Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur hochauflösenden optischen Detektion chemischer Informationen um implantierte medizinische Geräte mit röntgenangeregter lumineszenzchemischer Bildgebung (XELCI) vor. Dieses neuartige bildgebende Verfahren wird in unserem Labor entwickelt und ermöglicht die Untersuchung der Biochemie implantatassoziierter Infektionen.
Abstract
Mikrobielle Infektionen, die mit implantierbaren medizinischen Geräten in Verbindung gebracht werden, sind ein großes Problem für das Versagen der Frakturfixierung. Eine frühzeitige Diagnose einer solchen Infektion ermöglicht eine erfolgreiche Eradikation mit Antibiotika ohne zusätzliche Kosten für eine zweite Operation. In dieser Arbeit beschreiben wir XELCI als eine Technik mit hoher Röntgenauflösung, Implantatspezifität und chemischer Empfindlichkeit gegenüber nicht-invasiv abgebildeten chemischen Konzentrationen in der Nähe der Oberfläche implantierter medizinischer Geräte. Die Geräte sind mit chemisch berichtenden Oberflächen beschichtet. Diese chemisch ansprechende Oberfläche besteht aus zwei Schichten, die auf ein implantierbares medizinisches Gerät aufgetragen sind. eine pH-empfindliche Schicht (Bromthymolblau oder Bromkresolgrün eingearbeitetes Hydrogel), die zur Überwachung über eine rotlichtemittierende Szintillatorschicht (Gd2 O2S: Eu) aufgetragen wird. Ein fokussierter Röntgenstrahl bestrahlt einen Punkt auf dem Implantat, und das vom Szintillator erzeugte rote Licht (mit 620 nm und 700 nm Peaks) wird durch die Sensorschicht übertragen, wodurch sich das spektrale Verhältnis je nach pH-Wert ändert. Ein Bild wird erzeugt, indem der Röntgenstrahl über das Implantat abgetastet und das spektrale Verhältnis des Lichts, das das Gewebe durchdringt, Punkt für Punkt gemessen wird. Wir nutzten dieses bildgebende Verfahren zur Überwachung von implantatassoziierten Infektionen, die zuvor auf der Knochenoberfläche des Femurs mit einem modifizierten implantierbaren Plattensensor aufgetreten waren. Jetzt untersuchen wir pH-Veränderungen, die durch Infektionen des Tibia-Markstäbchens auftreten. Zwei verschiedene Arten von Markstäben werden in Studien mit Kaninchen vor dem Pilotprojekt verwendet, und wir haben gelernt, dass die XELCI-Technik verwendet werden kann, um chemische Veränderungen zu überwachen, die nicht nur auf der Knochenoberfläche, sondern auch im Inneren des Knochens auftreten. Dies ermöglicht eine nicht-invasive Bildgebung mit hoher räumlicher Auflösung und niedrigem lokalen pH-Hintergrund, um die Biochemie implantatassoziierter Infektionen zu untersuchen.
Introduction
In den Vereinigten Staaten werden jährlich etwa 2 Millionen Frakturfixierungsgeräte eingesetzt, von denen 5 % bis 10 % zu implantatassoziierten Infektionen führen1. Diese Infektionen sind in späteren Stadien aufgrund der Heterogenität und Antibiotikaresistenz der Biofilme schwieriger mit Antibiotika zu behandeln 2,3. Wenn sie frühzeitig diagnostiziert werden, können Infektionen mit Antibiotika und chirurgischem Debridement behandelt werden, um zusätzliche medizinische Kosten für eine zweite Operation zu vermeiden, bei der die Hardware an der behandelten Frakturstelle ersetzt wird. Einfache Röntgenaufnahmen und andere fortschrittliche Röntgentechniken werden bei der Diagnose von orthopädischen Implantat-assoziierten Infektionen, Pseudarthrosen und damit verbundenen Komplikationen eingesetzt. Obwohl diese Techniken häufig verwendet werden, um strukturelle Informationen über den umgebenden Knochen und das umgebende Gewebe am orthopädischen Implantat zu erhalten, sind sie nicht in der Lage, biochemische Informationen in der spezifischen Umgebung zu liefern. Daher haben wir eine neuartige röntgenangeregte lumineszenzchemische Bildgebungstechnik (XELCI) entwickelt, mit der biochemische Informationen nicht-invasiv am Implantatort abgebildet werden können. Die Diagnostik von orthopädischen Implantat-assoziierten Infektionen erfolgt in der Regel mit einem oder einer Kombination verschiedener Methoden. Klinische Beobachtungen (Schmerzen, Schwellungen, Rötungen, Wundausfluss etc.) deuten auf erste Anzeichen einer Infektion hin. Später werden radiologische und labortechnische Experimente durchgeführt, um das Versagen der Knochenheilungsprogression zu bestätigen und den pathogenen Erreger zu identifizieren 4,5. Zur besseren Darstellung des infizierten Implantats und der damit verbundenen Infektion werden nuklearmedizinische Verfahren wie Computertomographie (CT), Magnetresonanztomographie (MRT) und Radionukleotidmethoden wie die Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) und die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) eingesetzt 6,7. CT und MRT sind vorteilhaft bei der Bestimmung von Knochennekrosen bzw. Weichteilanomalien, verursachen jedoch Interferenzen in geringem Abstand zu den Metallimplantaten8. Verschiedene Röntgenmethoden wie SPECT und PET in Kombination mit Radioisotopen-markierten Analyten als in vivo bildgebende Kontrastmittel werden häufig zur Diagnose der implantatassoziierten Osteomyelitiseingesetzt 2. Aktuelle Anwendungen kombinieren sowohl Daten aus CT-Scans als auch Markierungsdaten aus SPECT oder PET, um anatomische Informationen zu generieren9. Obwohl eine oder mehrere dieser Bildgebungsmodalitäten zur Unterstützung der Infektionsdiagnose verwendet werden, können sie die mit der Infektion verbundenen pH-Schwankungen nicht frühzeitig erkennen, um die Behandlungen mit Antibiotika einzuleiten und zusätzliche medizinische und chirurgische Kosten zu vermeiden.
Der Hauptvorteil des in dieser Studie verwendeten Bildgebungssystems zur Überwachung implantatassoziierter Infektionen besteht darin, dass es biochemische Informationen über die Mikroumgebung des Biofilms mit einer spektralen Referenz aufdecken kann. Obwohl das Hauptaugenmerk auf der Bildgebung und Kartierung des pH-Werts an der infizierten Stelle liegt, kann diese Methode geändert werden, um andere Biomarker zu überwachen, die spezifisch für implantatassoziierte Infektionen sind. XELCI ermöglicht es somit, die Pathophysiologie der Infektion zu verstehen. Die hochauflösende Bildgebung ermöglicht es, die Heterogenität während des Wachstums der Infektion abzubilden. Der pH-Wert an der Oberfläche, an der die Biofilmbildung stattfindet, ist sehr wichtig für das Verständnis biochemischer Veränderungen. Auch andere Veränderungen der Mikroumgebung können aufgrund von antibiotikabedingten Stressreaktionen von Bakterien auftreten10,11. Durch oberflächenspezifische und räumlich hochauflösende Bildgebung kann die antibiotische Wirkung auf die Biofilm-Mikroumgebung überwacht werden. Die Technik kann auch verwendet werden, um die Biofilmumgebung für gezielte Experimente zur Verabreichung von Medikamenten zu untersuchen. Wir können die gezielte Freisetzung von Medikamenten mit niedrigem pH-Wert oder die Erhöhung des pH-Werts untersuchen, um sie anfälliger für die Arbeit bei einem höheren pH-Wert zu machen.
Drei spezifische Merkmale dieses Bildgebungsverfahrens sind die Röntgenauflösung, die Spezifität der Implantatoberfläche und die chemische Empfindlichkeit (Abbildung 1A). Diese Merkmale können mit den derzeit verfügbaren bildgebenden Verfahren zur Bildgebung orthopädischer implantatbedingter Infektionen verglichen werden (Abbildung 1B). Nach der Bestrahlung mit Röntgenstrahlen erzeugen Phosphorpartikel, die auf der Implantatoberfläche beschichtet sind, rotes Licht und Nah-IR-Licht (NIR), das einige Zentimeter Gewebe durchdringen kann (wenn auch mit einer gewissen Dämpfung)12,13. Tabelle 1 zeigt einige der Merkmale des entwickelten Bildgebungssystems im Vergleich zu anderen Methoden, die zur Messung des pH-Werts in Biofilmen oder durch Gewebe verwendet wurden.
XELCI ist ein neuartiges bildgebendes Verfahren zur optischen Erfassung chemischer Informationen mit hoher räumlicher Auflösung in der Nähe von implantierten medizinischen Geräten in Kombination mit Röntgenanregung, wie in Abbildung 2 dargestellt. Hier wird die selektive Anregung und optische Detektion von röntgenerregbaren Phosphorpartikeln genutzt. Das Implantat ist mit zwei Schichten beschichtet, einer pH-empfindlichen, farbstoffinkorporierten Polymerschicht über einer Schicht aus Szintillatorpartikeln. Sobald eine Sequenz von fokussierten Röntgenstrahlen das Implantat bestrahlt, erzeugt die Szintillatorschicht sichtbares Licht (620 nm und 700 nm). Dieses erzeugte Licht durchdringt die pH-empfindliche Schicht und moduliert das Lumineszenzspektrum in Abhängigkeit vom pH-Wert der Umgebung. Ein niedriger pH-Wert wird im Allgemeinen mit Infektionen und Biofilmbildung in Verbindung gebracht. Mit fortschreitender Infektion ändert sich der pH-Wert von physiologischem pH-Wert (pH 7,2) zu sauer (weniger als pH 7), und der pH-Farbstoff im Sensor ändert seine Farbe und damit seine Absorption. Die Variation des Lumineszenzspektrums ist in Abbildung 2E für den pH-Farbstoff Bromocresolgrün bei pH 7 und pH 4 dargestellt. Das durch Gewebe und Knochen durchgelassene Licht wird gesammelt und das spektrale Verhältnis bestimmt den pH-Wert. Um ein pH-Bild zu erzeugen, bestrahlt der fokussierte Röntgenstrahl jeweils einen Punkt in der Szintillatorfolie und tastet den Strahl Punkt für Punkt über die Probe ab. Zuvor wurde diese Technik angewendet, um pH-Variationen auf der Oberfläche der orthopädischen Implantate darzustellen14,15 und wurde getestet, um pH-Variationen im Markkanal durch Knochen und Gewebe zu überwachen.
Abbildung 3 unten zeigt eine schematische Darstellung des Bildgebungssystems. Grundlegende Komponenten des Bildgebungssystems sind die Röntgenanregungsquelle mit Polykapillaroptik, ein einteiliger Acryl-Lichtleiter, der mit zwei Photomultiplier-Röhren verbunden ist, der motorisierte x-, y- und z-Tisch (30 cm x 15 cm x 6 cm Verfahrweg) und der zur Datenerfassung angeschlossene Computer. Die Röntgenquelle, der x,y,z-Tisch und die Sammeloptik (Winkel, Lichtleiter, Photomultiplier-Röhren (PMTs)) befinden sich im röntgensicheren Gehäuse, während der Röntgencontroller, die Stromquelle für PMTs, der Funktionsgenerator, der mit der Datenerfassungsplatine (DAQ) und dem Computer verbunden ist, draußen untergebracht sind. Als Verriegelung dient ein Druckknopf, Schließerschalter, der zwischen dem Gehäuse und der Vorderseite der Tür platziert ist. Wenn die Tür nicht vollständig geschlossen ist (der Verriegelungsschalter ist geöffnet), schaltet sich die Röntgenquelle nicht ein und schaltet die Röntgenquelle automatisch aus, wenn sie während des Betriebs geöffnet wird. Die Motoren können einen kontinuierlichen Scan durchführen und an einen beliebigen diskreten Ort bewegt werden. Die Scangeschwindigkeit für die y-Achse beträgt in der Regel 1-5 mm/s, während die Schrittweite auf der x-Achse typischerweise von 150-2000 μm gewählt werden kann. Die Parameter können je nach benötigter räumlicher Auflösung gewählt werden. Gleichmäßige Belichtungszeiten werden durch eine konstante Geschwindigkeit während eines kontinuierlichen Scans bestätigt.
Sobald der fokussierte Röntgenstrahl auf die Röntgenlumineszenzpartikel bestrahlt wird, durchdringt das erzeugte Licht den pH-empfindlichen Film, indem es das Licht in Abhängigkeit vom umgebenden pH-Wert moduliert. Das transmittierte Licht interagiert (streut und absorbiert teilweise) mit einem Gewebe, während die Lichtabschwächung durch Streuung und Absorption mit zunehmender Gewebedicke zunimmt. Die Optik der Kollektion umfasst einen einteiligen, gegabelten Acryl-Lichtleiter, der zu Beginn mit einem reflektierenden Aluminiumbogen (mit 90°-Biegung und polierter reflektierender Innenfläche) ausgestattet ist. Dadurch soll sichergestellt werden, dass das Licht kollimiert wird, sobald das Licht den Lichtleiter erreicht. Diese Ergänzungen verbesserten die Effizienz der Lichtsammlung erheblich. Für weitere Details zeigt Abbildung 4 die Maschinenzeichnungen des Bogens und des Lichtleiters. Der 90°-Bogen wurde aus Aluminium gefräst, die Innenfläche auf Hochglanz poliert und der Lichtleiter mit Acryl bearbeitet. Wir haben auch einen Breitband-Langpass-Blaulichtfilter (der 350-450 nm Licht blockiert) am Anfang des Ellbogens angebracht, um sicherzustellen, dass nur rotes Licht durchgelassen wird. Das Ende des einteiligen Acryl-Lichtleiters teilt sich in zwei Ströme, die zu zwei verschiedenen PMTs führen. Die PMTs sind in einer kleinen lichtdichten Metallbox eingeschlossen, die mit einem thermoelektrischen Kühler in Kontakt steht, um die PMTs auf ~5 °C abzukühlen. Am Anfang eines der PMTs ist ein Schmalbereichs-Langpassfilter (der 570-640 nm Licht blockiert und 640-740 nm Licht durchlässt) angebracht, um nur das 700 nm Licht zu messen. Daher können die Lichtverhältnisse von 620 nm und 700 nm separat berechnet werden. Die PMTs sind im Photonenzählmodus aufgebaut und erzeugen für jedes detektierte Photon Transistor-Transistor-Logik-Impulse (TTL). Ein Datenerfassungssystem zählt die Impulse (Sättigungspunkt 20 Millionen Impulse pro Sekunde) über USB-Kommunikation. Nach der Verarbeitung der Daten werden zwei separate Intensitätskarten erstellt, und unter Berücksichtigung des Verhältnisses der Signalwellenlängenintensität (620 nm) zur Referenzwellenlängenintensität (700 nm) wird ein endgültiges Bild erstellt. Dieses Verhältnis erklärt Unterschiede in der Gesamtlichtsammeleffizienz, die stark von der Position der Sammeloptik, der Röntgenbestrahlungsintensität und der Gewebedicke abhängen. Darüber hinaus ist eine räumlich getrennte Referenzregion ohne pH-Indikatorfarbstoff für die spektrale Verzerrung durch wellenlängenabhängige Gewebepenetration verantwortlich. Eine grafikbasierte Programmiersprache wird zur Steuerung des Bildgebungssystems verwendet, und ein grundlegendes Flussdiagramm des Vorgangs ist unten dargestellt. Der Bildgebungsaufbau ist mit Ausnahme des Computers, des Röntgencontrollers und der Datenerfassungseinheit in einem sicheren Röntgengehäuse untergebracht, um die Strahlenbelastung zu minimieren.
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Protocol
Dieses Verfahren folgt den Tierverwendungsprotokollen, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Clemson University genehmigt wurden. Die Experimente werden gemäß dem Clemson University Biosafety Committee (IBC) und dem Radiation Safety Committee (RSC) sowie unter Einhaltung der einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.
HINWEIS: Ein Flussdiagramm zum Abschließen eines XELCI-Scans ist unten in Abbildung 5 dargestellt, gefolgt von einer detaillierten Schritt-für-Schritt-Beschreibung des Bildgebungsverfahrens.
1. Initialisieren Sie das System und erstellen Sie ein einfaches Röntgenbild
- Schalten Sie den PMT-Kühler ein, es dauert normalerweise ~15 Minuten, bis der Sollwert (z. B. 4 °C) erreicht ist. Führen Sie die restlichen Initialisierungsschritte aus, bevor Sie die PMTs einschalten.
- Öffnen Sie die Steuerungssoftware des Bildgebungssystems. Das Steuerungssoftwareprogramm kommuniziert und initialisiert den motorisierten Tisch der x-y-z-Achse. Bewegen Sie die x-Achse und die y-Achse des Tisches in die gewünschte Ausgangsposition.
- Platzieren Sie die Probe auf dem beweglichen x-y-z-Tisch. Positionieren Sie die Probenhöhe (z-Achse) so, dass sich das Radiolumineszenzgerät 5-5,5 cm unter der Polykapillarfokusoptik befindet, indem Sie die Röntgenquelle und/oder den Tisch anheben oder absenken. Positionieren Sie die Probe außerdem in der x-y-Ebene mit Hilfe der Lasertraverse (zwei rote linienförmige Laserpointer, die an der Röntgenfokussierkapillare befestigt und im 90°-Winkel zueinander positioniert sind, so dass sich die Linien dort schneiden, wo das Röntgenlicht fokussiert wird). Schalten Sie die Laser aus, bevor Röntgenstrahlen und PMTs eingeschaltet werden.
- Befestigen Sie die Drucktastenverriegelung an der Vordertür des Bildgebungsgehäuses. Schalten Sie die Strahlquelle ein. Entfernen Sie die Fokussieroptik, um ein einfaches Röntgenbild der Probe zu erhalten.
- Öffnen Sie die Röntgensteuerungssoftware und stellen Sie die Röntgenleistung ein (durch Einstellen von Spannung und Strom). Öffnen Sie den Röntgenverschluss mit der Röntgensteuerungssoftware.
- Öffnen Sie die Software für die Röntgenkamera. Drücken Sie die Belichtungstaste, um das einfache Röntgenbild aufzunehmen. Schalten Sie die Belichtung aus und schalten Sie die Röntgenstrahlung aus.
Anmerkungen: Bewegen Sie die Probe bei Bedarf, um die Probenposition zu verbessern, oder nehmen Sie eine Reihe von Röntgenbildern an verschiedenen Positionen auf, damit sie zusammengestellt werden können, um eine größere Röntgenansicht zu erhalten. Man kann auch eine Röntgenaufnahme auf einem separaten System machen, aber die Koregistrierung zwischen XELCI und Röntgenaufnahmen wird schwieriger, wenn sich die Probe bewegt. - Öffnen Sie die Gehäuseklappe.
2. Führen Sie optional einen Hintergrundscan bei ausgeschaltetem Röntgenbild durch
- Schließen Sie die Polykapillaroptik wieder an die Röntgenquelle an.
- Schließen Sie das Gehäuse und sichern Sie die Verriegelung. Schalten Sie das PMT-Netzteil ein.
Anmerkungen: Das PMT-Netzteil sollte immer ausgeschaltet werden, wenn die Tür geöffnet ist oder kurz vor dem Öffnen steht, um eine übermäßige Lichteinwirkung zu vermeiden. - Öffnen Sie die Steuerungssoftware des Bildgebungssystems und geben Sie die Schrittweite, die Scangeschwindigkeit und den Scanbereich an. Sobald alle Parameter eingestellt sind, starten Sie den Scan, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen klicken.
HINWEIS: Bei einem Scan mit hoher Auflösung beträgt die Schrittweite 1000 μm und bei einem Scan mit niedriger Auflösung 250 μm. Die Scangeschwindigkeit kann von 5 mm/s bis 1 mm/s gewählt werden. Die Fläche des Scans hängt von den Abmessungen der Probe ab. - Führen Sie einen Hintergrundscan bei ausgeschaltetem Röntgenbild durch, um die Dunkelzählung von allen im Gehäuse vorhandenen Lichtern außer der Probe zu bestimmen.
3. Führen Sie einen Probenscan mit eingeschaltetem Röntgenbild durch
- Stellen Sie sicher, dass sich die Probe mit der Lasertraverse noch in der richtigen Position befindet, um den Scan zu starten.
- Schließen Sie das Gehäuse und sichern Sie die Verriegelung. Wenn die PMTs ausgeschaltet sind (z. B. vor dem Öffnen der Tür ausgeschaltet), schalten Sie die PMT-Stromversorgung ein.
- Öffnen Sie die Steuerungssoftware des Bildgebungssystems. Geben Sie die Werte für Schrittweite, Scangeschwindigkeit und Scanbereich ein. Sobald alle Parameter eingestellt sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , um den Scan zu starten.
HINWEIS: Bei einem Scan mit hoher Auflösung beträgt die Schrittweite 1000 μm und bei einem Scan mit niedriger Auflösung 250 μm. Die Scangeschwindigkeit kann von 5 mm/s bis 1 mm/s gewählt werden. Die Fläche des Scans hängt von den Abmessungen der Probe ab. - Erstellen Sie den Scan für die Probe mit eingeschaltetem Röntgenbild.
- Führen Sie zunächst den Scan mit niedriger Auflösung mit größeren Schrittweiten und höherer Scangeschwindigkeit durch, um ein vorläufiges Bild des Ziels zu erhalten. Nachdem Sie einen Scan mit niedriger Auflösung des gewünschten Bereichs der Probe erhalten haben, erhalten Sie den Scan mit höherer Auflösung und kleinerer Schrittweite und geringerer Scangeschwindigkeit.
- Schalten Sie die PMT-Stromversorgung aus, bevor Sie die Tür öffnen.
4. Erzeugen des Bildes
- Überprüfen Sie, ob der aktuelle Scan den Interessenbereich des Ziels abbildet. Wenn nicht, stoppen Sie den aktuellen Scan, indem Sie auf die Schaltfläche Stopp klicken.
- Passen Sie die Scanpositionen in der Steuerungssoftware erneut an und klicken Sie erneut auf die Schaltfläche Ausführen .
HINWEIS: Die y-Achse wird ab der ersten Zeile des Scans kontinuierlich aufgezeichnet. Während der Durchführung eines Scans wird die Anzahl der Zählungen pro Wellenlänge und Zeit seit der letzten aktualisierten Motorposition aufgezeichnet. Die aufgezeichnete Zeit berücksichtigt alle Änderungen der Motordrehzahl und damit die Belichtungszeit. Für jedes Pixel wird die Anzahl pro Sekunde normalisiert. Der Motor der y-Achse tastet das Ende der aktuellen Reihe der y-Achse ab, und der Motor kehrt in die Ausgangsposition zurück. Dann erhöht der Motor der x-Achse seine Position um eine vom Benutzer definierte Schrittweite und tastet die zweite Reihe der y-Achse ab. Dieser Vorgang wird so lange getaktet, bis der Motor der x-Achse die vorgegebene Breite für die x-Richtung erreicht. Der Benutzer kann die Scangröße, die Motordrehzahl und die Startpositionen des Motors steuern. Die Schrittweite bestimmt die Größe der Pixel im endgültigen Bild der y-Achse.
5. Kultivierung von Bakterien für die Bildgebung unter sterilen Bedingungen (wenn bakteriell gewachsene Sensoren abgebildet werden)
- Um eine frische Kultur von Staphylococcus aureus 1945 (ATCC 25923) herzustellen, verwenden Sie eine Kolonie von einer TSA-Platte (Tryptic Soja-Agar), die innerhalb von 1 Woche gestreift wurde, um 5 ml sterile Tryptische Sojabrühe (TSB) zu beimpfen.
- Schütteln Sie die Bakterienkultur bei 37 °C für 16-18 h bis zur stationären Phase leicht.
- Als nächstes pelletieren Sie die Kultur aus dem TSB durch Zentrifugation bei 4000 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT) und waschen Sie das Pellet zweimal mit Phosphatpufferlösung (PBS) und resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml sterilem PBS.
- Quantifizieren Sie die Bakterienkonzentration anhand der optischen Dichte bei 600 nm unter Verwendung des linearen Bereichs, d. h. des OD-Bereichs, in dem das Beer-Lambert-Gesetz verifiziert wird (OD = kN; k ist ein Koeffizient relativ zur molekularen Extinktion und der Länge des Strahlengangs, N ist die Bakterienkonzentration)16. Anschließend wird die Probe mit sterilem PBS auf10 5 Zellen/ml verdünnt.
- Sterilisieren Sie den Tryptic Soja-Agar (TSA) durch Autoklavieren und kühlen Sie ihn dann durch Mischen ab, bis die Temperatur 45 °C erreicht. Impfen Sie die Bakterien in die TSA.
- Pipettieren Sie die verdünnte Bakterienkultur (100 μl) auf die Oberfläche des implantierbaren Sensors.
HINWEIS: Die Implantate wurden durch Eintauchen in 70%iges Ethanol für 5 Minuten sterilisiert und in sterilem PBS gelagert. - Pipettieren Sie 100 μl ungeimpftes TSA über ein anderes steriles Implantat als Kontrolle
- Fügen Sie dem implantierbaren Sensor zusätzlich 100 μl ungeimpftes TSA hinzu, bevor er vor der Implantation 48 h lang bei 37 °C inkubiert wird.
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Representative Results
Als Vorstudie haben wir den intramedullären Stäbchensensor in einer aufgebohrten Tibia eines Kaninchenkadaversabgebildet 14. Der Sensor verfügt über drei verschiedene Bereiche: den Referenzbereich, den pH-8-Bereich (basischer pH-Wert) und den pH-4-Bereich (saurer pH-Wert). Der Referenzbereich ist das Szintillatorpartikel (Gd 2 O2S:Eu), das in eine aufgeraute Epoxidfolie eingearbeitet ist. Die charakteristischen sauren und basischen pH-Bereiche repräsentieren infizierte und nicht infizierte Situationen innerhalb des intramedullären Kanals (Abbildung 6A,B)14.
Nach Abschluss des Scans wurden die Bilder bei 620 nm, 700 nm bzw. ratio (Abbildung 7A-C) in MATLAB erzeugt. Die Farbveränderungen deuten auf die Veränderungen des pH-Wertes hin. Da das Bromthymolblau im basischen pH-Bereich das emittierte Licht signifikant absorbiert als im sauren pH-Bereich, erscheint der niedrigere pH-Bereich bei 620 nm als helleres Signal. Die Szintillatoremission bei 700 nm dient als spektrale Referenz für Inkonsistenzen im Szintillatorfilm, Änderungen der Gewebezusammensetzung und alle Veränderungen, die in der Position der Detektionsoptik von Scan zu Scan auftreten.
Abbildung 1: Spezifische Merkmale der XELCI-Bildgebung im Vergleich zu den derzeit verfügbaren Techniken (A) Hauptmerkmale; (B) Vergleich mit den derzeit verfügbaren bildgebenden Verfahren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Funktionsprinzip der Technik und Sensorverhalten mit und ohne Infektion. (A) Schematische Darstellung des Implantats, das mit fokussiertem Röntgenstrahl bestrahlt wurde, und Lumineszenz, die zur Detektion gesammelt wurde; (B) vergrößerte Ansicht des Szintillators und des pH-empfindlichen, filmbeschichteten Markstabsensors; (C) bei niedrigem pH-Wert, der durch eine Infektion verursacht wird, wechselt der intramedulläre Stäbchensensor von blau zu gelb, während die farbstofffreie Referenzregion unverändert bleibt; (D) vergrößerte Ansicht des Markstabs während einer Infektion; (E) Spektren, die eine Epoxid-PEG-pH-Sensorfolie (10 % PEG-Hydrogel mit Bromocresolgrünem pH-Farbstoff, beschichtet auf einer Epoxidfolie, die Gd 2 O2S:Eu-Szintillatorpartikel enthält) bei pH 7 und pH 4 und einer Epoxid-Szintillatorschicht ohne pH-Indikator PEG-Hydrogel zeigen. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Uzair et al.14 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Bildgebendes System. (A) Schematische Darstellung (die roten Pfeile zeigen die Richtung des Lichts in Richtung PMTs); (B) ein Foto des tatsächlichen Systems. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Zeichnungen von Computer-Aided-Design-Software mit den Abmessungen . (A) Zeichnung des 90°-Bogens (B) Zeichnung des einteiligen Acryl-Lichtleiters. (Alle Maße sind in mm) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Flussdiagramm des bildgebenden Verfahrens Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Intramedullärer Stäbchensensor in einer aufgeriebenen Tibia eines Kaninchenkadavers. (A) Edelstahlstab, beschichtet mit Gd 2 O2S:Eu eingearbeitetem Epoxid- und pH-empfindlichem Acrylamid-PEG-Gel; (B) beschichteter Edelstahlstab, der in das gebohrte Loch im Kaninchenschienbein eingeführt wird. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Uzair et al.14 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Bilder des Stäbchensensors im Markkanal . (A) Analysiertes Bild für 620 nm Wellenlänge; (B) analysiertes Bild für 700 nm Wellenlänge; (C) analysiertes Verhältnisbild (620/700); (D) einfache Röntgenaufnahme des Stabsensors; (E) überlagertes Verhältnisbild und reine Röntgenaufnahme. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Uzair et al.14 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Oberflächenspezifische Bildgebung | Gleichgewicht/Nichtgleichgewicht | Hohe Auflösung durch Gewebe | Ionisierende Strahlung | Röntgenstrahlen lassen sich leicht überlagern | Repräsentative Referenzen | |
| pH-Mikroelektrode | Ja, Punkt für Punkt | Nichtgleichgewicht, Verschmutzung (Nernst-Gleichung) und Zeit können zu Drift führen | Ja, Punkt für Punkt | Nein | Nein | 23-25 |
| Fluoreszierende pH-Indikatoren | Ja | Gleichgewicht | Nein | Nein | Nein | 18,26 |
| MRT (MESZ) | Ja | Gleichgewicht | 3D, aber langsam | Nein | Nein | 27 |
| XELCI | Ja | Gleichgewicht | Ja | Ja | Ja | 14,15,22 |
Tabelle 1: Merkmale von XELCI im Vergleich zu anderen pH-Bildgebungsverfahren.
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Discussion
Um orthopädische Implantat-assoziierte Infektionen frühzeitig erkennen und untersuchen zu können, um Komplikationen durch Osteomyelitis und sekundäre chirurgische Eingriffe zu vermeiden, haben wir XELCI als neuartiges, funktionelles Bildgebungsverfahren eingeführt. Sie ist vergleichbar mit den derzeit verfügbaren Techniken zur pH-Überwachung durch Gewebe.
Bei der Positionierung der Probe für die Bildgebung verwenden wir eine Lasertraverse, die mit einer Polykapillar-Fokussieroptik verbunden ist, mit zwei sich kreuzenden linienförmigen Laserpointern im 90°-Winkel, um den Ellbogen genau darunter auszurichten. Diese Laser sollten vor Beginn eines Scans ausgeschaltet werden, um unerwünschtes Licht zu eliminieren, das den Detektor erreicht, mit Ausnahme des von den Szintillatoren erzeugten Lichts. In Bezug auf den Abstand misst der Benutzer den Abstand von der Spitze der Fokussieroptik zur Oberkante der Probe auf etwa 5-5,5 cm, bevor er das Experiment startet. Dies kann entweder durch manuelles Anheben der Röntgenquelle oder durch Auf- und Abbewegen des Tisches erreicht werden. Das gleiche Verfahren wird für ein lebendes Tier oder eine Messung durch das Gewebe verwendet, außer dass wir das Tier unter Narkose setzen und einen Isofluran-Gasschlauch laufen lassen, um sicherzustellen, dass es schläft. Wir überwachen regelmäßig die Temperatur und den Puls und fügen zusätzliche Einstreu und Klebeband hinzu, um die Anatomie des Tieres, insbesondere den Winkel, richtig zu positionieren, und wir schätzen, dass die Fokusposition von 5-5,5 cm die Tiefe des Implantats ist, anstatt nur den Abstand zur Oberseite der Haut zu verwenden. Oft wird ein einfaches Röntgenbild oder ein grober Scan aufgenommen, um die richtige Position sicherzustellen, und später mit dem chemischen XELCI-Bild überlagert, das an derselben Stelle aufgenommen wurde. Bei Sensoren, die nicht mit Gewebe bedeckt sind, wird der Strom der Röntgenquelle im Allgemeinen von maximal 600 μA bei 50 kV auf bis zu 15 μA reduziert, um sicherzustellen, dass die PMTs nicht gesättigt werden. Die Röntgenquelle und ihr Zustand werden regelmäßig von der Clemson University Radiation Safety überwacht. Der Schlüssel für den Röntgencontroller wird nur von XELCI-Benutzern verwendet und immer ferngehalten, um ein versehentliches Ein- und Ausschalten zu verhindern. Auch die Druckknopfverriegelung an der Vordertür des Gehäuses sollte vor dem Einschalten des Röntgengeräts sorgfältig gesichert werden. Wenn die Verriegelung nicht richtig funktioniert, kann der Benutzer das Röntgengerät nicht einschalten und es werden Fehler erzeugt. Während des gesamten Experiments, während das Röntgenbild eingeschaltet ist, wird ein orangefarbenes Licht eingeschaltet, um alle zu warnen, dass das Röntgenbild läuft.
In der Regel werden sowohl ein Scan mit niedriger Auflösung als auch ein Scan mit hoher Auflösung ausgeführt. Der Scan mit niedriger Auflösung hat eine größere Schrittweite und der Scan mit hoher Auflösung eine kleinere Schrittweite. Die Zeit, die für einen Scan benötigt wird, hängt im Wesentlichen von drei Faktoren ab: der Schrittweite, der Geschwindigkeit des Scans und dem Bereich des Scans. Beispielsweise dauert es ~20 Minuten, um einen Bereich von 15 mm x 15 mm für ein hochauflösendes Bild bei einer langsamen Scangeschwindigkeit von 1 mm/s und einer Schrittweite von 200 μm zu scannen. Das Scannen desselben Bereichs mit einer niedrigeren Auflösung und einer schnelleren Scangeschwindigkeit verkürzt die Zeit (z. B. dauert eine Schrittweite von 1 mm und eine Geschwindigkeit von 5 mm/s etwa 1 Minute). Vor dem Scannen wird zusätzliche Zeit benötigt, um das Tier oder die Probe richtig einzurichten und zu positionieren und zu verstehen, wo sich das Implantat befindet. Bei Tierversuchen wird die Körpertemperatur überwacht, um sicherzustellen, dass die Temperatur während der Narkose nicht zu stark abfällt. Die Erwärmung durch Röntgenstrahlung ist vernachlässigbar, da die Röntgendosis für den in dieser Studie verwendeten Scan gering ist. Unter der Annahme einer lokalen Röntgendosis von 1 Gy = 1 J/kg und einer Wärmekapazität von 3,45 kJ/kg K für Muskel17 wäre der maximale Temperaturanstieg durch Strahlungsabsorption kleiner als ein mK
Gleichung 1
Q- Wärmeenergie
m- Masse
C- Spezifische Wärmekapazität
ΔT- Temperaturänderung
Nach der obigen Berechnung ist der Temperaturanstieg vernachlässigbar. Darüber hinaus würde sich selbst dieser geringe Temperaturanstieg schnell über die Blutzirkulation auflösen.
Die PMTs haben einen aktiven Photokathodendurchmesser von 22 mm; Diese große Fläche erleichtert das Einfangen von Licht aus einem großen diffusen Bereich unter der Haut. Um den Dunkelstrom aus thermisch induzierter Elektronenemission zu reduzieren, werden die PMTs mit einem Kühler darunter abkühlen gelassen. Wir haben einen einteiligen Acryl-Lichtleiter, der sich in zwei Ströme aufteilt, was zu zwei verschiedenen Photomultiplier-Röhren (PMTs) zur Signaldetektion führt. Diese Verbesserung für das System ermöglichte es uns, die Effizienz der Lichtsammlung zu verbessern und so Signale durch Knochen und Gewebe zu detektieren. Bisher wurde diese bildgebende Technik zur Überwachung von Infektionen auf der Oberfläche der orthopädischen Implantate verwendet und wir konnten erfolgreich pH-Veränderungen abbilden14,15. Wir erzeugten Bilder mit hohem Signal/Rauschen eines modifizierten Markstäbchens durch etwa 2 cm Knochen und Gewebe in der Rabbit Tibia. Im Allgemeinen nimmt die Lichtabschwächung durch Streuung und Absorption exponentiell mit der Gewebedicke zu. Es gibt also einen Kompromiss zwischen der abgebildeten Gewebedicke, der Röntgendosis/Scanzeit und der räumlichen Auflösung.
Diese hier beschriebenen bildgebenden Verfahren beinhalten sowohl eine implantierte Sonde als auch einen Scanner. Die Sonde enthält Röntgenszintillatoren, die bei Bestrahlung mit Röntgenstrahlen sichtbares und NIR-Licht erzeugen. Es hat eine chemisch empfindliche Schicht, die über der Szintillatorschicht hergestellt wird und die Lichtintensität oder das Lichtspektrum beeinflusst. Die für diese Anwendung gewählte chemisch empfindliche Schicht ist Bromthymolblau, das eine pH-abhängige Absorption bei einer Wellenlänge von 600 nm und eine nahezu konstante (pH-unabhängige) Absorption bei 700 nm Licht aufweist, die sich mit der Szintillatoremission (620 nm und 700 nm) überlappt. Bromothymolblau oder Bromocresolgrün hateinen pK-a-Wert im pH-Bereich, an dem wir interessiert sind, um implantatassoziierte Infektionen zu überwachen. Während der Analyse der pH-Mikroumgebung des bakteriellen Biofilms mit einem pH-empfindlichen fluoreszierenden ratiometrischen Farbstoff kann der pH-Wert zwischen 5,6 (innerhalb des Biofilms) und pH 7 (in der umgebenden Flüssigkeit) variieren18. Die implantierte Sonde hat auch eine Szintillatorschicht ohne den pH-anzeigenden Farbstoff, der als räumlich unterschiedliche Referenzregion fungiert. Darüber hinaus haben die von uns verwendeten Szintillatorpartikel bei ~600 nm und ~700 nm Wellenlängen ausgeprägte Emissionen. Das Absorptionsspektrum der oben genannten Farbstoffe überschneidet sich mit dem Emissionsspektrum der Gd 2 O2S:Eu Partikel. Sowohl die anregenden Röntgenstrahlen als auch die roten/NIR-Lumineszenzphotonen werden in der biomedizinischen In-vivo-Bildgebung verwendet, da sie sich im Gewebe ausbreiten können 19,20,21.
Abbildung 1 zeigt drei spezifische Merkmale des in dieser Studie verwendeten Bildgebungssystems: Röntgenauflösung, chemische Spezifität und Spezifität der Implantatoberfläche. Diese Eigenschaften sind vergleichbar mit den derzeit verfügbaren bildgebenden Verfahren wie SPECT, PET, MRT, US usw.22. Obwohl diese Techniken hochauflösende strukturelle/anatomische Informationen in hoher Auflösung liefern, konnten wir chemische Veränderungen an einer Implantatoberfläche nicht abbilden. Diese Technik kombiniert die chemische Empfindlichkeit von optischen Indikatorfarbstoffen mit der Implantatspezifität der Beschichtung. Die räumliche Auflösung des Röntgenstrahls ermöglicht eine einzigartige, niedrige Hintergrund- und höhere räumliche Auflösung bei der Detektion/Kartierung chemischer Konzentrationen an Implantatoberflächen durch Knochen und Gewebe hindurch.
Die röntgenangeregte chemische Bildgebung mit Lumineszenz bietet eine einzigartige Möglichkeit, die lokale chemische Umgebung an einer Implantatoberfläche mit einer hohen räumlichen Auflösung für die Untersuchung von Infektionen zu untersuchen. In Zukunft kann der Ansatz verallgemeinert werden, um andere Analyten zu überwachen, indem verschiedene Indikatorfarbstoffe ausgewählt werden. Es kann potenziell bei anderen Krankheiten und Zuständen mit injizierten oder implantierten medizinischen Geräten angewendet werden, die mit Szintillatorpartikeln und Indikatorfarbstoffen beschichtet sind.
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Disclosures
Die Autoren machen keine Interessenkonflikte geltend.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei der Clemson University, COMSET und Clemson SC BioCRAFT. Das XELCI-Setup wurde zunächst mit Mitteln von NSF CAREER CHE 12255535 und später von NIH NIAMS R01 AR070305-01 entwickelt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 degree elbow | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| Bromo Cresol Green | Sigma-Aldrich | 45ZW10 | |
| Bromo Thymol Blue | Sigma | 76-59-5 | |
| ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate | Pollock industries, White River, VT, USA | TCP 50 | |
| Ethanol | Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051 |
64-17-5 | |
| Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm | Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England | UKL63/N-R1 | |
| LabVIEW | National Instruments, Austin, TX | ||
| Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis) | Motion Control, Smithtown, NY, USA | AT10-60 | |
| National instruments c-DAQ 9171 | National Instruments, Austin, TX | NI cDAQ™-9171 | |
| One piece acrylic light guide | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| pH 4 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5024 | |
| pH 8 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5060 | |
| Phosphate Buffer Solution | MP Biomedicals, Irvine, CA. USA | 2810305 | |
| Photo multiplier tubes Model P25PC-16 | SensTech, Surrey, UK | Model P25PC-16 | |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ATCC 25923 | |
| Tryptic Soy Agar | Teknova, Hollister, CA, USA | T0520 | |
| Tryptic Soy Broth | EMD Millipore, Burlington, MA, USA | 1005255000 | |
| X-ray source-iMOXS | Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany | ||
| X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel | Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA | LTS300 and LTS150 |
References
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