://biorender.com).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 Well plates Corning CLS3335 Polystyrene
B.O.D Incubator Oswald JRIC-10
Calcium Chloride Fisher Scientific 10101-41-4
Dissecting Microscope Zeiss Stemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTE Polycarbonate
Glass petriplates Borosil 3165A75 Glass
GraphpadPrism GraphPad Software, Inc. Version 5.01
Kline concavity slides Himedia GW092-1PK Glass
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266
Methylene blue hydrate Sigma-Aldrich 66720-100G
Parafilm Tarsons 380020 Paraffin film
Pasteur pipettes Himedia PW1212-1X500NO Polyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTI Polycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTD Polycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTL Polycarbonate
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5655
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653-5KG
Sodium hydroxide pellet SRL 1949181
Stereo Microscope Leica M205FA Leica Model/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-Ray Precision X-Ray X-RAD 225XL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teame, T., et al. The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models. Animal Frontiers. 9 (3), 68-77 (2019).
  2. Ye, M., Chen, Y. Zebrafish as an emerging model to study gonad development. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2373-2380 (2020).
  3. Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
  4. Zhang, C., Willett, C., Fremgen, T. Zebrafish: An animal model for toxicological studies. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 1, Unit 1.7 (2003).
  5. Dai, Y. J., et al. Zebrafish as a model system to study toxicology. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (1), 11-17 (2014).
  6. Gamse, J. T., Gorelick, D. A. Mixtures, metabolites, and mechanisms: Understanding toxicology using zebrafish. Zebrafish. 13 (5), 377-378 (2016).
  7. Yesudhason, B. V., et al. Developmental stages of zebrafish (Danio rerio) embryos and toxicological studies using foldscope microscope. Cell Biology International. 44 (10), 1968-1980 (2020).
  8. Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
  9. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
  10. McGrath, P., Li, C. Q. Zebrafish: A predictive model for assessing drug-induced toxicity. Drug Discovery Today. 13 (9-10), 394-401 (2008).
  11. Haque, E., Ward, A. C. Zebrafish as a model to evaluate nanoparticle toxicity. Nanomaterials. 8 (7), 561 (2018).
  12. Xia, Q., et al. Psoralen induces developmental toxicity in zebrafish embryos/larvae through oxidative stress, apoptosis, and energy metabolism disorder. Frontiers in Pharmacology. 9, 1457 (2018).
  13. Al-Samadi, A., et al. PCR-based zebrafish model for personalised medicine in head and neck cancer. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 235 (2019).
  14. Van Sebille, Y. Z., Gibson, R. J., Wardill, H. R., Carney, T. J., Bowen, J. M. Use of zebrafish to model chemotherapy and targeted therapy gastrointestinal toxicity. Experimental Biology and Medicine. 244 (14), 1178-1185 (2019).
  15. Heideman, W., Antkiewicz, D. S., Carney, S. A., Peterson, R. E. Zebrafish and cardiac toxicology. Cardiovascular Toxicology. 5 (2), 203-214 (2005).
  16. Sieber, S., et al. Zebrafish as a preclinical in vivo screening model for nanomedicines. Advanced Drug Delivery Reviews. 151-152, 152-168 (2019).
  17. Farrelly, J., McEntee, M. C. Principles and applications of radiation therapy. Clinical Techniques in Small Animal Practice. 18 (2), 82-87 (2003).
  18. Seegenschmiedt, M., Micke, O., Muecke, R. German Cooperative Group on Radiotherapy for Non-malignant Diseases (GCG-BD). Radiotherapy for non-malignant disorders: State of the art and update of the evidence-based practice guidelines. The British Journal of Radiology. 88 (1051), (2015).
  19. Mohan, G., et al. Recent advances in radiotherapy and its associated side effects in cancer-A review. The Journal of Basic and Applied Zoology. 80 (1), 14 (2019).
  20. Jarosz-Biej, M., Smolarczyk, R., Cichoń, T., Kułach, N. Tumor microenvironment as a "game changer" in cancer radiotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3212 (2019).
  21. Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
  22. Garibaldi, C., et al. Recent advances in radiation oncology. Ecancermedicalscience. 11, 785 (2017).
  23. Koka, K., Verma, A., Dwarakanath, B. S., Papineni, R. V. L. Technological advancements in external beam radiation therapy (EBRT): An indispensable tool for cancer treatment. Cancer Management and Research. 14, 1421-1429 (2022).
  24. Citrin, D. E. Recent developments in radiotherapy. The New England Journal of Medicine. 377 (11), 1065-1075 (2017).
  25. Ghani, S., et al. Recent developments in antibody derivatives against colorectal cancer; A review. Life Sciences. 265, 118791 (2021).
  26. Lu, L., Shan, F., Li, W., Lu, H. Short-term side effects after radioiodine treatment in patients with differentiated thyroid cancer. BioMed Research International. 2016, 4376720 (2016).
  27. Szejk, M., Kołodziejczyk-Czepas, J., Żbikowska, H. M. Radioprotectors in radiotherapy - Advances in the potential application of phytochemicals. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 70 (0), 722-734 (2016).
  28. Citrin, D., et al. Radioprotectors and mitigators of radiation-induced normal tissue injury. The Oncologist. 15 (4), 360-371 (2010).
  29. Jairam, V., et al. Treatment-related complications of systemic therapy and radiotherapy. JAMA Oncology. 5 (7), 1028-1035 (2019).
  30. Gong, L., Zhang, Y., Liu, C., Zhang, M., Han, S. Application of radiosensitizers in cancer radiotherapy. International Journal of Nanomedicine. 16, 1083-1102 (2021).
  31. Wardman, P. Chemical radiosensitizers for use in radiotherapy. Clinical Oncology. 19 (6), 397-417 (2007).
  32. Citrin, D. E. Radiation modifiers. Hematology/Oncology Clinics of North America. 33 (6), 1041-1055 (2019).
  33. Citrin, D. E., Mitchell, J. B. Altering the response to radiation: sensitizers and protectors. Seminars in Oncology. 41 (6), 848-859 (2014).
  34. Caragher, S., Chalmers, A. J., Gomez-Roman, N. Glioblastoma's next top model: Novel culture systems for brain cancer radiotherapy research. Cancers. 11 (1), 44 (2019).
  35. Wang, J. S., Wang, H. J., Qian, H. L. Biological effects of radiation on cancer cells. Military Medical Research. 5 (1), 20 (2018).
  36. Serrano Martinez, P., et al. Mouse parotid salivary gland organoids for the in vitro study of stem cell radiation response. Oral Diseases. 27 (1), 52-63 (2021).
  37. Martin, M. L., et al. Organoids reveal that inherent radiosensitivity of small and large intestinal stem cells determines organ sensitivity. Cancer Research. 80 (5), 1219-1227 (2020).
  38. Szabó, E. R., et al. Radiobiological effects and proton RBE determined by wildtype zebrafish embryos. PLoS One. 13 (11), 0206879 (2018).
  39. Hurem, S., et al. Dose-dependent effects of gamma radiation on the early zebrafish development and gene expression. PLoS One. 12 (6), 0179259 (2017).
  40. Lu, B., Hwang, M., Yong, C., Moretti, L. Zebrafish as a model system to screen radiation modifiers. Current Genomics. 8 (6), 360-369 (2007).
  41. Curran, W. Seminars in radiation oncology. 12 (1), 2-4 (2002).
  42. McAleer, M. F., et al. Novel use of zebrafish as a vertebrate model to screen radiation protectors and sensitizers. International Journal of Radiation Oncology - Biology - Physics. 61 (1), 10-13 (2005).
  43. Bladen, C. L., Lam, W. K., Dynan, W. S., Kozlowski, D. J. DNA damage response and Ku80 function in the vertebrate embryo. Nucleic Acids Research. 33 (9), 3002-3010 (2005).
  44. Geiger, G. A., et al. Zebrafish as a "biosensor"? Effects of ionizing radiation and amifostine on embryonic viability and development. Cancer Research. 66 (16), 8172-8181 (2006).
  45. Kelland, L. R. Flavopiridol, the first cyclin-dependent kinase inhibitor to enter the clinic: Current status. Expert Opinion on Investigational Drugs. 9 (12), 2903-2911 (2000).
  46. Prasanna, P. G., et al. Radioprotectors and radiomitigators for improving radiation therapy: The Small Business Innovation Research (SBIR) gateway for accelerating clinical translation. Radiation Research. 184 (3), 235-248 (2015).
  47. Daroczi, B., et al. In vivo radioprotection by the fullerene nanoparticle DF-1as assessed in a zebrafish model. Clinical Cancer Research. 12 (23), 7086-7091 (2006).
  48. Adenan, M. N. H., et al. Radioprotective effects of Kelulut honey in zebrafish model. Molecules. 26 (6), 1557 (2021).
  49. Liu, G., et al. High-throughput preparation of radioprotective polymers via Hantzsch's reaction for in vivo X-ray damage determination. Nature Communications. 11 (1), 1-11 (2020).
  50. Mohapatra, D., et al. Fluvastatin sensitizes pancreatic cancer cells toward radiation therapy and suppresses radiation- and/or TGF-β-induced tumor-associated fibrosis. Laboratory Investigation. 102 (3), 298-311 (2022).
  51. Chen, Y., Yang, J., Fu, S., Wu, J. Gold nanoparticles as radiosensitizers in cancer radiotherapy. International Journal of Nanomedicine. 15, 9407-9430 (2020).
  52. Ma, N., et al. Enhanced radiosensitization of gold nanospikes via hyperthermia in combined cancer radiation and photothermal therapy. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (42), 28480-28494 (2016).
  53. Hosen, M. J., et al. Zebrafish models for ectopic mineralization disorders: Practical issues from morpholino design to post-injection observations. Frontiers in Genetics. 4, 74 (2013).
  54. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  55. Zhou, R., et al. The effects of x-ray radiation on the eye development of zebrafish. Human & Experimental Toxicology. 33 (10), 1040-1050 (2014).
  56. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
  57. Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: The fish embryo toxicity test goes multi-species -- An update. ALTEX. 22 (2), 87-102 (2005).
  58. Nagel, R. DarT: The embryo test with the zebrafish Danio rerio--A general model in ecotoxicology and toxicology. ALTEX. 19, Suppl 1 38-48 (2002).
  59. Aspatwar, A., Hammaren, M. M., Parikka, M., Parkkila, S. Rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (150), e59315 (2019).
  60. Gence, L., et al. Hypericum lanceolatum Lam. Medicinal plant: Potential toxicity and therapeutic effects based on a zebrafish model. Frontiers in Pharmacology. 13, 832928 (2022).
  61. OECD. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals., Section 2. , OECD Publishing. Paris, France. (2019).
  62. Li, X., et al. Toxic effects and foundation of proton radiation on the early-life stage of zebrafish development. Chemosphere. 200, 302-312 (2018).
  63. Si, J., et al. Effects of ionizing radiation and HLY78 on the zebrafish embryonic developmental toxicity. Toxicology. 411, 143-153 (2019).
  64. Si, J., et al. Toxic effects of (56)Fe ion radiation on the zebrafish (Danio rerio) embryonic development. Aquatic Toxicology. 186, 87-95 (2017).
  65. Pucci, G., Forte, G. I., Cavalieri, V. Evaluation of epigenetic and radiomodifying effects during radiotherapy treatments in zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 9053 (2021).
  66. Song, Z., et al. Isoliquiritigenin triggers developmental toxicity and oxidative stress-mediated apoptosis in zebrafish embryos/larvae via Nrf2-HO1/JNK-ERK/mitochondrion pathway. Chemosphere. 246, 125727 (2020).
  67. Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: From preclinical modelling to clinical trials. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (8), 611-628 (2021).
  68. Rosa, J. G. S., Lima, C., Lopes-Ferreira, M. Zebrafish larvae behavior models as a tool for drug screenings and pre-clinical trials: A review. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6647 (2022).
  69. Kong, E. Y., Cheng, S. H., Yu, K. N. Biphasic and triphasic dose responses in zebrafish embryos to low-dose 150 kV X-rays with different levels of hardness. Journal of Radiation Research. 57 (4), 363-369 (2016).

Tags

Sebrafisk larver modell radiosensibilisatorer beskyttere strålingsforskning in vivo-modell strålingsindusert DNA-skade kreftstudier strålingsmodifikatorer strålebehandling legemiddelscreening toksisitetsvurdering røntgenstrålingseksponering prosedyre pålitelighet reproduserbarhet
Sebrafisk larver som en modell for å evaluere potensielle radiosensibilisatorer eller beskyttere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mohapatra, A. P., Parida, D.,… More

Mohapatra, A. P., Parida, D., Mohapatra, D., Nayak, U., Swain, R. K., Senapati, S. Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors. J. Vis. Exp. (186), e64233, doi:10.3791/64233 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter