Automatisierte Analyse intrazellulärer Phänotypen von Salmonellen mit ImageJ

Summary

Salmonellen dringen in intestinale Epithelzellen ein und replizieren sich sowohl in Salmonellen-spezifischen Vakuolen als auch frei im Zytosol (Hyperreplikation). Hier wird ein auf Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie basierendes Protokoll beschrieben, um die intrazellulären Phänotypen von Salmonellen durch zwei komplementäre Bildanalysen durch ImageJ zu quantifizieren, um Einzelzellauflösung und Scoring zu erreichen.

Abstract

Salmonellen sind ein enterischer Erreger, der in das Darmepithel eindringen und sich in Enterozyten vermehren kann, sowohl innerhalb von Salmonellen-spezifischen Vakuolen als auch frei im Zytosol (zytosolische Hyperreplikation). Diese verschiedenen Phänotypen der intrazellulären Replikation treiben zu verschiedenen Wegen der Pathogenese, d.h. zytosolische Hyperreplikation induziert den entzündlichen Zelltod und die Extrusion in das Darmlumen, während die vakuoläre Replikation zu einer Transepithelpenetration und systemischen Ausbreitung führt. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um Mikroskopiewerkzeuge zu entwickeln, um das Verhalten von Salmonellen in eingedrungenen Zellen zu untersuchen, wie das pCHAR-Duo-Fluoreszenzreporterplasmid, das eine Unterscheidung zwischen vakuolären und zytosolischen Bakterien durch differentielle Expression von mCherry und GFP ermöglicht. Intrazelluläre Phänotypen werden jedoch oft manuell bewertet, ein zeitaufwendiges Verfahren, das die Analyse auf eine kleine Anzahl von Proben und Zellen beschränkt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden zwei komplementäre und automatisierte Bildanalysen mit ImageJ, einer frei verfügbaren Bildanalysesoftware, entwickelt. Im Hochdurchsatzprotokoll wurden Epithelzellen mit Salmonellen infiziert, die pCHAR-Duo unter Verwendung von 96-Well-Platten trugen. Die Bildgebung erfolgte mit einem automatisierten Fluoreszenzmikroskop. Anschließend wurden zwei Bildanalysemethoden angewendet, um das intrazelluläre Verhalten von Salmonellen auf verschiedenen Detailebenen zu messen. Die erste Methode misst die gesamte intrazelluläre Bakterienbelastung und das Ausmaß der zytosolischen Hyperreplikation. Es ist schnell und ermöglicht die Bewertung einer hohen Anzahl von Zellen und Proben, wodurch es für Hochdurchsatz-Assays wie Screening-Experimente geeignet ist. Die zweite Methode führt Einzelzellanalysen durch, um den Prozentsatz der infizierten Zellen, die mittlere vakuoläre Belastung von Salmonellen und die zytosolische Hyperreplikationsrate zu bestimmen, die mehr Details über das Verhalten von Salmonellen in Epithelzellen liefern. Die Protokolle können von speziell entwickelten ImageJ-Skripten durchgeführt werden, um automatisch Batch-Analysen der wichtigsten Schritte der Salmonella-Enterozyten-Interaktion durchzuführen.

Introduction

Salmonellen sind der am häufigsten gemeldete bakterielle Erreger, der Ausbrüche lebensmittelbedingter Krankheiten in der Europäischen Union verursacht¹. Die primäre pathologische Manifestation der Salmonelleninfektion ist die Enteritis, die das Ergebnis des Erregerverhaltens im Darm nach der Einnahme und der daraus resultierenden lokalen Entzündungsreaktion ist². Salmonellen können sich jedoch auch an extraintestinalen Stellen ausbreiten und systemische Infektionen verursachen, insbesondere bei immungeschwächten Personen. Die Art der Interaktion zwischen Salmonellen und dem Darmepithel bedingt das Ergebnis der Infektion. Einmal im Darmlumen dringt Salmonella in Darmepithelzellen ein und repliziert sich. Auf intrazellulärer Ebene können Salmonellen zwei verschiedene Replikationsphänotypen aufweisen, die zytosolische Hyperreplikation und die intravakuoläre langsame Replikation innerhalb von Salmonellen-haltigen Vakuolen (SCVs). Die zytosolische Hyperreplikation induziert den entzündlichen Wirtszelltod und die Salmonellenextrusion in das Darmlumen³; Die vakuoläre Replikation führt zu einer Transepithelpenetration und systemischen Ausbreitung⁴. Daher beeinflusst das Ausmaß der Invasion und der vakuolären vs. zytosolischen Replikation den Verlauf der Infektion.

Die Gattung Salmonella ist sehr vielfältig, darunter Tausende von Serotypen mit unterschiedlichen Wirtsbereichen und Fähigkeiten, Krankheiten zu verursachen. Beispiel: S. Typhimurium wird als generalistisches Serovar definiert, da es mehrere nicht verwandte Wirte infiziert und eine der Hauptursachen für menschliche Salmonellose darstellt. Anders, S. Derby gilt als schweineangepasster Serovar, da es meist von den Schweinen isoliert ist, aber es wird auch in den Top fünf der Serovare berichtet, die für die Infektion des Menschen verantwortlich sind¹. Das Wissen über das bakterielle Verhalten innerhalb der Epithelzellen beschränkt sich jedoch im Wesentlichen auf die Untersuchung einiger weniger Referenzstämme, wie S. Typhimurium SL1344, die nicht die große natürliche Vielfalt der Salmonellenpathogenität repräsentieren. Die Charakterisierung der Interaktion verschiedener Salmonellenstämme mit Epithelzellen würde zum Verständnis ihrer unterschiedlichen Pathogenität beitragen. Aus diesem Grund wurde ein auf Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie basierendes Protokoll entwickelt, um das intrazelluläre Verhalten einer großen Anzahl von Stämmen schnell und weitgehend automatisiert zu analysieren. In diesem Protokoll wurde die Infektion von Epithelzellen in 96-Well-Bildgebungsplatten durchgeführt und die Bildaufnahme wurde mit einem automatisierten Fluoreszenzmikroskop durchgeführt. Das pCHAR-Duo-Plasmid wurde verwendet, um die Invasions- und Replikationsphänotypen von Salmonellen in Epithelzellen durch Fluoreszenzmikroskopie zu beobachten⁵. Dieses Plasmid trägt das Gen, das für den rot fluoreszierenden Reporter mCherry kodiert, der konstitutiv von allen transformierten Bakterienzellen exprimiert wird, und das Gen, das für den grün fluoreszierenden Reporter GFP kodiert, dessen Expression durch Glucose-6-phosphat aktiviert wird, das ausschließlich im Zytosol eukaryotischer Zellen vorhanden ist und in SCVs fehlt. Daher ermöglicht das Plasmid die Unterscheidung zwischen vakuolären und zytosolischen Bakterien durch differentielle Expression von mCherry- und GFP-Reportern.

Die vakuolären und zytosolischen Bakterien auf Mikroskopiebildern werden üblicherweise durch manuelles Scoring⁶ quantifiziert, aber dies ist eine zeitaufwändige Methode, die die Analyse auf eine kleine Anzahl von Proben beschränkt. Daher wurden zwei komplementäre und automatisierte Bildanalysen entwickelt - die Flächenanalyse und die Einzelzellanalyse - mit ImageJ⁷, einer frei verfügbaren Bildanalysesoftware. Die Flächenanalyse misst die gesamte intrazelluläre Bakterienlast und das Ausmaß der zytosolischen Hyperreplikation unter Verwendung von Daten von Bereichen, die von Epithelzellen, roten und grünen Salmonellen in jedem aufgenommenen Mikroskopiebild besetzt sind. Diese Methode kann auf Bilder angewendet werden, die bei geringer Vergrößerung aufgenommen wurden. Daher ermöglicht es, eine hohe Anzahl von Epithelzellen mit wenigen Bildern zu bewerten, wodurch die Erfassungszeit verkürzt wird. Die Einzelzellanalyse verwendet die Zellsegmentierung, um den Prozentsatz der infizierten Zellen, die mittlere vakuoläre Belastung und den Prozentsatz der infizierten Zellen zu bestimmen, die eine zytosolische Hyperreplikation mit Einzelzellauflösung durchlaufen.

In diesem Protokoll werden alle Schritte der Bildanalyse detailliert beschrieben, um manuell durchgeführt zu werden, aber die gleiche Analyse kann durch unsere speziell entwickelten ImageJ-Skripte automatisiert werden. Diese Skripte ermöglichen auch die Durchführung von Batch-Analysen, um mehrere Bilder automatisch zu analysieren und so die Ausführung der Methode zu beschleunigen.

Protocol

1. Infektion von Epithelzellen mit Salmonellen , die pCHAR-Duo-Reporterplasmid tragen

HINWEIS: Eine Mehrkanalpipette wird empfohlen.

1. Beschichten Sie 96-Well-Bildplatten mit schwarzen Wänden und flachem Glasboden direkt vor Gebrauch mit Kollagen.
   1. Eisessig (17,4 M) wird in sterilem demineralisiertem Wasser unter einer chemischen Haube verdünnt, um eine 20 mM Essigsäurelösung zu erhalten. Unter sterilen Bedingungen filtrieren Sie die Lösung durch einen Spritzenfilter mit einer Porengröße von 0,2 μm. Die Lösung 5 min in einem 0-4 °C Rack stehen lassen.
   2. Verdünnen Sie 3 mg/ml Kollagenbrühe auf 50 μg/ml in vorgekühlter 20 mM Essigsäurelösung. Mischen Sie durch 10-maliges Invertieren und geben Sie dann 30 μL Kollagenlösung pro Vertiefung (5 μg Kollagen/cm²) ab, wobei Sie die Lösung in einem 0-4 °C Rack aufbewahren, um Kollagengelieren zu vermeiden.
   3. Stellen Sie sicher, dass die Brunnenböden vollständig mit Kollagen bedeckt sind, und lassen Sie die Platte dann 1 h bei Raumtemperatur (RT) unter laminarer Strömung.
   4. Entfernen Sie die Lösung vorsichtig und führen Sie drei Wäschen mit 30 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette mit 100 μL oder 50 μL, um eine Kollagenablösung zu vermeiden.
2. Kultur INT407-Epithelzellen in kollagenbeschichteten Bildgebungsplatten 20-24 h vor der Infektion.
   1. Routinemäßige Kultivierung von INT407-Zellen in 25 cm² Kolben in Minimum Essential Medium mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), im Folgenden als Kulturmedium (CM) bezeichnet, ergänzt mit Penicillin 100 U/ml und Streptomycin 100 μg/ml (Pen/Streptokokken).
   2. Zweimal INT407-Kolben mit 5 ml PBS waschen und dann die Zellen mit 1 ml Trypsin-EDTA-Lösung für 3-5 min bei 37 °C in befeuchteter 5%_{CO2-Atmosphäre} 20-24 h vor der Infektion ablösen. Zählen Sie die Zellen und bereiten Sie eine 3 x 10⁵ Zellen/ml Suspension im CM vor.
   3. Dosieren Sie 100 μL Zellsuspension/Vertiefung in kollagenbeschichteten Bildplatten, um eine 100%ige Konfluenz zu erhalten. Bei 37 °C in befeuchteter 5%_{CO2-Atmosphäre} für 1 h inkubieren, um die Zelladhäsion zu erleichtern. Dann 100 μL CM zugeben und bei 37 °C in befeuchteter 5%_{CO2-Atmosphäre} für 20-24 h bis zur Infektion inkubieren (Schritt 1.4).
      HINWEIS: Um intrazelluläre Bakterien abzubilden, werden Salmonella-Stämme mit dem pCHAR-Duo-Reporterplasmid transformiert, das freundlicherweise von Dr. Olivia Steele-Mortimer zur Verfügung gestellt wurde. Die hier getesteten Stämme wurden ausgewählt, um die vom Protokoll abgedeckte Phänotypvielfalt abzubilden und die Bildanalysen in Abschnitt 4 zu validieren. Weitere Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Stämmen finden Sie in den repräsentativen Ergebnissen.
3. Herstellung von stationären Phasenkulturen von Salmonella-Stämmen , die das pCHAR-Duo-Reporterplasmid tragen.
   1. Proben Sie die Salmonella-Glycerinbrühe mit der Spitze einer 10-μL-Pipette und inokulieren Sie sie in 1 ml Luria Bertani-Brühe (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g Natriumchlorid pro Liter), ergänzt mit Ampicillin 100 μg / ml.
   2. Inkubieren Sie das Inokulum statisch bei 37 °C für 20 h vor der Infektion, um die stationäre Wachstumsphase zu erreichen, entsprechend ~1 x 10⁹ Koloniebildende Einheiten (CFU)/ml⁸.
4. INT407-Epithelzellen mit Salmonellen infizieren.
   HINWEIS: Infektionen werden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
   1. Waschen Sie INT407-Zellen vorsichtig mit 200 μL PBS/Well.
   2. Bereiten Sie Salmonella-Inokulum vor, indem Sie Bakterien über Nacht in CM verdünnen, um die gewünschte Anzahl von KBE pro Epithelzelle zu erhalten, definiert als die Multiplizität der Infektion (MOI). Hier kam MOI 100 zum Einsatz.
   3. 200 μL/Welle beimpfen, dann die Platte mit einer atmungsaktiven Dichtungsmembran abdecken und bei 37 °C in befeuchteter 5%_{CO2-Atmosphäre} für 1 h inkubieren. Die Impfung gilt als Zeit Null der Infektion.
   4. Entfernen Sie das Inokulum und waschen Sie es vorsichtig mit 200 μL PBS / Well, und fügen Sie dann 200 μL CM mit Gentamicin 100 μg / ml pro Vertiefung hinzu. Die Platte mit einer atmungsaktiven Dichtungsmembran abdecken und anschließend bei 37 °C in befeuchteter 5%_{CO2-Atmosphäre} 1 h inkubieren.
   5. Entfernen Sie das CM mit Gentamicin 100 μg/ml und waschen Sie es vorsichtig mit 200 μL PBS/Well. 200 μL CM mit Gentamicin 10 μg/ml pro Vertiefung zugeben, die Platte mit einer atmungsaktiven Dichtungsmembran abdecken und dann bei 37 °C in befeuchteter 5%_{CO2-Atmosphäre} für 8 h inkubieren.

2. Probenfixierung und Epithelzellfärbung

HINWEIS: Halten Sie die Proben vor direkter Lichteinwirkung geschützt. Volumina werden für Vertiefungen einer 96-Well-Platte angegeben. Eine Volumenoptimierung ist für verschiedene Zellkulturplatten oder -träger erforderlich.

1. 8 Stunden nach der Infektion CM entfernen und dreimal vorsichtig mit 200 μL/Welle PBS waschen. Entfernen Sie PBS, indem Sie die Platte auf saugfähigem Papier umkehren. Vermeiden Sie das Spucken.
2. Fixieren Sie die infizierten Monoschichten mit 100 μL/Well Paraformaldehyd (PFA) 4% in PBS für 20 min bei RT. Entfernen Sie PFA 4% und waschen Sie dreimal mit 200 μL/Welle PBS. Die Platte kann maximal 16-24 h bei 4 °C gelagert werden. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
3. Färbt Epithelzellen.
   HINWEIS: DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol) DNA-Färbung (Schritt 2.3.1) wird nur für die Flächenanalyse verwendet, um Kerne zu färben, und High Content Screening (HCS) Färbung (Schritt 2.3.2) wird für die Einzelzellanalyse verwendet, um die gesamte Epithelzelle zu färben. Andere zelluläre Färbungen können verwendet werden, aber eine Optimierung der Bildaufnahme und -analyse ist erforderlich.
   1. Flächenanalyse: 100 μL/Welle DAPI (300 nM Lösung in PBS) dosieren und 5 min bei RT lichtgeschützt inkubieren.
   2. Einzelzellanalyse: Permeabilisieren mit 100 μL/Welle Triton 0,1x in PBS für 15 min bei RT. Dreimal mit PBS waschen und 100 μL/Welle HCS-Färbung verdünnt 1:2000 in PBS dosieren. Inkubieren Sie für 30 min bei RT geschützt vor Licht.
4. Entfernen Sie die Färbelösung und waschen Sie sie dreimal mit 200 μL/Welle PBS. Fügen Sie 50 μL/Welle PBS für die automatisierte Bildaufnahme hinzu.

3. Bildaufnahme mit einem automatisierten Fluoreszenzmikroskop

HINWEIS: Hier werden im Erfassungsprotokoll eine geringe Vergrößerung (10x/0,3 NA, 1 μm/Pixelobjektiv) in Schritt 3.1.1 für die Flächenanalyse und eine hohe Vergrößerung (40x/0,75 NA, 0,255 μm/Pixelobjektiv) in Schritt 3.1.2 für die Einzelzellanalyse verwendet. Andere Vergrößerungen können verwendet werden, aber eine Optimierung der Bildaufnahme und -analyse ist erforderlich. Wenn das verfügbare Mikroskop dies zulässt, erfassen Sie Bilder als Tile Regions (TRs), ein "Mosaik" zusammenhängender Felder, die als Kacheln bezeichnet werden, um große Probenbereiche aufzuzeichnen. Stellen Sie den Autofokus in der Mitte eines TR ein, anstatt einen für jede Kachel einzustellen, um die Probenbelichtung während des Autofokus-Vorgangs zu reduzieren.

1. Verwenden Sie den Software-Autofokus im Zellfärbekanal (blauer Kanal für HCS-Färbung und DAPI-Kernfärbung) als Referenz-z-Position. Aufnahme von Bildern im Zellfärbungskanal (465 nm, Zellen oder Zellkerne) und in den pCHAR-Duo-Reporterkanälen mCherry (610 nm, intrazelluläre Salmonellen) und GFP (509 nm, zytosolische hyperreplizierende Salmonellen).
   1. Flächenanalyse: Bild ≥10⁴ Zellen/technische Replikation (d.h. mindestens drei TRs von vier Kacheln/Vertiefung, die einem technischen Replikat entsprechen, werden empfohlen) bei 10-facher Vergrößerung.
      HINWEIS: Eine einzige z-Ebene reicht aus, um sowohl Zellen mit Vakuum als auch Zellen mit zytosolischen hyperreplizierenden Salmonellen bei 10-facher Vergrößerung abzubilden.
   2. Einzelzellanalyse: Bild ≥1.000 Zellen/technische Replikation (d.h. mindestens zwei TRs von 16 Kacheln/Well, die einem technischen Replikat entsprechen) bei 40-facher Vergrößerung. Mehrere Z-Ebenen sind erforderlich, um sowohl Zellen mit Vakuum als auch Zellen mit zytosolischen hyperreplizierenden Salmonellen abzubilden. Definieren Sie den optimalen z-Stack (3,85 μm z-Stack mit 0,55 μm Intervall, um acht z-Ebenen zu erhalten, wird angezeigt, um INT407-Zellen abzubilden, die mit zytosolischen hyperreplizierenden Salmonellen bei 40x infiziert sind). Jede z-Ebene wird im Folgenden als n/8 bezeichnet, wobei n zwischen 1 (entsprechend der unteren z-Ebene) und 8 (entsprechend der oberen z-Ebene) liegt.
2. Die Ausgabe jeder Erfassung ist eine Datei mit dem Namen Acquisition.czi, die Bilder aller Felder, Kanäle und Z-Ebenen enthält. Wenn TRs erfasst wurden, verschmelzen Sie die Kacheln miteinander, um ein Gesamtbild jedes TR zu erhalten, indem Sie eine einzelne Acquisition.czi-Datei als Eingabe für die Stitching-Methode verwenden.

4. Bildanalyse mit ImageJ

HINWEIS: Schritt 4.1 und Schritt 4.2 wurden speziell für das oben beschriebene Experiment und den Erwerb entwickelt. Andere experimentelle Einstellungen erfordern möglicherweise eine Optimierung der Analyse. Die Analyse einer einzelnen Acquisition.czi-Datei wird beschrieben. Suchen Sie für die Batchanalyse das Einzelzellenanalyseskript und das Flächenanalyseskript als ergänzende Dateien (Zusatzdatei 1 und Zusatzdatei 2). Die in den Skripts und ImageJ-Befehlen verwendeten Beschriftungen sind in den folgenden Abschnitten fett gedruckt.

1. Flächenanalyse
   1. Öffnen Sie die Datei Acquisition.czi in ImageJ, die im Skript als AcquisitionTitle bezeichnet wird: File > Open > AcquisitionTitle.czi. Es öffnet sich ein Fenster mit allen Kanälen. Die Kanäle werden je nach Erfassungsreihenfolge als c:1-3/3 angegeben. Hier entspricht c:1/3 blau (DAPI), c:2/3 mCherry (intrazelluläre Salmonellen) und c:3/3 GFP (zytosolische hyperreplizierende Salmonellen).
   2. Reduzieren Sie zufälliges Rauschen, um Bilder für die Flächenmessung in den Schritten 4.1.6 und 4.1.7 vorzubereiten.
      1. Duplizieren Sie das Fenster AcquisitionTitle mit Image > Duplicate > OK , um das Fenster AcquisitionTitle1 zu erhalten.
      2. Wenden Sie Gaußsche Unschärfe auf AcquisitionTitle1 an, indem Sie > Gaußsche Unschärfe verarbeiten > filtern. Behalten Sie den Standardwert für Sigma bei 2 bei und klicken Sie auf OK. Ein Process Stack? Fenster öffnet sich, klicken Sie auf Ja , um alle Kanäle zu verarbeiten.
      3. Subtrahieren Sie den Gauß-gefilterten AcquisitionTitle1 von der Originaldatei AcquisitionTitle by Process > Image Calculator: Wählen Sie AcquisitionTitle als Image1, wählen Sie die Operation Subtrahieren in der Dropdownliste, und wählen Sie dann AcquisitionTitle1 als Image2 aus. Klicken Sie auf OK. Das Fenster Process Stack? wird geöffnet. Klicken Sie auf Ja, um alle drei Bilder (Kanäle) zu verarbeiten und das Fenster ResultsOfAcquisitionTitle zu erhalten.
   3. Teilen Sie Kanäle durch Bild- > Farb- > geteilte Kanäle. Jedes Kanalbild wird nun in einem separaten Fenster angezeigt, das von ImageJ automatisch als C-ResultsOfAcquisitionTitle benannt wird. Hier entspricht C1-ResultsOfAcquisitionTitle DAPI, C2-ResultsOfAcquisitionTitle mCherry (intrazelluläre Salmonellen) und C3-ResultsOfAcquisitionTitle GFP (zytosolische hyperreplizierende Salmonellen).
   4. Verarbeiten Sie das C1-ResultsOfAcquisitionTitle-Bild, um den Bereich zu messen, der von Epithelzellkernen eingenommen wird.
      1. Navigieren Sie zu Process > Smooth , um den Nukleolus zu homogenisieren, der als Löcher im Kernbereich erscheint.
      2. Schwellenwert für das C1-ResultsOfAcquisitionTitle-Bild, um den Hintergrund auszuschließen, indem Sie Image > Adjust > Threshold verwenden: Aktivieren Sie Dunkler Hintergrund und wählen Sie Rot in der Dropdown-Liste aus. Legen Sie den automatischen Schwellenwert für das Dreieck fest, und verwenden Sie dann den oberen Schieberegler, um den minimalen Schwellenwert festzulegen, wenn die Kerne rot und der Hintergrund schwarz angezeigt wird (Schwellenwert = 100, in diesem Protokoll angewendet).
         HINWEIS: Die in den Schritten 4.1.4.2, 4.1.7, 4.2.3.6.1 und 4.2.4.3 beschriebenen automatischen Schwellenwerte werden als Leitfaden für den Benutzer vorgeschlagen, um den am besten geeigneten Schwellenwert für Kerne/Epithelzellen bzw. Bakterien manuell zu definieren. Der Wert des automatischen Schwellenwerts wird im Skript durch den definierten manuellen Schwellenwert überschrieben. Der definierte manuelle Schwellenwert wird auf die gesamte Chargenanalyse angewendet.
   5. Wählen Sie die gewünschten Maßeaus, indem Sie Analyze > Set Measurement: Check Limit to Threshold (Messung auf Schwellenwert festlegen) verwenden, um die Messung auf Schwellenwertpixel zu beschränken. Prüfbereich, entsprechend der Gesamtfläche, die von Schwellenwertpixeln belegt ist (d. h. Kerne in C1-ResultsOfAcquisitionTitle, intrazelluläre Salmonellen in C2-ResultsOfAcquisitionTitle, zytosolische hyperreplizierende Salmonellen in C3-ResultsOfAcquisitionTitle). Aktivieren Sie Beschriftung anzeigen, um den Erfassungstitel und den Kanal für jedes Bild in der Ergebnistabelle aufzuzeichnen.
   6. Messen Sie die von den Kernen eingenommene Fläche mit Analyze > Measure. Messungen werden in der Ergebnistabelle aufgezeichnet, die sich automatisch öffnet.
   7. Verarbeiten Sie C2-ResultsOfAcquisitionTitle und C3-ResultsOfAcquisitionTitle, um die Fläche zu messen, die von intrazellulären Salmonellen bzw. zytosolischen hyperreplizierenden Salmonellen eingenommen wird. Führen Sie die Schritte 4.1.4-4.1.6 mit einigen Änderungen aus: Überspringen Sie den Glättungsschritt in Schritt 4.1.4.1 und verwenden Sie den automatischen Schwellenwert Otsu anstelle des Dreiecks in Schritt 4.1.4.2 als Leitfaden, um den minimalen Schwellenwert (oberer Schieberegler) festzulegen, wenn Salmonellen rot und der Hintergrund schwarz erscheint (Schwellenwert = 200 empfohlen).
   8. Speichern Sie die Ergebnistabelle mit Datei > Speichern unter > Alle Dateien.
   9. Öffnen Sie die Ergebnistabelle in einer Tabelle, um die Flächenverhältnisse für jede analysierte AcquisitionTitle-Datei zu berechnen:
      1. Berechnen Sie das Infektionsverhältnis: Teilen Sie die Fläche der gesamten intrazellulären Salmonellen (hier roter Kanal , C2-) durch die Fläche der Epithelzellkerne (hier DAPI, C1-).
      2. Berechnen Sie das Hyperreplikationsverhältnis: Teilen Sie den Bereich, der von zytosolischen hyperreplizierenden Salmonellen (grüner Kanal, C3-) eingenommen wird, durch den Bereich, der von gesamten intrazellulären Salmonellen eingenommen wird ( roter Kanal , C2-).
2. Einzelzellanalyse
   1. Öffnen Sie die Datei Acquisition.czi in ImageJ, die im Skript als AcquisitionTitle bezeichnet wird: Menü Datei > Öffnen Sie > Acquisition.czi. Es öffnet sich ein Fenster mit den Bildern aller Kanäle und aller Z-Ebenen.
   2. Teilen Sie die Kanäle nach Bild > Farbe > geteilten Kanälen. Die Kanäle werden nun in getrennten Fenstern angezeigt, die von ImageJ automatisch als C-AcquisitionTitle benannt werden. Hier entspricht das C1-AcquisitionTitle-Fenster Epithelzellen (blau), das C2-AcquisitionTitle-Fenster intrazellulären Salmonellen (mCherry) und das C3-AcquisitionTitle-Fenster dem zytosolischen hyperreplizierenden Salmonellenkanal (GFP). Jedes C-AcquisitionTitle-Fenster enthält alle erworbenen Z-Ebenen.
   3. Verarbeiten Sie die C1-AkquisitionTitel Fenster, entsprechend Epithelzellen, um Zellen zu segmentieren.
      1. Wählen Sie das Bild der Z-Ebene aus, das für die Zellsegmentierung verwendet werden soll. Wählen Sie das Fenster C1-AcquisitionTitle und verwenden Sie Image > Duplizieren: Schreiben Sie die Nummer der ausgewählten Z-Ebene (d.h. 1, um z 1/8 auszuwählen), schreiben Sie C1Zplane in das Feld Titel, deaktivieren Sie Duplicate Stack und klicken Sie dann auf OK , um nur das ausgewählte Z-Ebenenbild zu duplizieren. Ein Fenster namens C1Zplane mit dem ausgewählten Z-Ebenenbild wird geöffnet.
      2. Verarbeiten Sie das erhaltene C1Zplane-Bild , um den Bildkontrast zu erhöhen. Öffnen Sie Process > Enhance Contrast: Passen Sie die gesättigten Pixel an (d.h. hier wird 1% verwendet) und aktivieren Sie Normalisieren. Klicken Sie dann auf OK , um die Kontrastverstärkungstechnik anzuwenden, um ein kontrastnormalisiertes C1Zplane-Bild zu erhalten.
      3. Verarbeiten Sie das kontrastnormalisierte C1Zplane-Bild, um die Epithelzellen zu segmentieren. Verwenden Sie Process > Find Maxima, um das Menü FindMaxima zu öffnen: Kennzeichnen Sie zunächst die Vorschaupunktauswahl, um die Rauschtoleranz festzulegen, um jeder einzelnen Epithelzelle nur einen Maximapunkt zuzuordnen. Kennzeichen Kantenmaxima ausschließen. Wählen Sie den Ausgabetyp Segmentierte Partikel und klicken Sie auf OK, um C1ZplaneSegmented zu erhalten, ein neues binäres maskenähnliches Bild, das jedes segmentierte Partikel pro markiertem Maximalpunkt zeigt.
         Hinweis: Der Algorithmus "Maxima ImageJ suchen" wird zum Segmentieren von Zellen verwendet. Maximapunkte (Pixelintensitätsspitzen) werden im gesamten Bild erkannt, die möglicherweise Zellen entsprechen. Ein Rauschschwellenwert (Rauschtoleranz) wird festgelegt, und der zusammenhängende Bereich um Maximapunkte wird analysiert, um ein binäres maskenartiges Bild zu erstellen, das jedes segmentierte Partikel pro Maximalpunkt definiert, also jede Zelle.
      4. Verarbeiten Sie das C1ZplaneSegmented-Bild, um eine Maske aus segmentierten Zellen zu erstellen. Verwenden Sie Analysieren > Partikel analysieren: Wählen Sie die Option Masken anzeigen und an Kanten ausschließen. Passen Sie den Flächenbereich der segmentierten Partikel entsprechend dem Parameter Size an, der in die Maske aufgenommen werden soll, um falsch segmentierte Objekte wie Zellcluster und Zellfraktionen auszuschließen. Um den Bereich von fehlerhaft segmentierten Objekten zu bewerten, verwenden Sie das Zauberstab-Nachzeichnungswerkzeug in der Symbolleiste: Wählen Sie Partikel mit dem Zauberstab aus, und öffnen Sie dann Analysieren > Messen , um die Fläche fehlerhafter Objekte zu messen. Stellen Sie das Größenintervall ein (vorgeschlagener Bereich 250-1700 Pixel²) und klicken Sie auf OK , um die binäre Maske MaskofC1ZplaneSegmented zu erhalten.
      5. Standardmäßig verfügt die binäre MaskOfC1ZplaneSegmented-Binärmaske über eine invertierende LUT. Verwenden Sie LUT > Umkehren LUT in der Symbolleiste.
      6. Verarbeiten Sie die binäre Maske MaskOfC1ZplaneSegmented , um die Zellsegmentierung zu korrigieren:
         1. Schwellenwert-kontrastnormalisiertes C1Zplane-Bild , aufgenommen in Schritt 4.2.3.2. Bild verwenden> > Schwellenwert anpassen: Aktivieren Sie Dunkler Hintergrund. Legen Sie die Standardeinstellung für den automatischen Schwellenwert fest. Wählen Sie die Option Rot und passen Sie den minimalen Grenzwert (oberer Balken) an, bis die Zellen vollständig rot erscheinen und einen dunklen Hintergrund hinterlassen (Schwellenwert = 8.000 wird in diesem Protokoll angewendet). Klicken Sie dann auf Anwenden , um das kontrastnormalisierte C1Zplane-Bild in ein binäres Bild mit Zellen in Weiß und dem Hintergrund in Schwarz zu konvertieren.
         2. Korrekte Zellsegmentierung in der binären Maske MaskOfC1ZplaneSegmented . Verwenden Sie Process > Image Calculator: Wählen Sie MaskOfC1ZplaneSegmented as Image1, wählen Sie die Operation AND in der Dropdown-Liste und dann die kontrastnormalisierte C1Zplane als Image2 aus. Klicken Sie auf OK. Das Ausgabebild wird von ImageJ automatisch als Ergebnisse der Maske von C1Zplane Segmented benannt.
      7. Prozessergebnisse der Maskierung von C1Zplane Segmentiert, um jede einzelsegmentierte Zelle als Region of Interest (ROI) zu kennzeichnen. Verwenden Sie Analysieren > Partikel analysieren. Passen Sie die Größe wie in Schritt 4.2.3.4 an, und wählen Sie dann die Option Nichts anzeigen. Aktivieren Sie Zu Manager hinzufügen , um alle Partikel (segmentierte Zellen) zum ROI-Manager-Tool hinzuzufügen. Aktivieren Sie außerdem Ausschließen an Kanten. Klicken Sie auf OK. Das ROI-Manager-Menü zeigt eine Liste aller Partikel (segmentierte Zellen), definiert als ROIs, eindeutig mit ihren jeweiligen y- und x-Koordinaten gekennzeichnet.
      8. Speichern Sie ROIs-Daten als ROI-cells-AcquisitionTitle.zip über das ROI-Manager-Menü , indem Sie auf Mehr > Speichern klicken. ROI-cells-AcquisitionTitle.zip wird in Schritt 4.2.4.6 für die Einzelzellanalyse geöffnet.
   4. Verarbeiten Sie die C2-AkquisitionTitel Fenster (hier roter Kanal), entsprechend intrazellulär Salmonellae, um die Anzahl der infizierten Zellen und die intrazelluläre vakuoläre Belastung zu messen.
      1. Subtrahieren Sie den grünen Kanal (C3-) vom roten Kanal (C2-), um unscharfe Pixel der zytosolischen hyperreplizierenden Salmonellen zu entfernen.
         1. Verwenden Sie Process > Image Calculator. Wählen Sie C2-Acquisitiontitle als Image1, wählen Sie die Operation Subtrahieren in der Dropdown-Liste und dann C3-Acquisitiontitle als Image2. Aktivieren Sie Neues Fenster erstellen und klicken Sie auf OK.
         2. Subtraktion auf den gesamten Z-Stack anwenden, indem Sie im Prozessstapel auf Ja klicken? Fenster. Das Ausgabefenster heißt im Skript ResultsOfC2AcquisitionTitle.
      2. Process ResultsOfC2AcquisitionTitle , um zufälliges Rauschen zu reduzieren.
         1. Duplizieren Sie das Fenster ResultsOfC2AcquisitionTitle , indem Sie auf Image Menu > Duplicate klicken. Aktivieren Sie Duplicate Stack (Stapel duplizieren ), und drücken Sie OK , um das Fenster ResultsOfC2AcquisitionTitle1 zu erhalten.
         2. Wenden Sie Gaußsche Unschärfe auf das Fenster ResultsOfC2AcquisitionTitle1 an, indem Sie > Gaussschen Weichzeichner verarbeiten > Gaußsche Unschärfe filtern. Lassen Sie den Sigma-Wert als 2 oder passen Sie ihn an (d.h. hier wurde Sigma: 4 verwendet). Klicken Sie auf OK und wenden Sie Gaußsche Unschärfe auf den gesamten Z-Stapel an, indem Sie im Fenster Prozessstapel? auf Ja klicken.
         3. Subtrahieren Sie den Gaußschen gefilterten ResultsOfC2AcquisitionTitle1 zu ResultsOfC2AcquisitionTitle, indem Sie auf Process > Image Calculator klicken. Wählen Sie ResultsOfC2AcquisitionTitle als Image1 aus, wählen Sie in der Dropdownliste Operation Subtract aus, und wählen Sie dann ResultsOfC2AcquisitionTitle1 als Image2 aus. Klicken Sie auf OK. Wenden Sie die Subtraktion auf den gesamten Z-Stack an, indem Sie im Fenster Process Stack? auf Yes klicken, um ein Fenster zu erhalten, das von ImageJ automatisch als Results of Results of C2-AcquisitionTitle benannt wird.
      3. Verarbeiten Sie die Ergebnisse der Ergebnisse von C2-AcquisitionTitle, um Salmonellen vom Hintergrund zu trennen. Bild verwenden > Schwellenwert > anpassen: Aktivieren Sie Dunkler Hintergrund und legen Sie den automatischen Schwellenwert für Otsu fest. Passen Sie den minimalen Grenzwert (oberer Balken) an, bis Salmonellen vollständig rot erscheinen und einen dunklen Hintergrund hinterlassen (Schwellenwert = 100 wird in diesem Protokoll angewendet). Klicken Sie auf Übernehmen und das Fenster In Binärdatei konvertieren wird geöffnet: Aktivieren Sie Schwarzer Hintergrund und klicken Sie dann auf OK. Der vollständige Z-Stack wird nun in binäre Bilder konvertiert.
      4. Wählen Sie die mittlere Z-Ebene, die der vakuolären Salmonellen-Fokusebene entspricht, in den Ergebnissen des Binärfensters Ergebnisse von C2-AcquisitionTitle aus Schritt 4.2.4.3: Image > Stacks > Set Slice aus und schreiben Sie die Nummer der Z-Ebene Ihrer Wahl (z.B. wird hier z: 4/8 verwendet). Klicken Sie auf OK.
      5. Stellen Sie die Messungen ein, die für jeden ROI (Zelle) aufgezeichnet werden sollen. Verwenden Sie Analyze > Set Measurement: check Area, entsprechend der Gesamtfläche jedes ROI. Aktivieren Sie Flächenanteil und Grenzwert auf Schwellenwert, um nur den Flächenanteil aufzuzeichnen, der von Schwellenwertpixeln (intrazelluläre Salmonellen) für jeden ROI belegt ist. Aktivieren Sie Display-Label, um jeden einzelnen ROI mit dem Bildtitel, dem Kanal, der Z-Ebene und den x-y-Koordinaten in der Ergebnistabelle zu beschriften.
      6. Verarbeiten Sie die gewählte Z-Ebene der intrazellulären Salmonellen, um Labels, Area und %Area occupied by Salmonellae für jede einzelne Zelle (ROI) aufzuzeichnen: Öffnen Sie die in Schritt 4.2.3.8 gespeicherte Datei ROI-cells-AcquisitionTitle.zip nach Datei > Öffnen und klicken Sie im ROI-Manager-Menü auf Messen. Die Ausgabe ist eine Tabelle, die die ausgewählten Messungen angibt.
      7. Speichern Sie die Ergebnistabelle mit Datei > Speichern unter im Ergebnisfenster.
      8. Öffnen Sie ResultTable in einer Tabelle: Beschriftung Fläche und %Fläche, die von intrazellulären Salmonellen belegt ist, werden für jeden ROI angegeben, entsprechend einer konturierten Zelle, die eindeutig mit x- und y-Koordinaten identifiziert wird.
      9. Messen Sie die Anzahl der infizierten Zellen, die den ROIs entsprechen, die eine %Area > 0 aufweisen, die von Schwellenwertpixeln belegt ist, entsprechend Salmonellen (d. h. hier wird eine %Area > 0,2% berücksichtigt, um infizierte Zellen zu identifizieren). Berechnen Sie dann den Prozentsatz der infizierten Zellen an der Gesamtzahl der Zellen.
      10. Messen Sie die vakuoläre Belastung von Salmonellen/Zellen, indem Sie den mittleren % der von vakuolären Salmonellen belegten Fläche für alle infizierten Zellen berechnen.
   5. Verarbeiten Sie den grünen Kanal (C3-AcquisitionTitle), um die Anzahl der Zellen mit zytosolischen hyperreplizierenden Salmonellen zu messen. Folgen Sie den Schritten 4.2.4.2 bis 4.2.4.9, jedoch mit einigen Änderungen.
      1. Arbeiten an den oberen z-Ebenen (hier z:7/8), da Zellen mit zytosolischen hyperreplizierenden Salmonellen aus der Monoschicht herausragen; Daher konzentrieren sie sich auf einer anderen Ebene als Zellen, ohne Salmonellen zu hyperreplizieren.
      2. Messen Sie die Anzahl der Zellen, die zytosolische hyperreplizierende Salmonellen (grün) enthalten, indem Sie Zellen (ROIs) bewerten, die eine hohe %Fläche aufweisen, die von Salmonellen besetzt ist (z. B. wird eine %Fläche > 20% berücksichtigt, um Zellen mit zytosolischen hyperreplizierenden Salmonellen zu identifizieren). Berechnen Sie dann den Prozentsatz der Zellen, die zytosolische hyperreplizierende Salmonellen enthalten, auf die Gesamtzahl der infizierten Zellen, die in Schritt 4.2.4.9 bewertet wurden.

Representative Results

Infektion von Epithelzellen mit Salmonella-Stämmen
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die zelluläre Invasion und die zytosolische Replikation (Abbildung 1A) im Vergleich zur vakuolären Belastung (Abbildung 1B) von Salmonellen in Epithelzellen zu analysieren. Das Protokoll wurde anhand der drei folgenden Salmonella-Stämme validiert, S. Typhimurium SL1344 Referenzstamm (S. Tm), S. Derby ER1175 Wildtyp (S. Derby wt) und die isogene Mutante von S. Derby ER1175 ohne sipA-Gen (S. Derby ΔsipA). Der Stamm S. Derby ER1175 wurde aus Schweinen isoliert und gehört zur IZSLER-Überwachungssammlung von Salmonella-Isolaten. Die Stämme wurden ausgewählt, um die Phänotypvielfalt des Protokolls darzustellen. Insbesondere wurden diese Stämme ausgewählt, weil ihr Verhalten innerhalb von Epithelzellen bereits bekannt war, um sich in Bezug auf Invasion oder Replikation zu unterscheiden⁹; Daher waren sie wertvolle Kontrollen, um zu testen, ob das Protokoll es erlaubt, Unterschiede in intrazellulären Salmonella-Phänotypen quantitativ zu unterscheiden. Insbesondere S. Tm und S. Derby wt wurden aufgenommen, weil wir zuvor gezeigt hatten, dass S. Tm hat eine höhere Invasions- und intrazelluläre Replikationseffizienz als S. Derby wt⁹ während S. Derby Δ sipA wurde als hyperreplikationsgestörter Stamm hinzugefügt, da der VirulenzeffektorSipA eine entscheidende Rolle beim Beginn der Hyperreplikation spielt^10,11. Es wurde zuvor für S berichtet. Tm dass die zytosolische Replikation 4 h nach der Invasion beginnt, und dann hyperrepliziert die zytosolische Population schnell, um die Epithelzelle um 8 h^11,12 zu füllen. Konsequenterweise war eine 8 h lange Infektion geeignet, den zytosolischen Hyperreplikationsphänotyp auch in S zu beobachten und zu quantifizieren. Derby wt und S. Derby ΔsipA.

Flächenanalyse
Die Flächenanalyse in Schritt 4.1 liefert eine Messung der Gesamtbesiedlung von Epithelzellen durch Salmonellen (Infektionsrate) sowie eine Messung der Hyperreplikation (Hyperreplikationsverhältnis). In dem in Abbildung 2 beschriebenen Workflow für die Bereichsanalyse wird das zufällige Rauschen reduziert, und dann werden die Kanäle aufgeteilt und unabhängig voneinander verarbeitet. Für jeden Kanal wird ein Schwellenwert festgelegt, um den Hintergrund von der Flächenmessung auszuschließen. Anschließend wird der Bereich, der von Schwellenwertpixeln belegt ist, für jeden Kanal gemessen. Das Ergebnis der Flächenanalyse ist eine Tabelle, die für jede Akquisitionsdatei die Ausdehnung der Bereiche angibt, die von Epithelzellkernen (blauer Kanal), intrazellulären mCherry-exprimierenden Salmonellen (roter Kanal) und zytosolischen hyperreplizierenden Salmonellen, die GFP (grüner Kanal) zusammen mit mCherry exprimieren, besetzt sind. Das Infektionsverhältnis wird berechnet, indem die von mCherry-exprimierenden Salmonellen eingenommene Fläche durch die Fläche der Wirtszellkerne geteilt wird. Die Ergebnisse der getesteten Stämme zeigten, dass S. Tm zeigt eine signifikant höhere Infektionsrate im Vergleich zu beiden S. Derby-Stämme, wie erwartet (Abbildung 3A). Daher zeigen diese Ergebnisse die Wirksamkeit der Flächenanalyse bei der Erkennung von Unterschieden in der Fähigkeit von Salmonella-Stämmen, Epithelzellen zu besiedeln. Das Hyperreplikationsverhältnis von Salmonellen wird gemessen, indem der von GFP-exprimierenden Salmonellen besetzte Bereich durch den Bereich geteilt wird, der von intrazellulären mCherry-exprimierenden Salmonellen besetzt ist. In Übereinstimmung mit der Rolle von SipA bei der Bestimmung der Hyperreplikation wurde ein signifikant reduziertes Hyperreplikationsverhältnis für S. Die Derby-ΔsipA-Belastung wurde im Vergleich zu S gemessen. Derby wt, (Abbildung 3B). Es wurde kein Hyperreplikationsunterschied zwischen S beobachtet. Tm und S. Derby wt. Insgesamt zeigte die Flächenanalyse effektiv unterschiedliche Hyperreplikationsniveaus unter den untersuchten Stämmen.

Einzelzellanalyse
Die Einzelzellanalyse ermöglicht die Quantifizierung der Salmonelleninvasion und der vakuolären Last im Vergleich zur zytosolischen Replikation in Epithelzellen mit Einzelzellauflösung. Wie in Schritt 4.2 beschrieben, wurden für jede Erfassungsdatei blaue, rote und grüne Kanäle unabhängig voneinander verarbeitet (Abbildung 4). Insbesondere wurde der blaue Kanal, der Epithelzellen entspricht, in Schritt 4.2.3 verarbeitet, um eine Zellsegmentierung zu erhalten. Anschließend wurden segmentierte Zellen zum ROI-Manager (Region of Interest) hinzugefügt, um eine Liste der ROIs zu erhalten, die allen segmentierten Zellen entspricht, die eindeutig mit y-x-Koordinaten gekennzeichnet sind. Um unscharfe Pixel von GFP-exprimierenden hyperreplizierenden Salmonellen zu entfernen, wurden die Pixel des grünen Kanals von denen des roten Kanals subtrahiert. Die Ausgabetabelle der Einzelzellanalyse gibt für jeden ROI die Fläche und den Prozentsatz der ROI-Fläche an, die von Salmonellen besetzt ist, wobei nur der mCherry-konstitutive Reporter oder der GFP-Zytosol-responsive Reporter ausgedrückt wird. Der Prozentsatz der Zellfläche, der von mCherry-only exprimierenden Salmonellen eingenommen wird, wurde in Schritt 4.2.4 verarbeitet, um den Prozentsatz der infizierten Zellen und die mittlere vakuolare Belastung zu berechnen (Abbildung 5A). Die Analyse der vakuolären Belastung zeigte, dass die S. Derby-Stämme erzeugen eine mittlere vakuolare Belastung, die deutlich niedriger ist als S. Tm (Abbildung 5B). Umgekehrt wurde in S nur eine leichte und nicht signifikante Verringerung des Prozentsatzes infizierter Zellen beobachtet. Derby-Stämme im Vergleich zu S. Tm (Abbildung 5A). Der Prozentsatz der Zellfläche, der von GFP-exprimierenden Salmonellen eingenommen wird, wurde in Schritt 4.2.5 verarbeitet, um die Hyperreplikationsrate zu erhalten. Es wurde kein Unterschied zwischen S beobachtet. Tm und S. Derby wt, während S. Derby Δ sipA zeigte eine signifikante Abnahme der Hyperreplikation, was mit dem Ergebnis der Flächenanalyse (Abbildung 5C) und der Rolle vonSipA bei der Induktion der Hyperreplikation übereinstimmt.

Abbildung 1: Salmonella zytosolische Hyperreplikation und vakuoläre Belastung. Repräsentative Bilder von (A) der Salmonellen-Hyperreplikation und (B) der Vakuumbelastung, die bei hoher Vergrößerung (40x) erfasst wurde, werden gezeigt. Abbildung B zeigt die unterschiedlichen Fokusebenen von Zellen mit hyperreplizierenden Salmonellen (z:7/8) im Vergleich zu nicht-hyperreplizierenden Salmonellen (z:4/8). Weiße Skalenbalken sind 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Workflow der Flächenanalyse. Der Workflow der Flächenanalyse wird für eine repräsentative Erfassung von INT407-Zellen mit geringer Vergrößerung (10x) gezeigt, die 8 h lang mit Salmonellen infiziert waren, die das pCHAR-Duo-Plasmid (MOI 100) tragen. Zuerst wird das zufällige Rauschen reduziert, und dann werden die Kanäle in C1, C2 und C3 aufgeteilt und unabhängig voneinander verarbeitet. Für jeden Kanal wird ein Schwellenwert festgelegt, um den Hintergrund aus dem Messbereich auszuschließen. Dann wird für jeden Kanal die Fläche gemessen, die nur von den Schwellenwertpixeln eingenommen wird - entsprechend den Zellkernen in C1, allen intrazellulären Salmonellen in C2 und zytosolischen Salmonellen in C3. Die hier analysierten Bilder sind die Ergebnisse von vier Kacheln, die bei 10-facher Vergrößerung aufgenommen wurden und durch Stitching miteinander verschmolzen wurden. Weiße Skalenbalken sind 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Ergebnisse der Flächenanalyse. Die Ergebnisse der Flächenanalyse werden gezeigt. (A) Das Infektionsverhältnis wird berechnet, indem der Bereich, der von mCherry-exprimierenden Salmonellen (C2-Kanal), der alle intrazellulären Bakterien repräsentiert, eingenommen wird, durch den Bereich geteilt wird, der von Wirtszellkernen besetzt ist (C1-Kanal). (B) Das Hyperreplikationsverhältnis wurde gemessen, indem der Bereich, der von GFP-exprimierenden Salmonellen (C3-Kanal), die nur zytosolische hyperreplizierende Bakterien repräsentieren, eingenommen wird, durch den Bereich geteilt wurde, der von allen intrazellulären mCherry-exprimierenden Salmonellen besetzt ist. Jeder Punkt stellt eine Replikation dar. Die Analyse wurde an drei biologischen Replikaten durchgeführt, die jeweils dreifach getestet wurden. Die schwarzen Linien zeigen die Mittelwerte an. Die Signifikanz wurde mit einem zweiseitigen t-Test berechnet, und es werden p-Werte angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Workflow der Einzelzellanalyse. Der Workflow der Einzelzellanalyse wird für eine repräsentative Aufnahme mit hoher Vergrößerung (40x) von INT407-Zellen gezeigt, die 8 h lang mit Salmonellen infiziert waren, die das pCHAR-Duo-Plasmid (MOI 100) tragen. Zunächst werden Kanäle in C1, C2 und C3 aufgeteilt und unabhängig voneinander verarbeitet. Blauer Kanal (C1), der Epithelzellen entspricht, wird verarbeitet, um eine Zellsegmentierung zu erhalten, und dann wird jede segmentierte Zelle als Region of Interest (ROI) definiert, die eindeutig mit y-x-Koordinaten gekennzeichnet ist. Der rote Kanal (C2) wird verarbeitet, indem der grüne Kanal (C3) subtrahiert wird, um unscharfe zytosolische hyperreplizierende Salmonellen zu entfernen, so dass alle vakuolären Salmonellen nur mCherry exprimieren, und dann wurde zufälliges Rauschen reduziert, und der Schwellenwert wird so eingestellt, dass der Hintergrund von den Messungen ausgeschlossen wird. Schließlich wird die Fläche gemessen, die von vakuolären Salmonellen für jeden ROI belegt wird. Der grüne Kanal (C3), der den gesamten zytosolischen GFP-exprimierenden Salmonellen entspricht, wird ähnlich verarbeitet. Die hier analysierten Bilder sind das Ergebnis von 16 Kacheln, die durch Stitching miteinander verschmolzen sind. Weiße Skalenbalken sind 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Ergebnisse der Einzelzellanalyse. Die Ergebnisse der Einzelzellanalyse werden gezeigt. (A) Der Prozentsatz der infizierten Zellen erhält man, indem man die Anzahl der Zellen mit einem Prozentsatz der Fläche, die nur mCherry-exprimierende Salmonellen einnimmt> 0,2 durch die Gesamtzahl der Zellen dividiert. (B) Die mittlere vakuoläre Belastung wurde durch Berechnung des mittleren Prozentsatzes der Fläche ermittelt, die nur mCherry-exprimierende Salmonellen in den infizierten Zellen einnimmt. (C) Die Hyperreplikationsrate wurde berechnet, indem die Anzahl der Zellen mit einem Prozentsatz der Fläche, die von GFP-exprimierenden Salmonellen≥20% eingenommen war, durch die Gesamtzahl der infizierten Zellen geteilt wurde. Es werden Daten von drei bis vier biologischen Replikaten berichtet, die in dreifacher Ausführung getestet wurden. Die Balken zeigen den Standardmessfehler an. Die Signifikanz wurde mit einem zweiseitigen t-Test berechnet, und es werden p-Werte angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Datei 1: Flächenanalyseskript. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Einzelzellenanalyseskript. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die Art und Weise, wie Salmonellen Darmepithelzellen besiedeln, beeinflusst das Infektionsergebnis. Bei der Invasion induziert die zytosolische Hyperreplikation eine Entzündung des Darms³, während die vakuoläre Replikation zu einer systemischen Ausbreitung führen kann⁴. Salmonellenstämme können in ihrer Fähigkeit variieren, in intestinale Epithelzellen einzudringen und sich darin zu vermehren⁹. Tatsächlich sind Salmonellen eine äußerst vielfältige Gattung mit mehr als 2.500 Serovaren, die unterschiedliche Fähigkeiten haben, Krankheiten zu verursachen. Darüber hinaus sind Salmonellen die am häufigsten gemeldete Ursache lebensmittelbedingter Krankheitsausbrüche in der Europäischen Union, was auf eine starke Ausbreitung in der menschlichen Bevölkerung hindeutet¹. Daher ist die Verfügbarkeit zuverlässiger Hochdurchsatzmethoden zur Quantifizierung der intrazellulären Phänotypen von Salmonellen von großer Bedeutung, um Unterschiede in der Virulenz zwischen einer großen Anzahl von Salmonella-Stämmen zu bewerten und letztendlich eine genaue und stammspezifische Risikobewertung dieses Erregers zu ermöglichen.

Das hier beschriebene Protokoll misst das Verhalten von Salmonellen in Epithelzellen schnell und automatisiert. Die Infektion von Epithelzellen wird in 96-Well-Bildgebungs-Mikrotiterplatten durchgeführt und ein automatisiertes Fluoreszenzmikroskop wird für die Bildaufnahme verwendet, wodurch das Protokoll für Hochdurchsatzanwendungen geeignet ist. Dieses Protokoll nutzt das pCHAR-Duo-Plasmid, das es ermöglicht, vakuoläre von zytosolischen Salmonellen durch die differentielle Expression von zwei fluoreszierenden Reportern zu unterscheiden⁵. Die intrazellulären Phänotypen von Salmonellen werden häufig durch manuelles Scoring analysiert, ein zeitaufwändiges Verfahren, das für die Analyse einer großen Anzahl von Stämmen und Zellkulturen pro Stamm ungeeignet ist und anfällig für Bedienerfehler und Variationen zwischen den Bedienern ist. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden zwei komplementäre und automatisierte Bildanalysen entwickelt, die Flächenanalyse und die Einzelzellanalyse. Für die Entwicklung der beiden Analysen wurde ImageJ verwendet, eine frei verfügbare Software. Um die Protokollausführung zu beschleunigen, werden ImageJ-Skripte für die Batch-Analyse mehrerer Erfassungsdateien ohne Bedienereingriff als ergänzende Dateien bereitgestellt.

Die Flächenanalyse wurde entwickelt, um in wenigen Schritten die Gesamtbesiedlung von Epithelzellen (Infektionsrate) und das Hyperreplikationsniveau (Hyperreplikationsverhältnis) durch die Messung der Bereiche, die spezifisch von den Kernen von Epithelzellen besetzt sind, und durch Salmonellen , die entweder mCherry oder mCherry zusammen mit GFP exprimieren, zu quantifizieren. Die Flächenanalyse wird auf Bilder angewendet, die bei geringer Vergrößerung aufgenommen wurden, wobei sowohl vakuoläre als auch hyperreplizierende Salmonellen in derselben z-Ebene fokussiert sind und eine große Anzahl von Epithelzellen pro mikroskopischem Feld angezeigt wird, wodurch die Größe und Anzahl der Erfassungsdateien reduziert wird. Die Flächenanalyse ermöglicht eine automatisierte, schnelle und rechnerisch leichte Analyse einer großen Anzahl von Proben und eignet sich daher für Hochdurchsatz-Assays wie Screening-Experimente.

Die Einzelzellanalyse wurde entwickelt, um Salmonella-Phänotypen in Epithelzellen mit Einzelzellauflösung zu quantifizieren, die durch Zellsegmentierung und Messung des Zellbereichs und des Prozentsatzes der Fläche, die von vakuolären und zytosolischen hyperreplizierenden Salmonellen eingenommen wird, erhalten wird. Die Gesamtkolonisation von Epithelzellen, die durch die Flächenanalyse charakterisiert wird, wird hier in drei quantitative Parameter unterteilt, den Prozentsatz der infizierten Zellen, die mittlere vakuoläre Last und die Hyperreplikationsrate, so dass der Beitrag jedes Phänotyps zur Gesamtkolonisation bewertet und quantifiziert werden kann, wodurch die Ergebnisse der Flächenanalyse ergänzt werden. Die größeren Details, die die Einzelzellanalyse bietet, gehen zu Lasten einer langsameren Bildaufnahme und -analyse. Um eine Einzelzellauflösung zu erreichen, wird die Bildaufnahme bei hoher Vergrößerung durchgeführt. Dies bedeutet, dass mehrere z-Ebenen benötigt werden, um sowohl vakuoläre als auch zytosolische Salmonellen im Fokus zu beobachten, und dass die Erfassung einer großen Anzahl von Feldern pro Probe erforderlich ist, um eine hohe Anzahl von Epithelzellen zu erzielen, wodurch die Erfassungszeit im Vergleich zur Flächenanalyse verlängert wird. Darüber hinaus ist die Analyse mehrerer großer Erfassungsdateien rechenintensiv und erfordert daher eine geeignete Workstation (es wurde eine 6-Core-Workstation mit 32 GB RAM verwendet). Daher kann die Einzelzellanalyse als eigenständige Methode unter begrenzten Durchsatzbedingungen oder als Second-Level-Methode in Verbindung mit der Flächenanalyse eingesetzt werden, um ein tieferes Verständnis der Salmonella-Phänotypen in Epithelzellen zu erlangen.

Die beiden komplementären Analysen wurden mit S validiert. Tm, S. Derby wt, und S. Derby ΔsipA, gewählt, weil ihr Verhalten in Epithelzellen bereits bekannt war, um sich in Bezug auf Invasion oder Replikation zu unterscheiden ^9,10. Die Ergebnisse der Flächen- und Einzelzellanalysen zeigen, dass das Protokoll es erlaubte, Unterschiede in intrazellulären Salmonella-Phänotypen entsprechend den Eigenschaften der getesteten Stämme quantitativ zu unterscheiden. Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse, dass die Einzelzellanalyse eine Quantifizierung des Beitrags jedes intrazellulären Phänotyps (Invasion, vakuoläre Last und zytosolische Replikation) zur Gesamtkolonisation ermöglicht, die mit Hilfe der Flächenanalyse bewertet wird.

Dieses Protokoll wurde hier angewendet, um die In-vitro-Pathogenität verschiedener Salmonellenstämme zu untersuchen, aber es kann auch andere Anwendungen haben, wie die Untersuchung zufälliger Mutanten, um Gene zu identifizieren, die an der Invasion und / oder Replikation in Epithelzellen beteiligt sind. Darüber hinaus kann das Protokoll angepasst werden, um das Verhalten von Salmonellen in anderen Zelllinien als INT407-Zellen zu analysieren. Es kann auch als Ausgangspunkt für die Entwicklung ähnlicher Methoden zur Untersuchung der Zell-Pathogen-Interaktion anderer intrazellulärer Mikroorganismen verwendet werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well imaging microplate	Eppendorf	30741030	Cell culture and infection
Ampicillin	Sigma-Aldrich	59349	Bacteria culture
Axio observer inverted microscope	ZEISS		Automated fluorescence microscope
Axiocam 305 Mono	ZEISS		Microscope Camera
Breathable sealing membrane	Sigma-Aldrich	Z380059	Infection assay
Colibrì 5/7	ZEISS		Led light source
Collagen I rat tail	Life Technologies	A1048301	Collagen coating
DAPI	Invitrogen	D3571	Cell staining
Fetal bovine serum	Gibco	10099-141	Cell culture and infection
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G12664	Infection assay
Glacial acetic acid	Carlo Erba	401391	Collagen coating
HCS CellMask Blue	Invitrogen	H32720	Cell staining
ImageJ	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin)		Image processing software
Minimum Essential Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	M5650-500ML	Cell culture and infection
Paraformaldehyde 4%	Invitrogen	FB002	Cell fixation
Potassium chloride	PanReac AppliChem	131494.1211	PBS preparation
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	60220	PBS preparation
Sodium Chloride	PanReac AppliChem	131659.1214	Bacteria culture and PBS preparation
Sodium phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	71640	PBS preparation
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap	Euroclone	ET7025	Cell culture
Triton X-100	Biorad	1610407	Cell staining
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	Cell culture and infection
Tryptone	Oxoid	LP0042B	Bacteria culture
Yeast extract	Biolife	4122202	Bacteria culture