Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hurtig kolonidannende enhedstælling i 96-brønds pladeformat anvendt på Drosophila-mikrobiomet

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64298
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Embryology, Carnegie Institution for Science, 2Department of Biology, Johns Hopkins University

Summary

Denne metode kvantificerer mikrobiel overflod ved hjælp af et 96-brønds pladeformat til pladekolonidannende enheder (CFU'er) og anvendes på Drosophila-mikrobiomet i hele fluehomogenatprøver. CFU'er tælles med en automatiseret billedanalysesoftware, der leveres her.

Abstract

Tarmene hos dyr koloniseres af kommensale mikrober, som påvirker værtsudvikling, sundhed og adfærd. Præcis kvantificering af kolonisering er afgørende for at studere de komplekse interaktioner mellem vært og mikrobe både for at validere den mikrobielle sammensætning og studere dens virkninger. Drosophila melanogaster, som har en lav indfødt mikrobiel mangfoldighed og er økonomisk at opdrætte med defineret mikrobiel sammensætning, er opstået som en modelorganisme til undersøgelse af tarmmikrobiomet. Analyse af mikrobiomet af en individuel organisme kræver identifikation af hvilke mikrobielle arter der er til stede og kvantificering af deres absolutte overflod. Denne artikel præsenterer en metode til analyse af et stort antal individuelle fluemikrobiomer. Fluerne fremstilles i 96-brøndsplader, hvilket muliggør håndtering af et stort antal prøver på én gang. Mikrobiel overflod kvantificeres ved at platte op til 96 hele fluehomogenater på en enkelt agarplade i en række pletter og derefter tælle de kolonidannende enheder (CFU'er), der vokser på hvert sted. Dette pletteringssystem er parret med en automatiseret CFU-kvantificeringsplatform, der inkorporerer fotografering af pladerne, differentiering af fluorescerende kolonier og automatiseret tælling af kolonierne ved hjælp af et ImageJ-plugin. Fordelene er, at (i) denne metode er følsom nok til at opdage forskelle mellem behandlinger, (ii) pletpletteringsmetoden er lige så nøjagtig som traditionelle pletteringsmetoder, og (iii) den automatiserede optællingsproces er nøjagtig og hurtigere end manuel tælling. Arbejdsgangen, der præsenteres her, muliggør kvantificering af CFU'er med høj kapacitet i et stort antal replikater og kan anvendes på andre mikrobiologiske studiesystemer, herunder in vitro og andre smådyrsmodeller.

Introduction

Forholdet mellem tarmmikrobiota og deres dyrevært er i stigende grad i spidsen for biologiske undersøgelser1, som viser, at mikrobiomets stammesammensætning er vigtig for værtsfysiologi 2,3,4. Opdagelsestempoet har været begrænset af forvirrende faktorer som høj naturlig interindividuel variation og høj mangfoldighed af koloniserende bakterier 5,6,7. Bananfluen, Drosophila melanogaster, er opstået som en lovende model på grund af dens naturligt lavdiversitetsmikrobiom, lette håndtering og robuste værtsgenetik 8,9,10,11. Fluer kan gøres bakteriefri og re-associeres med en defineret mikrobiota12, og det har vist sig, at floraen påvirker fluens fysiologiske træk13,14. Den medfødte flora består af et begrænset sæt bakterier, der alle er dyrkbare, og nære slægtninge til disse er også endogene til pattedyrets tarm, herunder lactobaciller, proteobakterier og enterokokker15.

At studere mikrobiomets indflydelse på værtsegenskaber kræver kvantificering af mikrobiomet med hensyn til både hvilke arter der er til stede og deres absolutte overflod16. De fremherskende måder at analysere fluemikrobiomet på er kolonidannende enhed (CFU) tæller17, 16S rRNA-genampliconsekventering9 og qPCR af 16S rRNA-genet18. CFU-tællinger kan opnås uden dyre reagenser, og de bekræfter bakteriecellernes levedygtighed19. 16S-teknikkerne, herunder qPCR, har fordele, idet mikrobernes taksonomiske identiteter kan fastslås uden hensyntagen til deres vækstbehov eller kolonimorfologier20.

I det tilfælde, hvor eksperimenter bruger fluer med et defineret mikrobiom af kendte bakterier (gnotobiotiske fluer), har CFU-tællinger særlige fordele i forhold til sekventering21. Sekventering er dyr, hvilket kræver DNA-ekstraktion, PCR-baseret biblioteksforberedelse og high-throughput-sekventering for at opnå relative overflod22. På grund af de høje omkostninger skal sekventeringsmetoder med høj kapacitet typisk udføres i bulk for at reducere prisen pr. prøve23. Yderligere metoder såsom qPCR er nødvendige for at opnå absolutte mængder16. I modsætning hertil er CFU-tællinger hurtige og billige og giver det absolutte antal levedygtige celler. Drosophila8 og andre små mikrobiommodeller 24, herunder ormen, Caenorhabditis elegans 25,26, og larvezebrafisken, Danio rerio, dyrket gnotobiotisk27, har et begrænset udvalg af bakterier, som har kendte vækstegenskaber 28. I disse tilfælde, især med gnotobiotiske dyr, kan CFU-tælling differentiere alle bakteriearter inden for de multiartiske tarmsamfund21,27,29. CFU-tællemetoder med højere kapacitet vil yderligere forbedre omkostningseffektiviteten og hastigheden af måling af mikrobiomets sammensætning og kan anvendes på mange andre mikrobiologiske eksperimenter.

Tælling af CFU'er ved seriel fortyndingsbelægning af en bakteriel suspension på agarbaserede vækstmedier er en standardmetode på tværs af mikrobiologiområdet. Kolonierne, der vokser på pladerne, tælles derefter manuelt. Fortyndingerne giver forskeren mulighed for at vælge en tæthed af kolonier, der kan tælles (f.eks. ~ 100 CFU'er pr. Plade), hvilket betyder, at kolonierne ikke vokser ind i hinanden og kan tælles inden for en rimelig tid. De fleste mikrobiologer bruger stort set den samme CFU-tællemetode, der blev udviklet for 140 år siden i Robert Kochs laboratorium, og til mange applikationer er denne metode stadig tilstrækkelig. Der opstår imidlertid et problem, når man søger at kvantificere et stort antal prøver. En enkelt prøve kan kræve plettering af 1 til 10 serielle fortyndinger af prøven for at opnå tællelige CFU'er, så eksperimenter, der involverer mere end et par dusin prøver, bliver beskattende. Der er udviklet forskellige metoder til at øge effektiviteten af CFU-optællingen. Automatiseret spiralbelægning eliminerer behovet for serielle fortyndinger30, hvilket kun gør en plade nødvendig til CFU-tælling, men øger tiden til at plade prøven. Single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) tillader CFU-estimater fra færre plader pr.prøve 31. Disse metoder er en forbedring af den traditionelle spredningsbelægningsmetode, men kræver stadig håndtering og plettering af bakterieprøver enkeltvis og er derfor ikke ideelle til høj gennemstrømning. Håndtering af prøver i 96-brøndsplader og pletbelægning af disse 96 prøver på rektangulære agarplader forbedrer i høj grad gennemstrømningen af prøver19.

Mikrobiomer er typisk sammensat af flere stammer og arter. Mens arter ofte kan skelnes ved kolonimorfologi eller vækstmedier, kan fluorescens anvendes til yderligere at skelne mellem forskellige typer bakterier og deres væksttræk32. For eksempel kan forskellige genotyper af samme art mærkes med forskellige genetisk kodede fluorescerende proteiner. Pladebilleddannelsesmetoder, der inkorporerer fluorescens, giver forskere mulighed for at drage fordel af disse genetiske teknikker i CFU-baserede assays32. Inkorporering af fluorescens i CFU-tællemetoder med høj kapacitet vil yderligere forbedre deres anvendelighed.

Det bliver besværligt at tælle CFU'er manuelt, når der er et stort antal prøver. Automatiseret optælling af CFU'er kan udføres ved at fotografere pladen og behandle billedet ved hjælp af specialiseret software33. Sieuwerts et al. kombinerede den forbedrede pletteringseffektivitet af plettering med automatiseret kolonitælling ved hjælp af konventionel digital fotografering og ImageJ-software19.

En metode med høj kapacitet til at screene fænotyperne af specifikke mikrobe- og værtsforeninger ville hjælpe undersøgelser af mikrobiomsamfundssamling og indvirkningen på værtssundhed og fitness. Til undersøgelser af Drosophila-mikrobiomet ville en mikrobiologisk platform med høj kapacitet omfatte håndtering af flueprøver i 96-brønds pladeformat, fluelyse uden bakteriel lyse, effektiviteten af pletbelægning, evnen til at bruge fluorescens og skelne mellem flere fluorophorer, et kontrolleret lysmiljø til reproducerbar billeddannelse af CFU-plader og en pålidelig automatiseret kolonitællingssoftware. Denne artikel beskriver en metode, der er optimeret til analyse af CFU'er i gnotobiotiske fluer, som er enkel, hurtig og automatiseret. Denne protokol skitserer en ny arbejdsgang, der kombinerer det bedste fra tidligere offentliggjorte metoder og optimeret til at udforske tarmmikrobiomet i Drosophila.

Protocol

1. Flue kolonisering

BEMÆRK: Denne metode er velegnet til kvantitativ analyse af fluer med et dyrkningsbart tarmmikrobiom ved vækstplettering af CFU'er. En detaljeret protokol for opdræt af gnotobiotiske fluer er tidligere blevet offentliggjort12.

  1. Etablere stabil kolonisering af en kommensal bakterieart.
    1. Forbered en frisk bakteriekultur, pellet ved centrifugering ved 400 x g i 3 minutter ved stuetemperatur, og suspender cellepellet i PBS til en OD600 på 1,0. Til denne protokol, Lactiplantibacillus plantarum (tidligere kendt som Lactobacillus plantarum) blev dyrket natten over til en OD600 på 2,0.
    2. Pipetter 100 μL på foderet i et flueglas (se Materialetabel). Spred jævnt og lad væsken absorbere i 15-30 min.
    3. Overfør 20 kimfrie fluer til dette hætteglas ved hjælp af standard hætteglas til hætteglas vendeteknik34. Hver flue vil spise en nogenlunde lige stor mængde af bakteriedosis35. Alternativt kan kimfrie æg tilsættes.
    4. Overfør fluerne til frisk steril mad dagligt i 3 dage. Gør alt dette i et biosikkerhedsskab og brug steril teknik (figur 1A-1).
  2. Før måling af CFU-belastning overføres fluerne til et hætteglas, der indeholder sterilt agarvand i 4 timer for at fjerne forbigående bakterier fra tarmen. Agar-vand hætteglassene giver en kilde til fugt til fluen, men ingen ernæring til fluen eller bakterier på overfladen. De tilberedes i de samme sterile flueflasker som med standardfoder, men indeholder kun deioniseret vand og 1,5% agar.

2. Homogenisering af fluer individuelt i en 96-brønds PCR-plade

  1. Forbered perlepladeplader på forhånd.
    1. Hæld 0,5 μm glasperler (se Materialetabel) på perlemålebakken (3D-printet ved hjælp af supplerende kodningsfil 1 S1-perlemåler.stl). Spred perlerne på bakken, så alle brøndene er fulde og plane, og børst derefter overskydende perler af i et konisk rør for at genvinde dem.
    2. Placer en halvskørtet PCR-plade (se Materialebord) på hovedet på målebakken, og juster den med brøndene ved at montere den i fordybningen på målebakken. Vend det derefter hurtigt for at overføre perlerne.
    3. Fjern overskydende perler fra PCR-pladens overflade og dæk den med folie. Undersøg PCR-pladen for at sikre, at alle brøndene indeholder perler. Brug en vejeskovl, hvis det er nødvendigt for at tilføje perler til en enkelt brønd. Hvis statisk elektricitet får perler til at klæbe på pladeoverfladerne, skal du tørre eller sprøjte bagsiden af målebakken og PCR-pladen med 70% ethanol.
    4. Dæk med aluminiumsfolie. Mange plader kan fremstilles på denne måde og derefter autoklaveres og opbevares til senere brug. Når den er klar til brug, tilsættes 100 μL PBS til hver brønd ved hjælp af 96-kanals pipettor (se Materialetabel).
  2. Overfladesteriliser de mikrobekoloniserede fluer (se trin 1) med 70% ethanol før homogenisering.
    1. Anæstetik fluerne med 100% CO2 i 5 s. Overfør bedøvede fluer fra hætteglasset til et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved hjælp af en lille tragt (figur 1A-2). I denne undersøgelse blev der typisk tilføjet 25 fluer pr. Rør.
    2. Sprøjt straks ~ 1 ml 70% ethanol ind i røret, luk røret og bland ved inversion i 10 s. Derefter skal du opsuge ethanolen med en P1000-pipette og være forsigtig med ikke at aspirere fluer. Gentag igen med ethanol, derefter to gange med steril PBS (figur 1A-3).
  3. Efter den sidste PBS-vask skal du lukke røret og med hætten nedad banke den hårdt et par gange på bænken, så fluerne går ind i hætten.
  4. Åbn røret og dispenser fluer ind i brøndene ved hjælp af tang (figur 1A-4). Placer en flue i hver brønd (figur 1A-5). Hold pladen på is, mens du læsser for at holde fluerne bedøvet.
  5. Forsegl pladen ved hjælp af termisk bindingsvarmeforseglingsfolie (se Materialetabel).
    1. Fjern først eventuelle omstrejfende perler, der er tæt på brøndene, da disse kan forårsage lækage i folieforseglingen. Sørg for, at den kedelige side af folien er orienteret ned på pladen og den skinnende side op mod varmeforsegleren. Tryk varmeforsegleren (se Materialetabel) godt ned i 5 s (figur 1A-6). Brænd med håndapplikatoren (se Materialetabel) for at fastgøre folien.
      BEMÆRK: Dårlig forsegling er en årsag til tab af prøver.
  6. Fastgør pladen i pladerysteren. Homogeniser i 5 minutter (figur 1A-7). Drej perlepladen ned i 30 s i en minipladespinner (se Materialetabel) ved 350 x g for at fjerne væske fra tætningsfolien.
  7. Fjern folien, mens du holder pladen for ikke at sprøjte dråber af fluehomogen ud af brøndene.

3. Seriel fortynding af fluehomogenat og spotting på CFU-plader

  1. Anbring fire rektangulære MRS agar-vækstplader (se Materialetabel) i biosikkerhedsskabet, og fjern deres låg. I denne protokol blev MRS agar anvendt til vækst af L. plantarum. Lad disse tallerkener tørre i mindst 10 minutter (20 min, hvis de er frisk hældt eller kolde fra opbevaring).
    BEMÆRK: Hvis pladerne er våde, løber dråberne fra 96-brøndspladen sammen og ødelægger tællingerne.
  2. Der fremstilles tre fortyndingsplader ved at tilsætte 100 μL PBS til hver brønd i en steril 96-brøndsplade ved hjælp af en 96-kanals pipettor. Læg et stativ med P20-spidser på 96-kanals pipettoren.
  3. Der foretages en fortynding på 1:10 ved at aspirere 11,1 μL homogenat fra prøvepladen fremstillet i punkt 2 (figur 1A-8). Sørg for at tegne fra midten af brøndene i stedet for bunden af brøndene, fordi fluehomogenen og glasperlerne vil tilstoppe pipetterne. Perlerne synker, og fluepartiklerne flyder, så mellemlaget for det meste er klart.
  4. De 11,1 μL udleveres i den første fortyndingsplade, som allerede indeholder 100 μL steril PBS pr. boring. Hold fortyndingspladen på pladerysteren i 10 s ved 600 o / min. Bland igen ved at pipettere op og ned i fem cyklusser. Der overføres 11,1 μL fra den første fortyndingsplade til den anden fortyndingsplade, og blandingstrinnene gentages for de næste to fortyndingsplader.
  5. Udfør fortyndingsseriebelægning som beskrevet nedenfor.
    1. Hent vækstpladerne fra biosikkerhedsskabet.
    2. Start med den mest fortyndede plade, spot 2 μL fra hver brønd på agarpladerne ved hjælp af 96-brøndspipettor (figur 1A-9).
      1. Sænk pipettorhovedet langsomt ned på pladen, og pas på ikke at stikke ind i agaren. Undersøg pladen omhyggeligt, og sørg for, at alle pletter er blevet udleveret; hvis ikke, skal du manuelt tilføje 2 μL til den relevante position. Kontroller, at væskepletterne hurtigt suges ind i agaren og ikke løber sammen.
      2. Hvis pletterne løber sammen, skal du tørre et nyt sæt friske agarplader i længere tid og gentage spotting. Hvis der er flere pladetyper (f.eks. Forskellige medier eller med antibiotika), skal du også få øje på dem. Dispenser eventuel resterende opløsning tilbage i fortyndingspladen, og fortsæt til den næste højere koncentration.
        BEMÆRK: Når du opdager fortyndinger, blandes den næste fortynding fem gange for at sikre, at indholdet af pipettespidserne fjernes fra den tidligere fortynding. Fortyndingspladerne kan opbevares >8 timer ved 4 °C, uden at det påvirker kolonitællingerne35.
  6. Pletteringsprocessen gentages som beskrevet i trin 3.5 for de resterende fortyndingsplader, idet der sker fra de fleste fortyndede til de mest koncentrerede, indtil pladen med det oprindelige homogenat gentages.
  7. Når al væsken er absorberet i agaren, skal du vende pladerne og placere dem i inkubatoren (figur 1A-10). For Lactiplantibacillus og Acetobacter fra Drosophila er den optimale temperatur 30 °C på MRS-medier. Inkuberes, indtil kolonierne har nået optimal størrelse: kolonier er store nok til tydeligt at se dem, men ikke så store, at de fusionerer eller forstyrrer hinandens vækst (se de repræsentative resultater for kvantificering af den optimale størrelse).
    BEMÆRK: Optimale vækstbetingelser er belastningsafhængige og skal bestemmes empirisk. For Lactiplantibacillus fra Drosophila er den optimale inkubationstid 26 timer til 30 timer på MRS agar. For Acetobacter fra Drosophila er den optimale inkubationstid 30 timer til 48 timer på MRS afhængigt af stammen.
  8. Efter inkubation opbevares pladerne ved 4 °C, hvis det er nødvendigt, indtil de er klar til tælling.

4. Kvantificering af CFU'er

  1. Kvantificer CFU'er ved at fotografere pladerne og derefter tælle kolonierne ved hjælp af automatiseret software, som beskrevet nedenfor. Hvis pladerne blev opbevaret ved 4 °C, skal du først lade dem nå stuetemperatur, så der ikke er kondens på pladerne, hvilket giver blænding.
  2. Organiser pladerne i en logisk rækkefølge, og hold dem i den rækkefølge, mens du fotograferer - det gør det lettere at navngive filerne. Orienter alle pladerne, så A1 er i øverste venstre hjørne for alle pladerne. Det anbefales at mærke A1-hjørnet med et unikt ID for at sikre, at billederne ikke blandes sammen. Stak hver fortyndingsserie i rækkefølge.
  3. Fjern pladelåget, og placer pladen på scenen med A1 orienteret i det rigtige hjørne. Design er inkluderet til pladefotoboksen (supplerende fil 1, supplerende fil 2), som er optimeret til fotografering af disse bakkeplader og inkluderer belysnings- og filterindstillinger til billede af fluorescerende kolonier.
  4. Forestil dig pladerne. Brug kameraet (se Materialetabel) med manuelle indstillinger for at opnå et ensartet eksponeringsniveau mellem pladerne. En lang brændviddeindstilling anbefales for at minimere perspektivforvrængning. Tag billedet ved hjælp af en fjernlukker for at minimere sløring fra kamerarystelser.
  5. Overfør billederne til en computer, og omdøb dem, herunder eksperimentnavnet, medietypen, fortyndingsfaktoren og andre relevante detaljer. Nogle operativsystemer (se Tabel over materialer) har en nyttig batchomdøbningsfunktion i Finder ved at højreklikke på et udvalg af filer.

5. Automatiseret kolonitælling ved hjælp af Count-On-It-pakken (supplerende fil 3)

  1. Beskær billederne ved hjælp af det medfølgende Croptacular-plugin (Supplerende kodningsfil 2) til ImageJ. Dette plugin hjælper med at opdele billedet i et ordnet udvalg af underregioner (f.eks. 8 x 12 for en 96-brøndplade). Underregionerne tælles individuelt.
    BEMÆRK: Et separat plugin til tælling af cirkulære plader kaldet Circus er beskrevet i den supplerende kodningsfil 3 Circus_.ijm.
    1. Organiser de billeder, der skal behandles til kvantificering, i en mappe. Vælg filnavne, der adskiller pladerne, da disse filnavne bliver kolonnetitler for hvert sæt tællinger . I denne mappe skal du oprette undermapper med navnet "beskåret" og "kvitteringer" .
    2. Start Croptacular, og klik på OK for at starte beskæringen.
      BEMÆRK: Standardindstillingerne vises og er normalt tilstrækkelige. Afhængigt af billedets opløsning, belysningen, spotstørrelsen osv., Kan det være nyttigt at justere basisparametrene.
    3. Hvis billedet allerede er lige, skal du blot trykke på Mellemrum. Ellers skal du rette billedet ved at tegne en linje langs en kant, der skal blive vandret. Tegn linjen igen så mange gange som nødvendigt, hvis billedet stadig ikke vises rettet.
    4. Tegn derefter en afgrænsningsboks for det område, for hvilket der skal tælles. Juster størrelsen og proportionen, indtil alle pletterne er inden for deres celler. Træk markøren uden for afgrænsningsfeltet for at opdatere gitteret. Når gitteret ser godt ud, skal du trykke på Mellemrum.
    5. Sørg for, at det næste billede automatisk roterer til samme vinkel som det første; pluginet antager, at alle fotos er justeret ens. Hvis dette er korrekt, skal du trykke på Mellemrum for at fortsætte. Ellers skal du rette billedet som før. Gitteret minder også om den samme position som det forrige billede; juster om nødvendigt, og tryk derefter på Mellemrum.
  2. Opregne kolonierne på pladerne ved hjælp af det medfølgende Count-On-It: Gridiron-plugin til ImageJ (Supplerende kodningsfil 4). Detaljerede instruktioner til installation og brug af pluginet er inkluderet i supplerende fil 3.
    1. Start Count-On-It > Gridiron. Brug de samme gitterindstillinger som med Croptacular. Brugere kan batche en hel mappe, analysere et enkelt billede eller starte fra det aktuelle billede.
    2. Angiv tærsklen baseret på en øvre og en lavere pixelintensitetsværdi. Gør tærsklen så streng som muligt, mens du stadig vælger alle kolonierne. Ideelt set vil der være noget mellemrum mellem de valgte kolonier, men softwaren er i stand til at segmentere klatterne til en vis grad. Klik på OK i dialogboksen "Handling påkrævet", når tærsklen er tilfredsstillende .
    3. For at inspicere resultaterne skal du zoome ind og se nærmere på kolonitællingerne. Hvis du klikker på annuller, afbrydes pluginet. Klik på OK for at fortsætte.
    4. På det første billede skal du sikre dig, at der gives mulighed for at fortsætte eller vende tilbage til opsætningsmenuen, for eksempel for at ændre den mindste kolonistørrelse. Hvis du vil fortsætte med batchprocessen, skal du klikke på OK. Vælg derefter en mappe for at beholde tabellen kvitteringer og resultater. Brug mappen "kvitteringer" eller opret en ny mappe.
    5. Efter det første billede vil de næste billeder som standard have samme tærskel som de tidligere indstillinger. Klik på OK for at bruge disse indstillinger eller justere indstillingerne. Hvis billederne er konsistente, og indstillingen er nøjagtig, skal du klikke på OK i dialogboksen "Handling påkrævet".
      BEMÆRK: Når alle billederne i batchen er afsluttet, gemmes resultattabellen automatisk i samme mappe som kvitteringerne.
    6. Gennemgå de optællingskvitteringer, der produceres af softwaren, og ret eventuelle optællingsfejl manuelt. ImageJ-plug-in'et er statistisk nøjagtigt, men der opstår fejl. Bevis kvitteringerne for at undersøge outliers og identificere fejltællinger. Softwaren gemmer CFU-dataene som en .csv-fil i samme mappe som kvitteringerne.
  3. Analyser dataene ved hjælp af den brugerforetrukne software.

Representative Results

Opregning af CFU'er i hundredvis af individuelle fluer i 96-brønds pladeformat ved hjælp af koloniseringsanalyse
For at forstå sammensætningen af mange individuelle fluemikrobiomer blev CFU'er målt ved hjælp af den ledsagende protokol, som muliggjorde identifikation af de tilstedeværende arter, procentdelen af fluer koloniseret og den absolutte overflod af bakterier i hver flue. Årsagerne til den store observerede individuelle-til-individuelle variation i mikrobiomsammensætning er dårligt forstået, og kvantificering af den statistiske fordeling af kolonisering kan hjælpe med at studere denne variation36,37. For at opnå et betydeligt antal biologiske replikater blev der udviklet en rørledning med høj kapacitet til kvantificering af mikrobeforekomst i mange individuelle fluer ved hjælp af CFU-tællinger (figur 1A).

Den endelige kvantificering af CFU'er kan påvirkes af, hvordan fluer håndteres inden analyse, for eksempel faktorer, herunder overfladesterilisering, tid siden forbrug af bakterier og rydning af forbigående bakterier fra tarmen. For det første blev fluer med fokus på Drosophila commensale bakteriearter L. plantarum (Lp; se Lp stamme WF i Obadia et al.36) fodret med en dosis på ~ 105 CFU'er Lp og holdt i grupper på 25 fluer pr. Hætteglas. Disse fluer blev enten opbevaret i det samme hætteglas i 3 dage eller overført dagligt (overført) til frisk, steril mad (figur 1B). Ikke-overførte fluer blev derefter enten vasket i ethanol for at fjerne overfladebakterier (vasket) eller ikke vasket (uvasket). Vask gav en ikke-signifikant reduktion i de samlede målte CFU'er (figur 1B), hvilket indikerer, at flueoverfladen under disse stærkt kontrollerede podningsbetingelser ikke bliver signifikant koloniseret af bakterier på 3 dage. De andre grupper af fluer blev overført hver dag for at reducere ophobningen af bakterier fra vækst på mad (Overført); Derudover blev en gruppe overført til frisk mad i 4 timer før prøveudtagning (efter overførsel), eller de blev anbragt i hætteglas med kun sterilt agarvand i 4 timer (ryddet) for at tillade forbigående indtagne mikrober at rydde fra tarmen. Hvert af disse trin for at tilvejebringe strengere koloniseringsmåling medførte en statistisk signifikant reduktion i forekomsten af CFU'er i fluerne, med undtagelse af overfladevask i ethanol. Overførsel til steril mad (efter overførsel) eller agarvand (ryddet) i 4 timer før måling gav uadskillelige virkninger, hvilket indikerer, at overførsel til sterile forhold 4 timer før måling reducerer bakteriebelastningen. Dette resultat er i overensstemmelse med den fortolkning, at nogle tarmbakterier i fluetarmen er forbigående, mens andre er mere stabilt forbundet35. Overfloden af Lp varierede fra 1 x 10 4,3 CFU'er/fluer i klare fluer til 1 x 104,9 CFU'er i de uvaskede fluer (n = 724 fluer).

Dernæst blev det samme assay udført ved anvendelse af Acetobacter indonesiensis (Ai), en gramnegativ bakterie, der koloniserer fluetarmen (figur 1C; se stamme Ai SB003 i Obadia et al.36). Som med Lp-koloniserede fluer producerede overfladesterilisering en ikke-signifikant reduktion i CFU'er. Ligeledes reducerede daglig overførsel til steril mad bakteriebelastningen betydeligt, og overførsel til sterile forhold i 4 timer før homogenisering medførte en yderligere reduktion i bakteriebelastningen. Overfloden af Ai varierede fra 1 x 104,7 CFU'er/fluer i ryddede fluer til 1 x 105,0 CFU'er i de uvaskede fluer (n = 528 fluer). Nøjagtig kvantificering af tarmbakterier afhænger således af hyppigheden af overførsel, herunder på overførselsdagen. Fjernelse af den eksterne bakteriebelastning ved vask i ethanol havde en ikke-signifikant effekt, men mere signifikante virkninger kan observeres for forskellige bakteriestammer eller forskellige kulturbetingelser. Disse faktorer bør kontrolleres eksperimentelt.

Den potentielle effekt af homogeniseringsmetoden på CFU-tællinger blev også testet. Fluerne blev homogeniseret ved hjælp af en perlepisker med 0,5 μm glasperler i 100 μL PBS, hvilket kunne reducere levedygtigheden af bakterieceller. Først blev en suspension af Lp-bakterier fra dyrkning fremstillet i PBS og derefter belagt for at tælle CFU'er som en positiv kontrol. Den samme kultur blev placeret i perlepladen og (i) homogeniseret med perler, (ii) homogeniseret med perler og en kimfri flue eller (iii) homogeniseret i PBS uden perler (figur 1D). Homogenisering i perler, når en flue var til stede, påvirkede ikke signifikant overfloden af levedygtige celler i opløsning, mens homogeniseringen af bakterier i fravær af en flue dræbte et betydeligt antal bakterieceller. Homogenisering i PBS uden perler reducerede også antallet af levedygtige celler betydeligt. Tilsvarende blev Ai-levedygtighed bevaret, når den homogeniseres i nærværelse af en flue, mens homogenisering uden flue reducerede antallet af levedygtige celler i opløsning (figur 1E). Disse resultater indikerer, at fluevævet beskytter bakterierne mod at blive ødelagt af perlerne under homogenisering. Forsøgene i figur 1D og figur 1E blev imidlertid udført med mere end 108 CFU'er pr. brønd. I praksis viste det sig, at brønde med ~ 106 celler pr. Brønd eller mindre viste sig at vise lidt celletab, når perler blev brugt uden flue. Afkøling af pladen på is halvvejs gennem perleslag forbedrer også cellens levedygtighed. Betydningen af disse resultater er, at læserne skal være opmærksomme på disse potentielle problemer og designe passende kontroller til deres specifikke brugssag.

Nøjagtighed af pletbelægning af 96-brøndsplader til CFU-kvantificering med høj kapacitet
Da målet er at måle CFU's overflod for hundreder til tusinder af individuelle fluer, er traditionelle spredningsbelægningsmetoder uoverkommeligt tids- og materialeintensive. Spot plating er en effektiv metode til CFU-vækst og optælling19,31. Pletbelægningsmetoden anvender en 96-kanals pipettor til at dispensere 2 μL bakteriel suspension på medier fremstillet i rektangulære bakkeplader (figur 2A). Hver plet repræsenterer bakteriebelastningen af en enkelt prøve, så 96 fluer kan analyseres med en enkelt plade (figur 2B). Nøjagtigheden af pletbelægning blev sammenlignet med traditionel plettering ved podning af vækstplader ved hjælp af nøjagtig den samme 0,0001 OD suspension af Lp til begge metoder. Suspensionen blev to gange serielt fortyndet fem gange i PBS. Som en head-to-head sammenligning blev 50 μL af podet spredt på individuelle runde plader, eller 2 μL pletter blev lavet på rektangulære MRS-plader. Pladerne blev derefter inkuberet ved 30 °C, indtil kolonierne kunne tælles. De resulterende CFU-tællinger for hver fortynding blev anvendt til at beregne suspensionens oprindelige koncentration og sammenlignet (figur 2C). Runde plader med 50-500 CFU'er blev regnet som kontrol. Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel mellem high-throughput og traditionelle runde plating metoder.

Da tætheden af kolonier kan påvirke deres vækst og kvantificering, blev effekten af CFU-tæthed på endelige tællinger testet. Pletter med 2 til 25 kolonier pr. plet viste ingen forskel i det endelige antal sammenlignet med den traditionelle runde plademetode (figur 2C). Pletter med et gennemsnit på 35 kolonier gav resultater, der skævede lidt lavere end kontrolspredningspladerne (figur 2C; p = 0,0017). En nærmere undersøgelse af fotografierne af de enkelte pletter viste, at denne skævhed skyldtes kolonier, der overlappede hinanden i tætte pletter. Målinger baseret på pletter med et gennemsnit på 11 kolonier pr. plet resulterede i koncentrationer tættest på dem, der var baseret på spredningspladerne (figur 2C; Spredeplader: gennemsnit = 1 x 104,4 CFU'er; SD = 0,086 vs. pletter med 11 gennemsnitlige kolonier: gennemsnit = 1 x 104,4 CFU'er; SD = 0,12, p = 0,42, Welchs t-test).

Generering af billeder i høj kvalitet til kvantificering ved hjælp af en specialiseret fotograferingsplatform med enten hvidt lys eller fluorescens
Spot-plating med høj kapacitet genererer naturligvis et stort antal målområder, som skal tælles nøjagtigt. Kvalitetsfotografier kan bruges til at dokumentere dataene og til at lette optællingen af CFU'er. En robust og ligetil fotograferingsplatform blev udviklet ved hjælp af kommercielt tilgængelige materialer (figur 3A). Et digitalkamera blev fastgjort til et beslag oven på en specialkonstrueret lysboks, kaldet FluoroBox, og blev peget direkte ned, vinkelret på midten af pladen. Et farvet emissionsfilter blev eventuelt placeret foran linsen ved hjælp af en filterskyder. Et lysskjold forhindrede linseudbrud ved at blokere direkte lys fra LED-strimlerne nedenfor. LED-strimler oplyste pladen fra siderne i stedet for over for at forhindre blænding på pladen. Ud over hvidt lys blev enkeltfarvede blå og grønne lysdioder brugt til at begejstre henholdsvis grønne og røde fluorescerende proteiner. Pladen blev holdt på plads af en pladeholder på skuffen, og skuffen var udstyret med skuffeskydere for at gøre det nemt at indsætte pladen. Komplette designs er tilgængelige i supplerende fil 1 og supplerende fil 2.

Et foto af en pletplade af Lp-kolonier blev taget ved hjælp af hvide lysdioder og et digitalt kamera for at hjælpe med at tælle kolonier og skelne mellem forskellige farver og morfologier (figur 3B). For at validere, at lysintensiteten var jævn, blev agars baggrundsintensitet målt på tværs af forskellige regioner på et pladefotografi (figur 3C). For at demonstrere, at kolonierne tydeligt kan skelnes fra baggrunden, blev intensiteten over diameteren på 10 forskellige kolonier på forskellige dele af pladen målt og fundet at være ca. ~ 300% højere end baggrunden (figur 3C). Pladen blev podet med Lp med et mCherry fluorescerende proteinekspressivt plasmid samt noget Lp, der ikke indeholdt plasmidet, så kolonier var enten mCherry-positive eller mCherry-negative. For at skelne mellem disse to typer kolonier blev pladen fotograferet ved hjælp af det samme kamera med grønt LED-lys (515-525 nm) og et rødt filter (Tiffen # 29), hvilket fik mCherry-positive kolonier til at fluorescere (figur 3D). Forskellen i intensitet mellem mCherry-positiv og mCherry-negativ blev kvantificeret ved at måle intensiteten på tværs af en prøve af kolonier (n = 10 kolonier). mCherry-positive kolonier var ~ 1.000% højere intensitet end mCherry-negative (figur 3E). Kolonier af Ai, der udtrykker GFP og kolonier af Ai, der ikke udtrykker fluorescens, blev fotograferet ved hjælp af blå LED-lys (465-475 nm) og et grønt filter (Tiffen # 58) (figur 3F). GFP-positive kolonier viste 200% højere intensitet end GFP-negative (figur 3G).

Automatiseret optælling af CFU'er på spotplader ved hjælp af det brugerdefinerede ImageJ plug-in Count-On-It
Billeder alene hjælper med at tælle kolonier (f.eks. ved at gemme dataene, dele dataene, zoome ind, markere et overlay, adskille farver osv.). Imidlertid kan handlingen med manuelt at tælle og organisere resultaterne af hundredvis af pletter være kedelig, tidskrævende og tilbøjelig til menneske-til-menneske-forskelle i endelige tællinger. For at fremskynde optællingsprocessen og standardisere reproducerbarheden af tællinger blev der udviklet et specialiseret ImageJ-plug-in kaldet Count-On-It (figur 4A). Dette plug-in muliggør nøjagtig halvautomatisk optælling af CFU'er på agarplader. Brugeren forbereder billeder til tælling ved først at beskære og rette dem ved hjælp af den ekstra Croptacular plug-in. Billederne kan eventuelt batchbehandles, og tærsklen kan justeres for hver plade. Flere andre muligheder giver brugeren mulighed for at øge nøjagtigheden af pladetælling, herunder justering af lysbølgelængderne (RGB-billeder), indstilling af et interval af kolonistørrelse (i pixels), ændring af det maksimale billedformat og tilpasning af dimensionerne på det aktive markeringsgitter. Count-On-It udsender en tabel med resultater med hver plade repræsenteret som en kolonne af CFU-tællinger. Det genererer også en fotokvittering, der viser et overlay for visuelt at dokumentere dets tælleresultater og hjælpe med manuel fejlkorrektion (figur 4B). Mens der opstår fejl, når antallet af kolonier, der tælles manuelt, blev sammenlignet med antallet af kolonier, der blev talt ved hjælp af dette plug-in (figur 4C), var forholdet generelt ækvivalent med lineær regression mellem de manuelle og automatiserede tællinger, der viste en hældning på 0,95 med over 90% nøjagtighed (R2 = 0,93), selvom fejlen steg, da antallet af kolonier oversteg 20.

Count-On-It kan også bruges til separat at tælle fluorescerende kolonier ved hjælp af fluorescensfunktionen i FluoroBox. mCherry-positive kolonitællinger (figur 4D) ved software plug-in versus manuel havde en R2 på 0,92 (figur 4E). Tilsvarende havde GFP-positive kolonier (figur 4F) talt med software plug-in versus manuel en R2 på 0,90 (figur 4G). Fluorescerende versus ikke-fluorescerende kolonier kan skelnes inden for en enkelt prøve, og kolonistørrelse og form kan desuden bruges til at skelne mellem separate underpopulationer (figur 4H-K). Fotokvitteringerne giver en post, der giver brugeren mulighed for hurtigt at kontrollere nøjagtigheden af tællingerne og manuelt rette fejl. I figur 4C, E, G, I, K er fotokvitteringerne ikke blevet brugt til at forbedre tællenøjagtigheden, så læserne kan se metodens rå output. Tilfælde som i figur 4G, hvor en manuel optælling på 1 gav en automatiseret optælling på 21, kan hurtigt detekteres ved hjælp af fotokvitteringerne. I dette tilfælde skabte blænding på kanten af pladen klatter, der blev talt som kolonier. For hvert brugstilfælde skal de optimale indstillinger for software-plug-in'en bestemmes inden høj gennemstrømning.

Figure 1
Figur 1: Koloniseringsanalysen måler CFU'er i hundredvis af individuelle fluer ved hjælp af et 96-brønds pladeformat. (A) Billedoversigt over koloniseringsanalysen og kvantificeringsmetoden med høj kapacitet anvendt som beskrevet i protokolafsnittet. (B) Lactiplantibacillus plantarum (Lp) overflod i fluer efter koloniseringsanalysen blev målt under forskellige forhold ved hjælp af CFU-kvantificeringsmetoden med høj kapacitet. Fluer blev opbevaret i det samme hætteglas i 3 dage og derefter homogeniseret og belagt (uvasket), vasket i ethanol før plettering (vasket), både vasket og overført hver dag (overført), overført dagligt og derefter opbevaret på steril mad før plettering (efter overførsel) eller opbevaret i hætteglas med kun vand i 4 timer (ryddet) (n = 724 fluer i alt, 3 biologiske replikater og ~ 72 fluer i alt pr. behandling). (C) Det samme assay som i (B) blev udført under anvendelse af Acetobacter indonesiensis (Ai) (n = 528 fluer). (D) Lp bakteriel suspension blev fremstillet i PBS og derefter belagt til at tælle CFU'er eller først homogeniseret ved perleslagning, perleslagning i kombination med en kimfri (GF) flue eller rystet på perlepiskeren uden perler eller en flue (n = 236 prøvebrønde). (E) Ai levedygtighed efter homogenisering blev testet på samme måde som i (D) (n = 282 prøvebrønde). Statistisk signifikans for paneler (B-E) blev beregnet ved hjælp af en Kruskal-Wallis-test efterfulgt af parvise Wilcoxon rank-sum-tests med Bonferronis korrektion af flere sammenligninger. Boks giver interkvartilområde. Linjen angiver medianen. Whiskers giver total rækkevidde. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Nøjagtighed af pletbelægning af 96-brøndplader til CFU-kvantificering med høj kapacitet. (A) Plettering ved hjælp af en 96-kanals pipettor til dispensering af 2 μL på medier fremstillet i rektangulære bakkeplader. (B) MRS-agar vækstplade med 96 pletter af Lp-kolonier . (C) Koncentration af Lp-suspension baseret på CFU-tællinger fra traditionelle runde plader (n = 24 plader) sammenlignet med koncentration baseret på CFU-tællinger fra spotplader (n = 680 pletter) serielt fortyndet og arrangeret efter gennemsnitligt koloniantal pr. plet (~ 48 pletter for hver enkelt fortyndingsfaktor for tre replikatplader blev talt). Hvert datapunkt repræsenterer de nøjagtige kolonier pr. punkt, mens hver kolonne repræsenterer de gennemsnitlige kolonier for den fortynding. Vandret stiplet linje angiver det beregnede CFU-antal af den kultur, der blev belagt. Grønne skitserede punkter fremhæver de traditionelle runde pladetællinger. Rødfyldte punkter fremhæver den optimale kolonitæthed på 11 CFU'er pr. 2 μL-punkt. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af almindelig envejs ANOVA, der sammenlignede gennemsnittet af hver kolonne med gennemsnittet af spredningspladekontrolkolonnen med Bonferronis korrektion af flere sammenligninger. Boks giver interkvartilområde. Linjen angiver medianen. Whiskers giver total rækkevidde. **p < 0,01. ns = ikke signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: En fotoplatform producerer kvantificerbare billeder af plader ved hjælp af hvidt lys eller fluorescens . (A) Oversigt over FluoroBox-designet. (B) Foto af en pletplade af Lp-kolonier ved hjælp af hvidt lys. (C) Intensitetsprofil for enkelte kolonier under hvidt lys sammenlignet med intensiteten af baggrunden (BKG) (n = 10 kolonier, stiplet linje repræsenterer standardafvigelse). (D) Foto af den samme pletplade som i (B) ved hjælp af enkeltfarvede grønne lys og det røde filter til at vælge for mCherry-positive Lp-kolonier . (E) Intensitetsprofil for enkelte kolonier, der illustrerer forskellen mellem kolonier med og uden mCherry-emission. (F) Foto af en pletplade indeholdende Ai-kolonier , hvoraf nogle har en GFP-etiket. (G) Intensitetsprofil for enkeltkolonier, der illustrerer forskellen mellem GFP-negative og GFP-positive kolonier. E, F, G: n = 10 kolonier for hvert område. Kolonidiametre er ca. 1,5 mm. Stiplet linje er SD. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Nøjagtig optælling af spotplader ved hjælp af Count-On-It ImageJ-plug-in'en. (A) Skærmbillede af plug-in-opsætningsvinduet. (B) Plug-in'et genererer en kvittering for at dokumentere optælling og hjælp til fejlkorrektion. Indsat: Overlejring med antallet af kolonier talt for hver pletregion; Den gule kontur angiver, at en enkelt koloni blev talt og rød, at flere kolonier blev talt. (C) Plot, der viser antallet af kolonier, der tælles manuelt sammenlignet med antallet af kolonier, der tælles ved hjælp af plug-in (automatiseret), når der blev brugt et hvidt lysbillede, hvor hvert punkt på grafen repræsenterer et enkelt punkt, der tælles manuelt eller automatisk (hældning af pasform = 0,95, cyanlinje; 1:1 linje er prikket rød; R2 = 0,93, Pearsons korrelationskoefficient, p < 0,0001). (D) Fotokvitteringsbillede fra plug-in'et, når mCherry-positive kolonier blev valgt ved hjælp af fluorescensfunktionen i fotoboksen. (E) Plot, der viser antallet af mCherry-positive kolonier talt ved hjælp af manuel sammenlignet med automatiseret metode, når rød fluorescens blev brugt (hældning af pasform = 1,1, cyanlinje; 1:1 linje er prikket rød; R2 = 0,92, Pearsons korrelationskoefficient, p < 0,0001). Bemærk, at afvigelser og fejl ikke er blevet rettet ved hjælp af analysekvitteringerne for E, G, I, K. (F) Fotokvitteringsbillede fra plug-in'et, når GFP-positive kolonier blev valgt ved hjælp af fotoboksens grønne fluorescensfunktion og valg af den grønne kanal med plug-in'et. (G) Plot, der viser antallet af GFP-positive kolonier talt ved hjælp af manuel sammenlignet med automatiseret metode, da grøn fluorescensbelysning blev brugt (hældning af pasform = 1,1, cyanlinje; 1:1 linje er prikket rød; R2 = 0,90, Pearson korrelationskoefficient, p < 0,0001). (H) mCherry-positive kolonier udvalgt fra blandede kolonimorfologier ved hjælp af en høj fluorescenstærskel i plug-in'en. (I) Plot, der viser antallet af mCherry-positive kolonier talt ved hjælp af manuel sammenlignet med automatiseret metode, når der blev anvendt rød fluorescensbelysning (hældning af pasform = 0,99; R2 = 0,91, Pearsons korrelationskoefficient, p < 0,0001). J) mCherry-negative kolonier udvalgt fra blandede kolonimorfologier ved hjælp af en lav fluorescenstærskel. (K) Plot, der viser antallet af mCherry-negative kolonier talt ved hjælp af manuel sammenlignet med automatiseret metode, da intensitetstærsklen blev indstillet til at vælge ikke-fluorescerende kolonier (hældning af pasform = 1,1; R2 = 0,85, Pearsons korrelationskoefficient, p < 0,0001). Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: FluoroBox monteringsvejledning. Denne fil fører læseren trin for trin gennem konstruktionen af den kontrollerede belysningsboks, der bruges i videoen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: FluoroBox akryl laser cut. Denne fil indeholder en skåret skabelon til laserskæring af akrylstykkerne til den kontrollerede belysningsboks. Filen kan sendes til en laserskåret akrylleverandør. Se materialeoversigten for den leverandør, der er brugt i denne protokol. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: Software instruktioner. Denne fil fører læseren trin for trin gennem installationen og brugen af Croptacular og Count-On-It software, der følger med denne protokol. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 1: 3D-udskrivningskode til perlemålebakke (S1-bead-measurer.stl). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 2: Rektangulær pladefotobeskærer ImageJ-plugin (Croptacular_.ijm). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 3: Plugin til fotobeskæring af rundplade (Circus_.ijm). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 4: Rektangulær plade 96 spot counter plugin (Gridiron_.ijm). Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

De detaljerede teknikker, der præsenteres her, muliggør en >100-dobling i antallet af prøver, der kan evalueres i et CFU-tælleeksperiment. Denne teknik fremmer eksisterende metoder til mikrobiomeksperimenter i Drosophila 12,35,36 ved at bruge 96-brøndspladeformatet til at analysere individuelle fluer. Desuden anvender den en mere effektiv pletbelægningsmetode19,31 og en automatiseret arbejdsgang med en fotograferings- og kolonitællingsplatform. Betydningen af denne metode for Drosophila er at standardisere eksperimenter til 96-brøndpladeformatet, hvilket muliggør samtidig håndtering af et stort antal biologiske replikater med automatisering for at opnå kvantificering af CFU'er med høj kapacitet.

96-brøndsplatformen viser, at øget overførselsfrekvens og "rydning" af forbigående bakterier forårsager en betydelig reduktion i både den gennemsnitlige overflod og variationen mellem prøver (figur 1B, C), hvilket viser strengheden af denne forbedrede protokol. En begrænsning af co-housing fluer er den vandrette overførsel af bakterier mellem fluer. En foreslået løsning er at holde fluer individuelt i et 96-brønds pladeformat, såsom Whole Animal Feeding Flat38.

Selvom der ikke blev observeret en signifikant reduktion i bakteriebelastningen, når fluer blev vasket i ethanol, var disse fluer kun blevet opbevaret i nærværelse af eksterne bakterier i 3 dage. Boliger i længere perioder kan tillade en større bakteriebelastning at akkumulere39. Derfor anbefales det stadig at vaske i ethanol.

Overførsel af fluer til 96-brøndspladen er det kritiske første trin til opsætning af arbejdsgangen (figur 1A). Når fluerne er vasket, fordeles de i brøndene en ad gangen. Et pladediagram er nyttigt på dette stadium for at notere, hvilke forhold der er til stede i hver brønd og tilføje eventuelle noter som "flue gik tabt". Homogenisering er et andet kritisk skridt med nogle vigtige forbehold. Bakterier overlever homogeniseringsprocessen, når de er i nærværelse af en flue (figur 1D, E), og formodentlig gælder dette princip også, når bakterierne er inde i fluens tarm. Imidlertid dræbes bakterier også, når de homogeniseres i perleplader alene, hvilket viser, at homogeniseringen kan dræbe bakteriecellerne under visse omstændigheder, en begrænsning, der kan være vigtig, hvis man for eksempel homogeniserer dissekerede tarme. Især er tabet af CFU'er ved homogenisering afhængig af antallet af CFU'er i prøven, og tabet er minimalt, når der anvendes ~ 105 CFU'er pr. Brønd. Yderligere bevarelse af CFU'er kan opnås ved at stoppe homogenisering halvvejs igennem og afkøle pladen på is.

Homogenisering blev udført i 5 minutter i denne protokol baseret på kontrolforsøg, hvor et kendt antal CFU'er blev blandet med en kimfri flue, og dette fungerede empirisk for fluebakterier. Mindre slag medførte, at større fluedele var til stede, hvilket forstyrrer pipetterne, mens betydeligt længere homogeniseringstider på ~10 min gjorde CFU-tællingerne mere variable. Det mindre volumen og vinklede form af koniske pladebrønde blev observeret for at reducere effektiviteten af perleslag sammenlignet med cylindriske 2 ml rør. Mange variationer af denne generelle tilgang er mulige, herunder hvilke bakteriestammer, hvilken perleslagbeholder, hvilke perler og hvilken fluegenotype der anvendes. Individuelle brugercases skal bruge positive kontroller til at etablere deres tilgang.

Pletbelægningsmetoden blev anvendt på en bestemt måde: 1:2 fortyndinger af L. plantarum WF i PBS blev spottet på MRS-plader og inkuberet ved 30 °C i 2 dage (kortere inkubationstider kan implementeres for at generere mindre kolonistørrelser). Metoden kræver en vis forudgående investering i udstyr, primært perlepiskeren og 96-kanals pipettor (figur 2A), som er nødvendig for både fortyndingsserien og spotbelægningen. Imidlertid er billigere muligheder tilgængelige, herunder en 96-brønds pladereplikator med slidsede stifter. Fortyndingsserien er et kritisk trin, der påvirker nøjagtigheden af CFU-optællingsresultaterne. Med hensyn til fejltilstande er det muligt at tilstoppe pipettespidserne med fluedele eller glasperler, og at pipettespidserne ikke forsegles ordentligt på pipettoren eller svigter af en anden grund. Alle disse problemer resulterer i undertælling af de berørte brønde og bør overvåges. Tilstrækkelig blanding ved hvert trin i fortyndingsserien er også afgørende. Hver fortynding skal blandes grundigt enten ved at lægge pladen på en pladeryster eller ved at pipettere op og ned 15-20 gange, hvilket også tjener til at skylle spidserne. Ved at spotte fra den mest fortyndede til mindst fortyndede plade kan spidserne genbruges til hele fortyndingsserien. Med 1:2 fortyndinger er tællingen nøjagtig over et interval på 2-25 kolonier, der spænder over en størrelsesorden (figur 2C). Derfor sparer 1:10 fortyndinger tid og materialer. En anden variabel, der kan udnyttes, er inkubationstid, som kan justeres til at producere mindre kolonier og dermed øge rækkevidden af tællelige pletter ved at forhindre sammensmeltning af tilstødende kolonier.

Et kvalitetsfoto af pladen er afgørende, da det bliver de rå kildedata, hvorfra CFU'erne analyseres og kan arkiveres på ubestemt tid. FluoroBox er designet til at producere fotos af pladerne med ensartet lysintensitet, hvilket minimerer blænding på agaroverfladen. Derudover er designet i stand til selektivt at fotografere fluorescerende kolonier ved hjælp af enkeltfarvede LED-lys og farvede fotofiltre (figur 3A). Konstruktionen af et setup som FluoroBox med kontrolleret belysning og kameraindstillinger kan i høj grad øge reproducerbarheden af CFU-billeder, hvilket er vigtigt for automatiseret analyse. Kolonimorfologier, fluorescensintensitet og virkningerne af tid eller tæthed på kolonivækst er blot nogle få af de egenskaber, der kan analyseres ved hjælp af fotografierne. Fotoboksen kan konstrueres uden farvefiltre og ensfarvede lys, hvis der ikke anvendes fluorescerende bakterier, hvilket reducerer omkostningerne og kompleksiteten. Forskellige excitationslys og emissionsfiltre kan erstattes af dem, der anbefales her, hvis et andet fluorophore bruges af et laboratorium. Et kamera, der er tilsluttet en tablet via WiFi ved hjælp af en app, er nyttigt både til den automatiserede lukkerfunktion for at forhindre rystelser og for at lette dataoverførslen. Billeder kan overføres til tabletten og derefter til en bærbar computer ved hjælp af trådløs filoverførselssoftware. Anbefalede kameraer med disse muligheder er angivet i materialetabellen.

Count-On-It er et plug-in skrevet i ImageJ. Den automatiserede CFU-tællesoftware segmenterer pladebilledet i et ensartet 96-brøndsgitter, tæller kolonierne i hver gittercelle og batcher resultaterne i et simpelt regneark. Da der altid er variation i placeringen af spotgitteret på pladen og på billedet, skal brugeren manuelt tilpasse gitteret til billedet ved hjælp af Croptacular plug-in. Dette hjælper også med at udelukke områder nær pladekanten, som har blænding. Indstilling af tærsklen er nøglen til at få den mest nøjagtige CFU-optælling fra billedet. Hvis tærsklen er sat for højt, vil kolonierne fusionere; Hvis tærsklen er sat for lavt, vil kolonierne blive udelukket. Når tærsklen er indstillet, anvender makroen gaussisk sløring for at blødgøre kanterne og reducere aliasing, vandskelfilteret deler overlappende kolonier, og klatterne tælles ved hjælp af analysepartikler.

Nogle gange er tætheden af kolonier for høj på et bestemt sted. Count-On-It giver en måde at håndtere dette på. For at estimere antallet af kolonier i en gittercelle med delvist fusionerede kolonier tages først det gennemsnitlige areal af en cirkulær klat fra hele pladen som Cavg. Derefter divideres arealet af blob A 1 med det gennemsnitlige areal af en cirkulær blob A1/Cgns. Dette tal afrundes til nærmeste heltal, og det er estimatet for, hvor mange kolonier der er i en klat. Denne funktion er en af grundene til, at tærsklen kan påvirke tælleresultaterne: det relative gennemsnitlige koloniområde versus et flettet klatområde vil være forskelligt afhængigt af, hvordan tærsklen påvirkede flettede klatter.

De præsenterede metoder har flere begrænsninger. Disse omfatter behovet for udstyr til at dispensere flydende medier nøjagtigt fra 96-brøndplader. Dette udstyr, enten en 96-kanals pipettor eller et slidset replikatorstiftværktøj, kan koste tusindvis af dollars at få. Der findes billigere alternativer, men de er mindre præcise. Automatiseret optælling via Count-On-It giver også nogle begrænsninger. For eksempel, hvis to kolonityper i en blandet befolkning blev afgrænset baseret på størrelse alene, ville blobtælling ikke være i stand til at tildele kolonier til den korrekte type. I dette tilfælde skal pletter med klatter fjernes fra tællinger. Yderligere differentiering af kolonier baseret på morfologi ville være en værdifuld forlængelse af metoden, som ikke er implementeret i øjeblikket. Brugen af selektive medier, herunder stammespecifikke næringsstoffer og antibiotika, forenkler behovet for kompleks billedanalyse.

Vedligeholdelse af bananflueforsøg i 96-brøndsplader multiplicerer antallet af prøver og tilstande, der kan testes i et enkelt eksperiment og kan lette skærme med høj kapacitet i Drosophila-bakterieforeningsfænotyper. Vi forestiller os, at denne metode kan udvides ved at bruge selektive medier til at differentiere mange bakteriestammer i komplekse blandinger. Metoden er ikke begrænset til undersøgelsen af fluemikrobiomet. Kvantificering af CFU'er er almindelig i mange anvendelser af mikrobiologi, fra coliforme tal i drikkevand til identifikation af patogener. CFU-platingsystemet, der præsenteres her, muliggør skærme med høj kapacitet samt automatiseret erhvervelse, behandling, opbevaring og levering af resultater.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dr. Kerwyn Casey Huang, Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper og medlemmer af Ludington-laboratoriet gav værdifulde input til udviklingen af denne protokol. Finansiering blev ydet af NSF IOS-tilskud 2032985, NIH-tilskud DP5OD017851, et Carnegie Institution of Canada-tilskud og Carnegie Institute for Science's Endowment.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bead beating and spot plating
Fly vials Genesee 32-121 autoclavable
Fly vial stoppers Genesee 59-201 autoclavable
Hand Applicator 3M 3M PA1
Heat Sealer Eppendorf 5390
Mini-Beadbeater 96 BioSpec 1001
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm BioSpec  11079105
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner Labnet LI-CF-P1000
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor Mettler Toledo 30296705 Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural USA scientific 1402-9220 Must be polypropylene for heat sealer
Thermal Bond Heat Seal Foil 4titude 4ti-0591 Keep sterile
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile SPL Life Sciences 31001 For making rectangular agar plates
Photobox construction
¼”-20 X ½” Bolts (X2) Amazon ASIN: B07BP1WR3H To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works.
¼”-20 x ½” Connector Nut  Amazon UPC: 799862376780 AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important.
¼”-20 x ¾” bolts (X3) Amazon ASIN: B003QZSZY4 For the plate holder. Brand not important.
1/8” x ½” washer Amazon UPC: 611982484599 Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
18 Gauge Wire - Two Conductor Power Wire - 18 AWG Power Wire – 10ft Superbrightleds.com WP18-2
22-10 AWG Red Wire Nut - WN-R2210 – Quantity 4 Superbrightleds.com WN-R2210
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector - 22-18 AWG – Quantity 3 Superbrightleds.com SCFP-2218
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector - 8mm Single Color LED Strip Lights - Quantity 3 Superbrightleds.com SBL-MA2P-8-2
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor - 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 Superbrightleds.com SBL-MA2P-8-1 
6” drawer handle Amazon ASIN: B07Z331P99 Any drawer handle should work.
6” Drawer slides Btibpse UPC: 712243424979 Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders.
8-32 x ½” Cap Nuts (x4) Amazon ASIN: B00HYLZB98 Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) Amazon ASIN: B07KX9T7NF To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
Acrylic Glue SCIGRIP Ean: 7844908489337 SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle
Black Cable Ties - 10 Pack - 4 Inch Long  Superbrightleds.com CT-B04-10
Camera L-Bracket WLPREOE, Vikerer, Unbranded ASIN: B09X46YKQZ The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Canon T series camera for tethering option OR Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. 1894C002 The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model).
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Blue - 2 meters Superbrightleds.com STN-BBLU-B6A-08C1M-24V
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Green – 2 meters Superbrightleds.com STN-BGRE-B6A-08C1M-24V
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Natural White 4000K – 2 meters  Superbrightleds.com STN-A40K80-B6A-08C1M-24V
Drill with ¼”, 1/8” drill bits Black & Decker ‎BDCDD12PK Brand not important. 
Flat Black Spray Paint,  2X Ultra-Matte Rustoleum 331182 Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important.
Laser Cut Acrylic Walls Big Blue Saw www.bigbluesaw.com Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera 
Mean Well LED Switching Power Supply - LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply - 24V DC - 20 Watt  Superbrightleds.com LPV-20-24
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. DMC-ZS100K Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good.
Quick Release Plate Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch ASIN: B07417F21D Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Rubber Bands, Assorted sizes BAZIC Products Alliance Rubber 26649 Rubber bands go on the plate holder. Brand not important.
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases - 3/4 inch base – Quantity 4 Superbrightleds.com CTMB-20
SPST Round Rocker Switch - No LED – Quantity 3 Superbrightleds.com RRS-SP
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm  Tiffen 72R29
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm Tiffen 7258
Software
ImageJ64 https://imagej.net/downloads N/A Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019
MacOSX Apple N/A Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it.
Unix BSD N/A 64 bit
Windows Microsoft N/A 64 bit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Shepherd, E. S., Deloache, W. C., Pruss, K. M., Whitaker, W. R., Sonnenburg, J. L. An exclusive metabolic niche enables strain engraftment in the gut microbiota. Nature. 557 (7705), 434-438 (2018).
  3. Taur, Y., et al. Intestinal domination and the risk of bacteremia in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Clinical Infectious Diseases. 55 (7), 905-914 (2012).
  4. Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
  5. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  6. Vandeputte, D., et al. Temporal variability in quantitative human gut microbiome profiles and implications for clinical research. Nature Communications. 12 (1), 6740 (2021).
  7. D'hoe, K., et al. Integrated culturing, modeling and transcriptomics uncovers complex interactions and emergent behavior in a three-species synthetic gut community. eLife. 7, 2892 (2018).
  8. Ludington, W. B., Ja, W. W. Drosophila as a model for the gut microbiome. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008398 (2020).
  9. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: Ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genetics. 7 (9), 1002272 (2011).
  10. Pais, I. S., Valente, R. S., Sporniak, M., Teixeira, L. Drosophila melanogaster establishes a species-specific mutualistic interaction with stable gut-colonizing bacteria. PLoS Biology. 16 (7), 2005710 (2018).
  11. Adair, K. L., et al. Host determinants of among-species variation in microbiome composition in drosophilid flies. The ISME Journal. 14, 217-229 (2019).
  12. Koyle, M. L., et al. Rearing the fruit fly Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions. Journal of Visualized Experiments. (113), e54219 (2016).
  13. Lesperance, D. N. A., Broderick, N. A. Microbiomes as modulators of Drosophila melanogaster homeostasis and disease. Current Opinion in Insect Science. 39, 84-90 (2020).
  14. Grenier, T., Leulier, F. How commensal microbes shape the physiology of Drosophila melanogaster. Current Opinion in Insect Science. 41, 92-99 (2020).
  15. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  16. Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples. Microbiome. 6 (1), 110 (2018).
  17. Téfit, M. A., Gillet, B., Joncour, P., Hughes, S., Leulier, F. Stable association of a Drosophila-derived microbiota with its animal partner and the nutritional environment throughout a fly population's life cycle. Journal of Insect Physiology. 106, 2-12 (2017).
  18. Ryu, J. -H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  19. Sieuwerts, S., De Bok, F. A. M., Mols, E., De Vos, W. M., Van Hylckama Vlieg, J. E. T. A simple and fast method for determining colony forming units. Letters in Applied Microbiology. 47 (4), 275-278 (2008).
  20. Eckburg, P. B., et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).
  21. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Applied and Environmental Microbiology. 80 (2), 788-796 (2013).
  22. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  23. Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (1), 6 (2014).
  24. Vega, N. M., Ludington, W. B. From a parts list to assembly instructions and an operating manual: How small host models can re-write microbiome theory. Current Opinion in Microbiology. 64, 146-151 (2021).
  25. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  26. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).
  27. Sundarraman, D., et al. Higher-order interactions dampen pairwise competition in the zebrafish gut microbiome. mBio. 11 (5), 1-15 (2020).
  28. Douglas, A. E. Simple animal models for microbiome research. Nature Reviews Microbiology. 17, 764-775 (2019).
  29. Friedman, J., Higgins, L. M., Gore, J. Community structure follows simple assembly rules in microbial microcosms. Nature Ecology & Evolution. 1, 0109 (2017).
  30. Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. Spiral plate method for bacterial determination. Applied Microbiology. 25 (2), 244-252 (1973).
  31. Thomas, P., Sekhar, A. C., Upreti, R., Mujawar, M. M., Pasha, S. S. Optimization of single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) with sample anchoring as an assured method for bacterial and yeast cfu enumeration and single colony isolation from diverse samples. Biotechnology Reports. 8, 45-55 (2015).
  32. Nuñez, I., et al. Low cost and open source multi-fluorescence imaging system for teaching and research in biology and bioengineering. PLoS One. 12 (11), 0187163 (2017).
  33. Putman, M., Burton, R., Nahm, M. H. Simplified method to automatically count bacterial colony forming unit. Journal of Immunological Methods. 302 (1-2), 99-102 (2005).
  34. Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).
  35. Dodge, R., et al. A gut commensal niche regulates stable association of a multispecies microbiota. bioRxiv. , (2021).
  36. Obadia, B., et al. Probabilistic invasion underlies natural gut microbiome stability. Current Biology. 27 (13), 1999-2006 (2017).
  37. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLoS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
  38. Jaime, M., et al. The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults. bioRxiv. , (2018).
  39. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metabolism. 6 (2), 144-152 (2007).

Tags

Biologi udgave 191
Hurtig kolonidannende enhedstælling i 96-brønds pladeformat anvendt på <em>Drosophila-mikrobiomet</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dodge, R., Ludington, W. B. Fast… More

Dodge, R., Ludington, W. B. Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome. J. Vis. Exp. (191), e64298, doi:10.3791/64298 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter