Summary
Burada, X-ışını uyarılmış lüminesans kimyasal görüntüleme (XELCI) ile implante edilmiş tıbbi cihazların etrafındaki kimyasal bilgilerin yüksek çözünürlüklü optik tespiti için bir protokol sunuyoruz. Bu yeni görüntüleme tekniği, implantla ilişkili enfeksiyon biyokimyasının incelenmesini sağlayan laboratuvarımızda geliştirilmiştir.
Abstract
İmplante edilebilir tıbbi cihazlarla ilişkili mikrobiyal enfeksiyonlar kırık fiksasyon başarısızlığında önemli bir endişe kaynağıdır. Bu tür bir enfeksiyonun erken teşhisi, ikinci bir ameliyat için ekstra bir maliyet olmaksızın antibiyotiklerle başarılı bir eradikasyon sağlayacaktır. Burada, XELCI'yi yüksek X-ışını çözünürlüğüne, implant özgüllüğüne ve implante edilmiş tıbbi cihazların yüzeyine yakın invaziv olmayan görüntü kimyasal konsantrasyonlarına karşı kimyasal duyarlılığa sahip bir teknik olarak tanımlıyoruz. Cihazlar kimyasal olarak raporlanan yüzeylerle kaplanmıştır. Bu kimyasal olarak duyarlı yüzey, implante edilebilir bir tıbbi cihaz üzerine kaplanmış iki katmandan oluşur; izleme için kırmızı ışık yayan bir sintilatör (Gd 2 O2S: Eu) tabakası üzerine kaplanan pH'a duyarlı bir tabaka (bromoktimol mavisi veya bromokresolyeşili dahil hidrojel). Odaklanmış bir X-ışını ışını implant üzerindeki bir noktayı ışınlar ve sintilatör tarafından üretilen kırmızı ışık (620 nm ve 700 nm pik noktaları ile), pH'a bağlı olarak spektral oranı değiştiren algılama tabakasından iletilir. X-ışını ışınının implant boyunca taranması ve dokudan noktadan noktaya geçen ışığın spektral oranının ölçülmesiyle bir görüntü oluşturulur. Bu görüntüleme tekniğini, daha önce femur kemiğinin kemik yüzeyinde implantla ilişkili enfeksiyonları modifiye edilebilir bir implante plaka sensörü ile izlemek için kullandık. Şimdi tibial intramedüller çubuk enfeksiyonlarından kaynaklanan pH değişikliklerini inceliyoruz. Pilot öncesi tavşan çalışmalarında iki farklı tipte intramedüller çubuk tasarımı kullanılmıştır ve XELCI tekniğinin sadece kemik yüzeyinde değil, kemik içinde de meydana gelen kimyasal değişiklikleri izlemek için kullanılabileceğini öğrendik. Böylece, bu, implantla ilişkili enfeksiyon biyokimyasını incelemek için invaziv olmayan, yüksek uzamsal çözünürlük, düşük arka plan yerel pH görüntülemeyi mümkün kılar.
Introduction
Amerika Birleşik Devletleri'nde, yılda yaklaşık 2 milyon kırık fiksasyon cihazı yerleştirilmektedir ve bunların% 5-10'u implantla ilişkili enfeksiyonlara yol açmaktadır1. Bu enfeksiyonların, biyofilmlerin heterojenliği ve antibiyotiğe dirençli doğası nedeniyle daha sonraki aşamalarda antibiyotiklerle tedavi edilmesi daha zordur 2,3. Erken teşhis edilirse, enfeksiyonlar, tedavi edilen kırık bölgesinde donanımın değiştirilmesi için ikinci bir ameliyat için ekstra tıbbi maliyetleri önlemek için antibiyotikler ve cerrahi debridman ile tedavi edilebilir. Düz radyografi ve diğer ileri radyografik teknikler ortopedik implant ile ilişkili enfeksiyonların, kaynamaların ve buna bağlı komplikasyonların tanısında uygulanmaktadır. Bu teknikler ortopedik implantta çevre kemik ve dokunun yapısal bilgilerini elde etmek için sıklıkla kullanılsa da, spesifik ortamda biyokimyasal bilgi sağlayamamaktadır. Bu nedenle, implant bölgesinde invaziv olmayan biyokimyasal bilgilerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için yeni bir X-ışını uyarılmış lüminesans kimyasal görüntüleme (XELCI) tekniği geliştirdik. Ortopedik implantla ilişkili enfeksiyonların teşhisi genellikle bir veya farklı araçların bir kombinasyonu ile gerçekleştirilir. Klinik gözlemler (ağrı, şişlik, kızarıklık, yara akıntısı vb.) enfeksiyonun ilk belirtilerini göstermektedir. Daha sonra, kemik iyileşmesinin ilerlemesinin başarısızlığını doğrulamak ve patojenik organizmayı tanımlamak için radyolojik ve laboratuvar deneyleri yapılır 4,5. Bilgisayarlı tomografi (BT), manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi nükleer tıbbi teknikler ve Tek Foton Emisyon Bilgisayarlı Tomografi (SPECT) ve Pozitron Emisyon Tomografisi (PET) gibi radyonükleotid yöntemleri, enfekte implantın ve ilişkili enfeksiyonun daha iyi görüntülenmesi için kullanılmaktadır 6,7. BT ve MRG, sırasıyla kemik nekrozunu ve yumuşak doku anormalliklerini belirlemede avantajlıdır, ancak metal implantlara yakın mesafede parazitlere neden olur8. İn vivo görüntüleme kontrast maddeleri gibi radyoizotop etiketli analitlerle kombinasyon halinde SPECT ve PET gibi farklı X-ışını metodolojileri, implantla ilişkili osteomiyelit2'yi teşhis etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mevcut uygulamalar, anatomik bilgi üretmek için hem BT taramasından hem de SPECT veya PET'ten gelen etiketleme verilerini birleştirir9. Bu görüntüleme yöntemlerinden bir veya daha fazlası enfeksiyon tanısına yardımcı olmak için kullanılmasına rağmen, ekstra tıbbi ve cerrahi masraflardan kaçınmak için antibiyotiklerle tedavileri başlatmak için enfeksiyonla ilişkili pH varyasyonlarını erken tespit edemezler.
İmplantla ilişkili enfeksiyonları izlemek için bu çalışmada kullanılan görüntüleme sistemini kullanmanın temel avantajı, biyofilm mikroçevresi hakkındaki biyokimyasal bilgileri spektral bir referansla ortaya çıkarma yeteneğidir. Ana odak noktası enfekte bölgedeki pH'ı görüntülemek ve haritalamak olsa da, bu yöntem implantla ilişkili enfeksiyonlara özgü diğer biyobelirteçleri izlemek için değiştirilebilir. Böylece, XELCI enfeksiyonun patofizyolojisinin anlaşılmasını sağlar. Yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntüleme, enfeksiyon büyüdükçe heterojenliğin haritalandırılmasını sağlar. Biyofilm oluşumunun meydana geldiği yüzeydeki pH, biyokimyasal değişiklikleri anlamak için çok önemlidir. Ayrıca, bakterilerin antibiyotiğe bağlı stres tepkileri nedeniyle diğer mikro çevre değişiklikleri de ortaya çıkabilir10,11. Yüzeye özgü ve yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntüleme sayesinde, biyofilm mikroortamı üzerindeki antibiyotik etkisi izlenebilir. Bu teknik, hedeflenen ilaç dağıtım deneyleri için biyofilm ortamını incelemek için de kullanılabilir. Hedeflenen düşük pH'lı ilaç salınımını veya pH'ı yükseltmeyi, daha yüksek pH'ta çalışmaya daha duyarlı hale getirmek için inceleyebiliriz.
Bu görüntüleme tekniğinin üç spesifik özelliği X-ışını çözünürlüğü, İmplant yüzey özgüllüğü ve kimyasal duyarlılıktır (Şekil 1A). Bu özellikler, ortopedik implantla ilişkili enfeksiyonların görüntülenmesinde mevcut görüntüleme teknikleri ile karşılaştırılabilir (Şekil 1B). X-ışınları ile ışınlandıktan sonra, implant yüzeyinde kaplanan fosfor parçacıkları, birkaç santimetre dokudan (biraz zayıflama olsa da) nüfuz edebilen kırmızı ve IR'ye yakın (NIR) ışık üretir12,13. Tablo 1, geliştirilen görüntüleme sisteminin bazı özelliklerini, biyofilmlerde veya doku yoluyla pH ölçmek için kullanılan diğer yollara kıyasla göstermektedir.
XELCI, Şekil 2'de gösterildiği gibi, X-ışını uyarımı ile kombinasyon halinde implante edilmiş tıbbi cihazların yakınında optik olarak yüksek uzamsal çözünürlüklü kimyasal bilgi elde etmek için yeni bir görüntüleme tekniğidir. Burada X-ışını uyarılabilir fosfor parçacıklarının seçici uyarılması ve optik tespiti kullanılır. İmplant, bir sintilatör parçacık tabakası üzerine pH'a duyarlı bir boya içeren polimer tabaka olmak üzere iki katmanla kaplanmıştır. Bir dizi odaklanmış X-ışını ışını implantı ışınladığında, sintilatör tabakası görünür ışık üretir (620 nm ve 700 nm). Üretilen bu ışık, çevredeki ortamın pH'ına bağlı olarak lüminesans spektrumunu modüle eden pH'a duyarlı tabakadan geçer. Düşük pH genellikle enfeksiyon ve biyofilm oluşumu ile ilişkilidir; Enfeksiyon ilerledikçe, pH fizyolojik pH'tan (pH 7.2) asidik (pH 7'den az) olarak değişir ve sensördeki pH boyası renk ve dolayısıyla emilim değiştirir. Lüminesans spektrumunun varyasyonu, pH 7 ve pH 4'te Bromokresol yeşil pH boyası için Şekil 2E'de gösterilmiştir. Doku ve kemik yoluyla iletilen ışık toplanır ve spektral oran pH'ı belirler. Bir pH görüntüsü oluşturmak için, odaklanmış X-ışını ışını, sintilatör filmindeki bir seferde bir noktayı ışınlar ve ışını numune boyunca nokta nokta tarar. Daha önce, bu teknik ortopedik implantların yüzeyindeki pH varyasyonunu görüntülemek için uygulandı14,15 ve intramedüller kanaldaki pH varyasyonlarını kemik ve doku yoluyla izlemek için test edildi.
Aşağıdaki Şekil 3 , görüntüleme sisteminin bir şemasını göstermektedir. Görüntüleme sisteminin temel bileşenleri, poli kılcal optiklere sahip X-ışını uyarma kaynağı, iki fotoçarpan tüpüne bağlanan tek parçalı akrilik ışık kılavuzu, x, y ve z motorlu aşama (30 cm x 15 cm x 6 cm hareket) ve veri toplama için bağlanan bilgisayardır. X-ışını kaynağı, x,y,z aşaması ve toplama optikleri (dirsek, ışık kılavuzu, fotoçarpan tüpleri (PMT'ler)) X-ışını geçirmez muhafaza içindeyken, X-ışını kontrolörü, PMT'ler için güç kaynağı, veri toplama (DAQ) kartına bağlı fonksiyon üreteci ve bilgisayar dışarıda tutulur. Muhafaza ile kapının önü arasına yerleştirilen normalde açık anahtar olan bir basmalı düğme, bir kilitleme görevi görür. Kapı tamamen kapalı değilse (kilitleme anahtarı açıksa), X-ışını kaynağı açılmaz ve çalışma sırasında açılırsa X-ışını kaynağını otomatik olarak kapatır. Motorlar sürekli bir tarama yapabilir ve herhangi bir ayrı konuma taşınabilir. Y ekseni için tarama hızı genellikle 1-5 mm / s iken, x eksenindeki adım boyutu tipik olarak 150-2000 μm arasında seçilebilir. Parametreler, gerekli uzamsal çözünürlüğe bağlı olarak seçilebilir. Pozlama süreleri bile sürekli tarama boyunca tutarlı bir hız ile doğrulanır.
Odaklanmış X-ışını ışını, X-ışını lüminesans parçacıkları üzerinde ışınlandıktan sonra, üretilen ışık, çevreleyen pH'a bağlı olarak ışığı modüle ederek pH'a duyarlı filmden geçecektir. İletilen ışık bir doku ile etkileşime girer (kısmen saçılır ve emilir), doku kalınlığı arttıkça saçılma ve emilim yoluyla ışık zayıflaması artar. Koleksiyon optikleri, başlangıçta yansıtıcı bir alüminyum dirsek (90° büküm ve cilalı yansıtıcı iç yüzeye sahip) ile donatılmış tek parçalı çatallı akrilik ışık kılavuzu içerir. Bu, ışık ışık kılavuzuna ulaşır ulaşmaz ışığın toplanmasını sağlamak içindir. Bu eklemeler ışık toplama verimliliğini önemli ölçüde artırdı. Daha fazla ayrıntı için, Şekil 4 dirsek ve ışık kılavuzunun makine çizimlerini göstermektedir. 90° dirsek alüminyumdan işlendi ve iç yüzey ayna kaplamasına cilalandı ve ışık kılavuzu Akrilik ile işlendi. Ayrıca, yalnızca kırmızı ışığın geçmesini sağlamak için dirseğin başına geniş aralıklı uzun geçişli mavi ışık filtresi (350-450 nm ışığı engelleyen) taktık. Tek parçalı akrilik ışık kılavuzunun ucu, iki farklı PMT'ye yol açan iki akışa bölünür. PMT'ler, PMT'leri ~ 5 ° C'ye soğutmak için bir termoelektrik soğutucu ile temas halinde olan küçük, ışık geçirmez bir metal kutu içine alınmıştır. PMT'lerden birinin başında, yalnızca 700 nm ışığı ölçmek için dar aralıklı bir uzun geçirgen filtre (570-640 nm ışığı engelleyen ve 640-740 nm ışığı geçiren) takılıdır. Bu nedenle, 620 nm ve 700 nm ışık ayrı ayrı hesaplanabilir. PMT'ler foton sayma modunda ayarlanır ve tespit edilen her foton için transistör-transistör mantığı (TTL) darbeleri üretirler. Bir DAQ sistemi, USB iletişimini kullanarak darbeleri (doygunluk noktası saniyede 20 milyon darbe) sayar. Veriler işlendikten sonra iki ayrı yoğunluk haritası oluşturulur ve sinyal dalga boyu yoğunluğunun (620 nm) referans dalga boyu yoğunluğuna (700 nm) oranı dikkate alınarak nihai bir görüntü oluşturulur. Bu oran, toplama optiklerinin konumuna, X-ışını ışınlama yoğunluğuna ve doku kalınlığına büyük ölçüde bağlı olan toplam ışık toplama verimliliğindeki farklılıkları açıklar. Ek olarak, herhangi bir pH indikatör boyası olmadan uzamsal olarak ayrılmış bir referans bölgesi, dalga boyuna bağlı doku penetrasyonundan spektral bozulmayı açıklar. Görüntüleme sistemini kontrol etmek için grafik tabanlı bir programlama dili kullanılır ve işlemin temel bir akış şeması aşağıda gösterilmiştir. Bilgisayar, X-ışını denetleyicisi ve DAQ ünitesi hariç görüntüleme kurulumu, radyasyona maruz kalmayı en aza indirmek için güvenli bir X-ışını muhafazası içine alınmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu prosedür, Clemson Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan hayvan kullanım protokollerini takip eder. Deneyler, Clemson Üniversitesi Biyogüvenlik Komitesi (IBC) ve radyasyon güvenliği komitesine (RSC) göre ve ayrıca ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilir.
NOT: Bir XELCI taramasını tamamlamanın akış diyagramı aşağıda Şekil 5'te gösterilmiştir ve ardından görüntüleme prosedürünün ayrıntılı bir adım adım açıklaması verilmiştir.
1. Sistemi başlatın ve düz bir radyografi edinin
- PMT soğutucuyu açın, ayar noktasına ulaşmak genellikle ~ 15 dakika sürer (örneğin, 4 ° C). PMT'leri açmadan önce başlatma adımlarının geri kalanını gerçekleştirin.
- Görüntüleme sistemi kontrol yazılımını açın. Kontrol yazılımı programı, x-y-z ekseni motorlu aşamasını haberleştirir ve başlatır. Sahne alanı x eksenini ve y eksenini istenen başlangıç konumuna getirin.
- Örneği hareketli x-y-z sahne alanına yerleştirin. X-ışını kaynağını ve/veya sahneyi yükselterek veya alçaltarak numune yüksekliğini (z ekseni) radyolüminesan cihaz polikapiler odak optiklerinin 5-5,5 cm altına yerleştirin. Ayrıca, örneği lazer çapraz kafasının yardımıyla x-y düzleminde konumlandırın (X-ışını odaklama kılcal damarına tutturulmuş ve çizgilerin X-ışınının odaklanacağı yerde kesişmesi için birbirine 90 ° 'de yerleştirilmiş iki kırmızı çizgi şeklindeki lazer işaretçisi). X-ışınları ve PMT'ler açılmadan önce lazerleri kapatın.
- Basmalı düğme kilidini görüntüleme muhafazasının ön kapısına sabitleyin. Işın kaynağının gücünü açın. Numunenin düz radyografisini elde etmek için odaklama optiklerini çıkarın.
- X-ışını kontrol yazılımını açın ve X-ışını gücünü ayarlayın (voltajı ve akımı ayarlayarak). X-ışını deklanşörünü X-ışını kontrol yazılımı ile açın.
- X-ray kamera için yazılımı açın. Düz radyografiyi almak için pozlama düğmesine basın. Pozlamayı kapatın ve röntgeni kapatın.
NOT: Gerekirse, numune konumunu iyileştirmek için numuneyi hareket ettirin veya farklı pozisyonlarda bir dizi X-ışını elde edin, böylece daha büyük bir radyografi görünümü elde etmek için harmanlanabilirler. Ayrı bir sistemde bir radyografi de elde edilebilir, ancak örnek hareket ederse XELCI ve radyografi arasında ortak kayıt daha zor hale gelir. - Kasa kapağını açın.
2. İsteğe bağlı olarak, X-ışını kapalıyken bir arka plan taraması gerçekleştirin
- Polikapiler optikleri tekrar X-ışını kaynağına bağlayın.
- Kasayı kapatın ve kilidi sabitleyin. PMT güç kaynağını açın.
NOT: PMT güç kaynağı, ışığa aşırı maruz kalmayı önlemek için kapı açıkken veya açılmak üzereyken daima kapatılmalıdır. - Görüntüleme sistemi kontrol yazılımını açın ve adım boyutunu, tarama hızını ve tarama alanını belirtin. Tüm parametreler ayarlandıktan sonra, Çalıştır düğmesine basarak taramayı başlatın.
NOT: Yüksek çözünürlüklü bir tarama için adım boyutu 1000 μm ve düşük çözünürlüklü bir tarama için adım boyutu 250 μm olacaktır. Tarama hızı 5 mm/s ile 1 mm/s arasında seçilebilir. Tarama alanı, numunenin boyutlarına bağlıdır. - Numune dışında muhafazada bulunan herhangi bir ışıktan gelen karanlık sayıları belirlemek için X-ışını kapalıyken bir arka plan taraması yapın.
3. X-ışını açıkken bir numune taraması gerçekleştirin
- Taramaya başlamak için lazer çapraz kafa ile numunenin hala doğru konumda olduğundan emin olun.
- Kasayı kapatın ve kilidi sabitleyin. PMT'ler kapalıysa (örneğin, kapıyı açmadan önce kapalıysa), PMT güç kaynağını açın.
- Görüntüleme sistemi kontrol yazılımını açın. Adım boyutu, tarama hızı ve tarama alanı değerlerini girin. Tüm parametreler ayarlandıktan sonra, taramayı başlatmak için Çalıştır düğmesine basın.
NOT: Yüksek çözünürlüklü bir tarama için adım boyutu 1000 μm ve düşük çözünürlüklü bir tarama için adım boyutu 250 μm olacaktır. Tarama hızı 5 mm/s ile 1 mm/s arasında seçilebilir. Tarama alanı, numunenin boyutlarına bağlıdır. - X-ışını açıkken numune taramasını alın.
- İlk olarak, hedefin ön görüntüsünü elde etmek için düşük çözünürlüklü taramayı daha büyük adım boyutları ve daha yüksek tarama hızı ile gerçekleştirin. Numunenin istenen alanının düşük çözünürlüklü bir taramasını elde ettikten sonra, daha küçük bir adım boyutu ve daha düşük tarama hızı ile daha yüksek çözünürlüklü taramayı elde edin.
- Kapıyı açmadan önce PMT güç kaynağını kapatın.
4. Görüntünün oluşturulması
- Geçerli taramanın hedefin ilgi alanını görüntülediğini doğrulayın. Değilse, Durdur (Stop ) düğmesine basarak geçerli taramayı durdurun.
- Kontrol yazılımındaki tarama konumlarını tekrar ayarlayın ve Çalıştır düğmesine tekrar basın.
NOT: Y ekseni, taramanın ilk satırından başlayarak sürekli olarak kaydedilir. Bir tarama yapılırken, her dalga boyu başına sayım sayısı ve son güncellenen motor konumundan bu yana geçen süre kaydedilir. Kaydedilen süre, motor hızındaki herhangi bir değişikliği, dolayısıyla maruz kalma süresini hesaba katacaktır. Her piksel için sayı/saniye normalleştirilir. Y ekseni motoru, y ekseninin mevcut satırının sonunu taramak için hareket eder ve motor başlangıç konumuna geri döner. Daha sonra x ekseni motoru, konumunu kullanıcı tarafından tanımlanan bir adım boyutuyla artırır ve y ekseninin ikinci satırını tarar. Bu işlem, x ekseni motoru x yönü için belirtilen genişliğe ulaşana kadar çevrimlenir. Kullanıcı tarama boyutunu, motor hızını ve motor çalıştırma konumlarını kontrol edebilir. Adım boyutu, y ekseninin son görüntüsündeki piksellerin boyutunu belirler.
5. Steril koşullarda görüntüleme için bakteri kültürü (Bakteri yetiştiren sensörler görüntüleniyorsa)
- Yeni bir Staphylococcus aureus 1945 (ATCC 25923) kültürü hazırlamak için, 5 mL steril Triptik Soya Suyu (TSB) aşılamak için 1 hafta içinde çizgilenmiş bir TSA (Triptik soya agar) plakasından bir koloni kullanın.
- Bakteri kültürünü 37 ° C'de durağan faza kadar 16-18 saat boyunca hafifçe çalkalayın.
- Daha sonra, kültürü TSB'den oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüjleme yoluyla pelet edin ve peletleri Fosfat Tampon Çözeltisi (PBS) ile iki kez yıkayın ve peletleri 5 mL steril PBS'de yeniden askıya alın.
- Beer-Lambert yasasının doğrulandığı OD aralığı olan doğrusal aralığı kullanarak 600 nm'de optik yoğunluğu kullanarak bakteri konsantrasyonunu ölçün (OD = kN; k , moleküler yok oluşa ve optik yolun uzunluğuna göre bir katsayıdır, N , bakteri konsantrasyonudur)16. Daha sonra steril PBS kullanarak numuneyi 105 hücre/mL'ye seyreltin.
- Triptik Soya Agarını (TSA) otoklavlayarak sterilize edin ve daha sonra sıcaklık 45 ° C'ye ulaşana kadar karıştırarak soğutun. Bakterileri TSA'ya aşılayın.
- Seyreltilmiş bakteri kültürünü (100 μL) implante edilebilir sensörün yüzeyine pipetleyin.
NOT: İmplantlar 5 dakika süreyle %70 etanol içine daldırılarak sterilize edildi ve steril PBS'de saklandı. - Kontrol olarak başka bir steril implant üzerinde 100 μL aşılanmamış TSA pipet
- İmplantasyondan önce 48 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilmeden önce implante edilebilir sensör üzerine ilave 100 μL aşılanmamış TSA ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir ön çalışma olarak, intramedüller çubuk sensörünü bir tavşan kadavra14'ün raybalı tibiasında görüntüledik. Sensörün üç ayrı bölgesi vardır: referans bölgesi, pH 8 bölgesi (bazik pH) ve pH 4 bölgesi (asidik pH). Referans bölge, pürüzlü epoksi film içine dahiledilen sintilatör (Gd 2 O2S: Eu) parçacığıdır. Ayırt edici asidik ve bazik pH bölgeleri, intramedüller kanal içindeki enfekte olmuş ve enfekte olmayan durumları temsil eder (Şekil 6A, B)14.
Taramayı tamamladıktan sonra, MATLAB'da sırasıyla 620 nm, 700 nm ve orandaki görüntüler (Şekil 7A-C) oluşturulmuştur. Renkteki değişiklikler pH'daki değişikliklerin göstergesidir. Temel pH bölgesindeki bromothymol mavisi, yayılan ışığı asidik pH bölgesinden önemli ölçüde emdiğinden, düşük pH bölgesi 620 nm'de daha parlak bir sinyal olarak görünür. 700 nm'deki sintilatör emisyonu, sintilatör filmindeki tutarsızlıklar, doku bileşimi değişiklikleri ve taramadan taramaya algılama optiklerinin konumunda meydana gelen değişiklikler için spektral bir referans olarak işlev görür.
Şekil 1: XELCI görüntülemenin mevcut tekniklerle karşılaştırıldığında spesifik özellikleri (A) Temel özellikler; (B) Mevcut görüntüleme teknikleri ile karşılaştırma. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tekniğin çalışma prensibi ve enfeksiyonlu ve enfeksiyonsuz sensör davranışı. (A) Tespit için toplanan odaklanmış X-ışını ışını ve lüminesans ile ışınlanmış implantı gösteren şematik; (B) Sintilatör ve pH'a duyarlı film kaplı intramedüller çubuk sensörünün yakınlaştırılmış görünümü; (C) Enfeksiyonun neden olduğu düşük pH'ta, intramedüller çubuk sensörü maviden sarıya dönerken, boyasız referans bölgesi değişmez; (D) Bir enfeksiyon sırasında intramedüller çubuğun yakınlaştırılmış görünümü; (E) pH 7 ve pH 4'te epoksi-PEG pH sensör filminin (%10 PEG hidrojel, Bromocresol Green pH boyası içeren, Gd 2,O,2, S:Eu sintilatör parçacıkları içeren epoksi filmin üzerine kaplanmış) ve pH göstergesi PEG hidrojeli olmayan epoksi-sintilatör tabakasında gösterilen spektrumlar. Bu rakam Uzair ve ark.14'ün izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Görüntüleme sistemi. (A) Şematik diyagram (kırmızı oklar ışığın PMT'lere doğru yönünü gösterir); (B) gerçek sistemin bir fotoğrafı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Boyutları gösteren bilgisayar destekli tasarım yazılımı çizimleri . (A) 90° dirseğin çizimi (B) Tek parça akrilik ışık kılavuzunun çizimi. (Tüm boyutlar mm cinsindendir) Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Görüntüleme prosedürünün akış şeması Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 6: Bir tavşan kadavranının raybalı tibiasındaki intramedüller çubuk sensörü. (A) Gd2O2S:EU ile kaplanmış paslanmaz çelik çubuk, epoksi ve pH'a duyarlı Akrilamid-PEG jel içerir; (B) tavşan tibiasındaki delinmiş deliğe yerleştirilmiş kaplamalı paslanmaz - çelik çubuk. Bu rakam Uzair ve ark.14'ün izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: İntramedüller kanaldaki çubuk sensörünün görüntüleri. (A) 620 nm dalga boyu için analiz edilen görüntü; (B) 700 nm dalga boyu için analiz edilen görüntü; (C) analiz edilen Oran görüntüsü (620/700); (D) çubuk sensörünün düz radyografisi; (E) üst üste bindirilmiş oran görüntüsü ve düz radyografi. Bu rakam Uzair ve ark.14'ün izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Yüzeye özel görüntüleme | Denge/dengesizlik | Doku boyunca yüksek çözünürlük | İyonlaştırıcı radyasyon | X-ışını kolayca üst üste bindirilir | Temsilci referansları | |
| pH mikroelektrot | Evet, her seferinde bir nokta | dengesizlik, (Nernst Denklemi) kirlenme ve zaman sürüklenmesine neden olabilir | Evet, her seferinde bir nokta | Hayır | Hayır | 23-25 |
| Floresan pH göstergeleri | Evet | Denge | Hayır | Hayır | Hayır | 18,26 |
| MRG (CEST) | Evet | Denge | 3D ama yavaş | Hayır | Hayır | 27 |
| XELCI | Evet | Denge | Evet | Evet | Evet | 14,15,22 |
Tablo 1: XELCI'nin diğer pH görüntüleme tekniklerine göre özellikleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Osteomiyelit ve sekonder cerrahi prosedürlerden kaynaklanan komplikasyonları önlemek için ortopedik implantla ilişkili enfeksiyonları erken tespit edebilmek ve inceleyebilmek için, XELCI'yi yeni, fonksiyonel bir görüntüleme tekniği olarak tanıttık. Doku yoluyla pH izleme için şu anda mevcut olan tekniklerle karşılaştırılabilir.
Numuneyi görüntüleme için konumlandırırken, dirseği tam olarak altına hizalamak için 90° açıyla kesişen iki çizgi şeklindeki lazer işaretçisi ile polikapiler odaklama optiklerine bağlı bir lazer çapraz kafa kullanıyoruz. Bu lazerler, sintilatörler tarafından üretilen ışık dışında dedektöre ulaşan istenmeyen ışığı ortadan kaldırmak için taramaya başlamadan önce kapatılmalıdır. Mesafe açısından, kullanıcı deneye başlamadan önce odaklama optiğinin ucundan numunenin tepesine kadar olan mesafeyi yaklaşık 5-5,5 cm olacak şekilde ölçer. Bu, X-ışını kaynağını manuel olarak yükselterek veya sahneyi yukarı ve aşağı hareket ettirerek sağlanabilir. Aynı prosedür, canlı bir hayvan veya doku yoluyla ölçüm için de kullanılır, ancak hayvanı anestezi altına alırız ve uykuda olduğundan emin olmak için bir izofluran gaz tüpü çalıştırırız. Sıcaklığını ve nabzını periyodik olarak izliyoruz ve hayvan anatomisini, özellikle de açıyı düzgün bir şekilde konumlandırmak için ek yatak takımları ve bant ekliyoruz ve 5-5.5 cm odak pozisyonunun sadece cildin üst yüzeyine olan mesafeyi kullanmak yerine implantın derinliği olduğunu tahmin ediyoruz. Genellikle doğru yeri sağlamak için düz bir X-ışını görüntüsü veya kaba tarama yapılır ve daha sonra aynı noktada çekilen kimyasal XELCI görüntüsü ile üst üste bindirilir. Doku ile kaplı olmayan sensörler için, PMT'lerin doymadığından emin olmak için X-ışını kaynağı akımı genellikle 50 kV'de maksimum 600 μA'dan 15 μA'ya kadar düşürülür. X-ışını kaynağı ve durumu, Clemson Üniversitesi Radyasyon Güvenliği tarafından periyodik olarak izlenir. X-ray kontrol cihazının anahtarı yalnızca XELCI kullanıcıları tarafından kullanılır ve yanlışlıkla açılıp kapanmayı önlemek için her zaman uzak tutulur. Ayrıca, muhafazanın ön kapısındaki basmalı düğme kilidi, X-ışınını açmadan önce dikkatlice sabitlenmelidir. Kilitleme düzgün çalışmıyorsa, kullanıcı X-ışınını açamaz ve hatalar üretir. Deney boyunca, X-ışını açıkken, herkesi X-ışınının çalıştığı konusunda uyarmak için turuncu bir ışık yanar.
Genellikle hem düşük çözünürlüklü tarama hem de yüksek çözünürlüklü tarama çalıştırılır. Düşük çözünürlüklü tarama daha büyük bir adım boyutuna sahiptir ve yüksek çözünürlüklü tarama daha küçük bir adım boyutuna sahiptir. Bir tarama için geçen süre büyük ölçüde üç faktöre bağlıdır: adım boyutu, taramanın hızı ve taramanın alanı. Örneğin, 15 mm x 15 mm'lik bir alanın, 1 mm/sn yavaş tarama hızında ve 200 μm adım boyutunda yüksek çözünürlüklü bir görüntü için taranması ~20 dakika sürer. Aynı alanı daha düşük çözünürlükte ve daha hızlı tarama hızında taramak süreyi azaltır (ör. 1 mm adım boyutu ve 5 mm/sn hız yaklaşık 1 dakika sürer). Hayvanı veya numuneyi düzgün bir şekilde kurmak ve konumlandırmak ve implantın nerede bulunduğunu belirtmek için taramadan önce ek zamana ihtiyaç vardır. Hayvan deneyleri için, anestezi sırasında sıcaklığın çok fazla düşmemesini sağlamak için vücut ısısı izlenir. Bu çalışmada kullanılan tarama için X-ışını dozu küçük olduğu için X-ışını radyasyonundan ısıtma ihmal edilebilir. 1 Gy = 1 J / kg lokal X-ışını dozu ve kas17 için 3.45 kJ / kg K ısı kapasitesi varsayarsak, radyasyon emiliminden kaynaklanan maksimum sıcaklık artışı bir mK'dan daha az olacaktır
Denklem 1
Q- ısı enerjisi
m- kütle
c- Özgül ısı kapasitesi
ΔT- sıcaklıktaki değişim
Yukarıdaki hesaplamaya göre, sıcaklıktaki artış ihmal edilebilir. Ek olarak, bu küçük sıcaklık artışı bile kan dolaşımı yoluyla hızla dağılacaktır.
PMT'lerin aktif foto katot çapı 22 mm'dir; Bu geniş alan, cildin altındaki geniş bir dağınık alandan ışık yakalamayı kolaylaştırır. Karanlık akımı termal olarak indüklenen elektron emisyonundan azaltmak için, PMT'lerin altındaki soğutucu ile soğumasına izin verilir. Sinyal algılama için iki farklı fotoçarpan tüpüne (PMT) yol açan iki akışa çatallanan tek parçalı bir akrilik ışık kılavuzumuz var. Sistem için yapılan bu iyileştirme, ışık toplama verimliliğini artırmamıza ve böylece kemik ve doku yoluyla sinyalleri tespit etmemize izin verdi. Daha önce bu görüntüleme tekniği ortopedik implantların yüzeyindeki enfeksiyonları izlemek için kullanılıyordu ve pH değişikliklerini14,15 olarak başarıyla görüntüleyebiliyorduk. Tavşan tibiasındaki yaklaşık 2 cm'lik kemik ve doku boyunca modifiye edilmiş bir intramedüller çubuğun yüksek sinyal / gürültü görüntülerini ürettik. Genel olarak, saçılma ve emilim yoluyla ışık zayıflaması, doku kalınlığı ile katlanarak artar. Bu nedenle, görüntülenen doku kalınlığı, X-ışını dozu / tarama süresi ve uzamsal çözünürlük arasında bir denge vardır.
Burada açıklanan bu görüntüleme teknikleri hem implante edilmiş bir probu hem de bir tarayıcıyı içerir. Prob, X-ışınları tarafından ışınlandığında görünür ve NIR ışığı üreten X-ışını sintilatörleri içerir. Işık yoğunluğunu veya spektrumunu etkileyen sintilatör tabakası üzerinde imal edilmiş kimyasal olarak hassas bir tabakaya sahiptir. Bu uygulama için seçilen kimyasal olarak hassas tabaka, 600 nm dalga boyunda pH bağımlı absorbansa ve sintilatör emisyonu (620 nm ve 700 nm) ile örtüşen 700 nm ışıkta neredeyse sabit (pH bağımsız) absorbansa sahip Bromothymol Blue'dur. Bromothymol Blue veya Bromocresol green, pH aralığındabir pK değerine sahiptir, implantla ilişkili enfeksiyonları izlemekle ilgileniyoruz. Bakteriyel biyofilmin pH mikroortamının pH'a duyarlı floresan orantımetrik boya ile analizi sırasında, pH 5.6 (biyofilm içinde) ile pH 7 (çevredeki dökme sıvıda)18 arasında değişebilir. İmplante edilen prob ayrıca, mekansal olarak farklı bir referans bölgesi olarak işlev gören pH'ı gösteren boya içermeyen bir sintilatör tabakasına sahiptir. Dahası, kullandığımız sintilatör parçacıkları ~ 600 nm ve ~ 700 nm dalga boylarında belirgin emisyonlara sahiptir. Yukarıdaki boyaların absorbans spektrumu, Gd2O2S: Eu parçacıklarının emisyon spektrumu ile örtüşür. Hem heyecan verici X-ışınları hem de kırmızı / NIR lüminesans fotonları, doku 19,20,21 boyunca yayılabildikleri için in vivo biyomedikal görüntülemede kullanılır.
Şekil 1 , bu çalışmada kullanılan görüntüleme sisteminin üç spesifik özelliğini göstermektedir: X-ışını çözünürlüğü, kimyasal özgüllük ve implant yüzey özgüllüğü. Bu özellikler SPECT, PET, MRI, US, vb. gibi mevcut görüntüleme teknikleriyle karşılaştırılabilir22. Bu teknikler yüksek çözünürlükte yüksek çözünürlüklü yapısal/anatomik bilgi sağlasa da, bir implant yüzeyindeki kimyasal değişiklikleri haritalayamadık/görüntüleyemedik. Bu teknik, optik indikatör boyalarından kimyasal hassasiyeti kaplamadan implant özgüllüğü ile birleştirir. X-ışınından gelen uzamsal çözünürlük, kemik ve doku yoluyla implant yüzeylerindeki kimyasal konsantrasyonların benzersiz, düşük arka plan ve daha yüksek uzamsal çözünürlükte algılanmasını/haritalanmasını sağlar.
X-ışını uyarılmış lüminesans kimyasal görüntüleme, enfeksiyonları incelemek için yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip bir implant yüzeyindeki yerel kimyasal ortamı incelemek için benzersiz bir yol sağlar. Gelecekte, yaklaşım farklı gösterge boyaları seçerek diğer analitleri izlemek için genelleştirilebilir. Sintilatör parçacıkları ve gösterge boyaları ile kaplanmış enjekte edilmiş veya implante edilmiş tıbbi cihazlar kullanılarak diğer hastalıklar ve durumlar için potansiyel olarak uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını iddia ediyorlar.
Acknowledgments
Yazarlar Clemson Üniversitesi, COMSET ve Clemson SC BioCRAFT'a teşekkür eder. XELCI kurulumu başlangıçta NSF CAREER CHE 12255535 ve daha sonra NIH NIAMS R01 AR070305-01 tarafından geliştirilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 degree elbow | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| Bromo Cresol Green | Sigma-Aldrich | 45ZW10 | |
| Bromo Thymol Blue | Sigma | 76-59-5 | |
| ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate | Pollock industries, White River, VT, USA | TCP 50 | |
| Ethanol | Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051 |
64-17-5 | |
| Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm | Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England | UKL63/N-R1 | |
| LabVIEW | National Instruments, Austin, TX | ||
| Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis) | Motion Control, Smithtown, NY, USA | AT10-60 | |
| National instruments c-DAQ 9171 | National Instruments, Austin, TX | NI cDAQ™-9171 | |
| One piece acrylic light guide | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| pH 4 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5024 | |
| pH 8 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5060 | |
| Phosphate Buffer Solution | MP Biomedicals, Irvine, CA. USA | 2810305 | |
| Photo multiplier tubes Model P25PC-16 | SensTech, Surrey, UK | Model P25PC-16 | |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ATCC 25923 | |
| Tryptic Soy Agar | Teknova, Hollister, CA, USA | T0520 | |
| Tryptic Soy Broth | EMD Millipore, Burlington, MA, USA | 1005255000 | |
| X-ray source-iMOXS | Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany | ||
| X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel | Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA | LTS300 and LTS150 |
References
- Arciola, C. R., Alvi, F. I., An, Y. H., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infection and infection resistant materials: A mini review. International Journal of Artificial Organs. 28 (11), 1119-1125 (2005).
- Renick, P., Tang, L. Device-related infections. Racing for the Surface. Li, B., Moriarty, T. F., Webster, T., Xing, M. , Springer International Publishing. Cham. 171-188 (2020).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J.
- Metsemakers, W. J., et al. Fracture-related infection: A consensus on definition from an international expert group. Injury. 49 (3), 505-510 (2018).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infections: Adhesion, biofilm formation and immune evasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (7), 397-409 (2018).
- Polvoy, I., Flavell, R. R., Rosenberg, O. S., Ohliger, M. A., Wilson, D. M. Nuclear Imaging of Bacterial Infection: The State of the Art and Future Directions. Journal of Nuclear Medicine. 61 (12), 1708-1716 (2020).
- vander Bruggen, W., Bleeker-Rovers, C. P., Boerman, O. C., Gotthardt, M., Oyen, W. J. G. PET and SPECT in Osteomyelitis and Prosthetic Bone and Joint Infections: A Systematic Review. Seminars in Nuclear Medicine. 40 (1), 3-15 (2010).
- Trampuz, A., Zimmerli, W. Diagnosis and Treatment of infections associated with fracture-fixation devices. Injury. 37 (2), 59-66 (2006).
- Ady, J., Fong, Y. Imaging for infection: From visualization of inflammation to visualization of microbes. Surgical Infections. 15 (6), 700-707 (2014).
- Truong-Bolduc, Q. C., et al. Implication of the NorB Efflux pump in the adaptation of Staphylococcus Aureus to growth at acid pH and in resistance to Moxifloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3214-3219 (2011).
- Hengge-Aronis, R. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the σS (RpoS) subunit of RNA polymerase. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 373-395 (2002).
- Gao, R., Yan, D. Molecular phosphors for x-ray detection. Science Bulletin. 67 (10), 1015-1017 (2022).
- Gao, R., Fang, X., Yan, D. Recent developments in stimuli-responsive luminescent films. Journal of Materials Chemistry C. 7 (12), 3399-3412 (2019).
- Uzair, U., et al. Conformal coating of orthopedic plates with x-ray scintillators and ph indicators for x-ray excited luminescence chemical imaging through tissue. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (47), 52343-52353 (2020).
- Uzair, U., Benza, D., Behrend, C. J., Anker, J. N. Noninvasively imaging pH at the surface of implanted orthopedic devices with x-ray excited luminescence chemical imaging. ACS Sensors. 4 (9), 2367-2374 (2019).
- Begot, C., Desnier, I., Daudin, J. D., Labadie, J. C., Lebert, A. Recommendations for calculating growth parameters by optical density measurements. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 225-232 (1996).
- Giering, K., Minet, O., Lamprecht, I., Müller, G. Review of thermal properties of biological tissues. Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering. , 45-65 (1995).
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Pogue, B. W., Leblond, F., Krishnaswamy, V., Paulsen, K. D. Radiologic and Near-Infrared/Optical Spectroscopic Imaging: Where Is the Synergy. American Journal of Roentgenology. 195 (2), 321-332 (2010).
- Ryan, S. G., et al. Imaging of X-ray-excited emissions from quantum dots and biological tissue in whole mouse. Scientific Reports. 9 (1), 19223 (2019).
- Yang, Y., Wang, K. -Z., Yan, D. Ultralong persistent room temperature phosphorescence of metal coordination polymers exhibiting reversible pH-responsive emission. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (24), 15489-15496 (2016).
- Chen, H., Rogalski, M. M., Anker, J. N. Advances in functional X-ray imaging techniques and contrast agents. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (39), 13469 (2012).
- Allan, V. J. M., Macaskie, L. E., Callow, M. E. Development of a pH gradient within a biofilm is dependent upon the limiting nutrient. Biotechnology letters. 21 (5), 407-413 (1999).
- Wang, Z., Deng, H., Chen, L., Xiao, Y., Zhao, F. In situ measurements of dissolved oxygen, pH and redox potential of biocathode microenvironments using microelectrodes. Bioresource Technology. 132, 387-390 (2013).
- Xiao, Y., et al. In situ probing the effect of potentials on the microenvironment of heterotrophic denitrification biofilm with microelectrodes. Chemosphere. 93 (7), 1295-1130 (2013).
- Nakata, E., et al. A novel strategy to design latent ratiometric fluorescent pH probes Based on self-assembled SNARF derivatives. RSC Adv. 2014 (4), 348-357 (2014).
- Villano, D., et al. A fast multislice sequence for 3D MRI-CEST pH. Magnetic Resonance in Medicine. 85 (3), 1335-1349 (2021).
