Summary
Zebrafisken har nyligen utnyttjats som modell för att validera potentiella strålningsmodifierare. Detta protokoll beskriver de detaljerade stegen för att använda zebrafiskembryon för strålningsbaserade screeningexperiment och några observationsmetoder för att utvärdera effekten av olika behandlingar och strålning.
Abstract
Zebrafiskar används i stor utsträckning i flera typer av forskning eftersom de är en av de lättskötta ryggradsdjursmodellerna och uppvisar flera egenskaper hos ett unikt och bekvämt modellsystem. Eftersom mycket proliferativa celler är mer mottagliga för strålningsinducerade DNA-skador är zebrafiskembryon en frontlinje in vivo-modell inom strålningsforskning. Dessutom projicerar denna modell effekten av strålning och olika läkemedel inom en kort tid, tillsammans med stora biologiska händelser och tillhörande svar. Flera cancerstudier har använt zebrafiskar, och detta protokoll är baserat på användningen av strålningsmodifierare i samband med strålbehandling och cancer. Denna metod kan lätt användas för att validera effekterna av olika läkemedel på bestrålade embryon och kontrollembryon (icke-bestrålade), och på så sätt identifiera läkemedel som radiosensibiliserande eller skyddande läkemedel. Även om denna metod används i de flesta läkemedelsscreeningexperiment, är detaljerna i experimentet och toxicitetsbedömningen mot bakgrund av röntgenstrålningsexponering begränsade eller endast kortfattade, vilket gör det svårt att utföra. Detta protokoll tar upp denna fråga och diskuterar proceduren och toxicitetsutvärderingen med en detaljerad illustration. Proceduren beskriver ett enkelt tillvägagångssätt för att använda zebrafiskembryon för strålningsstudier och strålningsbaserad läkemedelsscreening med stor tillförlitlighet och reproducerbarhet.
Introduction
Zebrafisken (Danio rerio) är en välkänd djurmodell som har använts flitigt i forskning under de senaste 3 decennierna. Det är en liten sötvattensfisk som är lätt att föda upp och föda upp under laboratorieförhållanden. Zebrafisken har använts i stor utsträckning för olika utvecklings- och toxikologiska studier 1,2,3,4,5,6,7,8. Zebrafisken har hög fruktsamhet och kort embryonal generation; Embryona är lämpliga för att spåra olika utvecklingsstadier, är visuellt transparenta och är mottagliga för olika typer av genetisk manipulation och screeningplattformarmed hög kapacitet 9,10,11,12,13,14. Dessutom tillhandahåller zebrafisken in toto och levande avbildning för vilken dess utvecklingsprocess och olika missbildningar i närvaro av olika giftiga ämnen eller faktorer lätt kan studeras med hjälp av stereo- eller fluorescerande mikroskopi 7,15,16.
Strålbehandling är en av de viktigaste terapeutiska metoderna som används vid behandling av cancer 17,18,19,20,21,22,23,24. Strålbehandling av cancer kräver dock potentiella strålskydd för att skydda normala friska celler från att dö samtidigt som maligna celler dödas eller för att skydda människors hälsa under behandling med högenergistrålning 25,26,27,28,29. Omvänt undersöks också potenta radiosensibilisatorer för att öka effektiviteten av strålning för att döda maligna celler, särskilt i riktade terapier och precisionsterapier30,31,32,33. Därför, för att validera potenta strålprotektorer och sensibilisatorer, är en modell som är lämplig för läkemedelsscreening med semi-hög genomströmning och mätbart uppvisande av strålningseffekter mycket efterfrågad. Flera tillgängliga modeller används i strålningsstudier och används i drogscreeningsexperiment. Högre ryggradsdjur och till och med den vanligaste in vivo-modellen, möss, är dock olämpliga för storskalig läkemedelsscreening eftersom det är tidskrävande, kostsamt och utmanande att utforma sådana screeningexperiment med dessa modeller. På samma sätt är cellodlingsmodeller idealiska för olika typer av storskaliga läkemedelsscreeningsexperiment34,35. Experiment som involverar cellodling är dock inte alltid pragmatiska, mycket reproducerbara eller tillförlitliga eftersom celler i odling kan ändra sitt beteende markant beroende på tillväxtförhållandena och kinetiken. Olika celltyper visar också differentiell strålningssensibilisering. Noterbart är att 2D- och 3D-cellodlingssystem inte representerar hela organismscenariot, och därför kan de erhållna resultaten inte rekapitulera den faktiska nivån av radiotoxicitet36,37. I detta avseende ger zebrafisken flera fördelar vid screening för nya radiosensibiliserande ämnen och radioprotektorer. Den enkla hanteringen, den stora kullstorleken, den korta livslängden, den snabba embryonala utvecklingen, embryots transparens och den lilla kroppsstorleken gör zebrafisken till en lämplig modell för storskalig läkemedelsscreening. På grund av ovanstående fördelar kan experiment lätt upprepas på kort tid, och effekten kan enkelt observeras under ett dissekerande mikroskop i flerbrunnsplattor. Därför blir zebrafisken allt populärare inom läkemedelsscreeningsforskning som involverar strålningsstudier38,39.
Zebrafiskens potential som en riktig modell för att screena strålningsmodifierare har visats i olika studier 40,41,42,43,44,45. Den strålskyddande effekten av potentiella radiomodifierare, såsom nanopartikel DF1, amifostin (WR-2721), DNA-reparationsproteiner KU80 och ATM, och transplanterade hematopoetiska stamceller, och effekterna av radiosensibilisatorer, såsom flavopiridol och AG1478, i zebrafiskmodellen har rapporterats 19,41,42,43,44,45,46 . Med hjälp av samma system utvärderades den strålskyddande effekten av DF-1 (fullerennanopartikel) både på systemisk och organspecifik nivå, och även användningen av zebrafiskembryon för radioprotektorisk screening undersöktes ytterligare47. Nyligen rapporterades Kelulut-honungen som en radioprotektor i zebrafiskembryon och visade sig öka embryoöverlevnaden och förhindra organspecifika skador, cellulära DNA-skador och apoptos48.
På liknande sätt kontrollerades de strålskyddande effekterna av polymerer som genererades via Hantzschs reaktion på zebrafiskembryon i en screening med hög kapacitet, och skyddet gavs huvudsakligen genom att skydda celler från DNA-skador49. I en av de tidigare studierna hittades den lipofila statinen fluvastatin som en potentiell radiosensibilisator med hjälp av zebrafiskmodellen med detta tillvägagångssätt50. På samma sätt anses guldnanopartiklar vara en idealisk radiosensibilisator och har använts i många studier51,52.
Den embryonala utvecklingen hos zebrafiskar involverar klyvning under de första 3 timmarna där en encellig zygot delar sig för att bilda 2 celler, 4 celler, 8 celler, 16 celler, 32 celler och 64 celler som lätt kan identifieras med ett stereomikroskop. Sedan når den blastulastadiet med 128 celler (2,25 timmar efter befruktning, hpf), där cellerna fördubblas var 15:e minut och fortsätter genom följande stadier: 256 celler (2,5 hpf), 512 celler (2,75 hpf) och når 1 000+ celler på bara 3 timmar (figur 1). Vid 4 timmar når ägget sfärstadiet, följt av bildandet av en kupolform i den embryonala massan 7,53,54. Gastrulationen hos zebrafiskar börjar från 5,25 hpf54, där den når sköldstadiet. Skölden visar tydligt cellernas snabba konvergensrörelse till ena sidan av könscellen (figur 1) och är en framträdande och distinkt fas av gastrulerande embryon som lätt kan identifieras53,54. Även om strålningsexponering för embryon kan göras i alla stadier av deras utveckling, kan strålningsexponering under gastrulation ha mer distinkta morfologiska förändringar som underlättar bättre avläsningar av strålningsinducerad toxicitet55. På samma sätt kan administrering av läkemedel till embryon påbörjas så tidigt som 2 HPF54.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den aktuella studien genomfördes med förhandsgodkännande från och enligt riktlinjerna från Institutional Animal Ethical Committee, Institute of Life Sciences, Bhubaneswar. All skötsel och uppfödning av zebrafiskar utfördes vid en lokal fiskodlingsanläggning vid 28,5 °C, och embryona hölls i en inkubator för biologisk syreförbrukning (BOD) vid en temperatur på 28,5 °C. Här användes zebrafiskstammen AB, och stadieindelningen utfördes enligt Kimmel et al.54. Röntgenstrålning gavs vid 6 hpf (skärmsteg), och olika fenotyper observerades upp till 120 hpf.
1. Uppfödning och embryoinsamling
- Ställ in avelsbassängerna (bestående av polykarbonat, kapacitet 1 L, se materialtabell). Häll systemvatten (pH 6,8–7,5, konduktivitet 500 μS och temperatur 28,5 °C) i odlingsbassängerna som täcker nästan 40 % av dess volym. Placera avdelaren i akvariet för att skapa två kammare, en för honor och en för hanar.
- Samla försiktigt in två friska honor och en frisk hane från föräldratankarna med hjälp av ett nät, lägg dem i sina respektive halvor och förvara dem i mörker över natten (minst 10 timmar) vid 28,5 °C.
- Nästa morgon tar du bort avdelaren och låter fiskarna para sig utan att störa avelsbassängerna.
OBS: Honorna börjar leka och äggen kommer att ses ligga på botten av akvariet inom 10-15 minuter efter att fiskarna har fått para sig56,57,58. - Sätt tillbaka fiskarna i akvariet efter leken, samla in embryona från avelsbassängen med hjälp av en sil, tvätta dem ordentligt med systemvatten och förvara de insamlade äggen i en petriskål med E-3-medier (4,94 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,43 mM CaCl 2, 0,85 mM MgCl2-salter, 1 % vikt/volym metylenblått, se Materialförteckning).
- Observera äggen under ett dissekerande mikroskop, ta bort de obefruktade eller döda embryona med en Pasteur-pipett och förvara petriplattorna med befruktade ägg i E-3-mediet vid 28,5 °C i en inkubator för att de ska växa och underhållas korrekt.
OBS: Obefruktade ägg kan identifieras med ett mjölkvitt utseende med en koagulerad korion eller med brustna celler inuti korionen. Tillsammans med obefruktade ägg måste ägg som inte genomgår klyvning och ägg med missbildningar som oregelbundenheter under klyvningen, t.ex. asymmetri, vesikelbildning eller skador på korionen, eller som inte utvecklas aktivt, kasseras för att hålla de insamlade embryona friska och för att hålla mediet rent 7,56.
2. Övervakning av embryon och urval för strålningsexperiment
- Övervaka de växande embryona under dissektionsmikroskopet, identifiera rätt stadium 7,54 och ta bort alla döda eller sjuka embryon. Se till att embryot stadieindelas på lämpligt sätt, eftersom strålnings- och läkemedelsdoserna kommer att ges i ett visst gastrulationsstadium.
OBS: Kontrollera varje dag nivån och kvaliteten på media i kulturskålarna. Byt media var 24:e timme, tillsammans med att ta bort döda embryon. Pasteurpipetter är att föredra att användas för att plocka embryon eller byta medium. - Innan experimentet påbörjas ska de friska embryona försiktigt fördelas på försöksplattorna med hjälp av en Pasteurpipett. För varje experimentgrupp tar du 15-20 embryon.
OBS: Placera endast friska embryon från de önskade utvecklingsstadierna på försöksplattan. Antag att läkemedelsbehandlingen måste göras med embryon vid 6 hpf, börja sedan så dem i experimentplattor minst 30-60 minuter tidigare.
3. Missbruksbehandling
- Tillsätt läkemedel med önskad koncentration till zebrafiskembryona. Förbered det läkemedelsinnehållande E-3-mediet i god tid. Se till att stamlösningen av läkemedlet inte har något oupplöst läkemedel innan du förbereder arbetsmediet för behandling av zebrafiskembryon.
- Innan du lägger till något läkemedel till ett medium för strålningsscreening, kontrollera den cytotoxiska effekten av läkemedlet med graderna av koncentrationer av läkemedlet. Följ OECD:s riktlinjer för att utvärdera LC 50 för de läkemedel som utvärderas 59,60,61.
OBS: Var försiktig när du flyttar tallrikar och tallrikar under bestrålnings- eller observationstiden. Det finns många chanser att plattorna kommer att störas under denna hantering, vilket gör att media läcker ut ur brunnarna eller att embryona rinner ut ur sina respektive brunnar, vilket potentiellt kan förorena närliggande brunnar och förstöra experimentet.
4. Bestrålning av röntgen
- När du sätter upp ett strålningsexperiment, inkludera en kontrollgrupp/icke-bestrålad grupp och en grupp som enbart bestrålar. På samma sätt, när du utför en läkemedelsscreening, inkludera en annan grupp där läkemedlen kommer att ges med samma koncentration som de som administreras i screeningexperimentet tillsammans med strålning.
OBS: Märk både locket och botten på brunnsplattor eller odlingsskålar så att locken inte tappas bort. - Fördela embryona i en brunnsplatta om strålskydden kan täcka och skydda de extra brunnarna från strålning medan de andra brunnarna utsätts för en viss stråldos. I annat fall kan du använda enskilda plattor eller skivor för att så embryon per stråldos.
- Slå på röntgenstrålaren (se materialtabell) och initiera maskinens initiering och uppvärmning.
OBS: Avståndet mellan källa och motiv (SSD) måste vara 50 cm; man kan använda olika SSD-enheter ännu en gång, vilket kräver standardisering. - Placera experimentplattan under bestrålaren inuti maskinen i mitten, se till att plattan är direkt under röntgenkällan, och ställ sedan in dosen (t.ex. 5 GY) och starta röntgenbilden.
OBS: Försegla plattorna med paraffinfilm för att undvika oönskat spill eller kontaminering under transporten av plattorna från inkubatorn till bestrålaren och tillbaka. - Efter avslutad bestrålning, ta ut plattorna, stäng av maskinprogrammet, stäng av maskinen och kontrollera plattorna under mikroskopet omedelbart efter strålningen. Ta ut de döda embryona och lägg tillbaka plattorna i inkubatorn vid 28,5 °C. Anteckna antalet döda embryon efter att ha utvärderat dem i dissekeringsmikroskopet.
OBS: Bestråla de olika grupperna av embryon med bestämda stråldoser utan större fördröjning mellan enskilda grupper, eftersom effekten av strålningen kan påverkas avsevärt av skillnaden i utvecklingsstadiet.
VARNING: Vidta lämpliga skyddsåtgärder när du använder röntgenmaskinen.
5. Datainsamling, bildbehandling och analys
- Samla in data med förutbestämda tidsintervall, till exempel var 24:e timme efter att strålningen har getts. Registrera alla möjliga observationer, t.ex. överlevnad, kläckningseffektivitet, utvecklingsstadium, antal hjärtslag, kropps- och svanskrökning, perikardiellt ödem, förlängning av gulesäcken, mikrocefali, simblåsans utveckling, allmän motilitet eller aktivitet osv.62,63,64.
- För att ta bilder, välj representativa embryon på en ren bild, kontrollera embryona under mikroskopet, orientera dem i en viss riktning och klicka på bilderna. Byt namn på bildfilerna efter grupp och tid.
OBS: Samma förstoring och belysning måste användas när du tar bilder med olika tidsintervall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollets övergripande layout visas i figur 2. Effekten av strålning och karakteriseringen på ett dosberoende sätt utvärderades med följande analyser.
Bedömning av röntgeninducerad toxicitet
Med hjälp av ett stereomikroskop bedömdes och karakteriserades följande avvikelser efter läkemedelsbehandling och/eller strålning. Enligt OECD:s riktlinjer 61 inkluderades fyra huvudsakliga apikala effektmått för toxicitetsutvärdering hos fiskar, inklusive koagulation av embryon, missbildningar i somitbildning, att svansen inte lossnar från gulesäcken och minskning eller frånvaro av hjärtslag, för att analysera den totala toxiciteten61. Den akuta toxiciteten bestämdes baserat på ett positivt utfall för någon av ovanstående avvikelser. Utöver dessa fyra huvudsakliga effektmått utfördes även morfologisk observation för böjning av ryggrad eller svans, huvudmissbildning och mikrocefali, utvecklingsdefekter, perikardiellt ödem, gulesäcksdeformiteter, deformiteter i simblåsan och förändringar i ögonstrukturen (Figur 3C och Figur 4). Poängsättningen för radiotoxiciteten kan baseras på överlevnadsprocenten och/eller poängsättningen av olika morfologiska avvikelser.
Överlevnadsprocent och överlevnadskurva
Överlevnadsprocenten beräknades genom att dividera det totala antalet levande embryon med det totala antalet embryon som ursprungligen togs i en grupp och multiplicera resultatet med 100 38,50,65. Sedan plottades de värden som motsvarade olika tidpunkter och olika experimentgrupper för att få fram överlevnadskurvan. Denna studie ger överlevnadskurvan för embryon som bestrålats med 6 hpf (Figur 3A).
Allvarliga avvikelser i samband med strålningsinducerad toxicitet (figur 3 och figur 4)
Kroppskrökning och svansböjning
Detta är en av de vanligaste parametrarna för att bedöma eventuella toxicitetsinducerade missbildningar i zebrafiskembryon 50,65,66. Kroppskrökningsdeformiteter kan ses i olika mönster som sträcker sig från låg, till måttlig, till svår, med böjning i den posthepatiska svansregionen eller i huvudkroppsaxeln eller till och med med en helt halvcirkelformad ryggrad eller mer än en böjning i kroppsaxeln och i svansen. Vid lägre stråldoser kan böjningen inte synas hos alla embryon, men den kan utvecklas hos de flesta embryon. Med en ökning av dosen ökar också böjningens svårighetsgrad och påverkar alla individer. I denna studie observerades dessa missbildningar hos embryon som behandlades med en strålningsdos på 10 GY.
Perikardiellt och hjärtödem
Embryon som behandlas med toxisk exponering som strålning och läkemedel utanför tolerabla intervall eller i toxiska doser utvecklar också perikardiellt ödem65,66. Embryon som utsätts för röntgenstrålning uppvisar hjärtsäcks- och hjärtödem, där vätska ansamlas i hjärtsäcken och hjärtat, vilket resulterar i ett svullet hjärtsäck och hjärta.
Gulesäcködem, förtjockning av äggulan och sammandragning av gulesäcken
Efter röntgenexponeringen ser man att gulesäcken hos vissa fiskar är förtjockad eller bibehållen, vilket tyder på röntgenstrålningens toxicitet. I vissa fall kan man också se en total sammandragning av gulesäcken, där guleförlängningen är kort, eller ödemutveckling i guleregionen.
Minskning av huvudstorlek (mikrocefali)
Ett förväntat utfall av kraftig strålning är en minskning av huvudets storlek, så kallad mikrocefali, vilket kan identifieras när behandlade embryon jämförs med embryona i kontrollgruppen.
Deformiteter i simblåsan
Efter bestrålning har simblåsan minskat eller nedsatt hos ett fåtal embryon, och missbildningen av simblåsan är större hos embryon som utsatts för högre stråldoser, vilket kan bidra till den låga rörelseförmågan eller nedsatt simförmåga hos embryon som exponerats för höga röntgendoser.
Förändring i ögonstrukturen
Strålning kan orsaka enorma DNA-skador och proteinförändringar, vilket så småningom leder till celldöd och en minskning av cellantalet eller döden av specifika celltyper65. Ögat kan påverkas av intensiva stråldoser, och liten ögonstorlek och en minskning av dess cellager har observerats55.
Hjärtslag per minut (bpm)
Hjärtslagen per minut räknades genom att observera embryona i stereomikroskop. När stråldosen ökar tenderar slag/min att minska (Figur 3B). Fem larver övervägdes för att beräkna bpm vid varje tidpunkt per grupp. En minskning av antalet hjärtslag kan tyda på hjärtdysfunktion66.
Med hjälp av detta protokoll var röntgenstråldosen på 10 GY synligt toxisk i zebrafiskembryon som bestrålades med 6 hpf. I kontrollgruppen och embryon som exponerades för 2 GY och 5 GY förekom ingen signifikant död hos embryon (Figur 3A). På samma sätt tydde antalet hjärtslag per minut på att hjärtfrekvensen minskade enormt med ökade doser av röntgenstrålning. I kontrollgruppen sågs hjärtfrekvensen öka med 24 timmars mellanrum (Figur 3B). Men vid varje tidpunkt sjönk hjärtfrekvensen med en ökad stråldos. De embryon som exponerades för 5 GY och 10 GY visade dock inga signifikanta skillnader förrän dag 5 efter befruktningen. Allvarlig kardiovaskulär deformation misstänks hos embryon som exponerats för 15 GY och 20 GY strålning eftersom hjärtslagen sjönk enormt (Figur 3B). Som diskuterats tidigare avbildas och utvärderas olika fenotypiska defekter och utvecklingsdefekter för embryon som exponerats för olika stråldoser vid olika tidpunkter (figur 3C och figur 4).
Figur 1: Stadier i zebrafiskembryots utveckling. Representativa bilder av olika stadier av zebrafiskens tidiga utveckling. Steg upp till 75 % epiboly (8 hpf) omfattas. Embryon i sköldstadiet; 6 HPF (grön färg) används för strålningsstandardisering. Skalstapel = 276,4 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Allmän disposition av protokollet . A) Avel, insamling av embryon och stadieindelning. (B) Experimentell uppställning: sådd av embryon i brunnsplattor och läkemedelsbehandling. C) Embryon i de stadier som krävs och som exponerats för strålning och fenotypiska förändringar som observerats efter strålning. (D) En översikt över röntgenapparaten och dess uppställning. (E) Observationer, datainsamling och avbildning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Effekt av olika doser av röntgenbestrålning på zebrafiskembryon med 6 hpf. A) Överlevnadskurva som visar den totala överlevande andelen zebrafiskembryon som exponerats för individuella stråldoser från 2 GY till 20 GY. (B) Antal hjärtslag per minut hos zebrafiskembryon som exponerats för olika doser av röntgenstrålning vid 6 hpf under de följande befruktningsdagarna. C) Representativa bilder av zebrafiskembryon som exponerats för olika stråldoser (från 2 GY till 20 GY), bestrålade med 6 hpf. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representation av olika morfologiska avvikelser på grund av strålningsinducerad toxicitet . A) En kontroll av zebrafiskembryon vid 72 hpf och (B) utstrålade embryon vid 72 hpf. Det övre embryot visar måttliga missbildningar, medan det nedre embryot har allvarliga missbildningar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafiskar används som värdefulla modeller i många studier, bland annat i flera olika typer av cancerforskning. Denna modell utgör en användbar plattform för storskalig läkemedelsscreening67,68. Liksom alla andra metoder för toxicitetsutvärdering är den kvantitativa utvärderingen av de viktigaste biologiska förändringarna vid strålning och/eller läkemedelsbehandling den mest avgörande delen av detta protokoll. I den här typen av studier får överlevnad inte vara det enda kriteriet för att observera toxicitet. Den måste stödjas med utvärdering av fysiska defekter eller utvecklingsdefekter genom lämpliga poängsystem. Även i detta fall, upp till 72 hpf, skiljer sig överlevnaden hos embryon inte mycket mellan de grupper där embryon utsätts för röntgenstråldoser på 5 GY, 10 GY och 20 GY; Men när embryonas övergripande morfologi och fenotyper kontrolleras vid dessa speciella doser är det tydligt att röntgentoxiciteten är allvarligare än den ser ut genom överlevnadsdiagrammet. Graden av morfologisk deformitet hos embryon vid dessa doser är mycket hög, vilket återspeglar förändringar i deras totala kroppsstorlek, defekter i utvecklingen, missbildningar av vitala organ och förändringar i deras allmänna aktivitet. Inte ens i gruppen 15 GY och 20 GY kan embryona ens kläckas ur sin korion och uppvisar rikliga missbildningar på ett dosberoende sätt. För att utvärdera effekten av giftiga ämnen, inklusive mycket dödlig röntgenstrålning, måste därför klassificeringen av morfologiska, utvecklingsmässiga och fysiologiska defekter inkluderas på alla möjliga sätt, och detta bör användas för att utvärdera den totala responsen hos zebrafiskembryon eller olika läkemedel som administreras under experimentets gång.
Även om det inte finns några definitiva poängsystem för att utvärdera radiotoxicitet i zebrafiskembryomodellen specifikt, har den totala överlevnaden och/eller morfologiska förändringar som böjning i kroppen, perikardiellt ödem, förändringar i gulesäcken, mikrocefali, förändringar i simblåsan och ögat, förändringar i hjärtslag och rörelsestörningar beaktats i olika studier62. 63,64. Embryonas överlevnad kan utvärderas baserat på hjärtslag eller utvärdering av apikala effektmått enligt beskrivningen i OECD:s riktlinjer. Samtidigt kunde de morfologiska abnormiteter som observerats i sådana experiment poängsättas individuellt; Till exempel har poängsättningen av svansböjning antagits av flera utredare61.
När man arbetar med zebrafiskar och genomför detta protokoll måste man vara försiktig med vissa överväganden. Dessa inkluderar avelsgruppen, som alltid måste tillhöra samma fiskstam. Alla försök måste omfatta en fördefinierad stam av zebrafiskembryo. En annan viktig faktor är embryostadiet; Man måste vara noggrann med det utvecklingsstadium där embryona bestrålas eftersom en liten förändring i tidpunkten eller stadiet kommer att leda till olika resultat. Vissa läkemedel kan påverka utvecklingen eller orsaka allvarliga skador på embryona när de administreras i ett tidigt utvecklingsstadium, som 2 hpf. I så fall måste den korrekta subletala dosen av läkemedlet bestämmas, och sedan kan screeningen utföras.
Röntgenbestrålningsparametrarna skall vara enhetliga för alla utförda experiment. De tre viktiga aspekterna av en vanlig röntgenstrålare är filtertypen, stråldosen och bestrålningsmönstret samt avståndet mellan röntgenkällan och objektet. Det finns i första hand två typer av filter som används för att generera röntgenstrålar: aluminiumfilter och kopparfilter; Filter med varierande kombinationer av koppar och aluminium eller andra metaller används dock också för att generera röntgenstrålar i andra fall69. För zebrafiskembryon används här koppfiltret för att producera röntgenstrålar. Avståndet från röntgenkällan till försökspersonen betecknas som avstånd mellan källa och försöksperson (SSD). I denna studie var SSD:n inställd på 50 cm. Röntgenstrålningen gavs med hjälp av ett 0,3 mm Cu-filter. En engångsexponering av önskad dos gavs vid en dosrat på 140,32 cGY/min inom våglängdsområdet 0,01-10 nm. Innan ett radiologiskt experiment utförs bör den stråldos som är lämplig för experimentet och målet standardiseras. Syftet med studien, tidpunkten för bestrålningen och stråldosen är de tre viktigaste kriterierna för standardisering av stråldoser. Tidpunkten för strålningen omfattar både i vilket skede av embryots utveckling strålningen ska ges och under vilken tidsperiod embryot kommer att exponeras för strålning med en viss dos. Det är välkänt att effekten av strålning maximeras i tidiga utvecklingsstadier. I detta protokoll bestrålades embryona i ett utvecklingsstadium på 6 hpf med olika stråldoser (2 GY, 5 GY, 10 GY, 15 GY och 20 GY) och observerades i 5 dagar efter befruktningen. Varje avvikelse från det vanliga protokollet bör vara tydligt definierad och standardiserad.
Denna modell har flera fördelar för att studera effekten av radiosensibiliserande medel eller beskyddare i en nästan longitudinell studie, såsom förmågan att få flera embryon från individuell avel, att avla varje vecka från en enda föräldrabassäng, att placera ett betydande antal embryon i experimentella grupper, att observera fenotypiska effekter några dagar efter behandling, och att se ett spektrum av fenotypiska variabler efter behandlingar. Denna modell kan återspegla strålningens inverkan på nästan alla system i embryot, och flera läkemedel kan testas samtidigt i brunnsplattformat. Detta tillvägagångssätt har dock också vissa begränsningar. Till exempel kan denna modell inte rekapitulera alla missbildningar som uppvisas av strålning hos högre djur och människor. Dessutom är många proteinbaserade eller mekanistiska studier på dessa fiskar begränsade på grund av problem med reagenstillgängligheten, t.ex. med antikroppar. Men trots dessa begränsningar visar sig zebrafisken vara en utmärkt modell för radiologiska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inte deklarerat några motstridiga intressen.
Acknowledgments
SS labb och RKS labb finansieras av anslag från DBT och SERB, Indien. APM är mottagare av ICMR-stipendiet, Government of India. DP är mottagare av CSIR-stipendiet, Government of India. FN är mottagare av DST-Inspire-stipendiet, Government of India. Figur 2 genererades med hjälp av Biorender (https://biorender.com).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Well plates | Corning | CLS3335 | Polystyrene |
| B.O.D Incubator | Oswald | JRIC-10 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | 10101-41-4 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| External Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTE | Polycarbonate |
| Glass petriplates | Borosil | 3165A75 | Glass |
| GraphpadPrism | GraphPad Software, Inc. | Version 5.01 | |
| Kline concavity slides | Himedia | GW092-1PK | Glass |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Methylene blue hydrate | Sigma-Aldrich | 66720-100G | |
| Parafilm | Tarsons | 380020 | Paraffin film |
| Pasteur pipettes | Himedia | PW1212-1X500NO | Polyethylene plastic |
| Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTI | Polycarbonate |
| Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTD | Polycarbonate |
| Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTL | Polycarbonate |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| Sodium hydroxide pellet | SRL | 1949181 | |
| Stereo Microscope Leica M205FA | Leica | Model/PN MDG35/10 450 125 | |
| X-Rad 225 Precision X-Ray | Precision X-Ray | X-RAD 225XL |
References
- Teame, T., et al. The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models. Animal Frontiers. 9 (3), 68-77 (2019).
- Ye, M., Chen, Y. Zebrafish as an emerging model to study gonad development. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2373-2380 (2020).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Zhang, C., Willett, C., Fremgen, T. Zebrafish: An animal model for toxicological studies. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 1, Unit 1.7 (2003).
- Dai, Y. J., et al. Zebrafish as a model system to study toxicology. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (1), 11-17 (2014).
- Gamse, J. T., Gorelick, D. A. Mixtures, metabolites, and mechanisms: Understanding toxicology using zebrafish. Zebrafish. 13 (5), 377-378 (2016).
- Yesudhason, B. V., et al. Developmental stages of zebrafish (Danio rerio) embryos and toxicological studies using foldscope microscope. Cell Biology International. 44 (10), 1968-1980 (2020).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- McGrath, P., Li, C. Q. Zebrafish: A predictive model for assessing drug-induced toxicity. Drug Discovery Today. 13 (9-10), 394-401 (2008).
- Haque, E., Ward, A. C. Zebrafish as a model to evaluate nanoparticle toxicity. Nanomaterials. 8 (7), 561 (2018).
- Xia, Q., et al. Psoralen induces developmental toxicity in zebrafish embryos/larvae through oxidative stress, apoptosis, and energy metabolism disorder. Frontiers in Pharmacology. 9, 1457 (2018).
- Al-Samadi, A., et al. PCR-based zebrafish model for personalised medicine in head and neck cancer. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 235 (2019).
- Van Sebille, Y. Z., Gibson, R. J., Wardill, H. R., Carney, T. J., Bowen, J. M. Use of zebrafish to model chemotherapy and targeted therapy gastrointestinal toxicity. Experimental Biology and Medicine. 244 (14), 1178-1185 (2019).
- Heideman, W., Antkiewicz, D. S., Carney, S. A., Peterson, R. E.
- Sieber, S., et al. Zebrafish as a preclinical in vivo screening model for nanomedicines. Advanced Drug Delivery Reviews. 151-152, 152-168 (2019).
- Farrelly, J., McEntee, M. C. Principles and applications of radiation therapy. Clinical Techniques in Small Animal Practice. 18 (2), 82-87 (2003).
- Seegenschmiedt, M., Micke, O., Muecke, R. German Cooperative Group on Radiotherapy for Non-malignant Diseases (GCG-BD). Radiotherapy for non-malignant disorders: State of the art and update of the evidence-based practice guidelines. The British Journal of Radiology. 88 (1051), (2015).
- Mohan, G., et al. Recent advances in radiotherapy and its associated side effects in cancer-A review. The Journal of Basic and Applied Zoology. 80 (1), 14 (2019).
- Jarosz-Biej, M., Smolarczyk, R., Cichoń, T., Kułach, N. Tumor microenvironment as a "game changer" in cancer radiotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3212 (2019).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Garibaldi, C., et al.
- Koka, K., Verma, A., Dwarakanath, B. S., Papineni, R. V. L. Technological advancements in external beam radiation therapy (EBRT): An indispensable tool for cancer treatment. Cancer Management and Research. 14, 1421-1429 (2022).
- Citrin, D. E.
- Ghani, S., et al. Recent developments in antibody derivatives against colorectal cancer; A review. Life Sciences. 265, 118791 (2021).
- Lu, L., Shan, F., Li, W., Lu, H. Short-term side effects after radioiodine treatment in patients with differentiated thyroid cancer. BioMed Research International. 2016, 4376720 (2016).
- Szejk, M., Kołodziejczyk-Czepas, J., Żbikowska, H. M. Radioprotectors in radiotherapy - Advances in the potential application of phytochemicals. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 70 (0), 722-734 (2016).
- Citrin, D., et al. Radioprotectors and mitigators of radiation-induced normal tissue injury. The Oncologist. 15 (4), 360-371 (2010).
- Jairam, V., et al. Treatment-related complications of systemic therapy and radiotherapy. JAMA Oncology. 5 (7), 1028-1035 (2019).
- Gong, L., Zhang, Y., Liu, C., Zhang, M., Han, S.
- Wardman, P. Chemical radiosensitizers for use in radiotherapy. Clinical Oncology. 19 (6), 397-417 (2007).
- Citrin, D. E.
- Citrin, D. E., Mitchell, J. B. Altering the response to radiation: sensitizers and protectors. Seminars in Oncology. 41 (6), 848-859 (2014).
- Caragher, S., Chalmers, A. J., Gomez-Roman, N. Glioblastoma's next top model: Novel culture systems for brain cancer radiotherapy research. Cancers. 11 (1), 44 (2019).
- Wang, J. S., Wang, H. J., Qian, H. L. Biological effects of radiation on cancer cells. Military Medical Research. 5 (1), 20 (2018).
- Serrano Martinez, P., et al. Mouse parotid salivary gland organoids for the in vitro study of stem cell radiation response. Oral Diseases. 27 (1), 52-63 (2021).
- Martin, M. L., et al. Organoids reveal that inherent radiosensitivity of small and large intestinal stem cells determines organ sensitivity. Cancer Research. 80 (5), 1219-1227 (2020).
- Szabó, E. R., et al. Radiobiological effects and proton RBE determined by wildtype zebrafish embryos. PLoS One. 13 (11), 0206879 (2018).
- Hurem, S., et al. Dose-dependent effects of gamma radiation on the early zebrafish development and gene expression. PLoS One. 12 (6), 0179259 (2017).
- Lu, B., Hwang, M., Yong, C., Moretti, L. Zebrafish as a model system to screen radiation modifiers. Current Genomics. 8 (6), 360-369 (2007).
- Curran, W. Seminars in radiation oncology. 12 (1), 2-4 (2002).
- McAleer, M. F., et al. Novel use of zebrafish as a vertebrate model to screen radiation protectors and sensitizers. International Journal of Radiation Oncology - Biology - Physics. 61 (1), 10-13 (2005).
- Bladen, C. L., Lam, W. K., Dynan, W. S., Kozlowski, D. J. DNA damage response and Ku80 function in the vertebrate embryo. Nucleic Acids Research. 33 (9), 3002-3010 (2005).
- Geiger, G. A., et al. Zebrafish as a "biosensor"? Effects of ionizing radiation and amifostine on embryonic viability and development. Cancer Research. 66 (16), 8172-8181 (2006).
- Kelland, L. R. Flavopiridol, the first cyclin-dependent kinase inhibitor to enter the clinic: Current status. Expert Opinion on Investigational Drugs. 9 (12), 2903-2911 (2000).
- Prasanna, P. G., et al. Radioprotectors and radiomitigators for improving radiation therapy: The Small Business Innovation Research (SBIR) gateway for accelerating clinical translation. Radiation Research. 184 (3), 235-248 (2015).
- Daroczi, B., et al. In vivo radioprotection by the fullerene nanoparticle DF-1as assessed in a zebrafish model. Clinical Cancer Research. 12 (23), 7086-7091 (2006).
- Adenan, M. N. H., et al. Radioprotective effects of Kelulut honey in zebrafish model. Molecules. 26 (6), 1557 (2021).
- Liu, G., et al. High-throughput preparation of radioprotective polymers via Hantzsch's reaction for in vivo X-ray damage determination. Nature Communications. 11 (1), 1-11 (2020).
- Mohapatra, D., et al. Fluvastatin sensitizes pancreatic cancer cells toward radiation therapy and suppresses radiation- and/or TGF-β-induced tumor-associated fibrosis. Laboratory Investigation. 102 (3), 298-311 (2022).
- Chen, Y., Yang, J., Fu, S., Wu, J. Gold nanoparticles as radiosensitizers in cancer radiotherapy. International Journal of Nanomedicine. 15, 9407-9430 (2020).
- Ma, N., et al. Enhanced radiosensitization of gold nanospikes via hyperthermia in combined cancer radiation and photothermal therapy. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (42), 28480-28494 (2016).
- Hosen, M. J., et al. Zebrafish models for ectopic mineralization disorders: Practical issues from morpholino design to post-injection observations. Frontiers in Genetics. 4, 74 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Zhou, R., et al. The effects of x-ray radiation on the eye development of zebrafish. Human & Experimental Toxicology. 33 (10), 1040-1050 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: The fish embryo toxicity test goes multi-species -- An update. ALTEX. 22 (2), 87-102 (2005).
- Nagel, R. DarT: The embryo test with the zebrafish Danio rerio--A general model in ecotoxicology and toxicology. ALTEX. 19, Suppl 1 38-48 (2002).
- Aspatwar, A., Hammaren, M. M., Parikka, M., Parkkila, S. Rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (150), e59315 (2019).
- Gence, L., et al. Hypericum lanceolatum Lam. Medicinal plant: Potential toxicity and therapeutic effects based on a zebrafish model. Frontiers in Pharmacology. 13, 832928 (2022).
- OECD. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals., Section 2. , OECD Publishing. Paris, France. (2019).
- Li, X., et al. Toxic effects and foundation of proton radiation on the early-life stage of zebrafish development. Chemosphere. 200, 302-312 (2018).
- Si, J., et al. Effects of ionizing radiation and HLY78 on the zebrafish embryonic developmental toxicity. Toxicology. 411, 143-153 (2019).
- Si, J., et al. Toxic effects of (56)Fe ion radiation on the zebrafish (Danio rerio) embryonic development. Aquatic Toxicology. 186, 87-95 (2017).
- Pucci, G., Forte, G. I., Cavalieri, V. Evaluation of epigenetic and radiomodifying effects during radiotherapy treatments in zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 9053 (2021).
- Song, Z., et al. Isoliquiritigenin triggers developmental toxicity and oxidative stress-mediated apoptosis in zebrafish embryos/larvae via Nrf2-HO1/JNK-ERK/mitochondrion pathway. Chemosphere. 246, 125727 (2020).
- Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: From preclinical modelling to clinical trials. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (8), 611-628 (2021).
- Rosa, J. G. S., Lima, C., Lopes-Ferreira, M. Zebrafish larvae behavior models as a tool for drug screenings and pre-clinical trials: A review. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6647 (2022).
- Kong, E. Y., Cheng, S. H., Yu, K. N. Biphasic and triphasic dose responses in zebrafish embryos to low-dose 150 kV X-rays with different levels of hardness. Journal of Radiation Research. 57 (4), 363-369 (2016).
