Summary
ここでは、X線励起発光化学イメージング(XELCI)を用いて、移植された医療機器周辺の化学情報を高解像度で光学的に検出するためのプロトコルを紹介します。この新しいイメージング技術は、インプラント関連感染症の生化学の研究を可能にする私たちの研究室で開発されています。
Abstract
埋め込み型医療機器に関連する微生物感染は、骨折固定不全の主要な懸念事項です。このような感染症の早期診断により、2回目の手術に追加費用をかけずに抗生物質による根絶を成功させることができます。ここでは、XELCIを、高いX線分解能、インプラント特異性、および埋め込み型医療機器の表面近くの化学物質濃度を非侵襲的に画像化する化学物質に対する化学物質感受性を備えた技術として説明します。デバイスは、化学的に報告する表面でコーティングされています。この化学的に応答する表面は、埋め込み型医療機器にコーティングされた2つの層で構成されています。pH感受性層(ブロモチモールブルーまたはブロモクレゾールグリーン組み込みヒドロゲル)を、モニタリング用の赤色発光シンチレータ(Gd2O2S:Eu)層上にコーティングする。集束X線ビームがインプラント上のスポットに照射され、シンチレータによって生成された赤色光(620nmおよび700nmのピークを持つ)は、pHに応じてスペクトル比を変化させる検出層を透過します。画像は、インプラントを横切ってX線ビームをスキャンし、組織を通過する光のスペクトル比をポイントごとに測定することによって生成されます。このイメージング技術を使用して、修正された埋め込み型プレートセンサーを使用して、以前は大腿骨の骨表面でのインプラント関連感染を監視していました。現在、脛骨髄内桿体感染によるpH変化について研究しています。パイロット前のウサギの研究では、2種類の髄内ロッド設計が使用されており、XELCI技術を使用して、骨表面だけでなく骨内部でも発生する化学変化を監視できることを学びました。したがって、これにより、インプラント関連感染症の生化学を研究するための非侵襲的、高空間分解能、低バックグラウンドの局所pHイメージングが可能になります。
Introduction
米国では、年間約200万個の骨折固定装置が挿入されており、そのうちの5%〜10%がインプラント関連感染症につながっています1。これらの感染症は、バイオフィルムの不均一性と抗生物質耐性の性質のために、後の段階で抗生物質で治療するのが困難です2,3。早期に診断された場合、感染症は抗生物質と外科的創面切除剤で治療され、治療された骨折部位のハードウェアを交換するための2回目の手術のための余分な医療費を防ぐことができます。プレーンX線撮影およびその他の高度なX線撮影技術は、整形外科インプラント関連感染症、非結合、および関連する合併症の診断に適用されます。これらの技術は、整形外科インプラントで周囲の骨や組織の構造情報を取得するために頻繁に使用されますが、特定の環境では生化学的情報を提供することはできません。そこで我々は、インプラント部位の生化学情報を非侵襲的に高解像度でイメージングする新しいX線励起発光化学イメージング(XELCI)技術を開発しました。整形外科インプラント関連感染症の診断は、一般に、異なる手段の1つまたは組み合わせによって行われる。臨床観察(痛み、腫れ、発赤、創傷分泌物など)は、感染の最初の兆候を示唆しています。その後、骨治癒進行の失敗を確認し、病原性生物を特定するために、放射線学的および実験室実験が行われる4,5。感染したインプラントと関連する感染をよりよく視覚化するために、コンピューター断層撮影(CT)、磁気共鳴画像法(MRI)、および単一光子放出コンピューター断層撮影(SPECT)や陽電子放出断層撮影(PET)などの放射性ヌクレオチド法などの核医学技術が使用されています6,7。CTおよびMRIは、それぞれ骨壊死および軟部組織異常の判定に有利であるが、金属インプラント8に近い距離で干渉を引き起こす。SPECTやPETなどのさまざまなX線方法論と放射性同位元素標識分析物をin vivoイメージング造影剤として組み合わせることで、インプラント関連骨髄炎の診断に広く使用されています2。現在のアプリケーションは、CTスキャンからのデータとSPECTまたはPETのいずれかからのラベリングデータの両方を組み合わせて、解剖学的情報を生成します9。これらの画像診断の1つ以上は感染診断を支援するために使用されますが、余分な医療費や外科的費用を避けるために抗生物質による治療を開始するために感染に関連するpH変動を早期に検出することはできません。
この研究で使用したイメージングシステムをインプラント関連感染症のモニタリングに利用する主な利点は、スペクトル参照を使用してバイオフィルム微小環境に関する生化学的情報を明らかにすることができることです。主な焦点は感染部位のpHのイメージングとマッピングですが、この方法は、インプラント関連感染症に特異的な他のバイオマーカーを監視するように変更できます。したがって、XELCIは感染症の病態生理学を理解することを可能にする。高空間分解能イメージングにより、感染の拡大に伴う不均一性をマッピングできます。バイオフィルム形成が起こる表面のpHは、生化学的変化を理解する上で非常に重要です。また、細菌10,11による抗生物質関連のストレス応答により、他の微小環境の変化が発生する可能性があります。表面特異的で空間分解能の高いイメージングにより、バイオフィルム微小環境に対する抗生物質の影響をモニターすることができます。この技術は、標的薬物送達実験のためのバイオフィルム環境を研究するためにも使用できます。標的とした低pHの薬物放出やpHの上昇を研究して、高pHでの作業を受けやすくすることができます。
このイメージング技術の3つの特定の特性は、X線分解能、インプラント表面特異性、および化学物質感受性です(図1A)。これらの特性は、整形外科インプラント関連感染症を画像化するために現在利用可能な画像化技術と比較することができる(図1B)。X線を照射すると、インプラント表面にコーティングされた蛍光体粒子は、数センチメートルの組織を透過できる赤色および近赤外(NIR)光を生成します(多少の減衰はありますが)12,13。表1は、バイオフィルム中または組織を通してpHを測定するために使用されてきた他の方法と比較した、開発されたイメージングシステムの特徴のいくつかを示しています。
XELCIは、図2に示すように、X線励起と組み合わせて、埋め込み型医療機器の近くで光学的に空間分解能の高い化学情報を取得するための新しいイメージング技術です。ここではX線励起性蛍光体粒子の選択的励起や光学的検出が利用される。インプラントは、シンチレータ粒子の層の上にポリマー層を組み込んだpH感受性色素の2つの層でコーティングされている。集束された一連のX線ビームがインプラントに照射されると、シンチレータ層は可視光(620nmおよび700nm)を生成する。この生成された光は、周囲の環境のpHに応じて発光スペクトルを調節するpH感受性層を通過します。低pHは一般に感染とバイオフィルム形成に関連しています。感染が進行するにつれて、pHは生理的pH(pH 7.2)から酸性(pH 7未満)に変化し、センサー内のpH染料は色を変え、したがって吸光度を変化させます。ルミネッセンススペクトルの変化を、pH 7およびpH 4におけるブロモクレゾールグリーンpH色素について図2Eに示す。組織と骨を透過した光が収集され、スペクトル比がpHを決定します。pH画像を生成するために、集束されたX線ビームはシンチレータフィルム内の一度に一点ずつ照射し、サンプルを横切ってビームを点ごとにスキャンします。以前、この技術は、整形外科インプラント14、15の表面のpH変動を画像化するために適用され、骨および組織を通る髄内管内のpH変動を監視するためにそれを試験してきた。
下の図3は、イメージングシステムの概略図を示しています。イメージングシステムの基本コンポーネントは、ポリキャピラリー光学系を備えたX線励起源、2つの光電子増倍管に接続するワンピースのアクリルライトガイド、x、y、z電動ステージ(30 cm x 15 cm x 6 cmトラベル)、およびデータ収集用に接続されたコンピューターです。X線源、x、y、zステージ、および収集光学系(エルボ、ライトガイド、光電子増倍管(PMT))はX線防止エンクロージャ内にあり、X線コントローラ、PMT用電源、データ収集(DAQ)ボードに接続された関数発生器、およびコンピュータは外部に保管されています。エンクロージャとドアの前面の間に配置されたプッシュボタン、ノーマルオープンスイッチは、インターロックとして機能します。ドアが完全に閉じていない(インターロックスイッチが開いている)場合、X線源はオンにならず、動作中に開くと自動的にX線源がオフになります。モーターは連続スキャンを実行でき、任意の離散的な場所に移動できます。y軸のスキャン速度は通常1〜5 mm / sですが、x軸のステップサイズは通常150〜2000μmから選択できます。パラメータは、必要な空間分解能に応じて選択できます。露光時間でさえ、連続スキャンを通して一貫した速度によって確認されます。
集束されたX線ビームがX線発光粒子に照射されると、生成された光は周囲のpHに応じて光を変調することによってpH感受性膜を通過します。透過光は組織と相互作用(部分的に散乱および吸収)しますが、散乱および吸収による光減衰は、組織の厚さが増すにつれて増加します。コレクション光学系には、最初に反射アルミニウムエルボ(90°曲げと研磨された反射内面)が取り付けられたワンピースの二股アクリルライトガイドが含まれています。これは、光がライトガイドに到達するとすぐに光がコリメートされるようにするためです。これらの追加により、集光効率が大幅に向上しました。詳細については、図4にエルボとライトガイドの機械 図 を示します。90°エルボはアルミニウムから機械加工され、内面は鏡面仕上げに研磨され、ライトガイドはアクリルで機械加工されました。また、肘の始めに広範囲のロングパス青色光フィルター(350〜450nmの光を遮断)を取り付けて、赤色光のみが通過するようにしました。ワンピースのアクリルライトガイドの端は、2つの異なるPMTにつながる2つのストリームに分岐します。PMTは、PMTを~5°Cに冷却するために熱電冷却器と接触する小さな遮光金属ボックスに封入されています。 PMTの1つの開始時に、700nmの光のみを測定するために、狭い範囲のロングパスフィルター(570〜640nmの光を遮断し、640〜740nmの光を通過させる)が取り付けられています。したがって、620nmと700nmの光は別々に計算することができる。PMTはフォトンカウンティングモードで設定され、検出されたフォトンごとにトランジスタ-トランジスタロジック(TTL)パルスを生成します。DAQシステムは、USB通信を使用してパルス(飽和点2,000万パルス/秒)をカウントします。データを処理した後、2つの別々の強度マップが生成され、信号波長強度(620 nm)と参照波長強度(700 nm)の比を考慮して最終的な画像が作成されます。この比率は、集光光学系の位置、X線照射強度、組織の厚さに強く依存する総集光効率の違いを説明しています。さらに、pH指示色素のない空間的に分離された参照領域は、波長依存的な組織浸透によるスペクトル歪みを説明します。イメージングシステムの制御にはグラフィックベースのプログラミング言語が使用されており、動作の基本的なフローチャートを以下に示します。コンピュータ、X線コントローラ、およびDAQユニットを除くイメージングセットアップは、放射線被曝を最小限に抑えるために安全なX線エンクロージャに囲まれています。
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Protocol
この手順は、クレムゾン大学施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認された動物使用プロトコルに従います。実験は、クレムソン大学バイオセーフティ委員会(IBC)および放射線安全委員会(RSC)に従って実施され、関連するガイドラインおよび規制に従って実施されます。
注:XELCIスキャンを完了するフロー図を 以下の図5 に示し、その後にイメージング手順の詳細なステップバイステップの説明を示します。
1.システムを初期化し、プレーンX線写真を取得します
- PMTクーラーをオンにすると、通常、設定値に達するまでに~15分かかります(例:4°C)。残りの初期化手順は、PMT をオンにする前に実行してください。
- イメージングシステム制御ソフトウェアを開きます。制御ソフトウェアプログラムは、x-y-z軸電動ステージを通信および初期化します。ステージの X 軸と Y 軸を目的の開始位置に移動します。
- サンプルを可動x-y-zステージに置きます。X線源および/またはステージを上下させることにより、放射発光装置がポリキャピラリーフォーカス光学系より5〜5.5cm下になるように、サンプルの高さ(z軸)を配置します。また、レーザークロスヘッド(X線集束キャピラリーに取り付けられた2つの赤い線状のレーザーポインター)を使用して標本をx-y平面に配置し、X線が焦点を合わせる場所で線が交差するように互いに90°に配置します。X線とPMTをオンにする前に、レーザーをオフにしてください。
- 押しボタン式インターロックをイメージングエンクロージャの前面ドアに固定します。光線ソースの電源をオンにします。サンプルのプレーンX線写真を取得するための集束光学系を取り外します。
- X線制御ソフトウェアを開き、X線パワーを設定します(電圧と電流を調整)。X線制御ソフトウェアでX線シャッターを開きます。
- X線カメラ用のソフトウェアを開きます。露出ボタンを押して、プレーンX線写真を撮ります。露出をオフにし、X線をオフにします。
注意: 必要に応じて、サンプルを移動してサンプルの位置を改善するか、さまざまな位置で一連のX線を取得して、照合してより大きなX線写真を取得できます view.別のシステムでX線写真を取得することもできますが、標本が移動すると、XELCIとX線撮影の間の共同登録がより困難になります。 - エンクロージャーのドアを開きます。
2.オプションで、X線をオフにしてバックグラウンドスキャンを実行します
- ポリキャピラリー光学系をX線源に再度接続します。
- エンクロージャーを閉じ、インターロックを固定します。PMT 電源をオンにします。
注意: 光に過度にさらされないように、ドアが開いているとき、または開こうとしているときはいつでも、PMT電源を常にオフにする必要があります。 - イメージングシステム制御ソフトウェアを開き、ステップサイズ、スキャン速度、およびスキャン領域を指定します。すべてのパラメータを設定したら、[ 実行 ]ボタンを押してスキャンを開始します。
注:高解像度スキャンの場合、ステップサイズは1000μmになり、低解像度スキャンの場合、ステップサイズは250μmになります。スキャン速度は5mm/sから1mm/sまで選択できます。スキャンの面積は、サンプルの寸法によって異なります。 - X線をオフにしてバックグラウンドスキャンを実行し、サンプル以外のエンクロージャーに存在するライトからのダークカウントを決定します。
3.X線をオンにしてサンプルスキャンを実行します
- スキャンを開始するには、サンプルがレーザークロスヘッドで正しい位置にあることを確認してください。
- エンクロージャーを閉じ、インターロックを固定します。PMTがオフの場合(たとえば、ドアを開ける前にオフになっている場合)、PMT電源をオンにします。
- イメージングシステム制御ソフトウェアを開きます。ステップサイズ、スキャン速度、スキャン領域の値を入力します。すべてのパラメータを設定したら、[ 実行 ]ボタンを押してスキャンを開始します。
注:高解像度スキャンの場合、ステップサイズは1000μmになり、低解像度スキャンの場合、ステップサイズは250μmになります。スキャン速度は5mm/sから1mm/sまで選択できます。スキャンの面積は、サンプルの寸法によって異なります。 - X線をオンにした状態でサンプルのスキャンを取得します。
- まず、より大きなステップサイズとより高いスキャン速度で低解像度スキャンを実行して、ターゲットの予備画像を取得します。サンプルの目的の領域の低解像度スキャンを取得した後、より小さなステップサイズとより低いスキャン速度で高解像度スキャンを取得します。
- ドアを開ける前に、PMT電源をオフにしてください。
4.イメージの形成
- 現在のスキャンがターゲットの関心領域をイメージングしていることを検証します。そうでない場合は、[ 停止 ]ボタンを押して現在のスキャンを停止します。
- 制御ソフトウェアのスキャン位置を再度調整し、[ 実行 ]ボタンをもう一度押します。
注意: Y軸は、スキャンの最初の行から連続的に記録されます。スキャンの実行中に、各波長ごとのカウント数と、最後に更新されたモーター位置からの時間が記録されます。記録された時間は、モーター速度の変化、つまり露出時間を考慮します。ピクセルごとに、カウント/秒が正規化されます。Y軸モーターはY軸の現在の行の終わりをスキャンするために移動し、モーターは開始位置に戻ります。次に、x軸モーターは、ユーザーが定義したステップサイズだけその位置を拡大し、y軸の2行目をスキャンします。このプロセスは、x軸モーターがx方向に指定された幅に達するまで繰り返されます。ユーザーは、スキャンサイズ、モーター速度、およびモーターの開始位置を制御できます。ステップサイズは、y軸の最終画像のピクセルのサイズを決定します。
5.無菌状態でイメージングするための細菌の培養(細菌増殖センサーをイメージングする場合)
- 黄色ブドウ球菌1945(ATCC 25923)の新鮮な培養物を調製するには、1週間以内に縞模様のTSA(トリプシン大豆寒天培地)プレートからの1つのコロニーを使用して、5 mLの滅菌トリプシン大豆ブロス(TSB)を接種します。
- 細菌培養物を37°Cで16〜18時間、固定相になるまで穏やかに振とうします。
- 次に、TSBからの培養物を室温(RT)で4000 x g で10分間遠心分離してペレット化し、リン酸緩衝液(PBS)でペレットを2回洗浄し、ペレットを5 mLの滅菌PBSに再懸濁します。
- ランベルトベールの法則が検証されるOD範囲である線形範囲(OD = kN、 k は分子消滅と光路の長さに対する係数、 N は細菌濃度)を用いて、600nmでの光学濃度を用いて細菌濃度を定量化する16。次に、滅菌PBSを使用してサンプルを105 細胞/ mLに希釈します。
- トリプシン大豆寒天培地(TSA)をオートクレーブ滅菌し、温度が45°Cに達するまで混合して冷却します。 細菌をTSAに接種します。
- 希釈した細菌培養物(100 μL)を埋め込み型センサーの表面にピペットで貼り付けます。
注:インプラントは、70%エタノールに5分間浸漬して滅菌し、滅菌PBSに保存しました。 - コントロールとして、別の滅菌インプラントの上に100 μLの未接種TSAをピペットで
- 移植前に37°Cで48時間インキュベートする前に、植込み型センサーの上に100 μLの未接種TSAを追加します。
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Representative Results
予備検討として、ウサギ死体14のリーマ脛骨に髄内ロッドセンサを画像化した。センサーには、基準領域、pH 8領域(塩基性pH)、pH 4領域(酸性pH)の3つの異なる領域があります。基準領域は、粗化処理されたエポキシフィルムに組み込まれたシンチレータ(Gd2O2S:Eu)粒子である。特徴的な酸性および塩基性pH領域は、髄内管内の感染状況と非感染状況を表しています(図6A、B)14。
スキャンが完了した後、それぞれ620nm、700nm、および比(図7A-C)の画像がMATLABで生成されました。色の変化はpHの変化を示しています。塩基性pH領域のブロモチモールブルーは酸性pH領域よりも放出光を有意に吸収するため、低pH領域は620nmでより明るいシグナルとして現れます。700nmでのシンチレータ発光は、シンチレータ膜の不整合、組織組成の変化、およびスキャンごとに検出光学系の位置で発生する変化のスペクトル基準として機能します。
図1:現在利用可能な技術と比較したXELCIイメージングの特定の特徴 (A)主な特徴;(b)現在利用可能なイメージング技術との比較。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:感染の有無にかかわらず、技術とセンサーの動作原理。 (a)集束X線ビームを照射し、検出のために収集された発光を示す模式図。(b)シンチレータおよびpH感受性フィルム被覆髄内ロッドセンサのズームインビュー;(C)感染によって引き起こされる低pHでは、髄内ロッドセンサーは青色から黄色に変わりますが、色素を含まない基準領域は変化しません。(D)感染中の髄内ロッドの拡大ビュー。(e)pH7及びpH4におけるエポキシPEG製pHセンサー膜(Gd2O2S:Euシンチレータ粒子を含有するエポキシフィルムの上にコーティングされたブロモクレゾールグリーンpH染料を含有する10%PEGヒドロゲル)及びpH指示薬を含まないエポキシシンチレータ層PEGヒドロゲルのスペクトル。この図は、Uzairらの許可を得て複製されています14。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:イメージングシステム。 (A)模式図(赤い矢印は光線光線から光線回折打に向かう方向を示す)。(B)実際のシステムの写真。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:寸法を示すコンピューター支援設計ソフトウェア図面 。 (A)90°エルボの描画 (B)ワンピースアクリルライトガイドの描画。(寸法はすべてmm単位です) この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:イメージング手順のフローチャート この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ウサギの死体のリーマ脛骨の髄内ロッドセンサー。 (A)Gd 2 O2S:Euを組み込んだエポキシおよびpH感受性アクリルアミド-PEGゲルでコーティングされたステンレス鋼棒;(b)被覆されたステンレス−ウサギ脛骨に穿孔された穴に挿入された鋼棒。この図は、Uzairらの許可を得て複製されています14。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:髄内管内のロッドセンサーの画像 。 (a)波長620nmの解析画像。(b)波長700nmの解析画像;(C)分析された比率画像(620/700);(d)ロッドセンサのプレーンX線写真;(e)画像と平野X線撮影の比重畳。この図は、Uzairらの許可を得て複製されています14。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 表面特異的イメージング | 平衡/非平衡 | 組織による高分解能 | 電離放射線 | X線が重ね合わせやすい | 代表的な参考文献 | |
| pH微小電極 | はい、一度に1ポイントずつ | 非平衡、(ネルンスト方程式)ファウリングと時間はドリフトを引き起こす可能性があります | はい、一度に1ポイントずつ | いいえ | いいえ | 23-25 |
| 蛍光pH指示薬 | はい | 均衡 | いいえ | いいえ | いいえ | 18,26 |
| MRI (CEST) | はい | 均衡 | 3Dだが遅い | いいえ | いいえ | 27 |
| ゼルチ | はい | 均衡 | はい | はい | はい | 14,15,22 |
表1:XELCIと他のpHイメージング技術の特徴。
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Discussion
骨髄炎や二次手術による合併症を回避するために、整形外科インプラント関連感染症を早期に検出および研究できるようにするために、新しい機能的イメージング技術としてXELCIを導入しました。これは、組織を介したpHモニタリングのために現在利用可能な技術に匹敵します。
イメージングのためにサンプルを配置する際には、ポリキャピラリーフォーカシング光学系に接続されたレーザークロスヘッドを使用し、2つの交差する線状のレーザーポインターを90°の角度で使用して、肘をその下に正確に位置合わせします。これらのレーザーは、シンチレータによって生成された光以外の検出器に到達する不要な光を排除するために、スキャンを開始する前にオフにする必要があります。距離に関しては、ユーザーは実験を開始する前に、集束光学系の先端からサンプルの上部までの距離を約5〜5.5cmと測定します。これは、X線源を手動で上げるか、ステージを上下に動かすことによって達成できます。生きた動物や組織による測定にも同じ手順が使用されますが、動物を麻酔下に置き、イソフルランガスチューブを流して眠っていることを確認します。その温度と脈拍を定期的に監視し、寝具とテープを追加して動物の解剖学的構造、特に角度を適切に配置し、皮膚の上面までの距離を使用するのではなく、インプラントの深さとして5〜5.5 cmの焦点位置を推定します。多くの場合、正しい位置を確保するためにプレーンX線画像または粗いスキャンが行われ、後で同じ場所で撮影された化学XELCI画像と重ね合わせられます。組織で覆われていないセンサーの場合、PMTが飽和しないように、X線源電流は通常、50kVで最大600μAから15μAまで減少します。X線源とその状態は、クレムソン大学の放射線安全によって定期的に監視されています。X線コントローラーのキーはXELCIユーザーのみが使用し、偶発的な電源のオン/オフを防ぐために常に遠ざけられています。また、X線をオンにする前に、エンクロージャの前面ドアにある押しボタンインターロックを慎重に固定する必要があります。インターロックが正しく機能していない場合、ユーザーはX線の電源を入れることができず、エラーが発生します。X線がオンの実験中は、オレンジ色のライトが点灯し、X線が稼働していることを全員に警告します。
通常、低解像度スキャンと高解像度スキャンの両方が実行されます。低解像度スキャンはステップサイズが大きく、高解像度スキャンはステップサイズが小さくなります。スキャンにかかる時間は、ステップサイズ、スキャンの速度、スキャンの領域という3つの要因に大きく依存します。例えば、15 mm x 15 mmの領域をスキャンすると、1 mm/sの低速スキャン速度と200 μmのステップサイズで高解像度画像をスキャンするには、~20分かかります。同じ領域を低解像度で高速のスキャン速度でスキャンすると、時間が短縮されます(たとえば、1 mmのステップサイズと5 mm/sの速度には約1分かかります)。動物または標本を適切にセットアップして配置し、インプラントがどこにあるかを過小評価するために、スキャンする前に追加の時間が必要です。動物実験では、麻酔中に体温が下がりすぎないように体温を監視します。この研究で使用されたスキャンのX線量が少ないため、X線放射による加熱はごくわずかです。1 Gy=1 J/kgの局所X線量、17筋の熱容量を3.45 kJ/kg Kと仮定すると、放射線吸収による最大温度上昇はmK未満となる。
式 1
Q-熱エネルギー
m-質量
C-比熱容量
ΔT-温度変化
上記の計算によると、温度の上昇はごくわずかです。さらに、このわずかな温度上昇でさえ、血液循環によって急速に消散します。
PMTのアクティブ光陰極直径は22mmです。この広い領域は、皮膚の下の大きな拡散領域からの光の取り込みを容易にします。熱誘起電子放出による暗電流を減らすために、PMTは下に冷却器を付けて冷却することができます。信号検出用の2つの異なる光電子増倍管(PMT)につながる2つのストリームに分岐するワンピースのアクリルライトガイドがあります。このシステムの改善により、集光効率を高め、骨や組織を介した信号を検出することができました。以前は、このイメージング技術は整形外科インプラントの表面の感染を監視するために使用され、pH変化を正常にイメージングすることができました14,15。ウサギの脛骨の約2 cmの骨と組織を通して、修正された髄内ロッドの高信号/ノイズ画像を生成しました。一般に、散乱および吸収による光減衰は、組織の厚さとともに指数関数的に増加する。したがって、画像化された組織の厚さ、X線量/スキャン時間、および空間分解能の間にはトレードオフがあります。
ここで説明するこのイメージング技術には、埋め込まれたプローブとスキャナーの両方が含まれます。プローブには、X線を照射すると可視光と近赤外光を発生するX線シンチレータが含まれています。これは、光強度またはスペクトルに影響を与えるシンチレータ層の上に製造された化学的に敏感な層を有する。この用途に選択された化学的に敏感な層はブロモチモールブルーで、600 nmの波長でpH依存の吸光度を持ち、シンチレータの発光(620 nmおよび700 nm)と重なる700 nmの光でほぼ一定の(pHに依存しない)吸光度を持っています。ブロモチモールブルーまたはブロモクレゾールグリーンは、インプラント関連感染症のモニタリングに関心のあるpH範囲のpKa値を持っています。pH感受性蛍光レシオメトリック色素を用いた細菌バイオフィルムのpH微小環境分析では、pHは5.6(バイオフィルム内)からpH7(周囲のバルク流体中)の間で変化する可能性があります18。移植プローブはまた、空間的に異なる基準領域として作用するpH指示色素を伴わないシンチレータ層を有する。さらに、我々が使用しているシンチレータ粒子は、~600nmおよび~700nmの波長で顕著な発光を有する。上記の色素の吸光度スペクトルは、Gd2O2S:Eu粒子の発光スペクトルと重なる。励起X線と赤色/NIR発光光子はどちらも、組織を伝播できるため、in vivo生物医学イメージングに利用されます19,20,21。
図1 は、この研究で使用されたイメージングシステムの3つの特定の特性を示しています:X線分解能、化学的特異性、およびインプラント表面特異性。これらの特性は、SPECT、PET、MRI、USなどの現在利用可能なイメージング技術に匹敵します22。これらの技術は、高解像度の構造/解剖学的情報を高解像度で提供しますが、インプラント表面の化学変化をマッピング/画像化することはできませんでした。この技術は、光学指示色素からの化学的感受性とコーティングからのインプラント特異性を組み合わせたものです。X線からの空間分解能は、骨や組織を通るインプラント表面での化学物質濃度のユニークで低バックグラウンドで高い空間分解能の検出/マッピングを提供します。
X線励起発光化学イメージングは、感染症を研究するための高い空間分解能でインプラント表面の局所化学環境を研究するユニークな方法を提供します。将来的には、このアプローチを一般化して、異なる指示色素を選択することで他の分析対象物をモニタリングすることができます。シンチレータ粒子と指示薬色素でコーティングされた注射または埋め込み型医療機器を使用して、他の疾患や症状にも適用できる可能性があります。
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Disclosures
著者は利益相反を主張していません。
Acknowledgments
著者らは、クレムソン大学、COMSET、クレムソンSC BioCRAFTに感謝したい。XELCIのセットアップは、当初はNSFキャリアCHE 12255535からの資金で開発され、後にNIH NIAMS R01 AR070305-01によって開発されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 degree elbow | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| Bromo Cresol Green | Sigma-Aldrich | 45ZW10 | |
| Bromo Thymol Blue | Sigma | 76-59-5 | |
| ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate | Pollock industries, White River, VT, USA | TCP 50 | |
| Ethanol | Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051 |
64-17-5 | |
| Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm | Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England | UKL63/N-R1 | |
| LabVIEW | National Instruments, Austin, TX | ||
| Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis) | Motion Control, Smithtown, NY, USA | AT10-60 | |
| National instruments c-DAQ 9171 | National Instruments, Austin, TX | NI cDAQ™-9171 | |
| One piece acrylic light guide | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| pH 4 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5024 | |
| pH 8 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5060 | |
| Phosphate Buffer Solution | MP Biomedicals, Irvine, CA. USA | 2810305 | |
| Photo multiplier tubes Model P25PC-16 | SensTech, Surrey, UK | Model P25PC-16 | |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ATCC 25923 | |
| Tryptic Soy Agar | Teknova, Hollister, CA, USA | T0520 | |
| Tryptic Soy Broth | EMD Millipore, Burlington, MA, USA | 1005255000 | |
| X-ray source-iMOXS | Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany | ||
| X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel | Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA | LTS300 and LTS150 |
References
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