Summary
Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento ottico ad alta risoluzione di informazioni chimiche intorno a dispositivi medici impiantati con imaging chimico a luminescenza eccitata a raggi X (XELCI). Questa nuova tecnica di imaging è stata sviluppata nel nostro laboratorio che consente di studiare la biochimica delle infezioni associate agli impianti.
Abstract
Le infezioni microbiche associate ai dispositivi medici impiantabili sono una delle principali preoccupazioni nel fallimento della fissazione delle fratture. La diagnosi precoce di tale infezione consentirà di eradicare con successo con antibiotici senza costi aggiuntivi per un secondo intervento chirurgico. Qui, descriviamo XELCI come una tecnica con elevata risoluzione dei raggi X, specificità dell'impianto e sensibilità chimica alle concentrazioni chimiche di immagini non invasive vicino alla superficie dei dispositivi medici impiantati. I dispositivi sono rivestiti con superfici di segnalazione chimica. Questa superficie chimicamente sensibile è costituita da due strati rivestiti su un dispositivo medico impiantabile; uno strato sensibile al pH (idrogel incorporato blu di bromotimolo o verde bromocresolo) che viene rivestito su uno scintillatore che emette luce rossa (Gd 2 O2S: Eu) per il monitoraggio. Un fascio di raggi X focalizzato irradia un punto sull'impianto e la luce rossa generata dallo scintillatore (con picchi di 620 nm e 700 nm) viene trasmessa attraverso lo strato di rilevamento che altera il rapporto spettrale a seconda del pH. Un'immagine viene generata scansionando il fascio di raggi X attraverso l'impianto e misurando il rapporto spettrale della luce che passa attraverso il tessuto punto per punto. Abbiamo utilizzato questa tecnica di imaging per monitorare le infezioni associate all'impianto precedentemente sulla superficie ossea del femore con un sensore a piastra impiantabile modificato. Ora stiamo studiando i cambiamenti di pH che si verificano dalle infezioni midollari tibiali dei bastoncelli intramidollari. Due diversi tipi di disegni di bastoncelli intramidollari sono utilizzati negli studi pre-pilota sui conigli e abbiamo appreso che la tecnica XELCI potrebbe essere utilizzata per monitorare eventuali cambiamenti chimici che si verificano non solo sulla superficie ossea ma anche all'interno dell'osso. Pertanto, ciò consente l'imaging locale non invasivo, ad alta risoluzione spaziale e a basso pH di fondo per studiare la biochimica delle infezioni associate all'impianto.
Introduction
Negli Stati Uniti, circa 2 milioni di dispositivi di fissazione delle fratture vengono inseriti ogni anno e il 5% -10% di essi porta a infezioni associate all'impianto1. Queste infezioni sono più difficili da trattare con antibiotici nelle fasi successive a causa dell'eterogeneità e della natura resistente agli antibiotici dei biofilm 2,3. Se vengono diagnosticate precocemente, le infezioni possono essere trattate con antibiotici e sbrigliamento chirurgico per evitare costi medici aggiuntivi per un secondo intervento chirurgico per sostituire l'hardware nel sito di frattura trattato. La radiografia semplice e altre tecniche radiografiche avanzate sono applicate nella diagnosi di infezioni ortopediche associate a impianti, non unioni e complicanze correlate. Sebbene queste tecniche siano utilizzate frequentemente per acquisire informazioni strutturali dell'osso e del tessuto circostante presso l'impianto ortopedico, non sono in grado di fornire informazioni biochimiche nell'ambiente specifico. Pertanto, abbiamo sviluppato una nuova tecnica di imaging chimico a luminescenza eccitata a raggi X (XELCI) per l'imaging ad alta risoluzione di informazioni biochimiche in modo non invasivo nel sito dell'impianto. La diagnosi di infezioni ortopediche associate agli impianti viene comunemente effettuata con uno o una combinazione di mezzi diversi. Le osservazioni cliniche (dolore, gonfiore, arrossamento, secrezione della ferita, ecc.) suggeriscono i primi segni di infezione. Successivamente, vengono effettuati esperimenti radiologici e di laboratorio per confermare il fallimento della progressione della guarigione ossea e identificare l'organismo patogeno 4,5. Tecniche di medicina nucleare come la tomografia computerizzata (TC), la risonanza magnetica (MRI) e metodi radionucleotidici come la tomografia computerizzata a emissione di fotoni singoli (SPECT) e la tomografia ad emissione di positroni (PET) sono in uso per una migliore visualizzazione dell'impianto infetto e dell'infezione associata 6,7. La TC e la risonanza magnetica sono vantaggiose nel determinare rispettivamente la necrosi ossea e le anomalie dei tessuti molli, ma causano interferenze a distanza ravvicinata dagli impianti metallici8. Diverse metodologie a raggi X come SPECT e PET in combinazione con analiti marcati con radioisotopi come agenti di contrasto di imaging in vivo sono ampiamente utilizzate per diagnosticare l'osteomielite 2 associata all'impianto. Le applicazioni attuali combinano sia i dati della scansione TC che i dati di etichettatura della SPECT o della PET per generare informazioni anatomiche9. Sebbene una o più di queste modalità di imaging siano utilizzate per aiutare la diagnosi dell'infezione, non possono rilevare precocemente le variazioni di pH associate all'infezione per iniziare i trattamenti con antibiotici per evitare spese mediche e chirurgiche extra.
Il vantaggio principale dell'utilizzo del sistema di imaging utilizzato in questo studio per il monitoraggio delle infezioni associate all'impianto è la sua capacità di rivelare informazioni biochimiche sul microambiente del biofilm con un riferimento spettrale. Sebbene l'obiettivo principale sia l'imaging e la mappatura del pH nel sito infetto, questo metodo può essere modificato per monitorare altri biomarcatori specifici per le infezioni associate all'impianto. Pertanto, XELCI consente di comprendere la fisiopatologia dell'infezione. L'imaging ad alta risoluzione spaziale consente di mappare l'eterogeneità man mano che l'infezione cresce. Il pH sulla superficie in cui si verifica la formazione del biofilm è molto importante per comprendere i cambiamenti biochimici. Inoltre, altri cambiamenti del microambiente possono verificarsi a causa di risposte allo stress correlate agli antibiotici da parte dei batteri10,11. Grazie all'imaging specifico della superficie e ad alta risoluzione spaziale, è possibile monitorare l'effetto antibiotico sul microambiente del biofilm. La tecnica può anche essere utilizzata per studiare l'ambiente del biofilm per esperimenti mirati di somministrazione di farmaci. Possiamo studiare il rilascio mirato di farmaci a basso pH o l'aumento del pH per renderli più suscettibili a lavorare a pH più alti.
Tre caratteristiche specifiche di questa tecnica di imaging sono la risoluzione dei raggi X, la specificità della superficie dell'impianto e la sensibilità chimica (Figura 1A). Queste caratteristiche possono essere confrontate con le tecniche di imaging attualmente disponibili per l'imaging delle infezioni correlate agli impianti ortopedici (Figura 1B). Una volta irradiate con i raggi X, le particelle di fosforo rivestite sulla superficie dell'impianto generano luce rossa e vicina all'IR (NIR) che può penetrare attraverso alcuni centimetri di tessuto (anche se con una certa attenuazione)12,13. La Tabella 1 mostra alcune delle caratteristiche del sistema di imaging sviluppato rispetto ad altri modi che sono stati utilizzati per misurare il pH nei biofilm o attraverso i tessuti.
XELCI è una nuova tecnica di imaging per acquisire informazioni chimiche ad alta risoluzione spaziale otticamente vicino a dispositivi medici impiantati in combinazione con l'eccitazione a raggi X, come mostrato nella Figura 2. Qui viene utilizzata l'eccitazione selettiva e la rilevazione ottica di particelle di fosforo eccitabili a raggi X. L'impianto è rivestito con due strati, uno strato polimerico incorporato in colorante sensibile al pH su uno strato di particelle scintillatrici. Una volta che una sequenza di fasci di raggi X focalizzati irradia l'impianto, lo strato scintillatore genera luce visibile (620 nm e 700 nm). Questa luce prodotta passa attraverso lo strato sensibile al pH modulando lo spettro di luminescenza a seconda del pH dell'ambiente circostante. Il basso pH è generalmente associato all'infezione e alla formazione di biofilm; man mano che l'infezione progredisce, il pH cambia da pH fisiologico (pH 7,2) ad acido (inferiore a pH 7) e il colorante pH nel sensore cambia colore e quindi assorbanza. La variazione dello spettro di luminescenza è mostrata nella Figura 2E per il colorante a pH verde Bromocresolo a pH 7 e pH 4. La luce trasmessa attraverso il tessuto e l'osso viene raccolta e il rapporto spettrale determina il pH. Per generare un'immagine del pH, il fascio di raggi X focalizzato irradia un punto alla volta nel film scintillatore e scansiona il fascio punto per punto attraverso il campione. In precedenza, questa tecnica è stata applicata per visualizzare la variazione del pH sulla superficie degli impianti ortopedici14,15 e l'ho testata per monitorare le variazioni di pH nel canale intramidollare attraverso ossa e tessuti.
La figura 3 seguente mostra uno schema del sistema di imaging. I componenti di base del sistema di imaging sono la sorgente di eccitazione a raggi X con ottica poli capillare, una guida di luce acrilica monopezzo che si collega a due tubi fotomoltiplicatori, lo stadio motorizzato x, y e z (corsa 30 cm x 15 cm x 6 cm) e il computer collegato per l'acquisizione dei dati. La sorgente di raggi X, lo stadio x, y, z e le ottiche di raccolta (gomito, guida luminosa, tubi fotomoltiplicatori (PMT)) sono nell'involucro a prova di raggi X, mentre il controller a raggi X, la fonte di alimentazione per PMT, il generatore di funzioni collegato alla scheda di acquisizione dati (DAQ) e il computer sono tenuti all'esterno. Un pulsante, normalmente aperto, posto tra l'involucro e la parte anteriore della porta funge da interblocco. Se la porta non è completamente chiusa (l'interruttore di interblocco è aperto), la sorgente di raggi X non si accende e spegne automaticamente la sorgente di raggi X se viene aperta durante il funzionamento. I motori possono eseguire una scansione continua e possono essere spostati in qualsiasi posizione discreta. La velocità di scansione per l'asse y è solitamente 1-5 mm/s, mentre la dimensione del passo sull'asse x può essere scelta tipicamente tra 150-2000 μm. I parametri possono essere scelti in base alla risoluzione spaziale richiesta. Anche i tempi di esposizione sono confermati da una velocità costante durante una scansione continua.
Una volta che il fascio di raggi X focalizzato viene irradiato sulle particelle di luminescenza dei raggi X, la luce generata passerà attraverso la pellicola sensibile al pH modulando la luce a seconda del pH circostante. La luce trasmessa interagirà (si diffonderà e assorbirà parzialmente) con un tessuto, mentre l'attenuazione della luce per diffusione e assorbimento aumenterà all'aumentare dello spessore del tessuto. L'ottica della collezione include una guida luminosa in acrilico biforcato monopezzo dotata di un gomito in alluminio riflettente (con curvatura a 90° e superficie interna riflettente lucida) all'inizio. Questo per garantire che la luce venga collimata non appena la luce raggiunge la guida luminosa. Queste aggiunte hanno migliorato significativamente l'efficienza di raccolta della luce. Per ulteriori dettagli, la Figura 4 mostra i disegni della macchina del gomito e della guida luminosa. Il gomito a 90° è stato lavorato in alluminio con la superficie interna lucidata a specchio e la guida luminosa è stata lavorata con acrilico. Abbiamo anche collegato un filtro luce blu passa-lungo ad ampio raggio (che blocca la luce a 350-450 nm) all'inizio del gomito per garantire che solo la luce rossa passi attraverso. L'estremità della guida di luce acrilica monopezzo si biforca in due flussi che portano a due diversi PMT. I PMT sono racchiusi in una piccola scatola metallica a tenuta di luce che è in contatto con un dispositivo di raffreddamento termoelettrico per raffreddare i PMT a ~ 5 ° C. All'inizio di uno dei PMT, un filtro passa-lungo a raggio stretto (bloccando la luce a 570-640 nm e passando la luce a 640-740 nm) è collegato per misurare solo la luce a 700 nm. Pertanto, la luce da 620 nm e 700 nm può essere calcolata separatamente. I PMT sono impostati in modalità di conteggio dei fotoni e generano impulsi logici transistor-transistor (TTL) per ogni fotone rilevato. Un sistema DAQ conta gli impulsi (punto di saturazione 20 milioni di impulsi al secondo) utilizzando la comunicazione USB. Dopo l'elaborazione dei dati vengono generate due mappe di intensità separate e viene creata un'immagine finale considerando il rapporto tra l'intensità della lunghezza d'onda del segnale (620 nm) e l'intensità della lunghezza d'onda di riferimento (700 nm). Questo rapporto tiene conto delle differenze nell'efficienza totale di raccolta della luce, che dipendono fortemente dalla posizione dell'ottica di raccolta, dall'intensità dell'irradiazione a raggi X e dallo spessore del tessuto. Inoltre, una regione di riferimento spazialmente separata senza alcun colorante indicatore di pH tiene conto della distorsione spettrale dovuta alla penetrazione tissutale dipendente dalla lunghezza d'onda. Per il controllo del sistema di imaging viene utilizzato un linguaggio di programmazione basato su grafica e di seguito viene illustrato un diagramma di flusso di base dell'operazione. La configurazione delle immagini, ad eccezione del computer, del controller a raggi X e dell'unità DAQ, è racchiusa in un involucro a raggi X sicuro per ridurre al minimo l'esposizione alle radiazioni.
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Protocol
Questa procedura segue i protocolli di utilizzo degli animali approvati dal Clemson University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Gli esperimenti sono condotti secondo il Comitato per la biosicurezza della Clemson University (IBC) e il comitato per la sicurezza delle radiazioni (RSC), nonché seguendo le linee guida e i regolamenti pertinenti.
NOTA: Un diagramma di flusso del completamento di una scansione XELCI è mostrato di seguito nella Figura 5 seguito da una descrizione dettagliata passo-passo della procedura di imaging.
1. Inizializzare il sistema e acquisire una radiografia semplice
- Accendere il dispositivo di raffreddamento PMT, in genere occorrono ~ 15 minuti per raggiungere il setpoint (ad esempio, 4 ° C). Eseguire il resto dei passaggi di inizializzazione prima di attivare i PMT.
- Aprire il software di controllo del sistema di imaging. Il programma software di controllo comunica e inizializza lo stadio motorizzato dell'asse x-y-z. Spostate l'asse x e l'asse y dello stage nella posizione iniziale desiderata.
- Posizionare il campione sul palco mobile x-y-z. Posizionare l'altezza del campione (asse z), in modo che il dispositivo radioluminescente si trovi 5-5,5 cm al di sotto dell'ottica di messa a fuoco policapillare sollevando o abbassando la sorgente di raggi X e/o lo stadio. Inoltre, posizionare il campione nel piano x-y con l'aiuto della traversa laser (due puntatori laser a forma di linea rossa attaccati al capillare di messa a fuoco dei raggi X e posizionati a 90° l'uno dall'altro in modo che le linee si intersechino dove si concentrerà il raggio X). Spegnere i laser prima di accendere i raggi X e i PMT.
- Fissare l'interblocco a pulsante sulla porta anteriore dell'alloggiamento di imaging. Accendere l'alimentazione per la sorgente del raggio. Rimuovere l'ottica di messa a fuoco per ottenere la radiografia semplice del campione.
- Aprire il software di controllo a raggi X e impostare la potenza dei raggi X (regolando tensione e corrente). Aprire l'otturatore a raggi X con il software di controllo a raggi X.
- Aprire il software per la telecamera a raggi X. Premi il pulsante di esposizione per eseguire la radiografia normale. Spegnere l'esposizione e spegnere la radiografia.
NOTA: Se necessario, spostare il campione per migliorare la posizione del campione o acquisire una serie di raggi X in posizioni diverse in modo che possano essere raccolti per ottenere una visione radiografica più ampia. Si può anche acquisire una radiografia su un sistema separato, ma la co-registrazione tra XELCI e radiografia diventa più difficile se il campione si muove. - Apri la porta del recinto.
2. Facoltativamente, eseguire una scansione in background con la radiografia spenta
- Collegare nuovamente l'ottica policapillare alla sorgente di raggi X.
- Chiudere l'involucro e fissare l'interblocco. Accendere l'alimentatore PMT.
NOTA: l'alimentatore PMT deve essere sempre spento ogni volta che la porta è aperta o in procinto di essere aperta per evitare la sovraesposizione alla luce. - Aprire il software di controllo del sistema di imaging e specificare la dimensione del passo, la velocità di scansione e l'area di scansione. Una volta impostati tutti i parametri, avviare la scansione premendo il pulsante Esegui .
NOTA: per una scansione ad alta risoluzione, la dimensione del passo sarà 1000 μm e per una scansione a bassa risoluzione, la dimensione del passo sarà 250 μm. La velocità di scansione può essere scelta da 5 mm/s a 1 mm/s. L'area della scansione dipende dalle dimensioni del campione. - Eseguire una scansione in background con i raggi X spenti per determinare i conteggi scuri da qualsiasi luce presente nell'involucro diversa dal campione.
3. Eseguire una scansione del campione con la radiografia accesa
- Assicurarsi che il campione sia ancora nella posizione corretta con la testa a croce laser per iniziare la scansione.
- Chiudere l'involucro e fissare l'interblocco. Se i PMT sono spenti (ad esempio, spenti prima di aprire lo sportello), accendere l'alimentatore PMT.
- Aprire il software di controllo del sistema di imaging. Immettere i valori per le dimensioni del passaggio, la velocità di scansione e l'area di scansione. Una volta impostati tutti i parametri, premi il pulsante Esegui per avviare la scansione.
NOTA: per una scansione ad alta risoluzione, la dimensione del passo sarà 1000 μm e per una scansione a bassa risoluzione, la dimensione del passo sarà 250 μm. La velocità di scansione può essere scelta da 5 mm/s a 1 mm/s. L'area della scansione dipende dalle dimensioni del campione. - Ottenere la scansione per il campione con la radiografia accesa.
- Innanzitutto, eseguire la scansione a bassa risoluzione con dimensioni di passo maggiori e velocità di scansione più elevate per ottenere un'immagine preliminare della destinazione. Dopo aver ottenuto una scansione a bassa risoluzione dell'area desiderata del campione, ottenere la scansione a risoluzione più elevata con una dimensione del passo inferiore e una velocità di scansione inferiore.
- Spegnere l'alimentazione PMT prima di aprire lo sportello.
4. Formare l'immagine
- Convalidare la scansione corrente è l'imaging dell'area di interesse del target. In caso contrario, interrompere la scansione corrente premendo il pulsante Stop .
- Regolare nuovamente le posizioni di scansione nel software di controllo e premere nuovamente il pulsante Esegui .
NOTA: l'asse y viene registrato continuamente a partire dalla prima riga della scansione. Durante l'esecuzione di una scansione, viene registrato il numero di conteggi per ciascuna lunghezza d'onda e tempo dall'ultima posizione del motore aggiornata. Il tempo registrato terrà conto di eventuali variazioni della velocità del motore, quindi del tempo di esposizione. Per ogni pixel, il conteggio/secondo viene normalizzato. Il motore dell'asse y viaggia per scansionare la fine della riga corrente dell'asse y e il motore torna alla posizione iniziale. Quindi il motore dell'asse x aumenta la sua posizione di una dimensione del passo definita dall'utente e scansiona la seconda riga dell'asse y. Questo processo viene ciclizzato fino a quando il motore dell'asse x raggiunge la larghezza specificata per la direzione x. L'utente può controllare le dimensioni della scansione, la velocità del motore e le posizioni di avviamento del motore. La dimensione del passo determinerà la dimensione dei pixel nell'immagine finale dell'asse y.
5. Coltura di batteri per l'imaging in condizioni sterili (se vengono ripresi sensori di crescita batterica)
- Per preparare una nuova coltura di Staphylococcus aureus 1945 (ATCC 25923), utilizzare una colonia da una piastra TSA (agar di soia triptico) striata entro 1 settimana per inoculare 5 ml di brodo di soia tripttica sterile (TSB).
- Agitare delicatamente la coltura batterica a 37 °C per 16-18 ore fino alla fase stazionaria.
- Successivamente, pellettare la coltura dal TSB tramite centrifugazione a 4000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) e lavare il pellet due volte con Phosphate Buffer Solution (PBS) e risospendere il pellet in 5 ml di PBS sterile.
- Quantificare la concentrazione batterica utilizzando la densità ottica a 600 nm utilizzando l'intervallo lineare, che è l'intervallo OD in cui viene verificata la legge di Beer-Lambert (OD = kN; k è un coefficiente relativo all'estinzione molecolare e alla lunghezza del percorso ottico, N è la concentrazione batterica)16. Quindi diluire il campione a 105 cellule/ml usando PBS sterile.
- Sterilizzare l'Agar di Soia Trittica (TSA) in autoclave e quindi raffreddare mescolando fino a raggiungere la temperatura di 45 °C. Inoculare i batteri nella TSA.
- Pipettare la coltura batterica diluita (100 μL) sulla superficie del sensore impiantabile.
NOTA: Gli impianti sono stati sterilizzati mediante immersione in etanolo al 70% per 5 minuti e conservati in PBS sterile. - Pipetta 100 μL di TSA non inoculata su un altro impianto sterile come controllo
- Aggiungere altri 100 μL di TSA non inoculata sul sensore impiantabile prima che venga incubato a 37 °C per 48 ore prima dell'impianto.
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Representative Results
Come studio preliminare, abbiamo ripreso il sensore dell'asta intramidollare in una tibia alesata di un cadavere di coniglio14. Il sensore ha tre regioni distinte: la regione di riferimento, la regione pH 8 (pH basico) e la regione pH 4 (pH acido). La regione di riferimento è la particella scintillatrice (Gd 2O2S:Eu) incorporata in film epossidico irruvidito. Le regioni distintive del pH acido e basico rappresentano situazioni infette e non infette all'interno del canale intramidollare (Figura 6A,B)14.
Dopo aver completato la scansione, le immagini rispettivamente a 620 nm, 700 nm e rapporto (Figura 7A-C), sono state generate in MATLAB. I cambiamenti di colore sono indicativi dei cambiamenti nel pH. Poiché il blu di bromotimolo nella regione del pH di base assorbe significativamente la luce emessa rispetto alla regione del pH acido, la regione del pH inferiore appare come un segnale più luminoso a 620 nm. L'emissione dello scintillatore a 700 nm funge da riferimento spettrale per le incongruenze nel film scintillatore, i cambiamenti nella composizione del tessuto e qualsiasi cambiamento che si verifica nella posizione dell'ottica di rilevamento dalla scansione alla scansione.
Figura 1: Caratteristiche specifiche dell'imaging XELCI rispetto alle tecniche attualmente disponibili (A) Caratteristiche principali; (B) confronto con le tecniche di imaging attualmente disponibili. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Principio di funzionamento della tecnica e del comportamento del sensore con e senza infezione. (A) Schema che mostra l'impianto irradiato con fascio di raggi X focalizzato e la luminescenza raccolti per il rilevamento; (B) vista ingrandita dello scintillatore e del sensore intramidollare rivestito con pellicola sensibile al pH; (C) a basso pH causato da infezione, il sensore di barre intramidollari passa da blu a giallo, mentre la regione di riferimento priva di coloranti è invariata; (D) visualizzazione ingrandita dell'asta intramidollare durante un'infezione; (E) spettri che mostrano la pellicola del sensore di pH epossi-PEG (idrogel PEG al 10% contenente colorante di pH verde Bromocresolo rivestito sopra pellicola epossidica contenente particellescintillatrici Gd 2 O2S:Eu) a pH 7 e pH 4 e strato di scintillatore epossidico senza idrogel PEG indicatore di pH. Questa figura è stata riprodotta con il permesso di Uzair et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Sistema di imaging. (A) Diagramma schematico (le frecce rosse indicano la direzione della luce verso i PMT); (B) una foto del sistema attuale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Disegni del software di progettazione assistita da calcolatore che mostrano le quote . (A) Disegno del gomito a 90° (B) Disegno della guida luminosa acrilica monopezzo. (Tutte le dimensioni sono in mm) Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Diagramma di flusso della procedura di imaging Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Sensore di barre intramidollari in una tibia alesata di un cadavere di coniglio. (A) Barra di acciaio inossidabile rivestita con gel epossidico e acrilammide-PEG incorporato Gd 2 O2S:Eu incorporato e sensibile al pH; (B) barra di acciaio inossidabile rivestita inserita nel foro praticato nella tibia del coniglio. Questa figura è stata riprodotta con il permesso di Uzair et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Immagini del sensore a barre nel canale intramidollare. (A) Immagine analizzata per lunghezza d'onda di 620 nm; (B) immagine analizzata per lunghezza d'onda 700 nm; (C) immagine Ratio analizzata (620/700); D) radiografia semplice del sensore a barre; (E) immagine proporzionale sovrapposta e radiografia semplice. Questa figura è stata riprodotta con il permesso di Uzair et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Imaging specifico della superficie | Equilibrio/non equilibrio | Alta risoluzione attraverso il tessuto | Radiazione ionizzante | Raggi X facilmente sovrapponibili | Referenze rappresentative | |
| Microelettrodo pH | Sì, un punto alla volta | incrostazioni di non equilibrio, (equazione di Nernst) e tempo possono causare deriva | Sì, un punto alla volta | No | No | 23-25 |
| Indicatori di pH fluorescenti | Sì | Equilibrio | No | No | No | 18,26 |
| Risonanza magnetica (CEST) | Sì | Equilibrio | 3D ma lento | No | No | 27 |
| XELCI | Sì | Equilibrio | Sì | Sì | Sì | 14,15,22 |
Tabella 1: Caratteristiche di XELCI rispetto ad altre tecniche di imaging del pH.
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Discussion
Per essere in grado di rilevare e studiare precocemente le infezioni ortopediche associate agli impianti per evitare complicazioni da osteomielite e procedure chirurgiche secondarie, abbiamo introdotto XELCI come una nuova tecnica di imaging funzionale. È paragonabile alle tecniche attualmente disponibili per il monitoraggio del pH attraverso i tessuti.
Durante il posizionamento del campione per l'imaging, utilizziamo una testa a croce laser collegata a ottiche di messa a fuoco policapillare con due puntatori laser a forma di linea intersecanti con un angolo di 90° per allineare il gomito con precisione sotto di esso. Questi laser devono essere spenti prima di iniziare una scansione per eliminare qualsiasi luce indesiderata che raggiunga il rilevatore diversa dalla luce generata dagli scintillatori. In termini di distanza, l'utente misura la distanza dalla punta dell'ottica di messa a fuoco alla parte superiore del campione per essere di circa 5-5,5 cm prima di iniziare l'esperimento. Ciò può essere ottenuto sollevando manualmente la sorgente di raggi X o spostando il palco su e giù. La stessa procedura viene utilizzata per un animale vivo o per la misurazione attraverso il tessuto, tranne per il fatto che mettiamo l'animale sotto anestesia e facciamo funzionare un tubo di gas isoflurano per assicurarci che si addormenta. Monitoriamo periodicamente la sua temperatura e il polso e aggiungiamo ulteriore lettiera e nastro per posizionare correttamente l'anatomia animale, in particolare l'angolo, e stimiamo che la posizione focale di 5-5,5 cm sia la profondità dell'impianto piuttosto che utilizzare solo la distanza dalla superficie superiore della pelle. Spesso viene eseguita una semplice immagine a raggi X o una scansione grossolana per garantire la posizione corretta e successivamente sovrapporsi all'immagine chimica XELCI presa nello stesso punto. Per i sensori non coperti di tessuto, la corrente della sorgente di raggi X viene generalmente ridotta dal massimo di 600 μA a 50 kV a un minimo di 15 μA per assicurarsi che i PMT non saturino. La sorgente di raggi X e le sue condizioni sono periodicamente monitorate dalla Clemson University Radiation Safety. La chiave per il controller a raggi X viene utilizzata solo dagli utenti XELCI ed è sempre tenuta lontana per evitare accensioni / spegnimenti accidentali. Inoltre, l'interblocco a pulsante sulla porta anteriore della custodia deve essere accuratamente fissato prima di accendere la radiografia. Se l'interblocco non funziona correttamente, l'utente non sarà in grado di accendere la radiografia e genererà errori. Durante l'esperimento, mentre la radiografia è accesa, una luce arancione viene accesa per avvertire tutti che la radiografia è in esecuzione.
In genere vengono eseguite sia una scansione a bassa risoluzione che una scansione ad alta risoluzione. La scansione a bassa risoluzione è con una dimensione del passo più grande e la scansione ad alta risoluzione è con una dimensione del passo più piccola. Il tempo necessario per una scansione dipende in gran parte da tre fattori: la dimensione del passo, la velocità della scansione e l'area della scansione. Ad esempio, ci vogliono ~ 20 minuti per scansionare un'area di 15 mm x 15 mm per un'immagine ad alta risoluzione a una velocità di scansione lenta di 1 mm / s e a una dimensione del passo di 200 μm. La scansione della stessa area a una risoluzione inferiore e una velocità di scansione più elevata riduce il tempo (ad esempio, la dimensione del passo di 1 mm e la velocità di 5 mm / s richiede circa 1 minuto). È necessario più tempo prima della scansione per impostare e posizionare correttamente l'animale o il campione e sottovalutare dove si trova l'impianto. Per gli esperimenti sugli animali, la temperatura corporea viene monitorata per garantire che la temperatura non scenda troppo durante l'anestesia. Il riscaldamento da radiazioni a raggi X è trascurabile in quanto la dose di raggi X per la scansione utilizzata in questo studio è piccola. Assumendo una dose di raggi X locale di 1 Gy = 1 J/kg e una capacità termica di 3,45 kJ/kg K per il muscolo17, l'aumento massimo della temperatura dovuto all'assorbimento delle radiazioni sarebbe inferiore a un mK
Equazione 1
Q- energia termica
m- massa
c- Capacità termica specifica
ΔT- variazione di temperatura
Secondo il calcolo di cui sopra, l'aumento della temperatura è trascurabile. Inoltre, anche questo piccolo aumento di temperatura si dissiperebbe rapidamente attraverso la circolazione sanguigna.
I PMT hanno un diametro del fotocatodo attivo di 22 mm; Questa grande area facilita la cattura della luce da una vasta area diffusa sotto la pelle. Per ridurre la corrente di buio dall'emissione di elettroni indotta termicamente, i PMT sono lasciati raffreddare con un dispositivo più freddo sottostante. Abbiamo una guida di luce acrilica monopezzo che si biforca in due flussi che portano a due diversi tubi fotomoltiplicatori (PMT) per il rilevamento del segnale. Questo miglioramento per il sistema ci ha permesso di migliorare l'efficienza di raccolta della luce e quindi rilevare i segnali attraverso ossa e tessuti. In precedenza questa tecnica di imaging veniva utilizzata per monitorare le infezioni sulla superficie degli impianti ortopedici e potevamo visualizzare con successo le variazioni di pH14,15. Abbiamo generato immagini ad alto segnale / rumore di un'asta intramidollare modificata attraverso circa 2 cm di osso e tessuto nella tibia del coniglio. In generale, l'attenuazione della luce per diffusione e assorbimento aumenta esponenzialmente con lo spessore del tessuto. Esiste quindi un compromesso tra lo spessore del tessuto ripreso, il tempo di dose/scansione dei raggi X e la risoluzione spaziale.
Queste tecniche di imaging qui descritte coinvolgono sia una sonda impiantata che uno scanner. La sonda contiene scintillatori a raggi X che generano luce visibile e NIR quando irradiati dai raggi X. Ha uno strato chimicamente sensibile fabbricato sopra lo strato scintillatore che influenza l'intensità o lo spettro della luce. Lo strato chimicamente sensibile scelto per questa applicazione è il blu di Bromotimolo che ha assorbanza pH-dipendente a 600 nm di lunghezza d'onda e assorbanza quasi costante (indipendente dal pH) a 700 nm di luce che si sovrappone all'emissione dello scintillatore (620 nm e 700 nm). Il blu di bromotimolo o il verde di bromocresolo ha un valore pKa nell'intervallo di pH che ci interessa monitorare le infezioni associate all'impianto. Durante l'analisi del microambiente pH del biofilm batterico con colorante raziometrico fluorescente sensibile al pH, il pH può variare tra 5,6 (all'interno del biofilm) e pH 7 (nel fluido sfuso circostante)18. La sonda impiantata ha anche uno strato scintillatore senza il colorante indicante pH che funge da regione di riferimento spazialmente distinta. Inoltre, le particelle scintillatrici che stiamo usando hanno emissioni prominenti a lunghezze d'onda ~ 600 nm e ~ 700 nm. Lo spettro di assorbanza dei coloranti di cui sopra si sovrappone allo spettro di emissione delle particelle Gd 2O2S:Eu. Sia i raggi X eccitanti che i fotoni di luminescenza rossa / NIR sono utilizzati nell'imaging biomedico in vivo in quanto possono propagarsi attraverso il tessuto 19,20,21.
La Figura 1 mostra tre caratteristiche specifiche del sistema di imaging utilizzato in questo studio: risoluzione dei raggi X, specificità chimica e specificità della superficie dell'impianto. Tali caratteristiche sono paragonabili alle tecniche di imaging attualmente disponibili come SPECT, PET, MRI, US, ecc.22. Sebbene queste tecniche forniscano informazioni strutturali/anatomiche ad alta risoluzione in alta risoluzione, non è stato possibile mappare/visualizzare i cambiamenti chimici sulla superficie di un impianto. Questa tecnica combina la sensibilità chimica dei coloranti indicatori ottici con la specificità dell'impianto dal rivestimento. La risoluzione spaziale della radiografia fornisce un rilevamento/mappatura unico, a bassa risoluzione spaziale e a bassa risoluzione delle concentrazioni chimiche sulle superfici dell'impianto attraverso ossa e tessuti.
L'imaging chimico a luminescenza eccitata dai raggi X fornisce un modo unico per studiare l'ambiente chimico locale sulla superficie di un impianto con un'elevata risoluzione spaziale per lo studio delle infezioni. In futuro, l'approccio può essere generalizzato per monitorare altri analiti selezionando diversi coloranti indicatori. Può essere applicato potenzialmente per altre malattie e condizioni utilizzando dispositivi medici iniettati o impiantati rivestiti con particelle scintillanti e coloranti indicatori.
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Disclosures
Gli autori non rivendicano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare la Clemson University, COMSET e Clemson SC BioCRAFT. La configurazione XELCI è stata inizialmente sviluppata con fondi di NSF CAREER CHE 12255535 e successivamente da NIH NIAMS R01 AR070305-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 degree elbow | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| Bromo Cresol Green | Sigma-Aldrich | 45ZW10 | |
| Bromo Thymol Blue | Sigma | 76-59-5 | |
| ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate | Pollock industries, White River, VT, USA | TCP 50 | |
| Ethanol | Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051 |
64-17-5 | |
| Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm | Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England | UKL63/N-R1 | |
| LabVIEW | National Instruments, Austin, TX | ||
| Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis) | Motion Control, Smithtown, NY, USA | AT10-60 | |
| National instruments c-DAQ 9171 | National Instruments, Austin, TX | NI cDAQ™-9171 | |
| One piece acrylic light guide | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| pH 4 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5024 | |
| pH 8 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5060 | |
| Phosphate Buffer Solution | MP Biomedicals, Irvine, CA. USA | 2810305 | |
| Photo multiplier tubes Model P25PC-16 | SensTech, Surrey, UK | Model P25PC-16 | |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ATCC 25923 | |
| Tryptic Soy Agar | Teknova, Hollister, CA, USA | T0520 | |
| Tryptic Soy Broth | EMD Millipore, Burlington, MA, USA | 1005255000 | |
| X-ray source-iMOXS | Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany | ||
| X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel | Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA | LTS300 and LTS150 |
References
- Arciola, C. R., Alvi, F. I., An, Y. H., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infection and infection resistant materials: A mini review. International Journal of Artificial Organs. 28 (11), 1119-1125 (2005).
- Renick, P., Tang, L. Device-related infections. Racing for the Surface. Li, B., Moriarty, T. F., Webster, T., Xing, M. , Springer International Publishing. Cham. 171-188 (2020).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J.
- Metsemakers, W. J., et al. Fracture-related infection: A consensus on definition from an international expert group. Injury. 49 (3), 505-510 (2018).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infections: Adhesion, biofilm formation and immune evasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (7), 397-409 (2018).
- Polvoy, I., Flavell, R. R., Rosenberg, O. S., Ohliger, M. A., Wilson, D. M. Nuclear Imaging of Bacterial Infection: The State of the Art and Future Directions. Journal of Nuclear Medicine. 61 (12), 1708-1716 (2020).
- vander Bruggen, W., Bleeker-Rovers, C. P., Boerman, O. C., Gotthardt, M., Oyen, W. J. G. PET and SPECT in Osteomyelitis and Prosthetic Bone and Joint Infections: A Systematic Review. Seminars in Nuclear Medicine. 40 (1), 3-15 (2010).
- Trampuz, A., Zimmerli, W. Diagnosis and Treatment of infections associated with fracture-fixation devices. Injury. 37 (2), 59-66 (2006).
- Ady, J., Fong, Y. Imaging for infection: From visualization of inflammation to visualization of microbes. Surgical Infections. 15 (6), 700-707 (2014).
- Truong-Bolduc, Q. C., et al. Implication of the NorB Efflux pump in the adaptation of Staphylococcus Aureus to growth at acid pH and in resistance to Moxifloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3214-3219 (2011).
- Hengge-Aronis, R. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the σS (RpoS) subunit of RNA polymerase. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 373-395 (2002).
- Gao, R., Yan, D. Molecular phosphors for x-ray detection. Science Bulletin. 67 (10), 1015-1017 (2022).
- Gao, R., Fang, X., Yan, D. Recent developments in stimuli-responsive luminescent films. Journal of Materials Chemistry C. 7 (12), 3399-3412 (2019).
- Uzair, U., et al. Conformal coating of orthopedic plates with x-ray scintillators and ph indicators for x-ray excited luminescence chemical imaging through tissue. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (47), 52343-52353 (2020).
- Uzair, U., Benza, D., Behrend, C. J., Anker, J. N. Noninvasively imaging pH at the surface of implanted orthopedic devices with x-ray excited luminescence chemical imaging. ACS Sensors. 4 (9), 2367-2374 (2019).
- Begot, C., Desnier, I., Daudin, J. D., Labadie, J. C., Lebert, A. Recommendations for calculating growth parameters by optical density measurements. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 225-232 (1996).
- Giering, K., Minet, O., Lamprecht, I., Müller, G. Review of thermal properties of biological tissues. Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering. , 45-65 (1995).
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Pogue, B. W., Leblond, F., Krishnaswamy, V., Paulsen, K. D. Radiologic and Near-Infrared/Optical Spectroscopic Imaging: Where Is the Synergy. American Journal of Roentgenology. 195 (2), 321-332 (2010).
- Ryan, S. G., et al. Imaging of X-ray-excited emissions from quantum dots and biological tissue in whole mouse. Scientific Reports. 9 (1), 19223 (2019).
- Yang, Y., Wang, K. -Z., Yan, D. Ultralong persistent room temperature phosphorescence of metal coordination polymers exhibiting reversible pH-responsive emission. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (24), 15489-15496 (2016).
- Chen, H., Rogalski, M. M., Anker, J. N. Advances in functional X-ray imaging techniques and contrast agents. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (39), 13469 (2012).
- Allan, V. J. M., Macaskie, L. E., Callow, M. E. Development of a pH gradient within a biofilm is dependent upon the limiting nutrient. Biotechnology letters. 21 (5), 407-413 (1999).
- Wang, Z., Deng, H., Chen, L., Xiao, Y., Zhao, F. In situ measurements of dissolved oxygen, pH and redox potential of biocathode microenvironments using microelectrodes. Bioresource Technology. 132, 387-390 (2013).
- Xiao, Y., et al. In situ probing the effect of potentials on the microenvironment of heterotrophic denitrification biofilm with microelectrodes. Chemosphere. 93 (7), 1295-1130 (2013).
- Nakata, E., et al. A novel strategy to design latent ratiometric fluorescent pH probes Based on self-assembled SNARF derivatives. RSC Adv. 2014 (4), 348-357 (2014).
- Villano, D., et al. A fast multislice sequence for 3D MRI-CEST pH. Magnetic Resonance in Medicine. 85 (3), 1335-1349 (2021).
