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Immunology and Infection

इमेजजे का उपयोग करके साल्मोनेला के इंट्रासेल्युलर फेनोटाइप का स्वचालित विश्लेषण

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/64263
Automatic Translation
1, 1, 1
1Risk Analysis and Genomic Epidemiology Unit, Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia-Romagna (IZSLER)

Summary

साल्मोनेला आंतों के उपकला कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला-विशिष्ट रिक्तिकाओं में और साइटोसोल (हाइपर-प्रतिकृति) में मुक्त होता है। इमेजजे के माध्यम से दो पूरक छवि विश्लेषणों द्वारा साल्मोनेला के इंट्रासेल्युलर फेनोटाइप को निर्धारित करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी-आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जो एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन और स्कोरिंग तक पहुंचता है।

Abstract

साल्मोनेला एक एंटरिक रोगज़नक़ है जो आंतों के उपकला पर आक्रमण करने और एंटरोसाइट्स में प्रतिकृति करने में सक्षम है, दोनों साल्मोनेला-विशिष्ट रिक्तिकाओं के अंदर और साइटोसोल (साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति) में मुक्त। इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति के ये अलग-अलग फेनोटाइप रोगजनन के विभिन्न मार्गों को ड्राइव करते हैं, यानी, साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति आंत लुमेन में भड़काऊ कोशिका मृत्यु और एक्सट्रूज़न को प्रेरित करती है, जबकि वैक्यूलर प्रतिकृति ट्रांस-एपिथेलियम प्रवेश और प्रणालीगत प्रसार की ओर ले जाती है। आक्रमण की गई कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए माइक्रोस्कोपी उपकरण बनाने के लिए महत्वपूर्ण प्रयास किए गए थे, जैसे कि पीपीएआर-डुओ फ्लोरेसेंस रिपोर्टर प्लास्मिड जो एमचेरी और जीएफपी की अंतर अभिव्यक्ति द्वारा वैक्यूलर और साइटोसोलिक बैक्टीरिया के बीच भेदभाव की अनुमति देता है। हालांकि, इंट्रासेल्युलर फेनोटाइप्स को अक्सर मैन्युअल रूप से स्कोर किया जाता है, एक समय लेने वाली प्रक्रिया जो विश्लेषण को नमूनों और कोशिकाओं की एक छोटी संख्या तक सीमित करती है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, इमेजजे, एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके दो पूरक और स्वचालित छवि विश्लेषण विकसित किए गए थे। उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल में, उपकला कोशिकाओं को 96-वेल प्लेटों का उपयोग करके पीपीएआर-डुओ ले जाने वाले साल्मोनेला से संक्रमित किया गया था। इमेजिंग एक स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया गया था। फिर, विभिन्न विस्तार स्तरों पर साल्मोनेला के इंट्रासेल्युलर व्यवहार को मापने के लिए दो छवि विश्लेषण विधियों को लागू किया गया था। पहली विधि समग्र इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल लोड और साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति की सीमा को मापती है। यह तेज है और उच्च संख्या में कोशिकाओं और नमूनों के स्कोरिंग की अनुमति देता है, जिससे यह स्क्रीनिंग प्रयोगों जैसे उच्च-थ्रूपुट परख के लिए उपयुक्त हो जाता है। दूसरी विधि संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिशत, साल्मोनेला के औसत वैक्यूलर लोड और साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति दर को निर्धारित करने के लिए एकल-कोशिका विश्लेषण करती है जो उपकला कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला व्यवहार के बारे में अधिक विवरण देती है। प्रोटोकॉल को विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए इमेजजे स्क्रिप्ट द्वारा किया जा सकता है ताकि साल्मोनेला-एंटरोसाइट इंटरैक्शन के प्रमुख चरणों के बैच विश्लेषण स्वचालित रूप से चलाए जा सकें।

Introduction

साल्मोनेला यूरोपीय संघ1 में खाद्य जनित बीमारी के प्रकोप का कारण बनने वाला सबसे अधिक बार रिपोर्ट किया गया जीवाणु एजेंट है। साल्मोनेला संक्रमण की प्राथमिक रोग संबंधी अभिव्यक्ति आंत्रशोथ है, जो अंतर्ग्रहण के बाद आंत में रोगज़नक़ व्यवहार और परिणामस्वरूप स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रियाका परिणाम है। हालांकि, साल्मोनेला अतिरिक्त आंतों की साइटों पर भी फैल सकता है और प्रणालीगत संक्रमण का कारण बन सकता है, खासकर इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड व्यक्तियों में। साल्मोनेला और आंतों के उपकला के बीच बातचीत का प्रकार संक्रमण के परिणाम की स्थिति बनाता है। एक बार आंत लुमेन में, साल्मोनेला आंतों के उपकला कोशिकाओं के अंदर आक्रमण करता है और प्रतिकृति करता है। इंट्रासेल्युलर स्तर पर, साल्मोनेला दो अलग-अलग प्रतिकृति फेनोटाइप, साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति और साल्मोनेला युक्त रिक्तिकाओं (एससीवी) के भीतर इंट्रावाक्यूलर धीमी प्रतिकृति पेश कर सकता है। साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति आंत लुमेन 3 में भड़काऊ मेजबान कोशिका मृत्यु और साल्मोनेला एक्सट्रूज़न को प्रेरित करतीहै; वैक्यूलर प्रतिकृति एक ट्रांस-एपिथेलियम प्रवेश और प्रणालीगत प्रसारकी ओर ले जाती है। इसलिए, आक्रमण और वैक्यूलर बनाम साइटोसोलिक प्रतिकृति की सीमा संक्रमण के पाठ्यक्रम को प्रभावित करती है।

जीनस साल्मोनेला बहुत विविध है, जिसमें विभिन्न मेजबान-श्रेणियों और बीमारी पैदा करने की क्षमताओं वाले हजारों सीरोटाइप शामिल हैं। उदाहरण के लिए, एस। टाइफिमुरियम को एक सामान्यवादी सेरोवर के रूप में परिभाषित किया गया है, क्योंकि यह कई असंबंधित मेजबानों को संक्रमित करता है, और मानव साल्मोनेलोसिस के प्रमुख कारणों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। अलग तरह से, एस। डर्बी को सूअर-अनुकूलित सेरोवर माना जाता है, क्योंकि यह ज्यादातर सूअर से अलग होता है, लेकिन यह मानव संक्रमणके लिए जिम्मेदार सेरोवार के शीर्ष पांच में भी बताया जाता है। हालांकि, उपकला कोशिकाओं के अंदर जीवाणु व्यवहार के बारे में ज्ञान अनिवार्य रूप से कुछ संदर्भ उपभेदों के अध्ययन तक सीमित है, जैसा कि एस। टाइफिमुरियम एसएल 1344, जो साल्मोनेला रोगजनकता की विशाल प्राकृतिक विविधता का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। उपकला कोशिकाओं के साथ साल्मोनेला के विभिन्न उपभेदों की बातचीत को चिह्नित करना उनकी विभिन्न रोगजनकता को समझने में योगदान देगा। इस कारण से, एक तेज और बड़े पैमाने पर स्वचालित तरीके से बड़ी संख्या में उपभेदों के इंट्रासेल्युलर व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी-आधारित प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में, उपकला कोशिकाओं का संक्रमण 96-वेल इमेजिंग प्लेटों में किया गया था और एक स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवि अधिग्रहण किया गया था। पीपीएआर-डुओ प्लास्मिड का उपयोग फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी5 के माध्यम से उपकला कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला के आक्रमण और प्रतिकृति फेनोटाइप का निरीक्षण करने के लिए किया गया था। यह प्लास्मिड लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर एमचेरी को एन्कोडिंग करने वाले जीन को वहन करता है, जो सभी रूपांतरित जीवाणु कोशिकाओं द्वारा संवैधानिक रूप से व्यक्त किया जाता है, और जीन एन्कोडिंग ग्रीन फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीएफपी, जिसकी अभिव्यक्ति विशेष रूप से यूकेरियोटिक कोशिकाओं के साइटोसोल में मौजूद ग्लूकोज -6-फॉस्फेट द्वारा सक्रिय होती है और एससीवी में अनुपस्थित होती है। इसलिए, प्लास्मिड एमचेरी और जीएफपी संवाददाताओं की अंतर अभिव्यक्ति द्वारा वैक्यूलर और साइटोसोलिक बैक्टीरिया के बीच भेदभाव की अनुमति देता है।

माइक्रोस्कोपी छवियों पर वैक्यूलर और साइटोसोलिक बैक्टीरिया को आमतौर पर मैन्युअल स्कोरिंग6 द्वारा निर्धारित किया जाता है, लेकिन यह एक समय लेने वाली विधि है जो विश्लेषण को नमूनों की एक छोटी संख्या तक सीमित करती है। इसलिए, दो पूरक और स्वचालित छवि विश्लेषण विकसित किए गए थे- क्षेत्र विश्लेषण और एकल-सेल विश्लेषण-इमेजजे7, एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके। क्षेत्र विश्लेषण प्रत्येक अधिग्रहित माइक्रोस्कोपी छवि में उपकला कोशिकाओं, लाल और हरे साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्रों के डेटा का उपयोग करके समग्र इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल लोड और साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति की सीमा को मापता है । इस विधि को कम आवर्धन पर प्राप्त छवियों पर लागू किया जा सकता है; इसलिए, यह कुछ छवियों के साथ उपकला कोशिकाओं की एक उच्च संख्या को स्कोर करने की अनुमति देता है, जिससे अधिग्रहण का समय कम हो जाता है। एकल-कोशिका विश्लेषण संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिशत, औसत वैक्यूलर लोड और एकल-कोशिका संकल्प के साथ साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति से गुजरने वाली संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए सेल विभाजन का उपयोग करता है।

इस प्रोटोकॉल में, छवि विश्लेषण के सभी चरणों को मैन्युअल रूप से किए जाने के लिए विस्तार से वर्णित किया गया है, लेकिन एक ही विश्लेषण हमारे विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए इमेजजे स्क्रिप्ट द्वारा स्वचालित किया जा सकता है। ये स्क्रिप्ट कई छवियों का स्वचालित रूप से विश्लेषण करने के लिए बैच विश्लेषण चलाने की अनुमति देती हैं और इस प्रकार विधि के निष्पादन को गति देती हैं।

Protocol

1. साल्मोनेला के साथ उपकला कोशिकाओं का संक्रमण जिसमें पीपीएआर-डुओ रिपोर्टर प्लास्मिड होता है

नोट: एक मल्टीचैनल पिपेट की सिफारिश की जाती है।

  1. उपयोग से ठीक पहले कोलेजन के साथ काली दीवारों और फ्लैट ग्लास बॉटम के साथ 96-वेल इमेजिंग प्लेटों को कोट करें।
    1. 20 एमएम एसिटिक एसिड समाधान प्राप्त करने के लिए रासायनिक हुड के नीचे बाँझ डिमिनरलाइज्ड पानी में पतला ग्लेशियल एसिटिक एसिड (17.4 एम)। बाँझ स्थितियों के तहत, 0.2 μm छिद्र आकार के साथ सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें। घोल को 0-4 डिग्री सेल्सियस रैक में 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
    2. प्री-कूल्ड 20 एमएम एसिटिक एसिड घोल में 3 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन स्टॉक को 50 μg / mL तक पतला करें। कोलेजन जेलिंग से बचने के लिए घोल को 0-4 डिग्री सेल्सियस रैक में रखते हुए, प्रति अच्छी तरह से कोलेजन समाधान के 30 μL (कोलेजन / सेमी2 का 5 μg) वितरित करें।
    3. सुनिश्चित करें कि कुएं के तल पूरी तरह से कोलेजन से ढके हुए हैं, और फिर कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 घंटे के लिए लैमिनार प्रवाह के तहत प्लेट छोड़ दें।
    4. धीरे से घोल को हटा दें और फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 30 μL के साथ तीन वॉश करें। कोलेजन डिटेचमेंट से बचने के लिए मल्टीचैनल 100 μL या 50 μL पिपेट का उपयोग करें।
  2. संक्रमण से 20-24 घंटे पहले कोलेजन-लेपित इमेजिंग प्लेटों में आईएनटी 407 उपकला कोशिकाएं।
    1. नियमित रूप से 25 सेमी2 फ्लास्क में आईएनटी 407 कोशिकाओं को न्यूनतम आवश्यक माध्यम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ कल्चर करें, इसके बाद परिभाषित संस्कृति माध्यम (सीएम), पेनिसिलिन 100 यू / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 μg / mL (पेन / स्ट्रेप) के साथ पूरक।
    2. 5 एमएल पीबीएस के साथ दो बार आईएनटी 407 फ्लास्क धोएं, और फिर संक्रमण से20-24 घंटे पहले ह्यूमिडिफाइड 5% सीओ 2 वातावरण में 3-5 मिनट के लिए 3-5 मिनट के लिए ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को अलग करें। कोशिकाओं की गणना करें और सीएम में 3 x 105 कोशिकाएं / एमएल निलंबन तैयार करें।
    3. 100% संगम प्राप्त करने के लिए कोलेजन-लेपित इमेजिंग प्लेटों में सेल निलंबन / अच्छी तरह से 100 μL वितरित करें। सेल आसंजन की सुविधा के लिए 1 घंटे के लिए ह्यूमिडिफाइड 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, 100 μL CM जोड़ें और संक्रमण तक20-24 घंटे के लिए ह्यूमिडिफाइड 5% CO2 वातावरण में 37 °C पर इनक्यूबेट करें (चरण 1.4)।
      नोट: इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया की छवि बनाने के लिए, साल्मोनेला उपभेदों को पीपीएआर-डुओ रिपोर्टर प्लास्मिड के साथ बदल दिया जाता है जो डॉ ओलिविया स्टील-मोर्टिमर द्वारा प्रदान किया गया था। यहां परीक्षण किए गए उपभेदों को प्रोटोकॉल द्वारा कवर किए गए फेनोटाइप विविधता का प्रतिनिधित्व करने और अनुभाग 4 में छवि विश्लेषण को मान्य करने के लिए चुना गया था। इस अध्ययन में उपयोग किए गए उपभेदों के बारे में अधिक जानकारी के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें।
  3. साल्मोनेला उपभेदों की स्थिर-चरण संस्कृतियों को तैयार करें जो पीपीएआर-डुओ रिपोर्टर प्लास्मिड ले जाते हैं।
    1. साल्मोनेला ग्लिसरॉल स्टॉक को 10 μL पिपेट की नोक के साथ नमूना लें और इसे 1 एमएल लुरिया बर्टानी शोरबा (10 ग्राम ट्रिप्टोन, 5 ग्राम खमीर निकालने, और 10 ग्राम सोडियम क्लोराइड प्रति लीटर) में इंजेक्ट करें, जो एम्पीसिलीन 100 μg / mL के साथ पूरक है।
    2. संक्रमण से पहले 20 घंटे के लिए इनोकुलम को स्थिर रूप से 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ताकि विकास के स्थिर चरण तक पहुंचा जा सके, जो ~ 1 x 109 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू)/एमएल8 के अनुरूप है।
  4. साल्मोनेला के साथ आईएनटी 407 उपकला कोशिकाओं को संक्रमित करें।
    नोट: संक्रमण तीन प्रतियों में किए जाते हैं।
    1. धीरे से आईएनटी 407 कोशिकाओं को पीबीएस / कुएं के 200 μL के साथ धोएं।
    2. संक्रमण की बहुलता (एमओआई) के रूप में परिभाषित प्रति उपकला कोशिका में सीएफयू की वांछित संख्या प्राप्त करने के लिए सीएम में रात भर बैक्टीरिया को पतला करके साल्मोनेला इनोकुलम तैयार करें। यहां एमओआई 100 का इस्तेमाल किया गया था।
    3. 200 μL / कुएं को टीका लगाएं, और फिर प्लेट को एक सांस लेने योग्य सीलिंग झिल्ली के साथ कवर करें और 1 घंटे के लिए ह्यूमिडिफाइड 5%CO2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। टीकाकरण को संक्रमण का समय शून्य माना जाता है।
    4. इनोकुलम को निकालें और धीरे-धीरे पीबीएस / कुएं के 200 μL से धो लें, और फिर जेंटामाइसिन 100 μg / mL प्रति अच्छी तरह से 200 μL CM जोड़ें। प्लेट को एक सांस लेने योग्य सीलिंग झिल्ली के साथ कवर करें, और फिर 1 घंटे के लिए ह्यूमिडिफाइड 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. सीएम को जेंटामाइसिन 100 μg / mL के साथ निकालें और धीरे से 200 μL PBS / अच्छी तरह से धो लें। जेंटामाइसिन 10 μg/mL प्रति अच्छी तरह से 200 μL CM जोड़ें, प्लेट को एक सांस लेने योग्य सीलिंग झिल्ली के साथ कवर करें, और फिर 8 घंटे के लिए ह्यूमिडिफाइड 5%CO2 वातावरण में 37 °C पर इनक्यूबेट करें।

2. नमूना निर्धारण और उपकला कोशिका धुंधला होना

नोट: प्रत्यक्ष प्रकाश जोखिम से सुरक्षित नमूने बनाए रखें। वॉल्यूम 96-वेल प्लेट के कुओं के लिए इंगित किए जाते हैं। वॉल्यूम ऑप्टिमाइज़ेशन विभिन्न सेल कल्चर प्लेटों या समर्थन के लिए आवश्यक है।

  1. संक्रमण के बाद 8 घंटे पर, सीएम को हटा दें और धीरे से पीबीएस के 200 μL / वेल के साथ तीन बार धोएं। शोषक कागज पर प्लेट को इनवर्ट करके पीबीएस को हटा दें; पसीना बहाने से बचें।
  2. संक्रमित मोनोलेयर को 100 μL/well पैराफॉर्मलडिहाइड (PFA) 4% के साथ RT पर 20 मिनट के लिए PBS में ठीक करें। PFA को 4% निकालें और PBS के 200 μL/वेल से तीन बार धोएं। प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम 16-24 घंटे के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। अगले चरण के साथ आगे बढ़ें।
  3. उपकला कोशिकाओं को दाग दें।
    नोट: DAPI (4', 6-diamidino-2-फेनिलइंडोल) डीएनए दाग (चरण 2.3.1) का उपयोग केवल नाभिक को दागने के लिए क्षेत्र विश्लेषण के लिए किया जाता है, और उच्च सामग्री स्क्रीनिंग (HCS) दाग (चरण 2.3.2) का उपयोग पूरे उपकला कोशिका को दागने के लिए एकल-कोशिका विश्लेषण के लिए किया जाता है। अन्य सेलुलर दाग का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के अनुकूलन की आवश्यकता है।
    1. क्षेत्र विश्लेषण: DAPI (PBS में 300 nM समाधान) के 100 μL / वेल को वितरित करें और प्रकाश से सुरक्षित आरटी पर 5 मिनट का इनक्यूबेट करें।
    2. एकल-कोशिका विश्लेषण: RT पर 15 मिनट के लिए PBS में ट्राइटन 0.1x के 100 μL/वेल के साथ परमेबिलाइज करें। पीबीएस के साथ तीन बार धोएं और PBS में 1:2000 को पतला HCS दाग के 100 μL/well से निकालें। प्रकाश से सुरक्षित आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. धुंधला घोल निकालें और पीबीएस के 200 μL / वेल के साथ तीन बार धोएं। स्वचालित छवि अधिग्रहण के लिए पीबीएस के 50 μL / वेल जोड़ें।

3. एक स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ छवि अधिग्रहण

नोट: यहां, क्षेत्र विश्लेषण के लिए चरण 3.1.1 में कम आवर्धन (10x/0.3 NA, 1 μm/पिक्सेल उद्देश्य) और चरण 3.1.2 में उच्च आवर्धन (40x/0.75 NA, 0.255 μm/पिक्सेल उद्देश्य) एकल-सेल विश्लेषण के लिए अधिग्रहण प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है। अन्य आवर्धन का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के अनुकूलन की आवश्यकता है। यदि उपलब्ध माइक्रोस्कोप द्वारा अनुमति दी जाती है, तो बड़े नमूना क्षेत्रों को रिकॉर्ड करने के लिए टाइल्स नामक सन्निहित क्षेत्रों का एक "मोज़ेक" टाइल्स (टीआर) के रूप में छवियां प्राप्त करें। ऑटोफोकस प्रक्रिया के दौरान नमूना जोखिम को कम करने के लिए, प्रत्येक टाइल के लिए एक सेट करने के बजाय टीआर के केंद्र में ऑटोफोकस सेट करें।

  1. संदर्भ जेड-स्थिति के रूप में सेल स्टेनिंग चैनल (एचसीएस स्टेन और डीएपीआई परमाणु दाग के लिए नीला चैनल) में सॉफ्टवेयर ऑटोफोकस का उपयोग करें। सेल स्टेनिंग चैनल (465 एनएम, कोशिकाओं या नाभिक) और पीपीएआर-डुओ रिपोर्टर चैनलों एमचेरी (610 एनएम, इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला) और जीएफपी (509 एनएम, साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला) में छवियां प्राप्त करें।
    1. क्षेत्र विश्लेषण: छवि ≥104 कोशिकाएं / तकनीकी प्रतिकृति (यानी, चार टाइलों के कम से कम तीन टीआर / तकनीकी प्रतिकृति के अनुरूप अच्छी तरह से अनुशंसित हैं) 10x आवर्धन पर।
      नोट: एक एकल जेड-प्लेन 10x आवर्धन पर वैक्यूलर युक्त कोशिकाओं और साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला युक्त कोशिकाओं दोनों को चित्रित करने के लिए पर्याप्त है।
    2. एकल-कोशिका विश्लेषण: छवि ≥1,000 कोशिकाओं / तकनीकी प्रतिकृति (यानी, तकनीकी प्रतिकृति के अनुरूप 16 टाइल्स / अच्छी तरह से कम से कम दो टीआर की सिफारिश की जाती है) 40 x आवर्धन पर। वैक्यूलर युक्त कोशिकाओं और साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला युक्त कोशिकाओं दोनों को चित्रित करने के लिए कई जेड-प्लेन की आवश्यकता होती है। इष्टतम जेड-स्टैक को परिभाषित करें (आठ जेड-प्लेन प्राप्त करने के लिए 0.55 μm अंतराल के साथ 3.85 μm z-स्टैक को 40x पर साइटोसोलिक हाइपर-रेप्लिकेटेड साल्मोनेला से संक्रमित INT407 कोशिकाओं की छवि के लिए इंगित किया गया है)। प्रत्येक जेड-प्लेन को बाद में एन /8 के रूप में पहचाना जाता है, जिसमें एन 1 (नीचे जेड-प्लेन के अनुरूप) और 8 (शीर्ष जेड-प्लेन के अनुरूप) के बीच होता है।
  2. प्रत्येक अधिग्रहण का आउटपुट एक फ़ाइल है जिसे Acquisition.czi नाम दिया गया है जिसमें सभी फ़ील्ड, चैनल और z-प्लेन की छवियां शामिल हैं। यदि टीआर का अधिग्रहण किया गया था, तो सिलाई विधि के लिए इनपुट के रूप में एकल अधिग्रहण.czi फ़ाइल का उपयोग करके प्रत्येक TR की समग्र छवि प्राप्त करने के लिए टाइलों को एक साथ फ्यूज करें।

4. ImageJ का उपयोग कर छवि विश्लेषण

नोट: चरण 4.1 और चरण 4.2 विशेष रूप से ऊपर वर्णित प्रयोग और अधिग्रहण के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। अन्य प्रयोगात्मक सेटिंग्स को विश्लेषण के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। एकल Acquisition.czi फ़ाइल का विश्लेषण वर्णित है। बैच विश्लेषण के लिए, पूरक फ़ाइलों (पूरक फ़ाइल 1 और पूरक फ़ाइल 2) के रूप में एकल-सेल विश्लेषण स्क्रिप्ट और क्षेत्र विश्लेषण स्क्रिप्ट ढूंढें। स्क्रिप्ट और इमेजजे कमांड में उपयोग किए जाने वाले लेबल नीचे दिए गए अनुभागों में बोल्ड में हैं।

  1. क्षेत्र विश्लेषण
    1. ImageJ में Acquisition.czi फ़ाइल खोलें, जिसे स्क्रिप्ट में अधिग्रहण शीर्षक के रूप में नामित किया गया है: फ़ाइल > open > AcquisitionTitle.czi. सभी चैनलों को दिखाने वाली एक विंडो खुल जाएगी। अधिग्रहण आदेश के आधार पर चैनलों को सी: 1-3/3 के रूप में दर्शाया गया है। यहां, सी: 1/3 नीले (डीएपीआई), सी: 2/3 से एमचेरी (इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला), और सी: 3/3 जीएफपी (साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला) से मेल खाती है।
    2. चरण 4.1.6 और 4.1.7 में क्षेत्र माप के लिए छवियां तैयार करने के लिए यादृच्छिक शोर कम करें।
      1. अधिग्रहण शीर्षक 1 विंडो प्राप्त करने के लिए छवि > डुप्लिकेट > ठीक का उपयोग करके अधिग्रहण शीर्षक विंडो डुप्लिकेट करें।
      2. गॉसियन ब्लर > प्रोसेस > फिल्टर के माध्यम से अधिग्रहण शीर्षक 1 पर गॉसियन ब्लर लागू करें। डिफ़ॉल्ट सिग्मा मान को 2 के रूप में छोड़ दें, और ओके पर क्लिक करें। एक प्रोसेस स्टैक विंडो खुलेगी, सभी चैनलों को संसाधित करने के लिए हां पर क्लिक करें।
      3. प्रक्रिया > छवि कैलकुलेटर द्वारा मूल फ़ाइल अधिग्रहण शीर्षक से गॉसियन-फ़िल्टर किए गए अधिग्रहण शीर्षक 1 को घटाएं: छवि 1 के रूप में अधिग्रहण शीर्षक का चयन करें, ड्रॉपडाउन सूची में ऑपरेशन घटाएं, और फिर छवि 2 के रूप में अधिग्रहण शीर्षक 1 का चयन करें। OK पर क्लिक करें। एक प्रक्रिया स्टैक? विंडो खुल जाएगी। परिणाम अधिग्रहण शीर्षक विंडो प्राप्त करने के लिए सभी तीन छवियों (चैनलों) को संसाधित करने के लिए हाँ पर क्लिक करें।
    3. छवि > रंग > स्प्लिट चैनलों के माध्यम से विभाजित चैनल। प्रत्येक चैनल छवि अब एक अलग विंडो में दिखाई जाती है, जिसे स्वचालित रूप से ImageJ द्वारा C-ResultsOfQuisitionTitle के रूप में नामित किया जाता है। यहां सी 1-परिणाम अधिग्रहण शीर्षक डीएपीआई, सी 2-परिणाम अधिग्रहण शीर्षक से एमचेरी (इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला) और सी 3-परिणाम जीएफपी (साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला) के लिए अधिग्रहण शीर्षक के परिणाम से मेल खाती है।
    4. उपकला कोशिका नाभिक द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र को मापने के लिए सी 1-परिणाम अधिग्रहण शीर्षक छवि को संसाधित करें।
      1. नाभिक क्षेत्र के अंदर छेद के रूप में दिखाई देने वाले न्यूक्लियोलस को समरूप करने के लिए प्रक्रिया > चिकनी पर नेविगेट करें।
      2. छवि > समायोजित > सीमा का उपयोग करके पृष्ठभूमि को बाहर करने के लिए C1-ResultsOfAcquisitionTitle छवि को थ्रेशोल्ड करें: डार्क पृष्ठभूमि की जांच करें और ड्रॉपडाउन सूची में लाल का चयन करें। त्रिभुज ऑटो-थ्रेशोल्ड सेट करें, और फिर नाभिक लाल दिखाई देने पर न्यूनतम थ्रेशोल्ड मान सेट करने के लिए ऊपरी स्लाइडर का उपयोग करें, और पृष्ठभूमि काली दिखाई देती है (थ्रेशोल्ड = 100, इस प्रोटोकॉल में लागू)।
        नोट: चरण 4.1.4.2, 4.1.7, 4.2.3.6.1, और 4.2.4.3 में वर्णित ऑटो-थ्रेसहोल्ड को उपयोगकर्ता के लिए क्रमशः नाभिक / उपकला कोशिकाओं और बैक्टीरिया के लिए मैन्युअल रूप से सर्वोत्तम फिटिंग सीमा को परिभाषित करने के लिए एक गाइड के रूप में सुझाया गया है। ऑटो-थ्रेशोल्ड का मूल्य परिभाषित मैनुअल सीमा द्वारा स्क्रिप्ट में ओवरराइड किया जाएगा। परिभाषित मैनुअल सीमा पूरे बैच विश्लेषण पर लागू की जाएगी।
    5. विश्लेषण > सेट माप का उपयोग करके ब्याज के मापकों का चयन करें: माप को थ्रेशोल्ड पिक्सेल तक सीमित करने के लिए सीमा की जांच करें। चेक एरिया, थ्रेशोल्ड पिक्सल द्वारा कब्जा किए गए कुल क्षेत्र के अनुरूप (यानी, सी 1-परिणाम अधिग्रहण शीर्षक में नाभिक, सी 2 में इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला- अधिग्रहण शीर्षक के परिणाम, सी 3 में साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला- अधिग्रहण शीर्षक के परिणाम)। परिणाम तालिका में प्रत्येक छवि के लिए अधिग्रहण शीर्षक और चैनल रिकॉर्ड करने के लिए प्रदर्शन लेबल की जाँच करें।
    6. विश्लेषण > माप का उपयोग करके नाभिक द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र को मापें। माप परिणाम तालिका में दर्ज किए जाते हैं जो स्वचालित रूप से खुलता है।
    7. प्रक्रिया सी 2-परिणाम अधिग्रहण शीर्षक और सी 3-परिणाम क्रमशः समग्र इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला और साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र को मापने के लिए। कुछ संशोधनों के साथ चरण 4.1.4-4.1.6 का पालन करें: चरण 4.1.4.1 में स्मूथिंग चरण को छोड़ दें और चरण 4.1.4.2 में त्रिकोण के बजाय ओत्सु ऑटो-थ्रेशोल्ड का उपयोग करें ताकि न्यूनतम थ्रेशोल्ड मान (ऊपरी स्लाइडर) सेट किया जा सके जब साल्मोनेला लाल दिखाई देता है और पृष्ठभूमि काली दिखाई देती है (थ्रेशोल्ड = 200 सुझाया गया)।
    8. सभी फ़ाइलों के रूप में सहेजें > फ़ाइल > रूप में सहेजें का उपयोग करके परिणाम तालिका सहेजें।
    9. प्रत्येक विश्लेषित अधिग्रहण शीर्षक फ़ाइल के लिए क्षेत्र अनुपात की गणना करने के लिए स्प्रेडशीट में परिणाम तालिका खोलें :
      1. संक्रमण अनुपात की गणना करें: उपकला कोशिका नाभिक (यहां DAPI, C1-) द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र द्वारा कुल इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला (यहां लाल चैनल, C2-) द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र को विभाजित करें।
      2. हाइपर-प्रतिकृति अनुपात की गणना करें: साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला (ग्रीन चैनल, सी 3-) द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र को कुल इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला (लाल चैनल, सी 2-) द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र से विभाजित करें।
  2. एकल-कोशिका विश्लेषण
    1. ImageJ में Open Acquisition.czi फ़ाइल खोलें, स्क्रिप्ट में अधिग्रहण शीर्षक के रूप में नामित: फ़ाइल मेनू > open > Acquisition.czi. सभी चैनलों और सभी जेड-विमानों की छवियों को दिखाने वाली एक विंडो खुल जाएगी।
    2. चैनलों को छवि > रंग > स्प्लिट चैनलों द्वारा विभाजित करें। चैनल अब अलग-अलग विंडो में दिखाए जाते हैं, स्वचालित रूप से इमेजजे द्वारा सी-अधिग्रहण शीर्षक के रूप में नामित किया जाता है। यहां, सी 1-अधिग्रहण शीर्षक खिड़की उपकला कोशिकाओं (नीले), सी 2-अधिग्रहण शीर्षक खिड़की इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला (एमचेरी) से मेल खाती है, और सी 3-अधिग्रहण शीर्षक खिड़की साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला चैनल (जीएफपी) से मेल खाती है। प्रत्येक सी-अधिग्रहण शीर्षक विंडो में अधिग्रहित सभी जेड-विमान शामिल हैं।
    3. प्रक्रिया करें C1-अधिग्रहण शीर्षक खिड़की, उपकला कोशिकाओं के अनुरूप, कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए।
      1. सेल विभाजन के लिए उपयोग करने के लिए जेड-प्लेन छवि चुनें। C1-अधिग्रहण शीर्षक विंडो का चयन करें और डुप्लिकेट > छवि का उपयोग करें: चुने हुए z-प्लेन की संख्या लिखें (यानी, z 1/8 का चयन करने के लिए 1), शीर्षक बॉक्स में C1Zplan लिखें, डुप्लिकेट स्टैक को अनचेक करें, और फिर केवल चयनित z-प्लेन छवि को डुप्लिकेट करने के लिए OK पर क्लिक करें। चयनित जेड-प्लेन छवि दिखाने वाली सी 1 जेडप्लेन नामक एक विंडो खुल जाएगी।
      2. छवि कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए प्राप्त C1ZPlan छवि को संसाधित करें। कंट्रास्ट को बढ़ाने > खुली प्रक्रिया: संतृप्त पिक्सेल समायोजित करें (यानी, यहां 1% का उपयोग किया जाता है) और सामान्यीकृत की जांच करें। फिर, कंट्रास्ट-सामान्यीकृत C1ZPlan छवि प्राप्त करने के लिए कंट्रास्ट एन्हांसमेंट तकनीक को लागू करने के लिए ओके पर क्लिक करें।
      3. उपकला कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए कंट्रास्ट-सामान्यीकृत सी 1 जेडप्लेन छवि को संसाधित करें। FindMaxima मेनू खोलने के लिए मैक्सिमा खोजने के लिए प्रक्रिया > Find Maxima का उपयोग करें: सबसे पहले, हर एक उपकला कोशिका को केवल एक मैक्सिमा बिंदु की विशेषता देने के लिए शोर सहिष्णुता सेट करने के लिए पूर्वावलोकन बिंदु चयन को ध्वजांकित करें। ध्वज को बाहर करें एज मैक्सिमा. आउटपुट प्रकार खंडित कणों का चयन करें और C1ZPlanSegmented प्राप्त करने के लिए OK पर क्लिक करें, एक नया बाइनरी मास्क जैसी छवि जो प्रत्येक खंडित कण प्रति मैक्सिमा बिंदु चिह्नित दिखाती है।
        नोट: फाइंड मैक्सिमा इमेजजे एल्गोरिथ्म का उपयोग कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए किया जाता है। मैक्सिमा बिंदु (पिक्सेल तीव्रता शिखर) छवि में पाए जाते हैं, संभवतः कोशिकाओं के अनुरूप। एक शोर सीमा (शोर सहिष्णुता) निर्धारित की जाती है, और मैक्सिमा बिंदुओं के आसपास के सन्निहित क्षेत्र का विश्लेषण प्रति मैक्सिमा बिंदु प्रत्येक खंडित कण को परिभाषित करने वाली द्विआधारी मुखौटा जैसी छवि बनाने के लिए किया जाता है, इसलिए प्रत्येक सेल।
      4. खंडित कोशिकाओं का मुखौटा बनाने के लिए सी 1 जेडप्लेन सेगमेंटेड छवि। कणों का विश्लेषण > विश्लेषण करें: मास्क दिखाएं और किनारों पर बाहर करें विकल्प का चयन करें। सेल क्लस्टर और सेल अंशों जैसे गलत रूप से खंडित वस्तुओं को बाहर करने के लिए, आकार पैरामीटर के अनुरूप मास्क में शामिल करने के लिए खंडित कणों की क्षेत्र सीमा को समायोजित करें। गलती से खंडित वस्तुओं के क्षेत्र को स्कोर करने के लिए, टूलबार में वांड ट्रेसिंग टूल का उपयोग करें: वांड के साथ कण का चयन करें, और फिर गलत वस्तुओं के क्षेत्र को मापने के लिए विश्लेषण > माप खोलें। आकार अंतराल (सुझाई गई सीमा 250-1700 पिक्सेल2) सेट करें और मास्कोफसी 1 जेडप्लेन सेगमेंटेड बाइनरी मास्क प्राप्त करने के लिए ओके पर क्लिक करें।
      5. डिफ़ॉल्ट रूप से, MaskOfC1ZPlanSegmented बाइनरी मास्क में एक इनवर्टिंग एलयूटी है। उपकरण पट्टी में LUT > Invert LUT का उपयोग करें।
      6. सेल विभाजन को सही करने के लिए MaskOfC1ZplanEसेगमेंटेड बाइनरी मास्क को संसाधित करें:
        1. चरण 4.2.3.2 में प्राप्त थ्रेशोल्ड कंट्रास्ट-सामान्यीकृत सी 1 जेडप्लेन छवि। छवि का उपयोग करें > > दहलीज समायोजित करें: अंधेरे पृष्ठभूमि की जांच करें। डिफ़ॉल्ट ऑटो-थ्रेशोल्ड सेटिंग सेट करें। लाल विकल्प चुनें और न्यूनतम कटऑफ मान (ऊपरी पट्टी) को समायोजित करें जब तक कि कोशिकाएं पूरी तरह से लाल दिखाई न दें, अंधेरे पृष्ठभूमि को छोड़ दें (इस प्रोटोकॉल में लागू थ्रेशोल्ड = 8,000)। फिर, कंट्रास्ट-सामान्यीकृत सी 1 जेडप्लेन छवि को सफेद में कोशिकाओं और काले रंग में पृष्ठभूमि के साथ बाइनरी छवि में बदलने के लिए लागू करें पर क्लिक करें।
        2. मास्कऑफसी 1 जेडप्लेन सेगमेंटेड बाइनरी मास्क में सही सेल विभाजन। इमेज कैलकुलेटर > प्रक्रिया का उपयोग करें: छवि 1 के रूप में विभाजित मास्कऑफ़सी 1 जेडप्लेन का चयन करें, ऑपरेशन चुनें और ड्रॉपडाउन सूची में, और फिर छवि 2 के रूप में थ्रेशोल्ड कंट्रास्ट-सामान्यीकृत सी 1 जेडप्लेन का चयन करें। OK पर क्लिक करें। आउटपुट छवि को स्वचालित रूप से इमेजजे द्वारा सी 1 जेडप्लेन सेगमेंटेड के मास्क के परिणाम के रूप में नामित किया गया है।
      7. C1Zplan के मास्क के प्रक्रिया परिणाम प्रत्येक एकल-खंडित सेल को रुचि के क्षेत्र (ROI) के रूप में लेबल करने के लिए खंडित हैं। कणों का विश्लेषण > विश्लेषण करें का उपयोग करें। चरण 4.2.3.4 में आकार समायोजित करें, और उसके बाद कुछ भी न दिखाएँ विकल्प का चयन करें। ROI प्रबंधक उपकरण में सभी कणों (खंडित कक्षों) को जोड़ने के लिए प्रबंधक में जोड़ें की जाँच करें। इसके अलावा, किनारों पर बाहर की जांच करें। OK पर क्लिक करें। ROI प्रबंधक मेनू सभी कणों (खंडित कोशिकाओं) की एक सूची दिखाएगा, जिन्हें ROIs के रूप में परिभाषित किया गया है, जो विशिष्ट रूप से उनके संबंधित y और x निर्देशांक के साथ लेबल किए गए हैं।
      8. RoI डेटा को ROI-cells-acquisitionTitle.zip के रूप में RoI प्रबंधक मेनू के माध्यम से अधिक > सहेजें पर क्लिक करके सहेजें। आरओआई-सेल-अधिग्रहण शीर्षक.zip एकल सेल विश्लेषण के लिए चरण 4.2.4.6 में खोला जाएगा।
    4. प्रक्रिया करें C2-अधिग्रहण शीर्षक विंडो (यहां लाल चैनल), इंट्रासेल्युलर के अनुरूप Salmonellae, संक्रमित कोशिकाओं की संख्या और इंट्रासेल्युलर वैक्यूलर लोड को मापने के लिए।
      1. साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला के आउट-ऑफ-फोकस पिक्सेल को हटाने के लिए लाल चैनल (सी 2-) से हरे चैनल (सी 3-) को घटाएं।
        1. छवि कैलकुलेटर > प्रक्रिया का उपयोग करें। छवि 1 के रूप में C2-अधिग्रहण शीर्षक का चयन करें, ड्रॉपडाउन सूची में कार्रवाई घटाएँ चुनें, और फिर छवि 2 के रूप में C3-अधिग्रहण शीर्षक का चयन करें। नई विंडो बनाएं की जाँच करें और OK पर क्लिक करें।
        2. प्रक्रिया स्टैक में हां पर क्लिक करके पूरे जेड-स्टैक में घटाव लागू करें? खिड़की। आउटपुट विंडो को स्क्रिप्ट में ResultsOfC2अधिग्रहण शीर्षक नाम दिया गया है।
      2. यादृच्छिक शोर को कम करने के लिए सी 2 अधिग्रहण शीर्षक की प्रक्रिया परिणाम।
        1. डुप्लिकेट > छवि मेनू पर क्लिक करके परिणामों की डुप्लिकेट करेंसी2अधिशीक्षक शीर्षक विंडो। डुप्लिकेट स्टैक की जाँच करें और परिणाम के परिणाम प्राप्त करने के लिए OK दबाएँ।
        2. गॉसियन ब्लर को प्रोसेस > फिल्टर > गॉसियन ब्लर के माध्यम से परिणामों के परिणामों पर लागू करें। सिग्मा मान को 2 के रूप में छोड़ दें या इसे अनुकूलित करें (यानी, यहां सिग्मा: 4 का उपयोग किया गया था)। ओके पर क्लिक करें और प्रोसेस स्टैक में हां पर क्लिक करके गॉसियन ब्लर को पूरे जेड-स्टैक पर लागू करें।
        3. प्रक्रिया > छवि कैलकुलेटर पर क्लिक करके गॉसियन फ़िल्टर किए गए परिणामों को घटाएं। छवि 1 के रूप में परिणाम C2अधिग्रहण शीर्षक का चयन करें, ड्रॉपडाउन सूची में कार्रवाई घटाएँ चुनें, और फिर छवि 2 के रूप में परिणाम C2अधिग्रहण शीर्षक 1 का चयन करें। OK पर क्लिक करें। C2-अधिग्रहण शीर्षक के परिणामों के परिणामों के रूप में ImageJ द्वारा स्वचालित रूप से नामित विंडो प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया स्टैक में हाँ पर क्लिक करके पूरे z-स्टैक में घटाव लागू करें।
      3. पृष्ठभूमि से साल्मोनेला को अलग करने के लिए सी 2-अधिग्रहण शीर्षक के परिणामों के परिणामों को संसाधित करें। छवि का उपयोग करें > > दहलीज समायोजित करें: डार्क पृष्ठभूमि की जांच करें और ओत्सु ऑटो-थ्रेशोल्ड सेट करें। न्यूनतम कटऑफ मान (ऊपरी पट्टी) को समायोजित करें जब तक कि साल्मोनेला पूरी तरह से लाल दिखाई न दे, जिससे अंधेरे पृष्ठभूमि (इस प्रोटोकॉल में लागू थ्रेशोल्ड = 100) न हो। लागू करें पर क्लिक करें और बाइनरी में परिवर्तित विंडो खुल जाएगी: काले पृष्ठभूमि की जांच करें, और फिर ओके पर क्लिक करें। पूर्ण जेड-स्टैक अब बाइनरी छवियों में परिवर्तित हो गया है।
      4. चरण 4.2.4.3 से C2-अधिग्रहण शीर्षक द्विआधारी विंडो के परिणामों में, वैक्यूलर साल्मोनेला फोकस प्लेन के अनुरूप मध्य-Z-प्लेन का चयन करें: छवि > स्टैक्स > सेट स्लाइस और पसंद के z-प्लेन की संख्या लिखें (उदाहरण के लिए, यहां z: 4/8 का उपयोग किया जाता है)। OK पर क्लिक करें।
      5. प्रत्येक ROI (सेल) के लिए रिकॉर्ड करने के लिए माप सेट करें। विश्लेषण > सेट माप का उपयोग करें: प्रत्येक आरओआई के कुल क्षेत्रफल के अनुरूप क्षेत्र की जांच करें। प्रत्येक आरओआई के लिए थ्रेशोल्ड पिक्सल (इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला) द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र अंश को रिकॉर्ड करने के लिए क्षेत्र अंश और सीमा से सीमा की जांच करें। परिणाम तालिका में छवि शीर्षक, चैनल, जेड-प्लेन और एक्स-वाई निर्देशांक के साथ हर एक ROI को लेबल करने के लिए डिस्प्ले लेबल पर जांचें।
      6. इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला के चुने हुए जेड-प्लेन को हर एक सेल (ROI) के लिए साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए लेबल, क्षेत्र और % क्षेत्र को रिकॉर्ड करने के लिए संसाधित करें: ROI-कोशिकाओं-अधिग्रहण शीर्षक.zip फ़ाइल खोलें, जिसे चरण 4.2.3.8 में सहेजा गया है, फ़ाइल > खोलें और ROI प्रबंधक मेनू में माप पर क्लिक करें। आउटपुट चयनित मापों की रिपोर्ट करने वाली एक तालिका है।
      7. परिणाम विंडो में फ़ाइल > के रूप में सहेजें का उपयोग करके परिणाम तालिका सहेजें।
      8. स्प्रेडशीट में ओपन रिजल्टटेबल : इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए लेबल क्षेत्र और % क्षेत्र को प्रत्येक आरओआई के लिए इंगित किया जाता है, जो एक्स और वाई निर्देशांक के साथ विशिष्ट रूप से पहचाने जाने वाले एक कंटूर्ड सेल के अनुरूप होता है।
      9. साल्मोनेला के अनुरूप थ्रेशोल्ड पिक्सेल द्वारा कब्जा किए गए %एरिया > 0 दिखाने वाले आरओआई के अनुरूप संक्रमित कोशिकाओं की संख्या को मापें (यानी, यहां संक्रमित कोशिकाओं की पहचान करने के लिए % क्षेत्र > 0.2% माना जाता है)। फिर, कुल कोशिकाओं पर संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करें।
      10. सभी संक्रमित कोशिकाओं के लिए वैक्यूलर साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए औसत % क्षेत्र की गणना करके साल्मोनेला / सेल के वैक्यूलर लोड को मापें।
    5. साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला दिखाने वाली कोशिकाओं की संख्या को मापने के लिए ग्रीन चैनल (सी 3-अधिग्रहण शीर्षक) को संसाधित करें। चरण 4.2.4.2 से 4.2.4.9 तक का पालन करें, लेकिन कुछ संशोधनों के साथ।
      1. ऊपरी जेड-प्लेन (यहां जेड: 7/8) पर काम करें, क्योंकि साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला दिखाने वाली कोशिकाएं मोनोलेयर से निकलती हैं; इसलिए, वे हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला के बिना कोशिकाओं की तुलना में एक अलग विमान पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं।
      2. साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए उच्च % क्षेत्र को दिखाने वाली कोशिकाओं (आरओआई) द्वारा साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला (हरा) युक्त कोशिकाओं की संख्या को मापें (उदाहरण के लिए, 20% > % को साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला युक्त कोशिकाओं की पहचान करने के लिए माना जाता है)। फिर, चरण 4.2.4.9 में स्कोर किए गए संक्रमित कोशिकाओं के कुल पर साइटोसोलिक हाइपर रेप्लिक्टिंग-साल्मोनेला युक्त कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करें।

Representative Results

साल्मोनेला उपभेदों के साथ उपकला कोशिकाओं का संक्रमण
यह प्रोटोकॉल उपकला कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला के सेलुलर आक्रमण और साइटोसोलिक प्रतिकृति (चित्रा 1 ए) बनाम वैक्यूलर लोड (चित्रा 1 बी) का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया था। प्रोटोकॉल को तीन निम्नलिखित साल्मोनेला उपभेदों, एस का उपयोग करके मान्य किया गया था। टाइफिमुरियम एसएल 1344 संदर्भ तनाव (एस। टीएम), एस। डर्बी ईआर 1175 वाइल्डटाइप (एस। डर्बी डब्ल्यूटी) और एस का इसोजेनिक उत्परिवर्ती। एसआईपीए जीन के बिना डर्बी ईआर 1175 (एस। डर्बी एएस पी ए)। एस डर्बी ईआर 1175 स्ट्रेन को सूअर से अलग किया गया था और यह साल्मोनेला आइसोलेट्स के आईजेडएसएलईआर निगरानी संग्रह से संबंधित है। प्रोटोकॉल द्वारा कवर किए गए फेनोटाइप विविधता का प्रतिनिधित्व करने के लिए उपभेदों का चयन किया गया था। विशेष रूप से, इन उपभेदों को चुना गया था क्योंकि उपकला कोशिकाओं के अंदर उनका व्यवहार पहले से ही आक्रमण या प्रतिकृति 9 के संदर्भ में भिन्न होने के लिए जानाजाता था; इसलिए, वे यह परीक्षण करने के लिए मूल्यवान नियंत्रण थे कि क्या प्रोटोकॉल ने इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला फेनोटाइप्स में अंतर को मात्रात्मक रूप से अलग करने की अनुमति दी है। विशेष रूप से, एस। टीएम और एस। डर्बी डब्ल्यूटी को शामिल किया गया था क्योंकि हमने पहले प्रदर्शित किया था कि एस। टीएम में एस की तुलना में उच्च आक्रमण और इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति दक्षता है। डर्बी9 वें स्थान पर है जबकि एस। डर्बीएसआईपीए को हाइपर-प्रतिकृति बिगड़ा तनाव के रूप में जोड़ा गया था क्योंकि विषाणु प्रभावक एसआईपीए हाइपर-प्रतिकृति10,11 की शुरुआत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह पहले एस के लिए रिपोर्ट किया गया था। साइटोसोलिक प्रतिकृति आक्रमण के बाद 4 घंटे शुरू होती है, और फिर साइटोसोलिक आबादी तेजी से उपकला कोशिका को 8 घंटे11,12 तक भरने के लिए हाइपर-प्रतिकृति करती है। लगातार, 8 घंटे लंबा संक्रमण एस में साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति फेनोटाइप का निरीक्षण और मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयुक्त था। डर्बी डब्ल्यूटी और एस। डर्बी ΔsipA.

क्षेत्र विश्लेषण
चरण 4.1 में क्षेत्र विश्लेषण हाइपर-प्रतिकृति (हाइपर-प्रतिकृति अनुपात) के माप के साथ-साथ साल्मोनेला (संक्रमण अनुपात) द्वारा उपकला कोशिकाओं के समग्र उपनिवेशीकरण का माप प्रदान करता है। चित्रा 2 में वर्णित क्षेत्र विश्लेषण वर्कफ़्लो में, यादृच्छिक शोर कम हो जाता है, और फिर चैनलों को विभाजित किया जाता है और स्वतंत्र रूप से संसाधित किया जाता है। क्षेत्र माप से पृष्ठभूमि को बाहर करने के लिए प्रत्येक चैनल के लिए एक सीमा निर्धारित की जाती है। फिर, प्रत्येक चैनल के लिए थ्रेशोल्ड पिक्सल द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र को मापा जाता है। क्षेत्र विश्लेषण का आउटपुट एक तालिका रिपोर्टिंग है, प्रत्येक अधिग्रहण फ़ाइल के लिए, उपकला कोशिका नाभिक (ब्लू चैनल), इंट्रासेल्युलर एमचेरी-व्यक्त साल्मोनेला (लाल चैनल), और साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्रों का विस्तार जो एमचेरी के साथ जीएफपी (ग्रीन चैनल) को व्यक्त करता है। संक्रमण अनुपात की गणना मेजबान सेल नाभिक द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र से एमचेरी-व्यक्त साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र को विभाजित करके की जाती है। परीक्षण किए गए उपभेदों के परिणामों से पता चला है कि एस। टीएम दोनों एस की तुलना में काफी अधिक संक्रमण अनुपात प्रदर्शित करता है। डर्बी उपभेद, जैसा कि अपेक्षित था (चित्रा 3 ए)। इसलिए, ये परिणाम उपकला कोशिकाओं को उपनिवेशित करने के लिए साल्मोनेला उपभेदों की क्षमता में अंतर का पता लगाने में क्षेत्र विश्लेषण की प्रभावकारिता का प्रदर्शन करते हैं। साल्मोनेला हाइपर-प्रतिकृति अनुपात को जीएफपी-व्यक्त साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र को इंट्रासेल्युलर एमचेरी-व्यक्त साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र से विभाजित करके मापा जाता है। हाइपर-प्रतिकृति निर्धारित करने में एसआईपीए की भूमिका के साथ लगातार, एस के लिए हाइपर-प्रतिकृति अनुपात में काफी कमी आई है। डर्बी एसिपा स्ट्रेन को एस की तुलना में मापा गया था। डर्बी डब्ल्यूटी, (चित्रा 3 बी)। एस के बीच कोई हाइपर-प्रतिकृति अंतर नहीं देखा गया था। टीएम और एस। डर्बी डब्ल्यूटी। कुल मिलाकर, क्षेत्र विश्लेषण ने प्रभावी रूप से परख किए गए उपभेदों के बीच विभिन्न हाइपर-प्रतिकृति स्तरों का खुलासा किया।

एकल-कोशिका विश्लेषण
एकल-कोशिका विश्लेषण एकल-कोशिका संकल्प के साथ उपकला कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला आक्रमण और वैक्यूलर लोड बनाम साइटोसोलिक प्रतिकृति को निर्धारित करने की अनुमति देता है। जैसा कि चरण 4.2 में वर्णित है, प्रत्येक अधिग्रहण फ़ाइल के लिए, नीले, लाल और हरे रंग के चैनलों को स्वतंत्र रूप से संसाधित किया गया था (चित्रा 4)। विशेष रूप से, उपकला कोशिकाओं के अनुरूप नीले चैनल को सेल विभाजन प्राप्त करने के लिए चरण 4.2.3 में संसाधित किया गया था। फिर, खंडित कोशिकाओं को आरओआई की एक सूची प्राप्त करने के लिए रुचि के क्षेत्र (आरओआई) प्रबंधक में जोड़ा गया था, जो वाई-एक्स निर्देशांक के साथ विशिष्ट रूप से लेबल किए गए सभी खंडित कोशिकाओं के अनुरूप था। जीएफपी के आउट-ऑफ-फोकस पिक्सेल को हटाने के लिए- हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला व्यक्त करते हुए, हरे चैनल के पिक्सेल को लाल चैनल से घटाया गया था। एकल सेल विश्लेषण रिपोर्ट की आउटपुट तालिका, प्रत्येक आरओआई के लिए, साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए आरओआई क्षेत्र का क्षेत्र और प्रतिशत केवल एमचेरी संवैधानिक रिपोर्टर या जीएफपी साइटोसोल-उत्तरदायी रिपोर्टर को व्यक्त करता है। संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिशत और औसत वैक्यूलर लोड (चित्रा 5 ए) की गणना करने के लिए एमचेरी-केवल व्यक्त साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए सेल के क्षेत्र का प्रतिशत चरण 4.2.4 में संसाधित किया गया था। वैक्यूलर लोड के विश्लेषण से पता चला है कि एस। डर्बी उपभेद एस की तुलना में काफी कम औसत वैक्यूलर लोड उत्पन्न करते हैं। टीएम (चित्रा 5 बी)। इसके विपरीत, एस में संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिशत में केवल मामूली और महत्वपूर्ण कमी देखी गई थी। एस की तुलना में डर्बी उपभेद। टीएम (चित्रा 5 ए)। जीएफपी-व्यक्त साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए सेल के क्षेत्र का प्रतिशत हाइपर-प्रतिकृति दर प्राप्त करने के लिए चरण 4.2.5 में संसाधित किया गया था। एस के बीच कोई अंतर नहीं देखा गया। टीएम और एस। डर्बी डब्ल्यूटी, जबकि एस। डर्बीएसआईपीए ने हाइपर-प्रतिकृति की एक महत्वपूर्ण कमी प्रदर्शित की, जो क्षेत्र विश्लेषण (चित्रा 5 सी) के परिणाम और हाइपर-प्रतिकृति को प्रेरित करने में एसआईपीए की भूमिका के अनुरूप है।

Figure 1
चित्रा 1: साल्मोनेला साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति और वैक्यूलर लोड। (ए) साल्मोनेला हाइपर-प्रतिकृति और (बी) उच्च आवर्धन (40x) पर अधिग्रहित वैक्यूलर लोड की प्रतिनिधि छवियां दिखाई गई हैं। पैनल बी गैर-हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला (जेड: 4/8) की तुलना में हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला (जेड: 7/8) युक्त कोशिकाओं के विभिन्न फोकस विमानों को दिखाता है। सफेद स्केल सलाखों 10 μm हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: क्षेत्र विश्लेषण का वर्कफ़्लो। क्षेत्र विश्लेषण का वर्कफ़्लो 8 घंटे के लिए संक्रमित आईएनटी 407 कोशिकाओं के प्रतिनिधि कम आवर्धन (10x) अधिग्रहण के लिए दिखाया गया है, जिसमें साल्मोनेला में pCHAR-Duo प्लास्मिड (MOI 100) होता है। सबसे पहले, यादृच्छिक शोर कम हो जाता है, और फिर चैनलों को सी 1, सी 2 और सी 3 में विभाजित किया जाता है और स्वतंत्र रूप से संसाधित किया जाता है। माप के क्षेत्र से पृष्ठभूमि को बाहर करने के लिए प्रत्येक चैनल के लिए एक सीमा निर्धारित की जाती है। फिर, केवल सी 1 में सेल नाभिक के अनुरूप, सी 2 में सभी इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला , और सी 3 में साइटोसोलिक साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र को प्रत्येक चैनल के लिए मापा जाता है। यहां विश्लेषण की गई छवियां सिलाई द्वारा एक साथ जुड़े 10x आवर्धन पर प्राप्त चार टाइलों के परिणाम हैं। सफेद स्केल सलाखों 100 μm हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: क्षेत्र विश्लेषण के परिणाम। क्षेत्र विश्लेषण के परिणाम दिखाए गए हैं। (ए) संक्रमण अनुपात की गणना एमचेरी-व्यक्त साल्मोनेला (सी 2 चैनल) द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र को विभाजित करके की जाती है, जो सभी इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया का प्रतिनिधित्व करता है, मेजबान सेल नाभिक (सी 1 चैनल) द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र द्वारा। (बी) हाइपर-प्रतिकृति अनुपात को जीएफपी-व्यक्त साल्मोनेला (सी 3 चैनल) द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र को विभाजित करके मापा गया था, जो केवल साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति बैक्टीरिया का प्रतिनिधित्व करता है, सभी इंट्रासेल्युलर एमचेरी-व्यक्त साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र द्वारा। प्रत्येक बिंदु एक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करता है। विश्लेषण तीन जैविक प्रतिकृतियों पर आयोजित किया गया था, प्रत्येक का तीन प्रतियों में परीक्षण किया गया था। काली रेखाएं माध्य मानों को इंगित करती हैं। महत्व की गणना दो पूंछ वाले टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी, और पी मानों की सूचना दी गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एकल-सेल विश्लेषण का वर्कफ़्लो। एकल-कोशिका विश्लेषण का वर्कफ़्लो आईएनटी 407 कोशिकाओं के प्रतिनिधि उच्च आवर्धन अधिग्रहण (40x) के लिए दिखाया गया है जो 8 घंटे के लिए संक्रमित होता है, जिसमें साल्मोनेला होता है जिसमें pCHAR-Duo प्लास्मिड (MOI 100) होता है। सबसे पहले, चैनलों को सी 1, सी 2 और सी 3 में विभाजित किया जाता है और स्वतंत्र रूप से संसाधित किया जाता है। उपकला कोशिकाओं के अनुरूप ब्लू चैनल (सी 1), सेल विभाजन प्राप्त करने के लिए संसाधित किया जाता है, और फिर प्रत्येक खंडित सेल को वाई-एक्स निर्देशांक के साथ विशिष्ट रूप से लेबल किए गए क्षेत्र (आरओआई) के रूप में परिभाषित किया जाता है। लाल चैनल (सी 2) को आउट-ऑफ-फोकस साइटोसोलिक हाइपर-रेप्लिकुलेटिंग साल्मोनेला को हटाने के लिए हरे चैनल (सी 3) को घटाकर संसाधित किया जाता है, जिससे सभी वैक्यूलर साल्मोनेला को केवल एमचेरी व्यक्त किया जाता है, और फिर यादृच्छिक शोर कम हो जाता है, और माप से पृष्ठभूमि को बाहर करने के लिए दहलीज निर्धारित की जाती है। अंत में, प्रत्येक आरओआई के लिए वैक्यूलर साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र को मापा जाता है। ग्रीन चैनल (सी 3), कुल साइटोसोलिक जीएफपी-व्यक्त साल्मोनेला के अनुरूप, इसी तरह संसाधित किया जाता है। यहां विश्लेषण की गई छवियां सिलाई द्वारा एक साथ जुड़ी 16 टाइलों के परिणाम हैं। सफेद स्केल सलाखों 100 μm हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एकल-सेल विश्लेषण के परिणाम। एकल-कोशिका विश्लेषण के परिणाम दिखाए गए हैं। (ए) संक्रमित कोशिकाओं का प्रतिशत कोशिकाओं की संख्या को कोशिकाओं की कुल संख्या से केवल एमचेरी-व्यक्त करने वाले साल्मोनेला> 0.2 द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र के प्रतिशत के साथ विभाजित करके प्राप्त किया जाता है। (बी) संक्रमित कोशिकाओं में एमचेरी-केवल व्यक्त साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए औसत प्रतिशत क्षेत्र की गणना करके औसत वैक्यूलर लोड प्राप्त किया गया था। (ग) अति-प्रतिकृति दर की गणना जीएफपी-व्यक्त साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र के प्रतिशत के साथ कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करके की गई थी≥20% संक्रमित कोशिकाओं की कुल संख्या से। तीन प्रतियों में परीक्षण किए गए तीन से चार जैविक प्रतिकृतियों के डेटा की सूचना दी गई है। पट्टियाँ माप की मानक त्रुटि को इंगित करती हैं। महत्व की गणना दो पूंछ वाले टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी, और पी मानों की सूचना दी गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: क्षेत्र विश्लेषण स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: एकल-सेल विश्लेषण स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

जिस तरह से साल्मोनेला आंतों के उपकला कोशिकाओं को उपनिवेशित करता है, संक्रमण के परिणाम को प्रभावित करता है। आक्रमण पर, साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति आंत3 की सूजन को प्रेरित करती है, जबकि वैक्यूलर प्रतिकृति प्रणालीगत प्रसार 4 का कारण बन सकतीहै। साल्मोनेला उपभेद आंतों के उपकला कोशिकाओं के अंदर आक्रमण करने और दोहराने की उनकी क्षमता में भिन्न होसकते हैं। दरअसल, साल्मोनेला एक अत्यंत विविध जीनस है जिसमें 2,500 सेरोवार शामिल हैं, जिनमें बीमारी पैदा करने की अलग-अलग क्षमताएं हैं। इसके अलावा, साल्मोनेला यूरोपीय संघ में खाद्य जनित प्रकोपों का सबसे अधिक बार रिपोर्ट किया जाने वाला कारण है, जो मानव आबादी में एक बड़े प्रसार का संकेत देताहै। इसलिए, साल्मोनेला के इंट्रासेल्युलर फेनोटाइप्स की मात्रा का परिमाणीकरण के लिए विश्वसनीय, उच्च-थ्रूपुट विधियों की उपलब्धता बड़ी संख्या में साल्मोनेला उपभेदों के बीच विषाणु में अंतर का मूल्यांकन करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है और अंततः इस रोगज़नक़ के सटीक और तनाव-विशिष्ट जोखिम मूल्यांकन की अनुमति देती है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक तेज और स्वचालित तरीके से उपकला कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला के व्यवहार को मापता है। उपकला कोशिकाओं का संक्रमण 96-वेल इमेजिंग माइक्रोप्लेट में किया जाता है और छवि अधिग्रहण के लिए एक स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है, जिससे प्रोटोकॉल उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हो जाता है। यह प्रोटोकॉल पीपीएआर-डुओ प्लास्मिड का लाभ उठाता है, जो दो फ्लोरोसेंटरिपोर्टरों 5 की अंतर अभिव्यक्ति के माध्यम से साइटोसोलिक साल्मोनेला से वैक्यूलर को अलग करने की अनुमति देता है। साल्मोनेला के इंट्रासेल्युलर फेनोटाइप्स का विश्लेषण अक्सर मैनुअल स्कोरिंग द्वारा किया जाता है, एक समय लेने वाली प्रक्रिया जो प्रति तनाव बड़ी संख्या में उपभेदों और सेल संस्कृतियों के विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त है और ऑपरेटर की त्रुटियों और अंतर-ऑपरेटर भिन्नता से ग्रस्त है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, दो पूरक और स्वचालित छवि विश्लेषण विकसित किए गए थे, क्षेत्र विश्लेषण और एकल-सेल विश्लेषण। इमेजजे, एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर, का उपयोग दो विश्लेषणों को विकसित करने के लिए किया गया था। प्रोटोकॉल निष्पादन में तेजी लाने के लिए, बिना किसी ऑपरेटर हस्तक्षेप के कई अधिग्रहण फ़ाइलों के बैच विश्लेषण के लिए इमेजजे स्क्रिप्ट पूरक फ़ाइलों के रूप में प्रदान की जाती हैं।

क्षेत्र विश्लेषण को कुछ चरणों में, उपकला कोशिकाओं (संक्रमण अनुपात) और हाइपर-प्रतिकृति स्तर (हाइपर-प्रतिकृति अनुपात) के समग्र उपनिवेशीकरण को विशेष रूप से उपकला कोशिकाओं के नाभिक द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्रों के माप के माध्यम से और साल्मोनेला द्वारा जीएफपी के साथ मिलकर एमचेरी या एमचेरी को व्यक्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। क्षेत्र विश्लेषण कम आवर्धन पर प्राप्त छवियों पर लागू होता है, जहां वैक्यूलर और हाइपर-रेप्लिक्टिंग साल्मोनेला दोनों एक ही जेड-प्लेन में फोकस में होते हैं, और बड़ी संख्या में उपकला कोशिकाओं को प्रति सूक्ष्म क्षेत्र में प्रदर्शित किया जाता है, जिससे अधिग्रहण फ़ाइलों का आकार और संख्या कम हो जाती है। क्षेत्र विश्लेषण बड़ी संख्या में नमूनों के स्वचालित, तेज और कम्प्यूटेशनल रूप से हल्के विश्लेषण की अनुमति देता है, जिससे यह स्क्रीनिंग प्रयोगों जैसे उच्च-थ्रूपुट परख के लिए उपयुक्त हो जाता है।

एकल-कोशिका विश्लेषण को एकल-कोशिका संकल्प के साथ उपकला कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला फेनोटाइप्स को निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जो सेल विभाजन और सेलुलर क्षेत्र के माप और वैक्यूलर और साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र के प्रतिशत के माध्यम से प्राप्त किया गया था। क्षेत्र विश्लेषण के माध्यम से विशेषता वाले उपकला कोशिकाओं के समग्र उपनिवेशीकरण को यहां तीन मात्रात्मक मापदंडों में विभाजित किया गया है, संक्रमित कोशिकाओं का प्रतिशत, औसत वैक्यूलर लोड, और हाइपर-प्रतिकृति दर, जिससे समग्र उपनिवेशीकरण के लिए प्रत्येक फेनोटाइप के योगदान का मूल्यांकन और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति मिलती है, इसलिए, क्षेत्र विश्लेषण के परिणामों का पूरक है। एकल-सेल विश्लेषण द्वारा पेश किए गए अधिक विवरण धीमी छवि अधिग्रहण और विश्लेषण की कीमत पर आते हैं। वास्तव में, एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए, छवि अधिग्रहण उच्च आवर्धन पर किया जाता है। इसका तात्पर्य यह है कि फोकस में वैक्यूलर और साइटोसोलिक साल्मोनेला दोनों का निरीक्षण करने के लिए कई जेड-प्लेन की आवश्यकता होती है और यह कि उपकला कोशिकाओं की उच्च संख्या को स्कोर करने के लिए प्रति नमूना बड़ी संख्या में क्षेत्रों के अधिग्रहण की आवश्यकता होती है, इस प्रकार क्षेत्र विश्लेषण की तुलना में अधिग्रहण समय का विस्तार होता है। इसके अलावा, कई बड़ी अधिग्रहण फ़ाइलों का विश्लेषण कम्प्यूटेशनल रूप से मांग कर रहा है, इस प्रकार एक उपयुक्त वर्कस्टेशन की आवश्यकता होती है (एक 6-कोर, 32 जीबी रैम वर्कस्टेशन का उपयोग किया गया था)। इसलिए, एकल-कोशिका विश्लेषण का उपयोग सीमित थ्रूपुट स्थितियों में स्टैंड-अलोन के रूप में या उपकला कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला फेनोटाइप की गहरी समझ हासिल करने के लिए क्षेत्र विश्लेषण के साथ युग्मित दूसरे स्तर की विधि के रूप में किया जा सकता है।

दो पूरक विश्लेषणों को एस का उपयोग करके मान्य किया गया था। टीएम, एस। डर्बी डब्ल्यूटी, और एस। डर्बी सिपा, क्योंकि उपकला कोशिकाओं के अंदरउनका व्यवहार पहले से ही आक्रमण या प्रतिकृति 9,10 के संदर्भ में भिन्न होने के लिए जाना जाता था। क्षेत्र और एकल-कोशिका विश्लेषण के परिणाम बताते हैं कि प्रोटोकॉल ने परीक्षण किए गए उपभेदों की विशेषताओं के अनुसार इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला फेनोटाइप्स में अंतर को मात्रात्मक रूप से अलग करने की अनुमति दी। इसके अलावा, इन परिणामों से पता चलता है कि एकल-कोशिका विश्लेषण क्षेत्र विश्लेषण का उपयोग करके स्कोर किए गए समग्र उपनिवेशीकरण के लिए प्रत्येक इंट्रासेल्युलर फेनोटाइप (आक्रमण, वैक्यूलर लोड और साइटोसोलिक प्रतिकृति) के योगदान का परिमाणीकरण करने की अनुमति देता है।

यह प्रोटोकॉल साल्मोनेला के विभिन्न उपभेदों के इन विट्रो रोगजनकता का अध्ययन करने के लिए यहां लागू किया गया था, लेकिन इसमें अन्य अनुप्रयोग हो सकते हैं जैसे कि उपकला कोशिकाओं के अंदर आक्रमण और / या प्रतिकृति में शामिल जीन की पहचान करने के लिए यादृच्छिक उत्परिवर्ती का अध्ययन। इसके अलावा, प्रोटोकॉल को आईएनटी 407 कोशिकाओं की तुलना में अन्य सेल लाइनों के अंदर साल्मोनेला के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसका उपयोग अन्य इंट्रासेल्युलर सूक्ष्मजीवों के सेल-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए समान तरीकों को विकसित करने के लिए शुरुआती बिंदु के रूप में भी किया जा सकता है।

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

ओलिविया स्टील-मोर्टिमर को पीपीएआर-डुओ प्लास्मिड साझा करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था, पीआरसी 2019014 और पीआरसी 2021004 अनुदान।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well imaging microplate Eppendorf 30741030 Cell culture and infection
Ampicillin Sigma-Aldrich 59349 Bacteria culture
Axio observer inverted microscope ZEISS Automated fluorescence microscope
Axiocam 305 Mono ZEISS Microscope Camera
Breathable sealing membrane Sigma-Aldrich Z380059 Infection assay
Colibrì 5/7 ZEISS Led light source
Collagen I rat tail Life Technologies A1048301 Collagen coating
DAPI Invitrogen D3571 Cell staining
Fetal bovine serum Gibco 10099-141 Cell culture and infection
Gentamicin Sigma-Aldrich G12664 Infection assay
Glacial acetic acid Carlo Erba 401391 Collagen coating
HCS CellMask Blue Invitrogen H32720 Cell staining
ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) Image processing software
Minimum Essential Eagle's Medium Sigma-Aldrich M5650-500ML Cell culture and infection
Paraformaldehyde 4% Invitrogen FB002 Cell fixation
Potassium chloride PanReac AppliChem 131494.1211 PBS preparation
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 60220 PBS preparation
Sodium Chloride PanReac AppliChem 131659.1214 Bacteria culture and PBS preparation
Sodium phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 71640 PBS preparation
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap Euroclone ET7025 Cell culture
Triton X-100 Biorad 1610407 Cell staining
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 Cell culture and infection
Tryptone Oxoid LP0042B Bacteria culture
Yeast extract Biolife 4122202 Bacteria culture

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References

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  5. Cooper, K. G., Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. Predictable, tunable protein production in Salmonella for studying host-pathogen interactions. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 475 (2017).
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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 186 साल्मोनेला इंट्रासेल्युलर फेनोटाइप्स वैक्यूलर प्रतिकृति साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल स्वचालित छवि विश्लेषण फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी इमेजजे स्क्रिप्ट
इमेजजे का उपयोग करके <em>साल्मोनेला</em> के इंट्रासेल्युलर फेनोटाइप का स्वचालित विश्लेषण
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Berni, M., Pongolini, S., Tambassi,… More

Berni, M., Pongolini, S., Tambassi, M. Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ. J. Vis. Exp. (186), e64263, doi:10.3791/64263 (2022).

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