Summary
Her presenterer vi en protokoll for høyoppløselig optisk deteksjon av kjemisk informasjon rundt implantert medisinsk utstyr med røntgeneksitert luminescens kjemisk avbildning (XELCI). Denne nye bildebehandlingsteknikken er utviklet i vårt laboratorium som gjør det mulig å studere implantatassosiert infeksjonsbiokjemi.
Abstract
Mikrobielle infeksjoner forbundet med implanterbart medisinsk utstyr er en stor bekymring ved fikseringssvikt ved brudd. Tidlig diagnose av slik infeksjon vil tillate vellykket utryddelse med antibiotika uten ekstra kostnad for en annen operasjon. Her beskriver vi XELCI som en teknikk med høy røntgenoppløsning, implantatspesifisitet og kjemisk følsomhet for ikke-invasive kjemiske konsentrasjoner nær overflaten av implantert medisinsk utstyr. Enhetene er belagt med kjemisk rapporterende overflater. Denne kjemisk responsive overflaten består av to lag belagt på et implanterbart medisinsk utstyr; et pH-følsomt lag (bromothymolblått eller bromokresolgrønt inkorporert hydrogel) som er belagt over et rødlysemitterende scintillatorlag (Gd2 O2S: Eu) for overvåking. En fokusert røntgenstråle bestråler et sted på implantatet, og det røde lyset som genereres av scintillatoren (med 620 nm og 700 nm topper) overføres gjennom sensorlaget som endrer spektralforholdet avhengig av pH. Et bilde genereres ved å skanne røntgenstrålen over implantatet og måle spektralforholdet mellom lys som passerer gjennom vevet punkt for punkt. Vi brukte denne avbildningsteknikken for å overvåke implantatassosierte infeksjoner tidligere på benoverflaten av lårbenet med en modifisert implanterbar platesensor. Nå studerer vi pH-endringer som oppstår fra tibial intramedullære stavinfeksjoner. To forskjellige typer intramedullære stavdesign brukes i pre-pilot kaninstudier, og vi lærte at XELCI-teknikken kunne brukes til å overvåke eventuelle kjemiske endringer som ikke bare skjer på beinoverflaten, men også inne i beinet. Dermed muliggjør dette ikke-invasiv, høy romlig oppløsning, lav bakgrunn lokal pH-avbildning for å studere implantatassosiert infeksjonsbiokjemi.
Introduction
I USA settes omtrent 2 millioner bruddfikseringsenheter inn årlig, og 5% -10% av dem fører til implantatassosierte infeksjoner1. Disse infeksjonene er vanskeligere å behandle med antibiotika på senere stadier på grunn av biofilmens heterogenitet og antibiotikaresistente natur 2,3. Hvis de diagnostiseres tidlig, kan infeksjoner behandles med antibiotika og kirurgisk debridement for å forhindre ekstra medisinske kostnader for en annen operasjon for å erstatte maskinvare på det behandlede bruddstedet. Vanlig radiografi og andre avanserte radiografiske teknikker brukes i diagnosen ortopediske implantatassosierte infeksjoner, ikke-fagforeninger og relaterte komplikasjoner. Selv om disse teknikkene ofte brukes til å skaffe strukturell informasjon om det omkringliggende bein og vev ved det ortopediske implantatet, er de ikke i stand til å gi biokjemisk informasjon i det spesifikke miljøet. Derfor utviklet vi en ny røntgeneksitert luminescens kjemisk bildebehandling (XELCI) teknikk for høyoppløselig avbildning av biokjemisk informasjon ikke-invasivt på implantatstedet. Diagnostisering av ortopediske implantatassosierte infeksjoner utføres vanligvis på en eller en kombinasjon av forskjellige måter. Kliniske observasjoner (smerte, hevelse, rødhet, sårutslipp, etc.) antyder de første tegn på infeksjon. Senere utføres radiologiske og laboratorieforsøk for å bekrefte svikt i beinhelingsprogresjon og identifisere den patogene organismen 4,5. Nukleærmedisinske teknikker som datastyrt tomografi (CT), magnetisk resonansavbildning (MRI) og radionukleotidmetoder som Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) og Positron Emission Tomography (PET) er i bruk for bedre visualisering av det infiserte implantatet og den tilhørende infeksjonen 6,7. CT og MR er fordelaktige for å bestemme henholdsvis bennekrose og bløtvevsavvik, men forårsaker forstyrrelser i nær avstand til metallimplantatene8. Ulike røntgenmetoder som SPECT og PET i kombinasjon med radioisotopmerkede analytter som in vivo bildekontrastmidler er mye brukt for å diagnostisere implantatassosiert osteomyelitt2. Nåværende applikasjoner kombinerer både data fra CT-skanning og merkingsdata fra enten SPECT eller PET for å generere anatomisk informasjon9. Selv om en eller flere av disse bildebehandlingsmodalitetene brukes til å hjelpe infeksjonsdiagnose, kan de ikke oppdage pH-variasjonene forbundet med infeksjon tidlig for å starte behandlingene med antibiotika for å unngå ekstra medisinske og kirurgiske utgifter.
Den største fordelen med å bruke bildebehandlingssystemet som brukes i denne studien for å overvåke implantatassosierte infeksjoner, er dens evne til å avsløre biokjemisk informasjon om biofilmmikromiljøet med en spektral referanse. Selv om hovedfokuset er på avbildning og kartlegging av pH på det infiserte stedet, kan denne metoden endres for å overvåke andre biomarkører som er spesifikke for implantatassosierte infeksjoner. Dermed gjør XELCI det mulig å forstå patofysiologien til infeksjonen. Den høye romlige oppløsningen gjør det mulig å kartlegge heterogenitet etter hvert som infeksjonen vokser. pH på overflaten der biofilmdannelsen skjer er svært viktig for å forstå biokjemiske endringer. Også andre mikromiljøendringer kan oppstå på grunn av antibiotikarelaterte stressresponser av bakterier10,11. På grunn av overflatespesifikk og høy romlig oppløsning kan den antibiotiske effekten på biofilmmikromiljøet overvåkes. Teknikken kan også brukes til å studere biofilmmiljøet for målrettede eksperimenter med legemiddellevering. Vi kan studere målrettet lav pH-frigjøring eller økning av pH for å gjøre dem mer utsatt for arbeid ved høyere pH.
Tre spesifikke kjennetegn ved denne avbildningsteknikken er røntgenoppløsning, implantatoverflatespesifisitet og kjemisk følsomhet (figur 1A). Disse karakteristika kan sammenlignes med tilgjengelige bildeteknikker for avbildning av ortopediske implantatrelaterte infeksjoner (figur 1B). Når fosforpartikler belagt på implantatoverflaten er bestrålt med røntgenstråler, genererer det rødt og nær-IR (NIR) lys som kan trenge gjennom noen få centimeter vev (om enn med en viss demping)12,13. Tabell 1 viser noen av funksjonene i det utviklede bildesystemet sammenlignet med andre måter som har blitt brukt til å måle pH i biofilmer eller gjennom vev.
XELCI er en ny avbildningsteknikk for å skaffe kjemisk informasjon med høy romlig oppløsning optisk nær implantert medisinsk utstyr i kombinasjon med røntgeneksitasjon, som vist i figur 2. Her utnyttes selektiv eksitasjon og optisk deteksjon av røntgeneksiterbare fosforpartikler. Implantatet er belagt med to lag, et pH-følsomt fargestoff innlemmet polymerlag over et lag av scintillatorpartikler. Når en sekvens av fokuserte røntgenstråler bestråler implantatet, genererer scintillatorlaget synlig lys (620 nm og 700 nm). Dette produserte lyset passerer gjennom det pH-følsomme laget som modulerer luminescensspekteret avhengig av pH-verdien i omgivelsene. Lav pH er generelt forbundet med infeksjon og biofilmdannelse; etter hvert som infeksjonen utvikler seg, endres pH fra fysiologisk pH (pH 7,2) til sur (mindre enn pH 7), og pH-fargestoffet i sensoren endrer farge og dermed absorbans. Variasjonen i luminescensspekteret er vist i figur 2E for Bromokresolgrønn pH-fargestoff ved pH 7 og pH 4. Det overførte lyset gjennom vev og bein samles og spektralforholdet bestemmer pH. For å generere et pH-bilde, bestråler den fokuserte røntgenstrålen et punkt om gangen i scintillatorfilmen og skanner strålen punkt for punkt over prøven. Tidligere ble denne teknikken brukt på bilde-pH-variasjon på overflaten av de ortopediske implantatene14,15 og har testet den for å overvåke pH-variasjoner i den intramedullære kanalen gjennom bein og vev.
Figur 3 nedenfor viser et skjema over bildesystemet. Grunnleggende komponenter i bildebehandlingssystemet er røntgeneksitasjonskilden med polykapillær optikk, en akryllysguide i ett stykke som kobles til to fotomultiplikatorrør, x, y og z motoriserte trinn (30 cm x 15 cm x 6 cm vandring) og datamaskinen koblet til datainnsamling. Røntgenkilden, x, y, z stadium og samlingsoptikk (albue, lysguide, fotomultiplikatorrør (PMT)) er i røntgensikker kabinett, mens røntgenkontrolleren, strømkilden for PMT, funksjonsgenerator koblet til datainnsamlingskortet (DAQ) og datamaskinen holdes utenfor. En trykknapp, normalt åpen bryter, plassert mellom kabinettet og forsiden av døren, fungerer som en sperre. Hvis døren ikke er helt lukket (sperrebryteren er åpen), slås ikke røntgenkilden på, og den slår automatisk av røntgenkilden hvis den åpnes under drift. Motorene kan utføre en kontinuerlig skanning, så vel som de kan flyttes til et hvilket som helst diskret sted. Skannehastigheten for y-aksen er vanligvis 1-5 mm/s, mens trinnstørrelsen på x-aksen typisk kan velges fra 150-2000 μm. Parametrene kan velges avhengig av den nødvendige romlige oppløsningen. Selv eksponeringstider bekreftes av konsekvent hastighet gjennom en kontinuerlig skanning.
Når den fokuserte røntgenstrålen er bestrålt på røntgenluminescenspartiklene, vil det genererte lyset passere gjennom den pH-følsomme filmen ved å modulere lyset avhengig av den omkringliggende pH. Det overførte lyset vil samhandle (spre seg og absorbere delvis) med et vev, mens lysdempingen ved spredning og absorpsjon vil øke etter hvert som vevtykkelsen øker. Kolleksjonsoptikken inkluderer en todelt akryllysguide i ett stykke utstyrt med en reflekterende aluminiumsalbue (med en 90° bøyning og polert reflekterende innvendig overflate) i begynnelsen. Dette er for å sikre at lyset kollimeres så snart lyset når lysguiden. Disse tilleggene forbedret lysinnsamlingseffektiviteten betydelig. For ytterligere detaljer viser figur 4 maskintegningene av albuen og lysføringen. Den 90 ° albuen ble maskinert ut av aluminium med den indre overflaten polert til en speilfinish og lysguiden ble maskinert med akryl. Vi har også festet et bredt spekter av langpassblått lysfilter (blokkerer 350-450 nm lys) i begynnelsen av albuen for å sikre at bare rødt lys vil passere gjennom. Enden av akryllysføringen i ett stykke forgrener seg i to bekker som fører til to forskjellige PMT-er. PMT-ene er innelukket i en liten lystett metallboks som er i kontakt med en termoelektrisk kjøler for å kjøle ned PMT-ene til ~ 5 ° C. I begynnelsen av en av PMT-ene er et langpassfilter med smalt område (blokkerer 570-640 nm lys og passerer 640-740 nm lys) festet for å måle bare 700 nm-lyset. Derfor kan lyset på 620 nm og 700 nm beregnes separat. PMT-ene er satt opp i fotontellingsmodus, og de genererer transistor-transistor-logikk (TTL) pulser for hver foton oppdaget. Et DAQ-system teller pulsene (metningspunkt 20 millioner pulser per sekund) ved hjelp av USB-kommunikasjon. To separate intensitetskart genereres etter behandling av dataene, og et endelig bilde opprettes ved å vurdere forholdet mellom signalbølgelengdeintensiteten (620 nm) og referansebølgelengdeintensiteten (700 nm). Dette forholdet står for forskjeller i total lysinnsamlingseffektivitet, som avhenger sterkt av posisjonen til oppsamlingsoptikk, røntgenbestrålingsintensitet og vevtykkelse. I tillegg står et romlig separert referanseområde uten pH-indikatorfargestoff for spektral forvrengning fra bølgelengdeavhengig vevspenetrasjon. Et grafikkbasert programmeringsspråk brukes til å kontrollere bildesystemet, og et grunnleggende flytskjema for operasjonen er vist nedenfor. Bildeoppsettet, bortsett fra datamaskinen, røntgenkontrolleren og DAQ-enheten, er innelukket i et trygt røntgenkabinett for å minimere strålingseksponering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne prosedyren følger dyrebruksprotokollene godkjent av Clemson University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Forsøkene utføres i henhold til Clemson University Biosafety Committee (IBC) og strålingssikkerhetskomiteen (RSC), samt i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter.
MERK: Et flytskjema for å fullføre en XELCI-skanning er vist nedenfor i figur 5 etterfulgt av en detaljert trinnvis beskrivelse av bildeprosedyren.
1. Initialiser systemet og skaff deg en vanlig radiograf
- Slå på PMT-kjøler, det tar vanligvis ~ 15 minutter å nå settpunktet (f.eks. 4 ° C). Utfør resten av initialiseringstrinnene før du slår på PMTene.
- Åpne programvaren for kontroll av bildesystemet. Den kontrollerende programvaren kommuniserer og initialiserer x-y-z-aksen motorisert stadium. Flytt trinn x-aksen og y-aksen til ønsket startposisjon.
- Plasser prøven på det bevegelige x-y-z-trinnet. Plasser prøvehøyden (z-aksen), slik at den radioluminescerende enheten er 5-5,5 cm under polykapillærfokusoptikken ved å heve eller senke røntgenkilden og / eller trinnet. Plasser også prøven i xy-planet ved hjelp av laserkrysshodet (to røde linjeformede laserpekere festet til røntgenfokuseringskapillæren og plassert 90° i forhold til hverandre slik at linjene krysser hverandre der røntgenstrålen vil fokusere). Slå av laserne før røntgenstråler og PMT slås på.
- Fest trykknapplåsen ved inngangsdøren til bildekabinettet. Slå på strømmen til strålekilden. Fjern fokuseringsoptikken for å oppnå vanlig røntgenbilde av prøven.
- Åpne røntgenkontrollprogramvaren og still inn røntgeneffekten (ved å justere spenning og strøm). Åpne røntgenlukkeren med røntgenkontrollprogramvaren.
- Åpne programvaren for røntgenkamera. Trykk på eksponeringsknappen for å ta vanlig røntgenbilde. Slå av eksponeringen og slå av røntgenstrålen.
MERK: Hvis det er nødvendig, flytt prøven for å forbedre prøveposisjonen eller skaff deg en serie røntgenstråler i forskjellige posisjoner slik at de kan sorteres for å få en større røntgenvisning. Man kan også skaffe seg røntgenbilde på et eget system, men samregistrering mellom XELCI og radiografi blir vanskeligere hvis prøven beveger seg. - Åpne skapdøren.
2. Eventuelt kan du utføre en bakgrunnsskanning med røntgenstrålen av
- Koble polykapillær optikk igjen til røntgenkilden.
- Lukk kabinettet og fest låsen. Slå på PMT-strømforsyningen.
MERK: PMT-strømforsyningen skal alltid slås av når døren er åpen eller i ferd med å åpnes for å unngå overeksponering for lys. - Åpne kontrollprogramvaren for bildesystemet og angi trinnstørrelse, skannehastighet og skanneområde. Når alle parametrene er angitt, starter du skanningen ved å trykke på Kjør-knappen .
MERK: For en høyoppløselig skanning vil trinnstørrelsen være 1000 μm, og for en lavoppløselig skanning vil trinnstørrelsen være 250 μm. Skannehastigheten kan velges fra 5 mm/s til 1 mm/s. Området for skanningen avhenger av dimensjonene til prøven. - Kjør en bakgrunnsskanning med røntgenstrålen av for å bestemme mørketallene fra noe lys som er tilstede i kabinettet annet enn prøven.
3. Utfør en prøveskanning med røntgenstrålen på
- Forsikre deg om at prøven fortsatt er i riktig posisjon med laserkorshodet for å starte skanningen.
- Lukk kabinettet og fest låsen. Hvis PMT-ene er slått av (f.eks. slått av før døren åpnes), må du slå på PMT-strømforsyningen.
- Åpne programvaren for kontroll av bildesystemet. Angi verdiene for trinnstørrelse, skannehastighet og skanneområde. Når alle parametrene er angitt, trykker du på Kjør-knappen for å starte skanningen.
MERK: For en høyoppløselig skanning vil trinnstørrelsen være 1000 μm, og for en lavoppløselig skanning vil trinnstørrelsen være 250 μm. Skannehastigheten kan velges fra 5 mm/s til 1 mm/s. Området for skanningen avhenger av dimensjonene til prøven. - Få skanningen for prøven med røntgenstrålen på.
- Først må du utføre skanningen med lav oppløsning med større trinnstørrelser og høyere skannehastighet for å få et foreløpig bilde av målet. Etter å ha oppnådd en lavoppløselig skanning av ønsket område av prøven, oppnår du skanningen med høyere oppløsning med en mindre trinnstørrelse og lavere skannehastighet.
- Slå av PMT-strømforsyningen før du åpner døren.
4. Danner bildet
- Valider gjeldende skanning er avbildning området av interesse for målet. Hvis ikke, stopp gjeldende skanning ved å trykke på Stopp-knappen .
- Juster skanneposisjonene i kontrollprogramvaren igjen og trykk på Kjør-knappen igjen.
MERK: Y-aksen registreres kontinuerlig fra og med den første raden i skanningen. Under utførelsen av en skanning registreres antall tellinger per hver bølgelengde og tid siden siste oppdaterte motorposisjon. Tiden som registreres vil ta hensyn til eventuelle endringer i motorhastigheten, altså eksponeringstiden. For hver piksel normaliseres antall/sekund. Y-aksemotoren beveger seg for å skanne enden av den gjeldende raden på y-aksen, og motoren kommer tilbake til startposisjonen. Deretter øker x-aksemotoren sin posisjon med en trinnstørrelse definert av brukeren og skanner den andre raden på y-aksen. Denne prosessen sykles til x-aksemotoren når den angitte bredden for x-retningen. Brukeren kan kontrollere skannestørrelsen, motorhastigheten og motorens startposisjoner. Trinnstørrelsen bestemmer størrelsen på pikslene i det endelige bildet av y-aksen.
5. Dyrking av bakterier for avbildning under sterile forhold (Hvis bakteriedyrkede sensorer avbildes)
- For å forberede en frisk kultur av Staphylococcus aureus 1945 (ATCC 25923), bruk en koloni fra en TSA (tryptisk soyaagar) plate stripet innen 1 uke for å inokulere 5 ml steril tryptisk soyabuljong (TSB).
- Rist bakteriekulturen forsiktig ved 37 °C i 16-18 timer til den stasjonære fasen.
- Deretter pelleterer du dyrkningen fra TSB via sentrifugering ved 4000 x g i 10 minutter ved romtemperatur (RT) og vasker pelleten to ganger med fosfatbufferløsning (PBS) og resuspenderer pelleten i 5 ml steril PBS.
- Kvantifiser bakteriekonsentrasjonen ved hjelp av optisk tetthet ved 600 nm ved hjelp av det lineære området, som er OD-området der Beer-Lambert-loven er verifisert (OD = kN; k er en koeffisient i forhold til molekylær utryddelse og lengden på den optiske banen, N er bakteriekonsentrasjonen)16. Fortynn deretter prøven til 105 celler/ml ved bruk av steril PBS.
- Steriliser Tryptic Soy Agar (TSA) ved autoklavering og avkjøl deretter ved å blande til temperaturen når 45 °C. Inokuler bakteriene i TSA.
- Pipetter den fortynnede bakteriekulturen (100 μL) på overflaten av den implanterbare sensoren.
MERK: Implantater ble sterilisert ved nedsenking i 70% etanol i 5 minutter og lagret i steril PBS. - Pipette 100 mikrol uninokulert TSA over et annet sterilt implantat som kontroll
- Legg til ytterligere 100 mikroliter ikke-inokulert TSA over den implanterbare sensoren før den inkuberes ved 37 °C i 48 timer før implantasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en foreløpig studie avbildet vi den intramedullære stavsensoren i en reamed tibia av en kaninkadaver14. Sensoren har tre forskjellige regioner: referanseområdet, pH 8-regionen (basisk pH) og pH 4-regionen (sur pH). Referanseområdet er scintillatorpartikkelen (Gd2O2S:Eu) inkorporert i grov epoksyfilm. De karakteristiske sure og basiske pH-regionene representerer infiserte og ikke-infiserte situasjoner inne i den intramedullære kanalen (figur 6A,B)14.
Etter fullført skanning ble bildene ved henholdsvis 620 nm, 700 nm og forhold (figur 7A-C) generert i MATLAB. Endringene i farge er indikative for endringene i pH. Siden bromothymolblått i det grunnleggende pH-området absorberer betydelig utsendt lys enn det sure pH-området, vises den nedre pH-regionen som et lysere signal ved 620 nm. Scintillatorutslippet ved 700 nm fungerer som en spektralreferanse for inkonsekvenser i scintillatorfilmen, vevssammensetningsendringer og eventuelle endringer som skjer i deteksjonsoptikkens posisjon fra skanning til skanning.
Figur 1: Spesifikke egenskaper ved XELCI-avbildningen sammenlignet med gjeldende tilgjengelige teknikker (A) Viktige funksjoner; (B) sammenligning med gjeldende tilgjengelige avbildningsteknikker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Arbeidsprinsipp for teknikken og sensorens oppførsel med og uten infeksjon. (A) Skjematisk viser implantat bestrålt med fokusert røntgenstråle og luminescens samlet for deteksjon; (B) zoomet inn på scintillatoren og den pH-sensitive filmbelagte intramedullære stavsensoren; (C) ved lav pH forårsaket av infeksjon, blir den intramedullære stavsensoren fra blå til gul, mens fargefri referanseregion er uendret; (D) zoomet inn på den intramedullære staven under en infeksjon; (E) spektra som viser epoksy-PEG pH-sensorfilm (10 % PEG-hydrogel inneholdende Bromokresolgrønt pH-fargestoff belagt på toppen av epoksyfilm inneholdende Gd2O2S:Eu scintillatorpartikler) ved pH 7 og pH 4 og epoksyscintillatorlag uten pH-indikator PEG-hydrogel. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Uzair et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bildesystem. (A) Skjematisk diagram (de røde pilene viser lysretningen mot PMT); (B) et bilde av det faktiske systemet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Dataassisterte designprogramvaretegninger som viser dimensjonene . (A) Tegning av 90° albuen (B) Tegning av akryllysføringen i ett stykke. (Alle dimensjonene er i mm) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Flytskjema over avbildningsprosedyren Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Intramedullær stavsensor i en reamed tibia av en kaninkadaver. (A) Stang i rustfritt stål belagt med Gd 2 O2S:Eu inkorporert epoksy- og pH-sensitiv akrylamid-PEG gel; (B) belagt rustfritt - stålstang satt inn i det borede hullet i kanintibia. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Uzair et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Bilder av stangsensoren i den intramedullære kanalen. (A) Analysert bilde for 620 nm bølgelengde; (B) analysert bilde for 700 nm bølgelengde; (C) analysert forholdsbilde (620/700); (D) vanlig røntgenbilde av stangsensoren; (E) overlagret forholdsbilde og vanlig radiografi. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Uzair et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Overflatespesifikk avbildning | Likevekt/ikke-likevekt | Høy oppløsning gjennom vev | Ioniserende stråling | Røntgen lett overlagret | Representative referanser | |
| pH-mikroelektrode | Ja, ett poeng av gangen | ikke-likevekt, (Nernst Equation) begroing og tid kan forårsake drift | Ja, ett poeng av gangen | Nei | Nei | 23-25 |
| Fluorescerende pH-indikatorer | Ja | Likevekt | Nei | Nei | Nei | 18,26 |
| MR (CEST) | Ja | Likevekt | 3D, men treg | Nei | Nei | 27 |
| XELCI | Ja | Likevekt | Ja | Ja | Ja | 14,15,22 |
Tabell 1: Egenskaper ved XELCI kontra andre pH-avbildningsteknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å kunne oppdage og studere ortopediske implantatassosierte infeksjoner tidlig for å unngå komplikasjoner fra osteomyelitt og sekundære kirurgiske prosedyrer, har vi introdusert XELCI som en ny, funksjonell avbildningsteknikk. Det er sammenlignbart med dagens tilgjengelige teknikker for pH-overvåking gjennom vev.
Mens vi plasserer prøven for avbildning, bruker vi et laserkrysshode koblet til polykapillær fokuseringsoptikk med to kryssende linjeformede laserpekere i 90° vinkel for å justere albuen nøyaktig under den. Disse laserne bør slås av før du starter en skanning for å eliminere uønsket lys som når detektoren annet enn lyset som genereres av scintillatorene. Når det gjelder avstand, måler brukeren avstanden fra spissen av fokuseringsoptikken til toppen av prøven til å være rundt 5-5,5 cm før eksperimentet starter. Dette kan oppnås enten ved å heve røntgenkilden manuelt eller ved å flytte scenen opp og ned. Den samme prosedyren brukes for et levende dyr eller måling gjennom vev, bortsett fra at vi legger dyret under anestesi og kjører et isofluran gassrør for å sikre at det sover. Vi overvåker temperaturen og pulsen med jevne mellomrom og legger til ekstra sengetøy og tape for å plassere dyreanatomien riktig, spesielt vinkelen, og vi anslår 5-5,5 cm brennposisjon til å være dybden på implantatet i stedet for bare å bruke avstanden til den øverste overflaten av huden. Ofte blir det tatt et vanlig røntgenbilde eller grov skanning for å sikre riktig plassering og overlapper senere det kjemiske XELCI-bildet tatt på samme sted. For sensorer som ikke er dekket med vev, reduseres røntgenkildestrømmen generelt fra maksimalt 600 μA ved 50 kV til så lavt som 15 μA for å sikre at PMTene ikke metter. Røntgenkilden og dens tilstand overvåkes periodisk av Clemson University Radiation Safety. Nøkkelen til røntgenkontrolleren brukes bare av XELCI-brukere, og den holdes alltid borte for å forhindre utilsiktet på/avslåing. Trykknapplåsen ved inngangsdøren til kabinettet bør også sikres forsiktig før du slår på røntgenstrålen. Hvis sperren ikke fungerer som den skal, vil brukeren ikke kunne slå på røntgenstrålen, og det vil generere feil. Gjennom hele eksperimentet mens røntgenstrålen er på, slås et oransje lys på for å advare alle om at røntgenstrålen kjører.
Vanligvis kjøres både en skanning med lav oppløsning og en skanning med høy oppløsning. Skanningen med lav oppløsning er med en større trinnstørrelse, og skanningen med høy oppløsning er med en mindre trinnstørrelse. Tiden det tar for en skanning avhenger i stor grad av tre faktorer: trinnstørrelsen, hastigheten på skanningen og området for skanningen. Det tar for eksempel ~20 min å skanne et område på 15 mm x 15 mm for et bilde med høy oppløsning med en langsom skannehastighet på 1 mm/s og med en trinnstørrelse på 200 μm. Skanning av det samme området med lavere oppløsning og raskere skannehastighet reduserer tiden (f.eks. 1 mm trinnstørrelse og 5 mm/s hastighet tar ca. 1 min). Ytterligere tid er nødvendig før skanning for å sette opp og plassere dyret eller prøven riktig og understating hvor implantatet er plassert. For dyreforsøk overvåkes kroppstemperaturen for å sikre at temperaturen ikke synker for mye under anestesi. Oppvarming fra røntgenstråling er ubetydelig da røntgendosen for skanningen som brukes i denne studien er liten. Forutsatt en lokal røntgendose på 1 Gy = 1 J/kg og en varmekapasitet på 3,45 kJ/kg K for muskel17, vil maksimal temperaturøkning fra stråleabsorpsjon være mindre enn en mK
Ligning 1
Q- varmeenergi
m- masse
c- spesifikk varmekapasitet
ΔT- temperaturendring
Ifølge beregningen ovenfor er temperaturøkningen ubetydelig. I tillegg vil selv denne lille temperaturøkningen raskt forsvinne gjennom blodsirkulasjonen.
PMT-ene har en aktiv fotokatodediameter på 22 mm; Dette store området muliggjør lysopptak fra et stort diffust område under huden. For å redusere den mørke strømmen fra termisk indusert elektronutslipp, får PMTene avkjøles med kjøler under. Vi har en akryllysguide i ett stykke som deler seg i to strømmer som fører til to forskjellige fotomultiplikatorrør (PMT) for signaldeteksjon. Denne forbedringen for systemet tillot oss å forbedre lysinnsamlingseffektiviteten og dermed oppdage signaler gjennom bein og vev. Tidligere ble denne avbildningsteknikken brukt til å overvåke infeksjoner på overflaten av de ortopediske implantatene, og vi kunne med hell avbilde pH-endringer14,15. Vi genererte høye signal/støybilder av en modifisert intramedullær stav gjennom ca. 2 cm bein og vev i kanintibia. Generelt øker lysdemping ved spredning og absorpsjon eksponentielt med vevtykkelse. Det er dermed en avveining mellom vevstykkelse avbildet gjennom, røntgendose/skanningstid og romlig oppløsning.
Denne avbildningsteknikken beskrevet her involverer både en implantert sonde og en skanner. Sonden inneholder røntgenscintillatorer som genererer synlig og NIR-lys når de bestråles av røntgenstråler. Den har et kjemisk følsomt lag fremstilt over scintillatorlaget som påvirker lysintensiteten eller spekteret. Det kjemisk følsomme laget som er valgt for denne applikasjonen er Bromothymol Blue, som har pH-avhengig absorbans ved 600 nm bølgelengde og nesten konstant (pH-uavhengig) absorbans ved 700 nm lys som overlapper med scintillatorutslippet (620 nm og 700 nm). Bromothymolblå eller Bromocresol grønn har en pK,en verdi i pH-området, vi er interessert i å overvåke implantatassosierte infeksjoner. Under analyse av pH-mikromiljøet til bakteriell biofilm med pH-sensitivt fluorescerende forholdsstoff, kan pH variere mellom 5,6 (i biofilmen) og pH 7 (i den omkringliggende bulkvæsken)18. Implantert sonde har også et scintillatorlag uten pH-indikerer fargestoff som fungerer som et romlig distinkt referanseområde. Videre har scintillatorpartiklene vi bruker fremtredende utslipp ved ~ 600 nm og ~ 700 nm bølgelengder. Absorbansspekteret til de ovennevnte fargestoffene overlapper med emisjonsspekterettil Gd2O2S:Eu-partiklene. Både de spennende røntgenstrålene og røde / NIR-luminescensfotoner brukes i in vivo biomedisinsk avbildning da de kan forplante seg gjennom vev 19,20,21.
Figur 1 viser tre spesifikke karakteristika ved bildesystemet som ble brukt i denne studien: røntgenoppløsning, kjemisk spesifisitet og implantatoverflatespesifisitet. Disse egenskapene er sammenlignbare med de tilgjengelige bildebehandlingsteknikkene som SPECT, PET, MR, US, etc22. Selv om disse teknikkene gir høyoppløselig strukturell/anatomisk informasjon i høy oppløsning, kunne vi ikke kartlegge/avbilde kjemiske endringer på en implantatoverflate. Denne teknikken kombinerer kjemisk følsomhet fra optiske indikatorfargestoffer med implantatspesifisitet fra belegget. Den romlige oppløsningen fra røntgenstrålen gir en unik, lav bakgrunn og høyere romlig oppløsningsdeteksjon/kartlegging av kjemiske konsentrasjoner på implantatoverflater gjennom ben og vev.
Røntgeneksitert luminescens kjemisk bildebehandling gir en unik måte å studere det lokale kjemiske miljøet på en implantatoverflate med høy romlig oppløsning for å studere infeksjoner. I fremtiden kan tilnærmingen generaliseres for å overvåke andre analytter ved å velge forskjellige indikatorfarger. Det kan brukes potensielt for andre sykdommer og tilstander ved hjelp av injisert eller implantert medisinsk utstyr belagt med scintillatorpartikler og indikatorfargestoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Clemson University, COMSET og Clemson SC BioCRAFT. XELCI-oppsettet ble opprinnelig utviklet med midler fra NSF CAREER CHE 12255535 og senere av NIH NIAMS R01 AR070305-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 degree elbow | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| Bromo Cresol Green | Sigma-Aldrich | 45ZW10 | |
| Bromo Thymol Blue | Sigma | 76-59-5 | |
| ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate | Pollock industries, White River, VT, USA | TCP 50 | |
| Ethanol | Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051 |
64-17-5 | |
| Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm | Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England | UKL63/N-R1 | |
| LabVIEW | National Instruments, Austin, TX | ||
| Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis) | Motion Control, Smithtown, NY, USA | AT10-60 | |
| National instruments c-DAQ 9171 | National Instruments, Austin, TX | NI cDAQ™-9171 | |
| One piece acrylic light guide | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| pH 4 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5024 | |
| pH 8 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5060 | |
| Phosphate Buffer Solution | MP Biomedicals, Irvine, CA. USA | 2810305 | |
| Photo multiplier tubes Model P25PC-16 | SensTech, Surrey, UK | Model P25PC-16 | |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ATCC 25923 | |
| Tryptic Soy Agar | Teknova, Hollister, CA, USA | T0520 | |
| Tryptic Soy Broth | EMD Millipore, Burlington, MA, USA | 1005255000 | |
| X-ray source-iMOXS | Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany | ||
| X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel | Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA | LTS300 and LTS150 |
References
- Arciola, C. R., Alvi, F. I., An, Y. H., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infection and infection resistant materials: A mini review. International Journal of Artificial Organs. 28 (11), 1119-1125 (2005).
- Renick, P., Tang, L. Device-related infections. Racing for the Surface. Li, B., Moriarty, T. F., Webster, T., Xing, M. , Springer International Publishing. Cham. 171-188 (2020).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J.
- Metsemakers, W. J., et al. Fracture-related infection: A consensus on definition from an international expert group. Injury. 49 (3), 505-510 (2018).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infections: Adhesion, biofilm formation and immune evasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (7), 397-409 (2018).
- Polvoy, I., Flavell, R. R., Rosenberg, O. S., Ohliger, M. A., Wilson, D. M. Nuclear Imaging of Bacterial Infection: The State of the Art and Future Directions. Journal of Nuclear Medicine. 61 (12), 1708-1716 (2020).
- vander Bruggen, W., Bleeker-Rovers, C. P., Boerman, O. C., Gotthardt, M., Oyen, W. J. G. PET and SPECT in Osteomyelitis and Prosthetic Bone and Joint Infections: A Systematic Review. Seminars in Nuclear Medicine. 40 (1), 3-15 (2010).
- Trampuz, A., Zimmerli, W. Diagnosis and Treatment of infections associated with fracture-fixation devices. Injury. 37 (2), 59-66 (2006).
- Ady, J., Fong, Y. Imaging for infection: From visualization of inflammation to visualization of microbes. Surgical Infections. 15 (6), 700-707 (2014).
- Truong-Bolduc, Q. C., et al. Implication of the NorB Efflux pump in the adaptation of Staphylococcus Aureus to growth at acid pH and in resistance to Moxifloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3214-3219 (2011).
- Hengge-Aronis, R. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the σS (RpoS) subunit of RNA polymerase. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 373-395 (2002).
- Gao, R., Yan, D. Molecular phosphors for x-ray detection. Science Bulletin. 67 (10), 1015-1017 (2022).
- Gao, R., Fang, X., Yan, D. Recent developments in stimuli-responsive luminescent films. Journal of Materials Chemistry C. 7 (12), 3399-3412 (2019).
- Uzair, U., et al. Conformal coating of orthopedic plates with x-ray scintillators and ph indicators for x-ray excited luminescence chemical imaging through tissue. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (47), 52343-52353 (2020).
- Uzair, U., Benza, D., Behrend, C. J., Anker, J. N. Noninvasively imaging pH at the surface of implanted orthopedic devices with x-ray excited luminescence chemical imaging. ACS Sensors. 4 (9), 2367-2374 (2019).
- Begot, C., Desnier, I., Daudin, J. D., Labadie, J. C., Lebert, A. Recommendations for calculating growth parameters by optical density measurements. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 225-232 (1996).
- Giering, K., Minet, O., Lamprecht, I., Müller, G. Review of thermal properties of biological tissues. Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering. , 45-65 (1995).
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Pogue, B. W., Leblond, F., Krishnaswamy, V., Paulsen, K. D. Radiologic and Near-Infrared/Optical Spectroscopic Imaging: Where Is the Synergy. American Journal of Roentgenology. 195 (2), 321-332 (2010).
- Ryan, S. G., et al. Imaging of X-ray-excited emissions from quantum dots and biological tissue in whole mouse. Scientific Reports. 9 (1), 19223 (2019).
- Yang, Y., Wang, K. -Z., Yan, D. Ultralong persistent room temperature phosphorescence of metal coordination polymers exhibiting reversible pH-responsive emission. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (24), 15489-15496 (2016).
- Chen, H., Rogalski, M. M., Anker, J. N. Advances in functional X-ray imaging techniques and contrast agents. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (39), 13469 (2012).
- Allan, V. J. M., Macaskie, L. E., Callow, M. E. Development of a pH gradient within a biofilm is dependent upon the limiting nutrient. Biotechnology letters. 21 (5), 407-413 (1999).
- Wang, Z., Deng, H., Chen, L., Xiao, Y., Zhao, F. In situ measurements of dissolved oxygen, pH and redox potential of biocathode microenvironments using microelectrodes. Bioresource Technology. 132, 387-390 (2013).
- Xiao, Y., et al. In situ probing the effect of potentials on the microenvironment of heterotrophic denitrification biofilm with microelectrodes. Chemosphere. 93 (7), 1295-1130 (2013).
- Nakata, E., et al. A novel strategy to design latent ratiometric fluorescent pH probes Based on self-assembled SNARF derivatives. RSC Adv. 2014 (4), 348-357 (2014).
- Villano, D., et al. A fast multislice sequence for 3D MRI-CEST pH. Magnetic Resonance in Medicine. 85 (3), 1335-1349 (2021).
