Summary
Her præsenterer vi en protokol til optisk detektion i høj opløsning af kemisk information omkring implanteret medicinsk udstyr med røntgenexciteret luminescens kemisk billeddannelse (XELCI). Denne nye billeddannelsesteknik er udviklet i vores laboratorium, som gør det muligt at studere implantatassocieret infektionsbiokemi.
Abstract
Mikrobielle infektioner forbundet med implanterbart medicinsk udstyr er et stort problem ved frakturfikseringsfejl. Tidlig diagnose af en sådan infektion vil muliggøre en vellykket udryddelse med antibiotika uden ekstra omkostninger til en anden operation. Heri beskriver vi XELCI som en teknik med høj røntgenopløsning, implantatspecificitet og kemisk følsomhed over for ikke-invasivt billedkemiske koncentrationer nær overfladen af implanteret medicinsk udstyr. Enhederne er belagt med kemisk rapporterende overflader. Denne kemisk responsive overflade består af to lag belagt med et implanterbart medicinsk udstyr; et pH-følsomt lag (bromthymolblåt eller bromocresolgrønt inkorporeret hydrogel), som er belagt over et rødt lys-scintillator (Gd2O2S: Eu) lag til overvågning. En fokuseret røntgenstråle bestråler et sted på implantatet, og det røde lys, der genereres af scintillator (med 620 nm og 700 nm toppe) transmitteres gennem sensorlaget, som ændrer spektralforholdet afhængigt af pH. Et billede genereres ved at scanne røntgenstrålen over implantatet og måle spektralforholdet mellem lys, der passerer gennem vævet punkt for punkt. Vi brugte denne billeddannelsesteknik til overvågning af implantatassocierede infektioner, der tidligere var på lårbenets knogleoverflade med en modificeret implanterbar pladesensor. Nu studerer vi pH-ændringer, der opstår fra tibiale intramedullære stanginfektioner. To forskellige typer intramedullære stangdesign anvendes i kaninstudier før pilot, og vi lærte, at XELCI-teknikken kunne bruges til at overvåge eventuelle kemiske ændringer, der ikke kun forekommer på knogleoverfladen, men også inde i knoglen. Dette muliggør således ikke-invasiv, høj rumlig opløsning, lokal pH-billeddannelse med lav baggrund til at studere implantatassocieret infektionsbiokemi.
Introduction
I USA indsættes ca. 2 millioner frakturfikseringsanordninger årligt, og 5% -10% af dem fører til implantatassocierede infektioner1. Disse infektioner er sværere at behandle med antibiotika på senere stadier på grund af biofilmenes heterogenitet og antibiotikaresistente karakter 2,3. Hvis de diagnosticeres tidligt, kan infektioner behandles med antibiotika og kirurgisk debridering for at forhindre ekstra medicinske omkostninger til en anden operation for at erstatte hardware på det behandlede brudsted. Almindelig radiografi og andre avancerede radiografiske teknikker anvendes til diagnosticering af ortopædiske implantatassocierede infektioner, ikke-fagforeninger og relaterede komplikationer. Selvom disse teknikker ofte bruges til at erhverve strukturel information om den omgivende knogle og væv ved det ortopædiske implantat, er de ikke i stand til at give biokemisk information i det specifikke miljø. Derfor udviklede vi en ny XELCI-teknik (X-ray Excited Luminescence Chemical Imaged) til billeddannelse i høj opløsning af biokemisk information noninvasivt på implantatstedet. Diagnose af ortopædiske implantatassocierede infektioner udføres almindeligvis på en eller en kombination af forskellige måder. Kliniske observationer (smerte, hævelse, rødme, sårudflåd osv.) tyder på de første tegn på infektion. Senere udføres radiologiske og laboratorieforsøg for at bekræfte svigt i knoglehelingsprogression og identificere patogenorganismen 4,5. Nukleære medicinske teknikker såsom computertomografi (CT), magnetisk resonansbilleddannelse (MR) og radionukleotidmetoder såsom Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) og Positron Emission Tomography (PET) er i brug til bedre visualisering af det inficerede implantat og den tilhørende infektion 6,7. CT og MR er fordelagtige til bestemmelse af henholdsvis knoglenekrose og abnormiteter i blødt væv, men forårsager interferens tæt på metalimplantaterne8. Forskellige røntgenmetoder såsom SPECT og PET i kombination med radioisotopmærkede analysander som in vivo-billeddannende kontrastmidler anvendes i vid udstrækning til at diagnosticere implantatassocieret osteomyelitis2. Nuværende applikationer kombinerer både data fra CT-scanning og mærkningsdata fra enten SPECT eller PET for at generere anatomisk information9. Selvom en eller flere af disse billeddannelsesmetoder bruges til at hjælpe infektionsdiagnosen, kan de ikke opdage pH-variationerne forbundet med infektion tidligt for at starte behandlingerne med antibiotika for at undgå ekstra medicinske og kirurgiske udgifter.
Den største fordel ved at udnytte billeddannelsessystemet, der anvendes i denne undersøgelse til overvågning af implantatassocierede infektioner, er dets evne til at afsløre biokemisk information om biofilmmikromiljøet med en spektral reference. Selvom hovedfokus er på billeddannelse og kortlægning af pH på det inficerede sted, kan denne metode ændres til at overvåge andre biomarkører, der er specifikke for implantatassocierede infektioner. Således tillader XELCI forståelse af infektionens patofysiologi. Den høje rumlige opløsning billeddannelse tillader kortlægning heterogenitet, når infektionen vokser. pH på overfladen, hvor biofilmdannelsen finder sted, er meget vigtig for at forstå biokemiske ændringer. Andre mikromiljøændringer kan også forekomme på grund af antibiotikarelaterede stressresponser fra bakterier10,11. På grund af overfladespecifik billeddannelse med høj rumlig opløsning kan antibiotikaeffekten på biofilmmikromiljøet overvåges. Teknikken kan også bruges til at studere biofilmmiljøet til målrettede lægemiddelleveringseksperimenter. Vi kan studere målrettet frigivelse af lægemidler med lav pH-værdi eller hæve pH-værdien for at gøre dem mere modtagelige for at arbejde ved højere pH-værdi.
Tre specifikke egenskaber ved denne billeddannelsesteknik er røntgenopløsning, implantatoverfladespecificitet og kemisk følsomhed (figur 1A). Disse egenskaber kan sammenlignes med de aktuelt tilgængelige billeddannelsesteknikker til billeddannelse af ortopædiske implantatrelaterede infektioner (figur 1B). Når fosforpartiklerne er bestrålet med røntgenstråler, genererer de rødt og nær-IR (NIR) lys, der kan trænge igennem nogle få centimeter væv (omend med en vis dæmpning)12,13. Tabel 1 viser nogle af funktionerne i det udviklede billeddannelsessystem sammenlignet med andre måder, der er blevet brugt til at måle pH i biofilm eller gennem væv.
XELCI er en ny billeddannelsesteknik til optisk at erhverve kemisk information med høj rumlig opløsning nær implanteret medicinsk udstyr i kombination med røntgenexcitation, som vist i figur 2. Her anvendes selektiv excitation og optisk detektion af røntgenexcitable fosforpartikler. Implantatet er belagt med to lag, et pH-følsomt farvestof, inkorporeret polymerlag over et lag af scintillator partikler. Når en sekvens af fokuserede røntgenstråler bestråler implantatet, genererer scintillatorlaget synligt lys (620 nm og 700 nm). Dette producerede lys passerer gennem det pH-følsomme lag, der modulerer luminescensspektret afhængigt af pH i det omgivende miljø. Lav pH er generelt forbundet med infektion og biofilmdannelse; efterhånden som infektionen skrider frem, ændres pH-værdien fra fysiologisk pH (pH 7,2) til sur (mindre end pH 7), og pH-farvestoffet i sensoren skifter farve og dermed absorbans. Variationen af luminescensspektret er vist i figur 2E for bromocresolgrønt pH-farvestof ved pH 7 og pH 4. Det transmitterede lys gennem væv og knogle opsamles, og spektralforholdet bestemmer pH. For at generere et pH-billede bestråler den fokuserede røntgenstråle et punkt ad gangen i scintillatorfilmen og scanner strålen punkt for punkt over prøven. Tidligere blev denne teknik anvendt til billed pH-variation på overfladen af de ortopædiske implantater14,15 og har testet den til at overvåge pH-variationer i den intramedullære kanal gennem knogler og væv.
Figur 3 nedenfor viser et skema over billeddannelsessystemet. Grundlæggende komponenter i billeddannelsessystemet er røntgenexcitationskilden med polykapillær optik, en akryllysguide i ét stykke, der forbinder to fotomultiplikatorrør, x, y og z motoriseret trin (30 cm x 15 cm x 6 cm vandring) og computeren tilsluttet til dataindsamling. Røntgenkilden, x, y, z-trinnet og opsamlingsoptikken (albue, lysguide, fotomultiplikatorrør (PMT'er)) er i røntgenbeviset kabinet, mens røntgencontrolleren, strømkilden til PMT'er, funktionsgenerator, der er tilsluttet dataindsamlingskortet (DAQ) og computeren, holdes udenfor. En trykknap, normalt åben kontakt, placeret mellem kabinettet og dørens forside fungerer som en låsning. Hvis døren ikke er helt lukket (låsekontakten er åben), tændes røntgenkilden ikke, og den slukker automatisk røntgenkilden, hvis den åbnes under drift. Motorerne kan udføre en kontinuerlig scanning, såvel som de kan flyttes til ethvert diskret sted. Scanningshastigheden for y-aksen er normalt 1-5 mm/s, mens trinstørrelsen på x-aksen typisk kan vælges fra 150-2000 μm. Parametrene kan vælges afhængigt af den krævede rumlige opløsning. Selv eksponeringstider bekræftes af ensartet hastighed gennem en kontinuerlig scanning.
Når den fokuserede røntgenstråle er bestrålet på røntgenluminescenspartiklerne, vil det genererede lys passere gennem den pH-følsomme film ved at modulere lyset afhængigt af den omgivende pH. Det transmitterede lys vil interagere (sprede og absorbere delvist) med et væv, mens lysdæmpningen ved spredning og absorption øges, når vævstykkelsen øges. Kollektionsoptikken inkluderer en todelt akryllysguide i ét stykke udstyret med en reflekterende aluminiumsalbue (med en 90 ° bøjning og poleret reflekterende indvendig overflade) i begyndelsen. Dette er for at sikre, at lyset kolliderer, så snart lyset når lysguiden. Disse tilføjelser forbedrede lysindsamlingseffektiviteten betydeligt. For yderligere detaljer viser figur 4 maskintegningerne af albuen og lysstyret. 90 ° albuen blev bearbejdet af aluminium med den indvendige overflade poleret til en spejlfinish, og lysstyret blev bearbejdet med akryl. Vi har også monteret et bredt udvalg af langpasblåt lysfilter (blokerer 350-450 nm lys) i begyndelsen af albuen for at sikre, at kun rødt lys passerer igennem. Enden af akryllysføringen i ét stykke deler sig i to strømme, der fører til to forskellige PMT'er. PMT'erne er lukket i en lille lystæt metalkasse, der er i kontakt med en termoelektrisk køler for at køle PMT'erne ned til ~ 5 ° C. I begyndelsen af en af PMT'erne er et langpasfilter med smal rækkevidde (blokering af 570-640 nm lys og passerer 640-740 nm lys) fastgjort til kun at måle 700 nm lyset. Derfor kan 620 nm og 700 nm lyset beregnes separat. PMT'erne er sat op i fotontællingstilstand, og de genererer transistor-transistorlogik (TTL) impulser for hver detekteret foton. Et DAQ-system tæller impulserne (mætningspunkt 20 millioner impulser pr. sekund) ved hjælp af USB-kommunikation. To separate intensitetskort genereres efter behandling af dataene, og et endeligt billede oprettes ved at overveje forholdet mellem signalbølgelængdeintensiteten (620 nm) og referencebølgelængdeintensiteten (700 nm). Dette forhold tegner sig for forskelle i total lysindsamlingseffektivitet, som i høj grad afhænger af opsamlingsoptikkens position, røntgenbestrålingsintensitet og vævstykkelse. Derudover tegner et rumligt adskilt referenceområde uden noget pH-indikatorfarvestof sig for spektral forvrængning fra bølgelængdeafhængig vævsindtrængning. Et grafikbaseret programmeringssprog bruges til styring af billedbehandlingssystemet, og et grundlæggende rutediagram over operationen er vist nedenfor. Billeddannelsesopsætningen, bortset fra computeren, røntgencontrolleren og DAQ-enheden, er lukket i et sikkert røntgenkabinet for at minimere strålingseksponering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne procedure følger de dyrebrugsprotokoller, der er godkendt af Clemson University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Forsøgene udføres i henhold til Clemson University Biosafety Committee (IBC) og strålingssikkerhedsudvalget (RSC) samt efter de relevante retningslinjer og regler.
BEMÆRK: Et flowdiagram over fuldførelse af en XELCI-scanning er vist nedenfor i figur 5 efterfulgt af en detaljeret trin-for-trin beskrivelse af billeddannelsesproceduren.
1. Initialiser systemet og få et almindeligt røntgenbillede
- Tænd PMT-køleren, det tager typisk ~ 15 minutter at nå sætpunktet (f.eks. 4 ° C). Udfør resten af initialiseringstrinnene, før du tænder PMT'erne.
- Åbn administrationssoftwaren til billedbehandlingssystemet. Det styrende softwareprogram kommunikerer og initialiserer x-y-z-aksens motoriserede trin. Flyt trinnet x-aksen og y-aksen til den ønskede startposition.
- Anbring prøven på det bevægelige x-y-z-trin. Prøvetagningshøjden (z-aksen), så den radioluminescerende enhed er 5-5,5 cm under polykapillærfokusoptikken ved at hæve eller sænke røntgenkilden og/eller trinnet. Placer også prøven i x-y-planet ved hjælp af lasertværhovedet (to røde linjeformede laserpegere, der er fastgjort til røntgenfokuseringskapillæret og placeret 90 ° til hinanden, så linjerne skærer hinanden, hvor røntgenstrålen vil fokusere). Sluk for laserne, før røntgenstråler og PMT'er tændes.
- Fastgør trykknaplåsningen ved hoveddøren til billedkabinettet. Tænd for strømmen til strålekilden. Fjern fokuseringsoptikken for at opnå det almindelige røntgenbillede af prøven.
- Åbn røntgenstyringssoftwaren, og indstil røntgeneffekten (ved at justere spænding og strøm). Åbn røntgenlukkeren med røntgenstyringssoftwaren.
- Åbn softwaren til røntgenkamera. Tryk på eksponeringsknappen for at tage det almindelige røntgenbillede. Sluk for eksponeringen, og sluk for røntgenstrålen.
BEMÆRK: Flyt om nødvendigt prøven for at forbedre prøvepositionen eller få en række røntgenstråler på forskellige positioner, så de kan samles for at få en større røntgenbillede. Man kan også erhverve et røntgenbillede på et separat system, men co-registrering mellem XELCI og radiografi bliver vanskeligere, hvis prøven bevæger sig. - Åbn skabsdøren.
2. Udfør eventuelt en baggrundsscanning med røntgenbilledet slukket
- Tilslut polykapillæroptikken igen til røntgenkilden.
- Luk kabinettet, og fastgør låsningen. Tænd for PMT-strømforsyningen.
BEMÆRK: PMT-strømforsyningen skal altid slukkes, når døren er åben eller ved at blive åbnet for at undgå overeksponering for lys. - Åbn administrationssoftwaren til billedsystemet, og angiv trinstørrelse, scanningshastighed og scanningsområde. Når alle parametre er indstillet, skal du starte scanningen ved at trykke på knappen Kør .
BEMÆRK: For en scanning med høj opløsning vil trinstørrelsen være 1000 μm, og for en scanning med lav opløsning vil trinstørrelsen være 250 μm. Scanningshastigheden kan vælges fra 5 mm/s til 1 mm/s. Scanningsområdet afhænger af prøvens dimensioner. - Kør en baggrundsscanning med røntgenstrålen slukket for at bestemme mørketællingerne fra ethvert andet lys i kabinettet end prøven.
3. Udfør en prøvescanning med røntgenbilledet tændt
- Sørg for, at prøven stadig er i den rigtige position med lasertværhovedet for at starte scanningen.
- Luk kabinettet, og fastgør låsningen. Hvis PMT'erne er slukket (f.eks. slukket, før døren åbnes), skal du tænde for PMT-strømforsyningen.
- Åbn administrationssoftwaren til billedbehandlingssystemet. Angiv værdierne for trinstørrelse, scanningshastighed og scanningsområde. Når alle parametre er indstillet, skal du trykke på knappen Kør for at starte scanningen.
BEMÆRK: For en scanning med høj opløsning vil trinstørrelsen være 1000 μm, og for en scanning med lav opløsning vil trinstørrelsen være 250 μm. Scanningshastigheden kan vælges fra 5 mm/s til 1 mm/s. Scanningsområdet afhænger af prøvens dimensioner. - Hent scanningen efter prøven med røntgenstrålen tændt.
- Udfør først scanningen med lav opløsning med større trinstørrelser og højere scanningshastighed for at få et foreløbigt billede af målet. Efter at have opnået en scanning med lav opløsning af det ønskede område af prøven, opnås scanningen med højere opløsning med en mindre trinstørrelse og lavere scanningshastighed.
- Sluk for PMT-strømforsyningen, inden døren åbnes.
4. Dannelse af billedet
- Valider den aktuelle scanning er billeddannelse af målets interesseområde. Hvis ikke, skal du stoppe den aktuelle scanning ved at trykke på Stands knap.
- Juster scanningspositionerne i styringssoftwaren igen, og tryk på knappen Kør igen.
BEMÆRK: Y-aksen registreres kontinuerligt startende fra den første række i scanningen. Under udførelse af en scanning registreres antallet af tællinger pr. bølgelængde og tid siden den sidst opdaterede motorposition. Den registrerede tid tager højde for eventuelle ændringer i motorhastigheden, og dermed eksponeringstiden. For hver pixel normaliseres antal/sekund. Y-aksemotoren bevæger sig for at scanne enden af den aktuelle række på y-aksen, og motoren kommer tilbage til startpositionen. Derefter øger x-aksemotoren sin position med en trinstørrelse, der er defineret af brugeren, og scanner den anden række af y-aksen. Denne proces cykles, indtil x-aksemotoren når den specificerede bredde for x-retningen. Brugeren kan styre scanningsstørrelsen, motorhastigheden og motorens startpositioner. Trinstørrelsen bestemmer pixelstørrelsen i det endelige billede af y-aksen.
5. Dyrkning af bakterier til billeddannelse under sterile forhold (Hvis bakteriedyrkede sensorer afbildes)
- For at forberede en frisk kultur af Staphylococcus aureus 1945 (ATCC 25923) skal du bruge en koloni fra en TSA (Tryptic sojaagar) plade stribet inden for 1 uge for at inokulere 5 ml steril tryptisk sojabuljong (TSB).
- Bakteriekulturen rystes forsigtigt ved 37 °C i 16-18 timer indtil den stationære fase.
- Derefter pelleteres kulturen fra TSB via centrifugering ved 4000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur (RT) og pellet vaskes to gange med fosfatbufferopløsning (PBS) og resuspenderes pellet i 5 ml steril PBS.
- Kvantificer bakteriekoncentrationen ved hjælp af optisk densitet ved 600 nm ved hjælp af det lineære område, som er OD-området, hvor Beer-Lambert-loven verificeres (OD = kN; k er en koefficient i forhold til den molekylære udryddelse og længden af den optiske vej, N er bakteriekoncentrationen)16. Derefter fortyndes prøven til10,5 celler/ml ved hjælp af steril PBS.
- Tryptic Soy Agar (TSA) steriliseres ved autoklavering og afkøles derefter ved blanding, indtil temperaturen når 45 °C. Pod bakterierne i TSA.
- Den fortyndede bakteriekultur (100 μL) pipetteres på overfladen af den implanterbare sensor.
BEMÆRK: Implantater blev steriliseret ved nedsænkning i 70% ethanol i 5 minutter og opbevaret i steril PBS. - Pipette 100 μL ikke-inokuleret TSA over et andet sterilt implantat som kontrol
- Der tilsættes yderligere 100 μL uinokuleret TSA over den implanterbare sensor, før den inkuberes ved 37 °C i 48 timer før implantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en foreløbig undersøgelse afbildede vi den intramedullære stangsensor i en reamed tibia af en kanokaver14. Sensoren har tre forskellige regioner: referenceregionen, pH 8-regionen (basisk pH) og pH-4-regionen (sur pH). Referenceregionen er scintillatorpartiklen (Gd2O2S:Eu), der er inkorporeret i ru epoxyfilm. De karakteristiske sure og basiske pH-regioner repræsenterer inficerede og ikke-inficerede situationer inde i den intramedullære kanal (figur 6A, B)14.
Efter afslutningen af scanningen blev billederne ved henholdsvis 620 nm, 700 nm og forhold (figur 7A-C) genereret i MATLAB. Farveændringerne er vejledende for ændringerne i pH. Da bromthymolblåt i det basiske pH-område absorberer udsendt lys betydeligt end det sure pH-område, fremstår det nedre pH-område som et lysere signal ved 620 nm. Scintillatoremissionen ved 700 nm fungerer som spektral reference for uoverensstemmelser i scintillatorfilmen, ændringer i vævssammensætning og eventuelle ændringer, der opstår i detektionsoptikkens position fra scanning til scanning.
Figur 1: Specifikke egenskaber ved XELCI-billeddannelsen sammenlignet med de aktuelt tilgængelige teknikker (A) Nøglefunktioner; B) sammenligning med de billeddannelsesteknikker, der er til rådighed på nuværende tidspunkt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Arbejdsprincip for teknikken og sensoradfærd med og uden infektion. A) skematisk oversigt over implantat bestrålet med fokuseret røntgenstråle og luminescens indsamlet til detektion B) zoomet ind på scintillatoren og den pH-følsomme filmbelagte intramedullære stangsensor (C) ved lav pH forårsaget af infektion bliver intramedullær stangsensor fra blå til gul, mens farvestoffri referenceregion er uændret; D) zoomet ind på den intramedullære stang under en infektion E) spektre viser epoxy-PEG pH-sensorfilm (10 % PEG-hydrogel indeholdende bromocresolgrønt pH-farvestof belagt oven på epoxyfilm indeholdende Gd2O2S:Eu scintillatorpartikler) ved pH 7 og pH 4 og epoxy-scintillatorlag uden pH-indikator PEG-hydrogel. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Uzair et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Billeddannelsessystem. (A) Skematisk diagram (de røde pile viser lysets retning mod PMT) B) et foto af det faktiske system. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Computerstøttede tegninger af konstruktionssoftware, der viser dimensionerne . (A) Tegning af 90° albuen (B) Tegning af akryllysstyret i ét stykke. (Alle dimensioner er i mm) Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Rutediagram over billedbehandlingsproceduren Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Intramedullær stangsensor i et reamed skinneben af et kaninkadaver. A) Stang af rustfrit stål belagt med Gd2O2S:Euepoxy og pH-følsom acrylamid-PEG-gel; (B) belagt rustfri stålstang indsat i det borede hul i kaninskinnebenet. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Uzair et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Billeder af stangsensoren i den intramedullære kanal. (A) Analyseret billede for 620 nm bølgelængde; (B) analyseret billede for 700 nm bølgelængde; (C) analyseret forholdsbillede (620/700); D) almindeligt røntgenbillede af stangsensoren (E) overlejret forhold billede og almindelig radiografi. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Uzair et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Overfladespecifik billeddannelse | Ligevægt/ikke-ligevægt | Høj opløsning gennem væv | Ioniserende stråling | Røntgen let overlejret | Repræsentative referencer | |
| pH-mikroelektrode | Ja, et punkt ad gangen | ikke-ligevægt, (Nernst Equation) tilsmudsning og tid kan forårsage drift | Ja, et punkt ad gangen | Nej | Nej | 23-25 |
| Fluorescerende pH-indikatorer | Ja | Ligevægt | Nej | Nej | Nej | 18,26 |
| MR (CEST) | Ja | Ligevægt | 3D, men langsom | Nej | Nej | 27 |
| XELCI | Ja | Ligevægt | Ja | Ja | Ja | 14,15,22 |
Tabel 1: Funktioner af XELCI vs. andre pH-billeddannelsesteknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at kunne opdage og studere ortopædiske implantatassocierede infektioner tidligt for at undgå komplikationer fra osteomyelitis og sekundære kirurgiske procedurer har vi introduceret XELCI som en ny, funktionel billeddannelsesteknik. Det kan sammenlignes med de aktuelt tilgængelige teknikker til pH-overvågning gennem væv.
Mens vi placerer prøven til billeddannelse, bruger vi et lasertværhoved forbundet til polykapillær fokuseringsoptik med to skærende linjeformede laserpegepinde i 90 ° vinkel for at justere albuen nøjagtigt under den. Disse lasere skal slukkes, inden en scanning påbegyndes for at eliminere uønsket lys, der når detektoren, bortset fra det lys, der genereres af scintillatorerne. Med hensyn til afstand måler brugeren afstanden fra spidsen af fokusoptikken til toppen af prøven til at være omkring 5-5,5 cm, før eksperimentet påbegyndes. Dette kan opnås enten ved at hæve røntgenkilden manuelt eller ved at flytte scenen op og ned. Den samme procedure bruges til et levende dyr eller måling gennem væv, bortset fra at vi lægger dyret under bedøvelse og kører et isoflurangasrør for at sikre, at det siger søvn. Vi overvåger dens temperatur og puls med jævne mellemrum og tilføjer ekstra strøelse og tape for korrekt placering af dyrets anatomi, især vinklen, og vi estimerer 5-5,5 cm brændvidde til at være implantatets dybde i stedet for blot at bruge afstanden til den øverste overflade af huden. Ofte tages et almindeligt røntgenbillede eller grov scanning for at sikre den korrekte placering og senere overlejres med det kemiske XELCI-billede taget på samme sted. For sensorer, der ikke er dækket af væv, reduceres røntgenkildestrømmen generelt fra maksimum 600 μA ved 50 kV til så lavt som 15 μA for at sikre, at PMT'erne ikke mættes. Røntgenkilden og dens tilstand overvåges periodisk af Clemson University Radiation Safety. Nøglen til røntgencontroller bruges kun af XELCI-brugere, og den holdes altid væk for at forhindre utilsigtet tænd/sluk. Trykknaplåsningen ved kabinettets hoveddør skal også sikres omhyggeligt, inden røntgenstrålen tændes. Hvis låsningen ikke fungerer korrekt, vil brugeren ikke være i stand til at tænde røntgenstrålen, og det vil generere fejl. Under hele eksperimentet, mens røntgenstrålen er tændt, tændes et orange lys for at advare alle om, at røntgenstrålen kører.
Typisk køres både en scanning med lav opløsning og en scanning med høj opløsning. Scanningen med lav opløsning er med en større trinstørrelse, og scanningen med høj opløsning er med en mindre trinstørrelse. Den tid, det tager for en scanning, afhænger stort set af tre faktorer: trinstørrelsen, scanningens hastighed og scanningsområdet. Det tager f.eks. ~20 minutter at scanne et område på 15 mm x 15 mm for et billede i høj opløsning med en langsom scanningshastighed på 1 mm/s og ved en trinstørrelse på 200 μm. Scanning af det samme område med en lavere opløsning og hurtigere scanningshastighed reducerer tiden (f.eks. tager 1 mm trinstørrelse og 5 mm / s hastighed ca. 1 min). Der er brug for yderligere tid før scanning for korrekt opsætning og placering af dyret eller prøven og underdrivelse, hvor implantatet er placeret. For dyreforsøg overvåges kropstemperaturen for at sikre, at temperaturen ikke falder for meget under anæstesi. Opvarmning fra røntgenstråling er ubetydelig, da røntgendosis til scanningen, der anvendes i denne undersøgelse, er lille. Hvis man antager en lokal røntgendosis på 1 Gy = 1 J/kg og en varmekapacitet på 3,45 kJ/kg K for muskel17, ville den maksimale temperaturstigning fra strålingsabsorption være mindre end en mK
Ligning 1
Q- varmeenergi
m- masse
c- specifik varmekapacitet
ΔT- temperaturændring
Ifølge ovenstående beregning er temperaturstigningen ubetydelig. Derudover vil selv denne lille temperaturstigning hurtigt spredes gennem blodcirkulationen.
PMT'erne har en aktiv fotokatodediameter på 22 mm; Dette store område letter lysoptagelse fra et stort diffust område under huden. For at reducere den mørke strøm fra termisk induceret elektronemission får PMT'erne lov til at afkøle med køligere nedenunder. Vi har en akryllysguide i ét stykke, der opdeles i to strømme, hvilket fører til to forskellige fotomultiplikatorrør (PMT'er) til signaldetektering. Denne forbedring af systemet gjorde det muligt for os at forbedre lysindsamlingseffektiviteten og dermed registrere signaler gennem knogler og væv. Tidligere blev denne billeddannelsesteknik brugt til overvågning af infektioner på overfladen af de ortopædiske implantater, og vi kunne med succes afbilde pH-ændringer14,15. Vi genererede billeder med højt signal/støj af en modificeret intramedullær stang gennem ca. 2 cm knogle og væv i kaninskinnebenet. Generelt øges lysdæmpning ved spredning og absorption eksponentielt med vævstykkelse. Der er således en afvejning mellem vævstykkelse afbildet gennem, røntgendosis / scanningstid og rumlig opløsning.
Denne billeddannelsesteknik beskrevet her involverer både en implanteret sonde og en scanner. Sonden indeholder røntgenscintillatorer, der genererer synligt og NIR-lys, når det bestråles af røntgenstråler. Det har et kemisk følsomt lag fremstillet over scintillatorlaget, der påvirker lysintensiteten eller spektret. Det kemisk følsomme lag, der er valgt til denne anvendelse, er bromthymolblåt, som har pH-afhængig absorbans ved 600 nm bølgelængde og næsten konstant (pH-uafhængig) absorbans ved 700 nm lys, som overlapper scintillatoremissionen (620 nm og 700 nm). Bromothymol Blue eller Bromocresol grøn har en pK,en værdi i pH-området, vi er interesserede i at overvåge implantatassocierede infektioner. Under analyse af pH-mikromiljøet i bakteriel biofilm med pH-følsomt fluorescerende ratiometrisk farvestof kan pH variere mellem 5,6 (inden i biofilmen) og pH 7 (i den omgivende bulkvæske)18. Implanteret sonde har også et scintillatorlag uden pH-indikerende farvestof, der fungerer som en rumligt særskilt referenceregion. Desuden har de scintillatorpartikler, vi bruger, fremtrædende emissioner ved ~ 600 nm og ~ 700 nm bølgelængder. Absorbansspektret for ovennævnte farvestoffer overlapper emissionsspektret for Gd2O2S:Eu-partiklerne. Både de spændende røntgenstråler og røde / NIR luminescensfotoner anvendes i in vivo biomedicinsk billeddannelse, da de kan formere sig gennem væv 19,20,21.
Figur 1 viser tre specifikke egenskaber ved billeddannelsessystemet, der anvendes i denne undersøgelse: røntgenopløsning, kemisk specificitet og implantatoverfladespecificitet. Disse egenskaber kan sammenlignes med de aktuelt tilgængelige billeddannelsesteknikker såsom SPECT, PET, MR, US osv.22. Selvom disse teknikker giver strukturel/anatomisk information i høj opløsning i høj opløsning, kunne vi ikke kortlægge/afbilde kemiske ændringer på en implantatoverflade. Denne teknik kombinerer kemisk følsomhed fra optiske indikatorfarvestoffer med implantatspecificitet fra belægningen. Den rumlige opløsning fra røntgenstrålen giver en unik, lav baggrund og højere rumlig opløsning detektion / kortlægning af kemiske koncentrationer på implantatoverflader gennem knogler og væv.
Røntgenexciteret luminescens kemisk billeddannelse giver en unik måde at studere det lokale kemiske miljø på en implantatoverflade med en høj rumlig opløsning til undersøgelse af infektioner. I fremtiden kan tilgangen generaliseres til overvågning af andre analysander ved at vælge forskellige indikatorfarvestoffer. Det kan potentielt anvendes til andre sygdomme og tilstande ved hjælp af injiceret eller implanteret medicinsk udstyr belagt med scintillatorpartikler og indikatorfarvestoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hævder ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Clemson University, COMSET og Clemson SC BioCRAFT. XELCI-opsætningen blev oprindeligt udviklet med midler fra NSF CAREER CHE 12255535 og senere af NIH NIAMS R01 AR070305-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 degree elbow | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| Bromo Cresol Green | Sigma-Aldrich | 45ZW10 | |
| Bromo Thymol Blue | Sigma | 76-59-5 | |
| ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate | Pollock industries, White River, VT, USA | TCP 50 | |
| Ethanol | Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051 |
64-17-5 | |
| Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm | Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England | UKL63/N-R1 | |
| LabVIEW | National Instruments, Austin, TX | ||
| Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis) | Motion Control, Smithtown, NY, USA | AT10-60 | |
| National instruments c-DAQ 9171 | National Instruments, Austin, TX | NI cDAQ™-9171 | |
| One piece acrylic light guide | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| pH 4 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5024 | |
| pH 8 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5060 | |
| Phosphate Buffer Solution | MP Biomedicals, Irvine, CA. USA | 2810305 | |
| Photo multiplier tubes Model P25PC-16 | SensTech, Surrey, UK | Model P25PC-16 | |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ATCC 25923 | |
| Tryptic Soy Agar | Teknova, Hollister, CA, USA | T0520 | |
| Tryptic Soy Broth | EMD Millipore, Burlington, MA, USA | 1005255000 | |
| X-ray source-iMOXS | Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany | ||
| X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel | Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA | LTS300 and LTS150 |
References
- Arciola, C. R., Alvi, F. I., An, Y. H., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infection and infection resistant materials: A mini review. International Journal of Artificial Organs. 28 (11), 1119-1125 (2005).
- Renick, P., Tang, L. Device-related infections. Racing for the Surface. Li, B., Moriarty, T. F., Webster, T., Xing, M. , Springer International Publishing. Cham. 171-188 (2020).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J.
- Metsemakers, W. J., et al. Fracture-related infection: A consensus on definition from an international expert group. Injury. 49 (3), 505-510 (2018).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infections: Adhesion, biofilm formation and immune evasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (7), 397-409 (2018).
- Polvoy, I., Flavell, R. R., Rosenberg, O. S., Ohliger, M. A., Wilson, D. M. Nuclear Imaging of Bacterial Infection: The State of the Art and Future Directions. Journal of Nuclear Medicine. 61 (12), 1708-1716 (2020).
- vander Bruggen, W., Bleeker-Rovers, C. P., Boerman, O. C., Gotthardt, M., Oyen, W. J. G. PET and SPECT in Osteomyelitis and Prosthetic Bone and Joint Infections: A Systematic Review. Seminars in Nuclear Medicine. 40 (1), 3-15 (2010).
- Trampuz, A., Zimmerli, W. Diagnosis and Treatment of infections associated with fracture-fixation devices. Injury. 37 (2), 59-66 (2006).
- Ady, J., Fong, Y. Imaging for infection: From visualization of inflammation to visualization of microbes. Surgical Infections. 15 (6), 700-707 (2014).
- Truong-Bolduc, Q. C., et al. Implication of the NorB Efflux pump in the adaptation of Staphylococcus Aureus to growth at acid pH and in resistance to Moxifloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3214-3219 (2011).
- Hengge-Aronis, R. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the σS (RpoS) subunit of RNA polymerase. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 373-395 (2002).
- Gao, R., Yan, D. Molecular phosphors for x-ray detection. Science Bulletin. 67 (10), 1015-1017 (2022).
- Gao, R., Fang, X., Yan, D. Recent developments in stimuli-responsive luminescent films. Journal of Materials Chemistry C. 7 (12), 3399-3412 (2019).
- Uzair, U., et al. Conformal coating of orthopedic plates with x-ray scintillators and ph indicators for x-ray excited luminescence chemical imaging through tissue. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (47), 52343-52353 (2020).
- Uzair, U., Benza, D., Behrend, C. J., Anker, J. N. Noninvasively imaging pH at the surface of implanted orthopedic devices with x-ray excited luminescence chemical imaging. ACS Sensors. 4 (9), 2367-2374 (2019).
- Begot, C., Desnier, I., Daudin, J. D., Labadie, J. C., Lebert, A. Recommendations for calculating growth parameters by optical density measurements. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 225-232 (1996).
- Giering, K., Minet, O., Lamprecht, I., Müller, G. Review of thermal properties of biological tissues. Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering. , 45-65 (1995).
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Pogue, B. W., Leblond, F., Krishnaswamy, V., Paulsen, K. D. Radiologic and Near-Infrared/Optical Spectroscopic Imaging: Where Is the Synergy. American Journal of Roentgenology. 195 (2), 321-332 (2010).
- Ryan, S. G., et al. Imaging of X-ray-excited emissions from quantum dots and biological tissue in whole mouse. Scientific Reports. 9 (1), 19223 (2019).
- Yang, Y., Wang, K. -Z., Yan, D. Ultralong persistent room temperature phosphorescence of metal coordination polymers exhibiting reversible pH-responsive emission. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (24), 15489-15496 (2016).
- Chen, H., Rogalski, M. M., Anker, J. N. Advances in functional X-ray imaging techniques and contrast agents. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (39), 13469 (2012).
- Allan, V. J. M., Macaskie, L. E., Callow, M. E. Development of a pH gradient within a biofilm is dependent upon the limiting nutrient. Biotechnology letters. 21 (5), 407-413 (1999).
- Wang, Z., Deng, H., Chen, L., Xiao, Y., Zhao, F. In situ measurements of dissolved oxygen, pH and redox potential of biocathode microenvironments using microelectrodes. Bioresource Technology. 132, 387-390 (2013).
- Xiao, Y., et al. In situ probing the effect of potentials on the microenvironment of heterotrophic denitrification biofilm with microelectrodes. Chemosphere. 93 (7), 1295-1130 (2013).
- Nakata, E., et al. A novel strategy to design latent ratiometric fluorescent pH probes Based on self-assembled SNARF derivatives. RSC Adv. 2014 (4), 348-357 (2014).
- Villano, D., et al. A fast multislice sequence for 3D MRI-CEST pH. Magnetic Resonance in Medicine. 85 (3), 1335-1349 (2021).
