Summary
Hier presenteren we gedetailleerde methoden voor de bereiding en evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo.
Abstract
Epitooppeptiden hebben wijdverspreide aandacht getrokken op het gebied van tumorvaccins vanwege hun veiligheid, hoge specificiteit en handige productie; in het bijzonder kunnen sommige MHC I-beperkte epitopen effectieve cytotoxische T-lymfocytenactiviteit induceren om tumorcellen te verwijderen. Bovendien is nasale toediening een effectieve en veilige toedieningstechniek voor tumorvaccins vanwege het gemak en de verbeterde therapietrouw van de patiënt. Epitopeptiden zijn echter niet geschikt voor nasale bevalling vanwege hun slechte immunogeniciteit en gebrek aan leveringsefficiëntie. Nano-emulsies (NEs) zijn thermodynamisch stabiele systemen die kunnen worden geladen met antigenen en rechtstreeks op het neusslijmvliesoppervlak kunnen worden afgeleverd. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) is het kernpentapeptide van laminine, een integrinebindend peptide dat tot expressie wordt gebracht door menselijke respiratoire epitheelcellen. In deze studie werd een intranasaal zelfgeassembleerd epitooppeptide NE-tumorvaccin met het synthetische peptide IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) bereid met een laagenergetische emulgeringsmethode. De combinatie van IKVAV en OVA257-264 kan de opname van antigeen door nasale mucosale epitheelcellen verbeteren. Hier stellen we een protocol op om de fysisch-chemische kenmerken te bestuderen door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), atoomkrachtmicroscopie (AFM) en dynamische lichtverstrooiing (DLS); stabiliteit in aanwezigheid van mucine-eiwit; toxiciteit door onderzoek naar de levensvatbaarheid van de cellen van BEAS-2B-cellen en de neus- en longweefsels van C57BL/6-muizen; cellulaire opname door confocale laserscanmicroscopie (CLSM); vrijgaveprofielen door kleine dieren in vivo in beeld te brengen; en het beschermende en therapeutische effect van het vaccin door gebruik te maken van een E.G7 tumordragend model. We verwachten dat het protocol technische en theoretische aanwijzingen zal bieden voor de toekomstige ontwikkeling van nieuwe T-cel epitoop peptide mucosale vaccins.
Introduction
Als een van de meest kritieke innovaties op het gebied van de volksgezondheid spelen vaccins een sleutelrol in de strijd tegen de wereldwijde last van menselijke ziekten1. Op dit moment worden bijvoorbeeld meer dan 120 kandidaat-vaccins voor COVID-19-ziekten getest, waarvan sommige in veel landen zijn goedgekeurd2. Recente rapporten stellen dat kankervaccins de voortgang van klinische kankerbehandelingen effectief hebben verbeterd omdat ze het immuunsysteem van kankerpatiënten sturen om antigenen te herkennen als lichaamsvreemd3. Bovendien kunnen meerdere T-cel epitopen binnen of buiten tumorcellen worden gebruikt om peptidevaccins te ontwerpen, die voordelen hebben aangetoond bij de behandeling van gemetastaseerde kankers vanwege het ontbreken van de significante toxiciteit geassocieerd met radiotherapie en chemotherapie 4,5. Sinds het midden van de jaren 1990 zijn preklinische en klinische proeven voor tumorbehandeling voornamelijk uitgevoerd met behulp van antigeenpeptidevaccins, maar weinig vaccins vertonen een adequaat therapeutisch effect op kankerpatiënten6. Bovendien hebben kankervaccins met peptide-epitopen een slechte immunogeniciteit en onvoldoende leveringsefficiëntie, wat te wijten kan zijn aan de snelle afbraak van extracellulaire peptiden die snel diffunderen vanaf de plaats van toediening, wat leidt tot onvoldoende antigeenopname door immuuncellen7. Daarom is het noodzakelijk om deze obstakels te overwinnen met vaccinafgiftetechnologie.
OVA 257-264, het MHC klasse I-bindende257-264 epitoop uitgedrukt als een fusie-eiwit, is een veelgebruikt model epitoop8. Bovendien is OVA257-264 cruciaal voor de adaptieve immuunrespons tegen tumoren, die afhankelijk is van de cytotoxische T-lymfocytenrespons (CTL). Het wordt gemedieerd door antigeenspecifieke CD8 + T-cellen in de tumor, die worden geïnduceerd door het OVA257-264-peptide . Het wordt gekenmerkt door onvoldoende granzyme B, dat wordt vrijgegeven door cytotoxische T-cellen, wat leidt tot de apoptose van doelcellen8. Vrije toediening van OVA257-264-peptiden kan echter weinig CTL-activiteit induceren omdat de opname van deze antigenen plaatsvindt in niet-specifieke cellen in plaats van antigeen-presenterende cellen (APC's). Het tekort aan geschikte immuunstimulatie resulteert in CTL-activiteit5. Daarom vereist de inductie van effectieve CTL-activiteit aanzienlijke vooruitgang.
Vanwege de barrière van epitheelcellen en de continue afscheiding van slijm, worden vaccinantigenen snel verwijderd uit het neusslijm 9,10. Het ontwikkelen van een efficiënte vaccinvector die door het slijmvliesweefsel kan gaan, is cruciaal omdat de antigeen-presenterende cellen zich onder het mucosale epitheel9 bevinden. Intranasale injectie van vaccins induceert theoretisch mucosale immuniteit om mucosale infectie te bestrijden11. Bovendien is nasale toediening een effectieve en veilige toedieningsmethode voor vaccins vanwege het gemak, het vermijden van darmtoediening en verbeterde patiëntcompliancy7. Daarom is nasale toediening een goed toedieningsmiddel voor het nieuwe peptide epitoop nanovaccin.
Verschillende synthetische biomaterialen zijn ontworpen om epitopen van cel-weefsel en cel-cel interacties te combineren. Bepaalde bioactieve eiwitten, zoals Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), zijn geïntroduceerd als onderdeel van de structuur van de hydrogel om bioactiviteitte verlenen 12. Dit peptide draagt waarschijnlijk bij aan celaanhechting, migratie en uitgroei13 en bindt integrinen α 3β1 en α6β1 om te interageren met verschillende kankerceltypen. IKVAV is een celadhesiepeptide afgeleid van het laminine keldermembraaneiwit α1-keten dat oorspronkelijk werd gebruikt om de neurale micro-omgeving te modelleren en de neuronale differentiatiete veroorzaken 14. Daarom is het vinden van een efficiënt leveringsmiddel voor dit nieuwe vaccin belangrijk voor ziektebestrijding.
Recent gerapporteerde emulsiesystemen, zoals W805EC en MF59, zijn ook samengesteld voor de toediening van de neusholte van geïnactiveerd influenzavaccin of recombinant hepatitis B-oppervlakteantigeen en geïllustreerd om zowel mucosale als systemische immuniteit te activeren15. Nano-emulsies (NE's) hebben de voordelen van eenvoudige toediening en gemakkelijke co-vorming met effectieve adjuvantia in vergelijking met deeltjesslijmvliesafgiftesystemen16. Van nano-emulsievaccins is gemeld dat ze het allergische fenotype op een duurzame manier veranderen die verschilt van traditionele desensibilisatie, wat resulteert in langdurige onderdrukkende effecten17. Anderen meldden dat nano-emulsies in combinatie met Mtb-specifieke immunodominante antigenen krachtige mucosale celresponsen konden induceren en significante bescherming konden bieden18. Daarom werd een nieuw intranasaal zelfgeassembleerd nanovaccin met het synthetische peptide IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, het peptide bestaande uit IKVAV gebonden aan OVA257-264) ontworpen. Het is belangrijk om dit nieuwe nanovaccin systematisch te beoordelen.
Het doel van dit protocol is om systematisch de fysisch-chemische kenmerken, toxiciteit en stabiliteit van het nanovaccin te evalueren, te detecteren of de opname van antigeen en beschermende en therapeutische effecten worden versterkt met behulp van technische middelen, en de belangrijkste experimentele inhoud uit te werken. In deze studie hebben we een reeks protocollen opgesteld om de fysisch-chemische kenmerken en stabiliteit te bestuderen, de omvang van de toxiciteit van de I-OVA NE voor BEAS-2B-cellen door CCK-8 te bepalen en het antigeen-presenterende vermogen van BEAS-2B-cellen voor het vaccin te observeren met behulp van confocale microscopie, de afgifteprofielen van dit nieuwe nanovaccin in vivo en in vitro te evalueren, en detecteer het beschermende en therapeutische effect van dit vaccin met behulp van een E.G7-OVA tumordragend muismodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Proefdierrichtlijn voor ethische beoordeling van dierenwelzijn (GB/T 35892-2018) en werden goedgekeurd door de Laboratoriumcommissie Dierenwelzijn en Ethiek van de Derde Militaire Medische Universiteit. De muizen werden geëuthanaseerd door een intraperitoneale injectie van 100 mg/kg 1% natriumpentobarbital.
1. Voorbereiding van de I-OVA NE
- Meng 1 mg monofosforyllipide A (MPLA) met 100 μL DMSO, vortex gedurende 5 minuten, en laat het 4 uur bij kamertemperatuur (RT) volledig oplossen.
- Voeg Tween 80 en I-OVA kwantitatief toe en meng.
OPMERKING: Tween 80 en I-OVA werden gemengd met een massaverhouding van 25:119. - Voeg squaleen toe aan het mengsel bereid in stap 1.2 (7:3, Smix: squaleen).
- Voeg 100 μL MPLA-oplossing (10 mg/ml) toe aan het mengsel bereid in stap 1.3.
- Bereid het nano-emulsievaccin met behulp van energiezuinige emulgeringsmethoden19: voeg de gemengde oplossing toe aan waterdruppels op ongeveer 70% van het totale volume en roer voorzichtig om een transparant en gemakkelijk stromend mengsel te verkrijgen.
OPMERKING: De BNE-controle (blanco emulsie) werd op dezelfde manier bereid, waarbij water werd vervangen door I-OVA.
2. Fysisch-chemische karakterisering en stabiliteit
OPMERKING: Beoordeel de druppelgrootteverdeling, zeta-potentiaal en andere fysisch-chemische gegevens van het I-OVA NE-vaccin volgens de stappen 2.1-2.3; morfologische karakterisering van het I-OVA NE-vaccin uitvoeren volgens de stappen 2.4-2.7; en onderzoek de 3D-structuur van het I-OVA NE-vaccin volgens de stappen 2.8-2.9.
- Meng 50 mg mucine-eiwit met 100 ml water voor injectie om een 0,05% mucine-oplossing te bereiden.
- Verdun 4 mg/ml I-ova ne 200-voudig met 0,05 mg/ml mucine-eiwit of gedeïoniseerd water.
- Observeer de deeltjesgroottes, zetapotentiaal, polydispersiteitsindex (PDI) en elektroforetische mobiliteit bij 25 °C met behulp van een nanoanalysator19.
- Verdun 10 μL I-OVA NE 200-voudig met 2 ml gedeïoniseerd water.
- Plaats 5 μL voorverdund I-OVA NE-vaccin (stap 2.4) op een met koolstof bekleed koperen rooster en bedek het gedurende 3 minuten met 10 μL 1% fosfotungstinezuur.
- Verwijder het overtollige fosfotungstic acid met filtreerpapier.
- Verkrijg afbeeldingen met TEM. Plaats een 50 μL verdund monster van 10 μL op een koolstofkoperrooster met 100 mazen en laat het gedurende 5 minuten op kamertemperatuur (RT) staan voordat 10 μL fosfotungstic acid (1%, pH 7,4) wordt toegevoegd. Onderzoek alle monsters met TEM bij een spanning van 120 kV.
- Karakteriseer de moleculaire morfologie van de I-OVA NEusing een hoge resolutie atoomkrachtmicroscoop. Verkrijg de kleurenbeelden van I-OVA NE onder de volgende omstandigheden: voor wolfraamsondes (krachtconstante: 0,06 N·m-1); scanbereik: 450 nm x 450 nm; Tikkende modus: beeldvormingsmodus; en scanmethode: puntsgewijs scannen bij RT.
3. In vitro en in vivo toxiciteitstests
OPMERKING: De in vitro toxiciteit van het I-OVA NE-vaccin werd beoordeeld volgens de stappen 3.1-3.9 en de in vivo toxiciteit van het I-OVA NE-vaccin werd beoordeeld volgens de stappen 3.10-3.13.
- Herleef menselijke BEAS-2B-epitheelcellen volgens de stappen 3.1.1-3.1.4 en kweek ze in een volledig groeimedium bij 37 °C in een CO 2-incubator van 5%.
OPMERKING: Om het volledige groeimedium te bereiden, voegt u foetaal runderserum (FBS) en penicilline/streptomycine toe aan het RPMI-1640-medium in eindconcentraties van respectievelijk 10% en 1%.- Zet het waterbad aan en stel de temperatuur in op 37 °C. Verwijder de celflacons bevroren in vloeibare stikstof en ontdooi snel in een waterbad van 37 °C.
- Na het ontdooien pipet u de cellen snel in een steriele centrifugebuis van 15 ml, voegt u 2 ml van het volledige groeimedium toe en centrifugeert u gedurende 5 minuten op 129 x g .
- Verwijder het supernatant, voeg 2 ml van het volledige groeimedium toe om de cellen te resuspenderen en centrifugeer gedurende 5 minuten op 129 x g.
- Verwijder het supernatant, voeg 6 ml volledig groeimedium toe om de cellen te resuspenderen en breng de cellen over in een T25-kweekkolf om de cellen bij 37 °C te kweken in een CO 2-incubator van 5%.
- Wanneer de celdichtheid 80% -90% bereikt, gooit u het kweekmedium weg en wast u de cellen tweemaal met 2 ml PBS. Voeg 1 ml 0,25% trypsine toe om de cellen gedurende 1-2 minuten te verteren. Wanneer afronding van de cellen wordt waargenomen, voeg dan onmiddellijk 4 ml van het volledige groeimedium toe om de trypsine te neutraliseren.
- Meng en zuig de monsters in een steriele centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 129 x g .
- Verwijder het supernatant en resuspensie van de cellen in 1 ml RPMI-1640 compleet medium. Gebruik 20 μL voor het tellen van de cellen en verdun de cellen tot 1 x 105 cellen/ml.
- Plaats de BEAS-2B-cellen met een dichtheid van 1 x 104 cellen/put in 96-putplaten in 100 μL RPMI-1640 compleet medium en pre-incubeer de platen gedurende 24 uur bij 37 °C in een 5% CO 2-incubator.
- Gooi het supernatant weg en voeg 100 μL I-OVA NE, 100 μL I-OVA+BNE (fysiek gemengd) en 100 μL I-OVA voorverdund met een volledig groeimedium toe in verschillende eindconcentraties (0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml, 8 mg/ml), met BNE als controle. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C.
OPMERKING: Voeg 100 μL volledig groeimedium toe aan de negatieve controlegroepen en 100 μL celsuspensie (1 x 105/ml) aan de positieve controlegroepen. - Verwijder het medium en voeg 90 μL volledig groeimedium en 10 μL CCK-8-oplossing toe aan elk putje van de plaat.
- Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij 37 °C in een 5% CO 2-incubator.
- Meet de absorptie van elke put bij 450 nm met behulp van een enzymgelabelde plaatlezer.
- Bereken de overlevingsratio van BEAS-2B-cellen zoals aangegeven in de volgende vergelijking:
(OD450 monster− OD450 negatieve controle/OD450 positieve controle− OD450 negatieve controle) × 100% - Verdeel willekeurig 6 weken oude C57BL / 6-muizen in vijf groepen (n = 5 in elke groep) en verdoof ze met 4% isofluraan voor inductie. Handhaaf anesthesie met 2% isofluraan. Gebruik neomycinesulfaatzalf op de ogen van de muizen om uitdroging te voorkomen.
- Gebruik pipetpunten van 10 μL om nasale immunisatie van de muizen uit te voeren met 10 μL / neusgat van I-OVA, I-OVA + BNE en IOVA NE bij 4 mg / ml gedurende alle 3 dagen. Gebruik BNE en PBS als experimentele controle.
OPMERKING: Zorg voor thermische ondersteuning totdat het dier herstelt van de anesthesie. - Euthanaseer alle muizen door een intraperitoneale injectie van 100 mg/kg 1% natriumpentobarbital op dag 4.
- Knip ongeveer 3 mm dikke monsters van neusweefsels met een schaar en verwijder de longweefsels.
- Fixeer de neusweefsels en het hele longweefsel in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur. Droog de weefsels uit door een seriële alcohol- en xyleengradiënt en sluit ze vervolgens in paraffine in. Snijd de afgewerkte wasblokken op een paraffinesnijder met een dikte van 4 μm.
- Bevlek de secties met hematoxyline en eosine (H &E). Observeer vervolgens de mucosale toxiciteit, waaronder hyperemie, oedeem, neutrofiele infiltratie en structurele schade in het neusslijmvlies en longweefsel, onder een microscoop (100x en 200x)7.
4. In vitro cellulaire opname
- Plaat BEAS-2B cellen met een dichtheid van 5 x 10 5 cellen/put in 12-well platen met coverslips in 2 ml van het volledige groeimedium en pre-incubeer de platen 's nachts bij 37 °C in een5 % CO2 incubator.
- Voeg 100 μL FITC-gelabelde I-OVA NE (zuiverheid: 98,3%, geproduceerd door het bedrijf, 4 mg / ml) of I-OVA (4 mg / ml) toe aan 900 μl celsuspensie en plaats bij 37 °C gedurende 90 minuten.
OPMERKING: Bereid FITC-gelabelde I-OVA NE voor zoals beschreven in stap 4.1. Voeg 1 ml volledig groeimedium toe aan de controlegroepen. - Was driemaal met 0,1 M PBS (1 ml/put) gedurende 30 minuten bij 37 °C na de behandeling.
- Bevestig deze monsters met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten in het donker. Verwijder na fixatie het paraformaldehyde en was 3 keer met 0,1 M PBS (1 ml/put) gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Pre-incubeer de monsters met DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindool) in een eindconcentratie van 10 μg/ml gedurende 10 minuten in het donker en was vervolgens 5 keer met 0,1 M PBS (1 ml/put) gedurende 30 minuten bij 37 °C na de behandeling.
- Verkrijg de mobiele opname door CLSM met de volgende parameterinstellingen: Framegrootte: 512 px x 512 px, Scansnelheid: 8; Lijnstap: 1; Middeling: 2.
5. In vivo vrijgave
- Verdoof naaktmuizen met 4% isofluraangas en handhaaf de anesthesie op 2% isofluraan. Immuniseer naakte muizen intranasaal met 10 μL PE-gelabelde I-OVA bij 4 mg / ml of PE-gelabelde I-OVA NE bij 4 mg / ml in elk neusgat.
- Bij 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3, 6 h, 9 h, 12 h en 24 h, vangen alle muizen onder narcose door het IVIS-systeem.
- Voer een achtergrondscan uit onmiddellijk vóór intranasale toediening om een drempelwaarde te verkrijgen (Min = 1,06 x 106) om de verzamelde beelden op alle tijdstippen aan te passen.
- Klik op de Living Image-software om de reeks te starten en klik op Initialiseren om het IVIS-systeem te initialiseren
- Wanneer het wordt geïnitialiseerd, is het temperatuurstatuslampje in het IVIS-acquisitiebedieningspaneel rood. Wanneer het temperatuurstatuslampje groen wordt, kan beeldvorming worden uitgevoerd.
- Klik op Wizard Beeldvorming en kies vervolgens Fluorescentie in het dialoogvenster dat wordt weergegeven.
- Pas de volgende parameters aan: Belichtingstijd: auto sec, Binning: 8, F / Stop: 2, Gezichtsveld: D.
- Selecteer het excitatiefilter van 620 nm en het emissiefilter van 670 nm. Klik op Acquire Sequence om de afbeelding te verkrijgen.
- Verwerk de live beelden van alle muizen en de stralingsgegevens met Living Image software.
- Nadat u de afbeelding hebt verkregen, klikt u op ROI-hulpmiddelen in het gereedschapspalet, selecteert u Cirkel en maakt u een ROI-cirkel.
- Klik op ROI's meten om een kwantitatieve waarde voor het ROI-gebied te verkrijgen.
6. In vivo antitumor werkzaamheid
- Ververs en kweek de muislymfoom E.G7-OVA-cellen uit EL4 met een volledig groeimedium volgens de stappen 2.1.1-2.1.4.
OPMERKING: Om E.G7-OVA cel compleet groeimedium te bereiden, meng RPMI 1640 medium met 2 mM L-glutamine aangepast om 1,5 g / L natriumbicarbonaat, 4,5 g / L glucose, 10 mM HEPES en 1,0 mM natriumpyruvaat te bevatten en aangevuld met 0,05 mM 2-mercaptoethanol en 0,4 mg / ml G418, 90%, en foetaal runderserum, 10%. - Subcultuur de cellen in een verhouding van 1:2 wanneer de cellen een dichtheid bereiken tussen 1 x 106 cellen/ml en 1 x 107 cellen/ml.
- Evalueer het preventieve beschermende effect op muizen zoals beschreven in de stappen 6.3.1-6.3.4.
- Verdeel willekeurig 6 weken oude C57BL/6 muizen in vijf groepen (n = 8 in elke groep). Verdoof naaktmuizen met 4% isofluraangas en handhaaf anesthesie met 2% isofluraan. Scheer het achterste haar en neomycinesulfaatzalf gedeeltelijk op de ogen van de muizen om uitdroging te voorkomen.
- Immuniseer de muizen intranasaal met 10 μL van 1 mg / ml i-eicellen, BNE + I-OVA of I-OVA NE in elk neusgat, BNE (vier keer verdund met PBS), of een PBS-controle 3 keer met een interval van 7 dagen tussen elke immunisatie.
- Ent alle muizen hypodermisch in de rechtsback met 5 x 105 E. G7-OVA cellen op de 7e dag na de laatste immunisatie.
- Controleer op 0, 6, 9, 12, 15 en 18 dagen na de laatste immunisatie de tumorvolumes door twee assen van de tumor te meten met behulp van digitale remklauwen en registreer de 30-daagse (na de laatste immunisatie) overleving van de muizen.
- Evalueer het therapeutische beschermende effect op muizen na het enten van E.G7-OVA-cellen zoals beschreven in stappen 6.4.1-6.4.3. Voor de groepering en de behandeling van muizen wordt verwezen naar stap 6.3.1.
- Injecteer op dag 0 de C57BL/6-muizen subcutaan in de rechtsrug met E.G7-OVA-cellen (5 x 105 cellen/muis).
- Immuniseer na 0, 7 en 14 dagen na injectie alle muizen intranasaal geïmmuniseerd met 10 μL I-OVA, BNE + I-OVA, I-OVA NE (allemaal in concentraties van 1 mg / ml), BNE of PBS driemaal in elk neusgat.
- Controleer op 0, 6, 9, 12, 15 en 18 dagen na injectie het tumorvolume en registreer de 30-daagse overleving van de muizen.
OPMERKING: Als het tumorvolume groter is dan 3.000 mm3, moeten de muizen om humane redenen worden geëuthanaseerd en zullen deze muizen als dood worden beschouwd in de overlevingscurve. Tumorvolume wordt berekend met een gewijzigde ellipsoïdale formule zoals aangegeven in de volgende vergelijking:
Volume = π/6 x L x B2
waarbij L de tumorlengte vertegenwoordigt en W de tumorbreedte (lengte-eenheid: mm, volume-eenheid: mm3).
7. Statistische analyse
- Analyseer de verschillen in gegevens tussen de verschillende groepen met behulp van geschikte statistische software met eenrichtings-ANOVA, Tukey's meerdere vergelijkingen of een student's t-test. Gebruik de Kaplan-Meier-methode om de overlevingsresultaten te schatten en de groepen te vergelijken met log-rank statistieken. Druk alle resultaten uit als gemiddelde ± SD. De betekenis van P-waarden P < 0,05, P < 0,01 en P < 0,001 wordt weergegeven met respectievelijk *, ** en *** op de percelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het protocol voltooiden we de voorbereiding en in vitro en in vivo experimentele evaluatie van de nasale tumornanovaccinafgifte. TEM, AFM en DLS zijn effectieve middelen voor de beoordeling van de basiskenmerken van het oppervlaktezetapotentiaal en de deeltjesgrootte van het nanovaccin (figuur 1). BEAS-2B-epitheelcellen zijn een nuttig screeningsmodel voor het in vitro toxiciteitsonderzoek van nasale vaccins (figuur 2A). De microfoto's gekleurd met H &E illustreren dat I-OVA NE geen duidelijke mucosale toxiciteit had, inclusief weefselbeschadiging, bloeding of infiltratie van ontstekingscellen (figuur 2B). Efficiënte opname van het antigeen door BEAS-2B-cellen in de neusholte is een voorwaarde voor de presentatie van antigeen om daaropvolgende immuunresponsen op te wekken (figuur 3). Het IVIS-systeem helpt het effect met aanhoudende afgifte van I-OVA NE in vitro op te helderen en suggereert dat dit nanovaccin de snelle afgifte kan vertragen, de tijd in het neusgebied kan verlengen en de opname van peptiden in cellen kan verbeteren (figuur 4). De preventieve beschermende modellen en de therapeutische beschermende modellen weerspiegelen direct het beschermende effect van het I-OVA NE-vaccin en het vermogen van het I-OVA NE-vaccin om tumorgroei te remmen en de mediane overlevingstijd van muizen te verlengen (figuur 5). De bovenstaande experimentele resultaten zijn gepubliceerd door Yang et al.7.
Figuur 1: Fysische kenmerken en stabiliteit van I-OVA NE . (A) Transmissie-elektronenmicrograaf (TEM), schaalbalk = 100 nm. (B) Micrografie van atoomkrachtmicroscopie (AFM). De X- en Y-as hebben beide een totale lengte van 450 nm. (C) Grootte, diameter en verdeling. D) Zeta-potentieel en -verdeling van I-OVA NE-analyses uitgevoerd met Nano ZS. (E) Deeltjesgroottes, (F) polydispersiteitsindexen, (G) zetapotentialen en (H) elektroforesemobiliteit van I-OVA NE in mucinestabiliteitsanalyses uitgevoerd met Nano ZS. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Yang et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: In vitro en in vivo toxiciteit van I-OVA NE. (A) Relatieve levensvatbaarheid van BEAS-2B-cellen in cultuur blootgesteld aan verschillende peptideconcentraties van I-OVA, BNE+I-OVA en I-OVA NE gedurende 24 uur. BNE werd gebruikt als controle. De gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD (n = 3). (B) Microscopisch onderzoek van pathologische secties van het neusslijmvlies en longweefsel, vastgesteld 5 uur na de uitdaging. Beelden werden gemaakt met een vergroting van 100x en 200x. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Yang et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Cellulaire opname van de I-OVA NE. In vitro confocale fluorescentie beeldvorming van BEAS-2B cellen behandeld gedurende 1 uur met I-OVA of I-OVA NE. PBS werd gebruikt als controle, I-OVA werd gelabeld met FITC (groene fluorescentie) en de kernen werden gekleurd met DAPI (blauwe fluorescentie) (schaalbalk = 50 μm). Dit cijfer is aangepast met toestemming van Yang et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: In vitro afgifte van I-OVA NE. (A) In vivo fluorescentie beeldvorming van PE-gelabelde I-OVA in de neusholte van de muis. Relatieve fluorescentie-intensiteit geregistreerd bij 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3 h, 6 h, 9 h, 12 h en 24 h na nasale toediening van I-OVA of I-OVA NE. (B) Kwantificering van de fluorescentie-intensiteit. De gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD (n = 5). *: P < 0,05; **: P <0,01; en ***: P < 0,001. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Yang et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: In vivo antitumor werkzaamheid van I-OVA NE . (A) Gemiddelde tumorgroeicurven van de gevaccineerde muizen in de preventieve beschermende modellen. (B) Procentuele overlevingskans van de gevaccineerde muizen in de preventief beschermende modellen. (C) Gemiddelde tumorgroeicurven van de gevaccineerde muizen in de therapeutische beschermende modellen. (D) Percentage overlevingskans van de gevaccineerde muizen in de therapeutische beschermende modellen. *: P < 0,05; **: P < 0,01; en ***: P < 0,001. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Yang et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nanovaccins gefunctionaliseerd met immunocytenmembranen hebben grote voordelen bij ziektegerichte therapie en de bijwerkingen worden geminimaliseerd door eigenschappen zoals uniek tumortropisme, de identificatie van specifieke doelen, langdurige circulatie, verbeterde intercellulaire interacties en lage systemische toxiciteit. Ze kunnen ook gemakkelijk worden geïntegreerd met andere behandelingsmodules om kankers coöperatief te behandelen16,20. Wenselijke eigenschappen kunnen worden verkregen door fysische en chemische eigenschappen zoals de meting, vorm en elektrische lading te regelen. Vandaar dat nanovaccins belangrijk zijn geworden in een breed scala aan toepassingen21. Deze eigenschappen zijn belangrijke doorslaggevende factoren met betrekking tot opname en toxiciteit, en nanovaccins kunnen alleen door manipulatie niet-toxisch worden gemaakt22. Daarom is dit protocol voor de studie van fysisch-chemische kenmerken, waaronder vorm, grootte en lading, van vitaal belang. TEM is een zeer nauwkeurig instrument dat al vele jaren op grote schaal wordt gebruikt in de wetenschappelijke gemeenschap23. Het is een essentieel hulpmiddel geworden om de eigenschappen van nanogestructureerde materialen te begrijpen en hun gedrag te manipuleren. Daarnaast is atomic force microscopy (AFM) naar voren gekomen als een krachtige techniek voor de nanomechanische karakterisering van biologische monsters24. Het kan informatie op hoge resolutie op 3D- en nanoschaal bieden en tegelijkertijd oppervlaktedetails op atomair niveau analyseren. Naast het bepalen van veranderingen in de deeltjesgrootteverdeling, kan DLS zowel de grootte als de lading meten om informatie te geven over de aggregatietoestand van nanodeeltjes in oplossing25.
Er is gemeld dat hoge zeta-potentiaalwaarden essentieel zijn voor de goede stabiliteit van colloïdale suspensies26. In deze studie gebruikten we deze protocollen om de fysisch-chemische kenmerken van nanovaccins met TEM, AFM en DLS te beoordelen. Bovendien bevat het oppervlak van het neusslijmvlies een grote hoeveelheid slijm, dat zorgt voor smering, vocht en een chemische beschermende barrière. Dit kan te wijten zijn aan de interactie tussen het slijm en sommige antigenen of toedieningssystemen, wat resulteert in de accumulatie en "vangst" van antigenen of toedieningssystemen en hun daaropvolgende verwijdering, waardoor de leveringsefficiëntie enorm wordt verminderd7. Het is bekend dat de stabiliteit van nanovaccins van vitaal belang is voor nasale toediening. Daarom gebruikten we Nano ZS om een reeks stabiliteitsparameters te bepalen, waaronder de deeltjesgrootte, polydispersiteitsindexen, zetapotentialen en elektroforesemobiliteit, na behandeling met 0,5% mucine-eiwit.
De in vivo histocompatibiliteits- en in vitro cellevensvatbaarheidstests toonden aan dat dit nieuwe nanovaccin niet-toxisch was in het bereik van de geteste concentraties27. Menselijke normale bronchiale epitheelcellen (BEAS-2B) zijn standaardcellijnen die worden gebruikt om de menselijke luchtwegente bestuderen 28. Vanwege de lagere kosten, snelheid en minimale ethische bezwaren is in-vitrotoxiciteitsbeoordeling een belangrijke methode. In deze studie werd de in vitro levensvatbaarheidstest van cellen bepaald door een CCK8-test. Bovendien wordt in vivo toxiciteitsbeoordeling meestal uitgevoerd in diermodellen zoals muizen en ratten. Histopathologisch onderzoek wordt vaak uitgevoerd op weefsels die zijn blootgesteld aan nanodeeltjes, zoals het hart, oog, hersenen, lever, nieren, longen en milt29. Daarom hebben we deze methoden gebruikt om de toxiciteit van dit nieuwe nanovaccin in vitro en in vivo te beoordelen.
Antigeenopname en -verlenging zijn voorwaarden voor antigeeninzending om een daaropvolgende immuunrespons te veroorzaken30. Het is noodzakelijk dat de cellulaire opname van BEAS-2B en de afgifteprofielen van het nieuwe nanovaccin in vivo en in vitro worden bepaald. CLSM is de meest voorkomende commerciële implementatie van de relevante technologie, die te vinden is in de overgrote meerderheid van de imaginglaboratoria en een breed scala aan toepassingen heeft. Deze instrumenten worden veel gebruikt en zijn relatief eenvoudig te gebruiken; ze zijn echter meestal niet optimaal voor kwantitatieve gegevensverzameling.
In ons protocol werd cellulaire opname gedetecteerd door CLSM vanwege de duidelijke resolutie, optische sectiemogelijkheden en veelzijdigheid met 3D-beeldvorming31. Bovendien werd IVIS gebruikt om de in vivo afgifteprofielen van het nieuwe nanomateriaal te verkrijgen, omdat het een beeldvormingskamer kan bieden met buitenlicht uitgesloten voor kwantitatieve bioluminescentie en fluorescentiebeeldvorming in vivo en in vitro. Daarom hebben we in dit protocol deze methoden gebruikt om de cellulaire opname- en afgifteprofielen van nieuwe nanovaccins in vivo en in vitro te bepalen.
Het is ook belangrijk om de tumoreffectiviteit van het nieuwe nanovaccin te beoordelen. In onze studie werd het E.G7 tumordragende model gebruikt om de therapeutische en beschermende effecten van het vaccin te bepalen. EL4-cellen zijn afgeleid van de T-lymfocyten van C57BL/6-muizen met hooggradige maligniteit. E.G7-cellen zijn afgeleid van EL4-lymfoomcellen getransfecteerd door elektroporatie32. In onze studie veroorzaakte dit nanovaccin beschermende immuniteit bij E.G7-OVA tumordragende muizen. Samenvattend is het noodzakelijk om een reeks protocollen vast te stellen om de fysisch-chemische kenmerken, stabiliteit, toxiciteit, afgifteprofielen, cellulaire opname en antitumoreffecten van nanovaccins in vitro en in vivo te bestuderen. Deze protocollen zullen nuttige resultaten opleveren voor het nieuwe nasale nanovaccin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die van invloed lijken te zijn geweest op het werk dat in dit artikel wordt gerapporteerd.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door nr. 31670938, 32070924, 32000651 van het National Natural Science Foundation Program of China, nr. 2014jcyjA0107 en nr. 2019jcyjA-msxmx0159 van het Natural Science Foundation Project Program van Chongqing, nr. 2020XBK24 en nr. 2020XBK26 van de Army Medical University Special-projecten, en nr. 202090031021 en nr. 202090031035 van het National Innovation and Entrepreneurship Program voor studenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | Bio-Rad 6.0 | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30088.03 | |
| FITC-labeled I-OVA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | NA | |
| HPLC | Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. | E2695 | |
| Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| IPC-208 | Chong Qing University, China | NA | |
| IVIS system | Caliper Life Science Limited Company | NA | |
| JEM-1230 TEM | JEOL Limited Company of Japan | 1230 TEM | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | NA | |
| MPLA | Invivogen Lit. Co. |
tlrl-mpla | |
| Neomycin Sulfate Ointment | Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. | H31022262 | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30809.01 | |
| Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope | Zeiss, Germany | Zeiss LSM800 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Mohammed, I., et al. The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).
- Tsung, K., Norton, J. A. In situ vaccine, immunological memory and cancer cure. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).
- Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. Development of peptide-based vaccines for cancer. Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).
- Mochizuki, S., et al. Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs. Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).
- Kalita, P., Tripathi, T. Methodological advances in the design of peptide-based vaccines. Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).
- Yang, Y., et al. A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression. International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).
- Ren, Y., et al. OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).
- Suzuki, K., et al. Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery. Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).
- Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).
- Lam, J. Y., et al. A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants. Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).
- Chai, Y., et al. Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).
- Paiva Dos Santos, B., et al. Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications. Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).
- Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).
- Makidon, P. E., et al. Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine. PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).
- Lin, X., et al. Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine. Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).
- O'Konek, J. J., et al. Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy. Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).
- Ahmed, M., et al. A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).
- Sun, H., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- Chen, C., et al. Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy. Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).
- Prasanna, P., et al. Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).
- George, S., et al. Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos. ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).
- Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. Electron Crystallography. Singh, D., Condurache-Bota, S. , IntechOpen. London, UK. (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zielinska, A., et al. Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology. Molecules. 25 (16), 3731 (2020).
- Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).
- Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy. Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).
- Zhang, J., et al. Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).
- Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles. International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas. DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).
