Summary
Burada, nazal kendiliğinden monte edilmiş nanoemülsiyon tümör aşısının in vitro ve in vivo olarak hazırlanması ve değerlendirilmesi için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.
Abstract
Epitop peptitler, güvenlikleri, yüksek özgüllükleri ve uygun üretimleri nedeniyle tümör aşıları alanında yaygın ilgi görmüştür; Özellikle, bazı MHC I kısıtlı epitoplar, tümör hücrelerini temizlemek için etkili sitotoksik T lenfosit aktivitesini indükleyebilir. Ek olarak, nazal uygulama, kolaylığı ve iyileştirilmiş hasta uyumu nedeniyle tümör aşıları için etkili ve güvenli bir uygulama tekniğidir. Bununla birlikte, epitop peptitleri, zayıf immünojeniteleri ve doğum etkinliği eksikliği nedeniyle nazal doğum için uygun değildir. Nanoemülsiyonlar (NE'ler), antijenlerle yüklenebilen ve doğrudan burun mukozal yüzeyine verilebilen termodinamik olarak stabil sistemlerdir. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), insan solunum epitel hücreleri tarafından eksprese edilen integrin bağlayıcı bir peptid olan laminin'in çekirdek pentapeptididir. Bu çalışmada, sentetik peptid IKVAV-OVA257-264 (I-OVA )'yi içeren intranazal kendinden montajlı epitop peptid NE tümör aşısı düşük enerjili emülsifikasyon yöntemi ile hazırlanmıştır. IKVAV ve OVA257-264 kombinasyonu, nazal mukozal epitel hücreleri tarafından antijen alımını artırabilir. Burada, transmisyon elektron mikroskobu (TEM), atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve dinamik ışık saçılması (DLS) ile fizikokimyasal özellikleri incelemek için bir protokol oluşturuyoruz; müsin proteini varlığında stabilite; BEAS-2B hücrelerinin hücre canlılığını ve C57BL / 6 farelerinin burun ve akciğer dokularını inceleyerek toksisite; konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile hücresel alım; küçük hayvanları in vivo olarak görüntüleyerek profilleri serbest bırakmak; ve bir E.G7 tümör taşıyan model kullanılarak aşının koruyucu ve terapötik etkisi. Protokolün, yeni T hücresi epitop peptid mukozal aşılarının gelecekteki gelişimi için teknik ve teorik ipuçları sağlayacağını öngörüyoruz.
Introduction
En kritik halk sağlığı yeniliklerinden biri olan aşılar, insan hastalıklarının küresel yüküyle mücadelede kilit bir rol oynamaktadır1. Örneğin, şu anda, COVID-19 hastalıkları için 120'den fazla aday aşı test edilmektedir ve bunlardan bazıları birçok ülkede onaylanmıştır2. Son raporlar, kanser aşılarının klinik kanser tedavilerinin ilerlemesini etkili bir şekilde iyileştirdiğini, çünkü kanser hastalarının bağışıklık sistemini antijenleri vücuda yabancı olarak tanımaya yönlendirdiğini belirtmektedir3. Ayrıca, tümör hücrelerinin içinde veya dışında bulunan çoklu T hücre epitopları, radyoterapi ve kemoterapi ile ilişkili önemli toksisitenin bulunmaması nedeniyle metastatik kanserlerin tedavisinde avantajlar gösteren peptid aşılarını tasarlamak için kullanılabilir 4,5. 1990'ların ortalarından bu yana, tümör tedavisi için klinik öncesi ve klinik çalışmalar esas olarak antijen peptid aşıları kullanılarak yürütülmüştür, ancak az sayıda aşı kanser hastaları üzerinde yeterli bir terapötik etki göstermektedir6. Ayrıca, peptit epitoplarına sahip kanser aşıları, zayıf immünojeniteye ve yetersiz dağıtım etkinliğine sahiptir, bu da uygulama bölgesinden hızla yayılan hücre dışı peptitlerin hızlı bir şekilde bozulmasından kaynaklanabilir ve bu da bağışıklık hücreleri tarafından yetersiz antijen alımına yol açabilir7. Dolayısıyla aşı dağıtım teknolojisi ile bu engelleri aşmak gerekmektedir.
Bir füzyon proteini olarak ifade edilen MHC sınıf I-bağlayıcı 257-264 epitopu olan OVA257-264, sıklıkla kullanılan bir model epitop8'dir. Ek olarak, OVA257-264, sitotoksik T lenfosit (CTL) yanıtına bağlı olan tümörlere karşı adaptif immün yanıt için çok önemlidir. Tümörde OVA257-264 peptidi tarafından indüklenen antijene özgü CD8 + T hücreleri aracılık eder. Sitotoksik T hücreleri tarafından salınan ve hedef hücrelerin apoptozuna yol açan yetersiz granzim B ile karakterizedir8. Bununla birlikte, serbest OVA257-264 peptid uygulaması, çok az CTL aktivitesine neden olabilir, çünkü bu antijenlerin alımı, antijen sunan hücrelerden (APC'ler) ziyade spesifik olmayan hücrelerde meydana gelir. Uygun immün stimülasyon eksikliği CTL aktivitesi5 ile sonuçlanır. Bu nedenle, etkili CTL aktivitesinin indüksiyonu önemli ölçüde ilerleme gerektirir.
Epitel hücrelerinin sağladığı bariyer ve sürekli mukus salgılanması nedeniyle, aşı antijenleri burun mukozasından hızla çıkarılır 9,10. Mukozal dokudan geçebilen etkili bir aşı vektörü geliştirmek çok önemlidir, çünkü antijen sunan hücreler mukozal epitel9'un altında bulunur. Aşıların intranazal enjeksiyonu teorik olarak mukozal enfeksiyonla savaşmak için mukozal bağışıklığı indükler11. Ek olarak, burun doğumu, kolaylığı, bağırsak uygulamasından kaçınması ve hasta uyumunun artması nedeniyle aşılar için etkili ve güvenli bir uygulama yöntemidir7. Bu nedenle, nazal doğum, yeni peptid epitop nanoaşısı için iyi bir uygulama aracıdır.
Hücre-doku ve hücre-hücre etkileşimlerinin epitoplarını birleştirmek için çeşitli sentetik biyomalzemeler geliştirilmiştir. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) gibi bazı biyoaktif proteinler, biyoaktivite12'yi sağlamak için hidrojelin yapısının bir parçası olarak tanıtılmıştır. Bu peptit muhtemelen hücre bağlanmasına, göçüne ve büyümesine katkıda bulunur13 ve farklı kanser hücresi tipleriyle etkileşime girmek için 3β1 ve α6β1 α integrinleri bağlar. IKVAV, başlangıçta nöral mikroçevreyi modellemek ve nöronal farklılaşmaya neden olmak için kullanılanlaminin bazal membran proteini α 1 zincirinden türetilen bir hücre yapışma peptididir14. Bu nedenle, bu yeni aşı için etkili bir dağıtım aracı bulmak hastalık kontrolü için önemlidir.
Son zamanlarda bildirilen W805EC ve MF59 gibi emülsiyon sistemleri, inaktive influenza aşısı veya rekombinant hepatit B yüzey antijeninin burun boşluğuna verilmesi için birleştirilmiştir ve hem mukozal hem de sistemik bağışıklığı tetiklediği gösterilmiştir15. Nanoemülsiyonlar (NE'ler), partikül mukozal dağıtım sistemlerine kıyasla etkili adjuvanlarla kolay uygulama ve uygun ko-oluşum avantajlarına sahiptir16. Nanoemülsiyon aşılarının, alerjik fenotipi, geleneksel duyarsızlaştırmadan farklı olarak sürekli bir şekilde değiştirdiği ve bunun da uzun süreli baskılayıcı etkilere neden olduğu bildirilmiştir17. Diğerleri, Mtb'ye özgü immünodominant antijenlerle kombine edilen nanoemülsiyonların güçlü mukozal hücre yanıtlarını indükleyebileceğini ve önemli koruma sağlayabileceğini bildirmiştir18. Bu nedenle, sentetik peptit IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, OVA 257-264'e bağlı IKVAV'dan oluşan peptit) ile yeni bir burun içi kendiliğinden monte edilmiş nanoaşı tasarlanmıştır. Bu yeni nanoaşıyı sistematik olarak değerlendirmek önemlidir.
Bu protokolün amacı, nanoaşının fizikokimyasal özelliklerini, toksisitesini ve stabilitesini sistematik olarak değerlendirmek, antijen alımının ve koruyucu ve terapötik etkilerin teknik araçlar kullanılarak arttırılıp arttırılmadığını tespit etmek ve ana deneysel içerikler üzerinde durmaktır. Bu çalışmada, fizikokimyasal özellikleri ve stabiliteyi incelemek, I-OVA NE'nin CCK-8 ile BEAS-2B hücrelerine toksisitesinin büyüklüğünü belirlemek ve konfokal mikroskopi kullanarak BEAS-2B hücrelerinin aşıya antijen sunma yeteneğini gözlemlemek, bu yeni nanoaşının salınım profillerini in vivo ve in vitro olarak değerlendirmek için bir dizi protokol oluşturdukve bu aşının koruyucu ve terapötik etkisini, bir E.G7-OVA tümör taşıyan fare modeli kullanarak tespit edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanı - Hayvan refahının etik incelemesi için kılavuz (GB / T 35892-2018) uyarınca yürütülmüş ve Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Refahı ve Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Fareler, 100 mg / kg% 1 sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyonu ile ötenazi yapıldı.
1. I-OVA NE'nin hazırlanması
- 1 mg monofosforil lipid A'yı (MPLA) 100 μL DMSO ile karıştırın, 5 dakika boyunca vorteks yapın ve tamamen çözünmesi için oda sıcaklığında (RT) 4 saat bekletin.
- Tween 80 ve I-OVA'yı nicel olarak ekleyin ve karıştırın.
NOT: Tween 80 ve I-OVA, 25:119 kütle oranında karıştırılmıştır. - Adım 1.2'de hazırlanan karışıma skualen ekleyin (7:3, Smix: skualene).
- Adım 1.3'te hazırlanan karışıma 100 μL MPLA çözeltisi (10 mg / mL) ekleyin.
- Düşük enerjili emülsifikasyon yöntemlerini kullanarak nanoemülsiyon aşısını hazırlayın19: Karışık çözeltiyi toplam hacmin yaklaşık% 70'inde su damlacıklarına ekleyin ve şeffaf ve kolay akan bir karışım elde etmek için hafifçe karıştırın.
NOT: BNE kontrolü (boş emülsiyon) aynı yöntemle hazırlandı ve suyun yerine I-OVA getirildi.
2. Fizikokimyasal karakterizasyon ve stabilite
NOT: I-OVA NE aşısının damlacık boyutu dağılımını, zeta potansiyelini ve diğer fizikokimyasal verilerini 2.1-2.3 adımlarını izleyerek değerlendirin; 2.4-2.7 adımlarını izleyerek I-OVA NE aşısının morfolojik karakterizasyonunu gerçekleştirmek; ve I-OVA NE aşısının 3D yapısını 2.8-2.9 adımlarını izleyerek inceleyin.
- % 0.05'lik bir müsin çözeltisi hazırlamak için enjeksiyon için 50 mg müsin proteinini 100 mL su ile karıştırın.
- 4 mg/mL I-OVA NE 200 katını 0.05 mg/mL müsin proteini veya deiyonize su ile seyreltin.
- Bir nanoanalizör19 kullanarak partikül boyutlarını, zeta potansiyelini, polidispersite indeksini (PDI) ve elektroforetik hareketliliği 25 °C'de gözlemleyin.
- 10 μL I-OVA NE 200 katını 2 mL deiyonize su ile seyreltin.
- Karbon kaplı bir bakır ızgara üzerine 5 μL önceden seyreltilmiş I-OVA NE aşısı (adım 2.4) yerleştirin ve 3 dakika boyunca 10 μL% 1 fosfotungstik asit ile örtün.
- Fazla fosfotungstik asidi filtre kağıdı ile çıkarın.
- TEM kullanarak görüntüler elde edin. 100 örgülü bir karbon bakır ızgara üzerine 50 kez seyreltilmiş 10 μL'lik bir numune yerleştirin ve 10 μL fosfotungstik asit (% 1, pH 7.4) eklemeden önce 5 dakika oda sıcaklığında (RT) bekletin. Tüm numuneleri TEM ile 120 kV gerilimde inceleyin.
- I-OVA NE'nin moleküler morfolojisini yüksek çözünürlüklü bir atomik kuvvet mikroskobu kullanarak karakterize edin. Aşağıdaki koşullar altında I-OVA NE'nin renkli görüntülerini elde edin: tungsten probları için (kuvvet sabiti: 0.06 N · m-1); tarama aralığı: 450 nm x 450 nm; Kılavuz Çekme Modu: Görüntüleme Modu; ve tarama yöntemi: RT'de noktadan noktaya tarama.
3. İn vitro ve in vivo toksisite testleri
NOT: I-OVA NE aşısının in vitro toksisitesi, 3.1-3.9 adımlarını takiben değerlendirildi ve I-OVA NE aşısının in vivo toksisitesi, 3.10-3.13 adımlarını izleyerek değerlendirildi.
- İnsan BEAS-2B epitel hücrelerini 3.1.1-3.1.4 adımlarını izleyerek canlandırın ve% 5'lik bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de tam bir büyüme ortamında kültürleyin.
NOT: Tam büyüme ortamını hazırlamak için, RPMI-1640 ortamına sırasıyla %10 ve %1'lik nihai konsantrasyonlarda fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin / streptomisin ekleyin.- Su banyosunu açın ve sıcaklığı 37 ° C'ye ayarlayın. Sıvı azotta dondurulmuş hücre şişelerini çıkarın ve 37 °C'lik bir su banyosunda hızla çözün.
- Çözüldükten sonra, hücreleri hızlı bir şekilde 15 mL'lik steril bir santrifüj tüpüne pipetin, 2 mL tam büyüme ortamı ekleyin ve 5 dakika boyunca 129 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatanı çıkarın, hücreleri yeniden askıya almak için tam büyüme ortamının 2 mL'sini ekleyin ve 5 dakika boyunca 129 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatanı çıkarın, hücreleri yeniden askıya almak için 6 mL tam büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de hücreleri kültürlemek için hücreleri bir T25 kültür şişesine aktarın.
- Hücre yoğunluğu% 80 -% 90'a ulaştığında, kültür ortamını atın ve hücreleri 2 mL PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri 1-2 dakika boyunca sindirmek için 1 mL% 0.25 tripsin ekleyin. Hücrelerin yuvarlanması gözlendiğinde, tripsini nötralize etmek için hemen tam büyüme ortamının 4 mL'sini ekleyin.
- Numuneleri 15 mL'lik steril bir santrifüj tüpüne karıştırın ve aspire edin ve 5 dakika boyunca 129 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatantı çıkarın ve hücreleri 1 mL RPMI-1640 tam ortamda yeniden askıya alın. Hücre sayımı için 20 μL kullanın ve hücreleri 1 x 105 hücre/mL'ye seyreltin.
- BEAS-2B hücrelerini 1 x 104 hücre / kuyu yoğunluğunda, 100 μL RPMI-1640 tam ortamdaki 96 delikli plakalarda plakalayın ve plakaları% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de 24 saat önceden inkübe edin.
- Süpernatanı atın ve kontrol olarak BNE ile çeşitli nihai konsantrasyonlarda (0.5 mg / mL, 1 mg / mL, 2 mg / mL, 4 mg / mL, 8 mg / mL) tam bir büyüme ortamı ile önceden seyreltilmiş 100 μL I-OVA I-OVA 100 μL I-OVA NE ekleyin. 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
NOT: Negatif kontrol gruplarına 100 μL tam büyüme ortamı ve pozitif kontrol gruplarına 100 μL hücre süspansiyonu (1 x 105/mL) ekleyin. - Ortamı çıkarın ve plakanın her bir kuyucuğuna 90 μL tam büyüme ortamı ve 10 μL CCK-8 çözeltisi ekleyin.
- Plakayı% 5 CO 2 inkübatörde 37 ° C'de2 saat boyunca inkübe edin.
- Enzim etiketli bir plaka okuyucu kullanarak her bir kuyucuğun emilimini 450 nm'de ölçün.
- Aşağıdaki denklemde belirtildiği gibi BEAS-2B hücrelerinin hayatta kalma oranını hesaplayın:
(OD450 örneği - OD450 negatif kontrol / OD450 pozitif kontrol - OD450 negatif kontrol) ×% 100 - 6 haftalık C57BL / 6 fareleri rastgele beş gruba bölün (her grupta n = 5) ve indüksiyon için% 4 izofluran ile uyuşturun. Anesteziyi% 2 izofluran ile sürdürün. Kuruluğu önlemek için farelerin gözlerinde neomisin sülfat merhem kullanın.
- 3 gün boyunca 4 mg/mL'de 10 μL/burun deliği I-OVA, I-OVA+BNE ve IOVA NE bulunan farelerin burun bağışıklamasını gerçekleştirmek için 10 μL pipet uçları kullanın. Deneysel kontrol olarak BNE ve PBS'yi kullanın.
NOT: Hayvan anesteziden iyileşene kadar termal destek sağlayın. - 4. günde 100 mg / kg% 1 sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyonu ile tüm fareleri ötenazi yapın.
- Burun dokusunun yaklaşık 3 mm kalınlığındaki örneklerini makasla kesin ve akciğer dokularını çıkarın.
- Burun dokularını ve tüm akciğer dokularını 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. Dokuları seri alkol ve ksilen gradyanı ile dehidrate edin ve daha sonra parafine gömün. Bitmiş balmumu bloklarını bir parafin dilimleyici üzerinde 4 μm kalınlığında dilimleyin.
- Kesitleri hematoksilin ve eozin (H&E) ile lekeleyin. Daha sonra, hiperemi, ödem, nötrofil infiltrasyonu ve burun mukozası ve akciğer dokusundaki yapısal hasar dahil olmak üzere mukozal toksisiteyi mikroskop altında (100x ve 200x)7 gözlemleyin.
4. In vitro hücresel alım
- BEAS-2B hücrelerini 5 x 10 5 hücre / kuyu yoğunluğunda, 12 delikli plakalarda, tam büyüme ortamının 2 mL'sinde kapaklı kapaklarla plakalayın ve plakaları%5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de gece boyunca önceden inkübe edin.
- 900 μL hücre süspansiyonuna 100 μL FITC etiketli I-OVA NE (saflık: %98,3, şirket tarafından üretilen, 4 mg/mL) veya I-OVA (4 mg/mL) ekleyin ve 90 dakika boyunca 37 °C'de bekletin.
NOT: Adım 4.1'de açıklandığı gibi FITC etiketli I-OVA NE'yi hazırlayın. Kontrol gruplarına 1 mL tam büyüme ortamı ekleyin. - İşlemden sonra 37 ° C'de 30 dakika boyunca 0,1 M PBS (1 mL / kuyu) ile üç kez yıkayın.
- Bu örnekleri karanlıkta 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Fiksasyondan sonra, paraformaldehiti çıkarın ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca 0,1 M PBS (1 mL / kuyu) ile 3 kez yıkayın.
- Numuneleri DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) ile karanlıkta 10 dakika boyunca 10 μg / mL'lik bir son konsantrasyonda önceden inkübe edin ve daha sonra işlemden sonra 37 ° C'de 30 dakika boyunca 0,1 M PBS (1 mL / kuyu) ile 5 kez yıkayın.
- CLSM tarafından hücresel alımı aşağıdaki parametre ayarlarıyla elde edin: Çerçeve boyutu: 512 piksel x 512 piksel, Tarama hızı: 8; Satır adımı: 1; Ortalama: 2.
5. In vivo sürüm
- Çıplak fareleri %4 izofluran gazı ile uyuşturun ve anesteziyi %2 izofluranda tutun. Çıplak fareleri 4 mg / mL'de 10 μL PE etiketli I-OVA veya her burun deliğinde 4 mg / mL'de PE etiketli I-OVA NE ile intranazal olarak bağışıklayın.
- 0 saatte, 0,5 saat, 1,5 saat, 3, 6 saat, 9 saat, 12 saat ve 24 saatte, IVIS sistemi tarafından anestezi altındaki tüm fareleri yakalayın.
- Tüm zaman noktalarında toplanan görüntüleri ayarlamak üzere bir eşik değeri (Min = 1,06 x 106) sağlamak için intranazal uygulamadan hemen önce bir arka plan taraması yapın.
- Diziyi başlatmak için Living Image yazılımına tıklayın ve IVIS sistemini başlatmak için Başlat'a tıklayın
- Başlatıldığında, IVIS edinme kontrol panelindeki sıcaklık durum ışığı kırmızıdır. Sıcaklık durumu ışığı yeşile döndüğünde, görüntüleme yapılabilir.
- Görüntüleme Sihirbazı'nı tıklatın ve görüntülenen iletişim kutusunda Floresan'ı seçin.
- Aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Pozlama Süresi: otomatik sn, Gruplama: 8, F / Stop: 2, Görüş Alanı: D.
- 620 nm uyarma filtresini ve 670 nm emisyon filtresini seçin. Görüntüyü elde etmek için Sırayı Al'a tıklayın.
- Living Image yazılımı ile tüm farelerin canlı görüntülerini ve parlaklık verilerini işleyin.
- Resmi aldıktan sonra, Araç Paleti'ndeki YG Araçları'na tıklayın, Daire'yi seçin ve bir YG dairesi oluşturun.
- YG alanı için nicel bir değer elde etmek üzere YG'leri ölç'e tıklayın.
6. İn vivo antitümör etkinliği
- EL4'ten fare lenfoması E.G7-OVA hücrelerini, 2.1.1-2.1.4 adımlarını izleyerek tam bir büyüme ortamı ile yenileyin ve kültürleyin.
NOT: E.G7-OVA hücresi tam büyüme ortamını hazırlamak için, RPMI 1640 ortamını 1.5 g / L sodyum bikarbonat, 4.5 g / L glikoz, 10 mM HEPES ve 1.0 mM sodyum piruvat içerecek şekilde ayarlanmış 2 mM L-glutamin ile karıştırın ve 0.05 mM 2-merkaptoetanol ve 0.4 mg / mL G418,% 90 ve% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiştir. - Alt kültür, hücreler 1 x 106 hücre / mL ile 1 x 107 hücre / mL arasında bir yoğunluğa ulaştığında hücreleri 1: 2 oranında alt kültüre alır.
- Fareler üzerindeki önleyici koruyucu etkiyi 6.3.1-6.3.4. adımlarında açıklandığı gibi değerlendirin.
- 6 haftalık C57BL/6 fareleri rastgele beş gruba ayırın (her grupta n = 8). Çıplak fareleri %4 izofluran gazı ile uyuşturun ve %2 izofluran ile anesteziyi sürdürün. Kuruluğu önlemek için farelerin gözlerindeki arka saçları ve neomisin sülfat merhemini kısmen tıraş edin.
- Her burun deliğinde 10 μL 1 mg / mL I-OVA, BNE + I-OVA veya I-OVA NE, BNE (PBS ILE DÖRT KEZ SEYRELTILIR) VEYA HER AŞıLAMA ARASıNDA 7 GÜNLÜK BIR ARALıKLA 3 KEZ PBS KONTROLÜ ILE FARELERI INTRANAZAL OLARAK BAĞıŞıKLAYıN.
- Son bağışıklamadan sonraki 7. günde tüm fareleri hipodermik olarak sağ sırta 5 x 105 E. G7-OVA hücreleri ile aşılayın.
- Son bağışıklamadan 0, 6, 9, 12, 15 ve 18 gün sonra, dijital kumpaslar kullanarak tümörün iki eksenini ölçerek tümör hacimlerini izleyin ve farelerin 30 günlük (son bağışıklamadan sonra) hayatta kalma süresini kaydedin.
- E.G7-OVA hücrelerini aşıladıktan sonra fareler üzerindeki terapötik koruyucu etkiyi 6.4.1-6.4.3 adımlarında açıklandığı gibi değerlendirin. Farelerin gruplandırılması ve işlenmesi için adım 6.3.1'e bakın.
- 0. günde, C57BL / 6 farelerini E.G7-OVA hücreleri (5 x 105 hücre / fare) ile sağ sırta deri altından enjekte edin.
- Enjeksiyondan 0, 7 ve 14 gün sonra, her burun deliğinde üç kez 10 μL I-OVA, BNE + I-OVA, I-OVA NE (hepsi 1 mg / mL konsantrasyonlarında), BNE veya PBS ile intranazal olarak aşılanmış tüm fareleri bağışıklayın.
- Enjeksiyondan 0, 6, 9, 12, 15 ve 18 gün sonra, tümör hacmini izleyin ve farelerin 30 günlük sağkalımını kaydedin.
NOT: Tümör hacmi 3.000mm3'ü aşarsa, fareler insani nedenlerle ötenazi yapılmalıdır ve bu fareler hayatta kalma eğrisinde ölü olarak kabul edilecektir. Tümör hacmi, aşağıdaki denklemde gösterildiği gibi modifiye edilmiş bir elipsoidal formülle hesaplanır:
Hacim = π/6 x U x G2
burada L, tümör uzunluğunu temsil eder ve W, tümör genişliğini temsil eder (uzunluk birimi: mm, hacim birimi:mm 3).
7. İstatistiksel analiz
- Tek yönlü ANOVA, Tukey'in çoklu karşılaştırmaları veya bir Öğrencinin t-testi ile uygun istatistiksel yazılımı kullanarak farklı gruplar arasındaki veri farklılıklarını analiz edin. Hayatta kalma sonuçlarını tahmin etmek ve grupları log-rank istatistikleriyle karşılaştırmak için Kaplan-Meier yöntemini kullanın. Tüm sonuçları ortalama ± SD olarak ifade edin. P değerleri P < 0,05, P < 0,01 ve P < 0,001 değerlerinin önemi , grafiklerde sırasıyla *, ** ve *** kullanılarak temsil edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokole göre, burun tümörü nanoaşı dağıtımının hazırlığını ve in vitro ve in vivo deneysel değerlendirmesini tamamladık. TEM, AFM ve DLS, yüzey zeta potansiyelinin temel özelliklerinin ve nanoaşının parçacık boyutunun değerlendirilmesinde etkili araçlardır (Şekil 1). BEAS-2B epitel hücreleri, nazal aşıların in vitro toksisite testi için yararlı bir tarama modelidir (Şekil 2A). H&E ile boyanmış mikrofotoğraflar, I-OVA NE'nin doku hasarı, kanama veya inflamatuar hücre infiltrasyonu dahil olmak üzere belirgin bir mukozal toksisiteye sahip olmadığını göstermektedir (Şekil 2B). Nazal boşluktaki BEAS-2B hücreleri tarafından antijenin etkin bir şekilde alınması, daha sonraki immün yanıtları ortaya çıkarmak için antijen sunumu için bir ön koşuldur (Şekil 3). IVIS sistemi, I-OVA NE in vitro 'un sürekli salınım etkisini aydınlatmaya yardımcı olur ve bu nanoaşının hızlı salınımı geciktirebileceğini, burun bölgesindeki süreyi uzatabileceğini ve hücrelerdeki peptitlerin alımını artırabileceğini düşündürmektedir (Şekil 4). Önleyici koruyucu modeller ve terapötik koruyucu modeller, I-OVA NE aşısının koruyucu etkisini ve I-OVA NE aşısının tümör büyümesini inhibe etme ve farelerin medyan sağkalım süresini uzatma yeteneğini doğrudan yansıtmaktadır (Şekil 5). Yukarıdaki deneysel sonuçlar Yang ve ark.7 tarafından yayınlanmıştır.
Resim 1: I-OVA NE'nin fiziksel özellikleri ve kararlılığı . (A) İletim elektron mikrografı (TEM), ölçek çubuğu = 100 nm. (B) Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) mikrografisi. X ve Y eksenlerinin her ikisi de toplam 450 nm uzunluğa sahiptir. (C) Boyut, çap ve dağılım. (D) Nano ZS kullanılarak gerçekleştirilen I-OVA NE analizlerinin Zeta potansiyeli ve dağılımı. (E) Nano ZS kullanılarak yapılan müsin stabilite analizlerinde parçacık boyutları, (F) polidispersite indeksleri, (G) zeta potansiyelleri ve (H) I-OVA NE'nin elektroforez hareketliliği. Bu rakam Yang ve ark.7'nin izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: I-OVA NE'nin in vitro ve in vivo toksisitesi. (A) 24 saat boyunca farklı peptid konsantrasyonları I-OVA, BNE + I-OVA ve I-OVA NE'ye maruz kalan kültürde BEAS-2B hücrelerinin göreceli canlılığı kontrol olarak kullanıldı. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edilir (n = 3). (B) Burun mukozasının patolojik kesitlerinin ve akciğer dokularının mikroskobik incelemesi, meydan okumadan 5 saat sonra sabitlendi. Görüntüler 100x ve 200x büyütmede yakalandı. Bu rakam Yang ve ark.7'nin izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: I-OVA NE'nin hücresel alımı. I-OVA veya I-OVA NE ile 1 saat boyunca tedavi edilen BEAS-2B hücrelerinin in vitro konfokal floresan görüntülemesi. Kontrol olarak PBS kullanıldı, I-OVA FITC (yeşil floresan) ile etiketlendi ve çekirdekler DAPI (mavi floresan) ile boyandı (ölçek çubuğu = 50 μm). Bu rakam Yang ve ark.7'nin izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: I-OVA NE'nin in vitro salınımı. (A) Fare burun boşluğunda PE etiketli I-OVA'nın in vivo floresan görüntülemesi. Bağıl floresan yoğunluğu, I-OVA veya I-OVA NE'nin nazal uygulamasından sonra 0 saat, 0.5 saat, 1.5 saat, 3 saat, 6 saat, 9 saat, 12 saat ve 24 saatte kaydedildi. (B) Floresan yoğunluğunun kantitasyonu. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edilir (n = 5). *: P < 0,05; **: P <0,01; ve ***: P < 0.001. Bu rakam Yang ve ark.7'nin izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: I-OVA NE'nin in vivo anti-tümör etkinliği . (A) Önleyici koruyucu modellerde aşılanmış farelerin ortalama tümör büyüme eğrileri. (B) Önleyici koruyucu modellerde aşılanmış farelerin yüzde hayatta kalma oranı. (C) Terapötik koruyucu modellerde aşılanmış farelerin ortalama tümör büyüme eğrileri. (D) Terapötik koruyucu modellerde aşılanmış farelerin yüzde hayatta kalma oranı. *: P < 0,05; **: P < 0,01; ve ***: P < 0.001. Bu rakam Yang ve ark.7'nin izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İmmünosit membranlarla fonksiyonelleştirilen nanoaşılar, hastalığa yönelik tedavide büyük avantajlara sahiptir ve benzersiz tümör tropizmi, spesifik hedeflerin belirlenmesi, uzun süreli dolaşım, gelişmiş hücreler arası etkileşimler ve düşük sistemik toksisite gibi özelliklerle yan etkiler en aza indirilmektedir. Ayrıca kanserleri işbirliği içinde tedavi etmek için diğer tedavi modülleriyle kolayca entegre edilebilirler 16,20. İstenilen özellikler, ölçüm, şekil ve elektrik yükü gibi fiziksel ve kimyasal özellikleri kontrol ederek elde edilebilir. Bu nedenle, nanoaşılar çok çeşitli uygulamalarda önemli hale gelmiştir21. Bu özellikler, alım ve toksisite ile ilgili önemli belirleyici faktörlerdir ve nanoaşılar sadece manipülasyon22 ile toksik olmayan hale getirilebilir. Bu nedenle, şekil, boyut ve yük dahil olmak üzere fizikokimyasal özelliklerin incelenmesi için bu protokol hayati önem taşımaktadır. TEM, bilim camiasında uzun yıllardır yaygın olarak kullanılan son derece hassas bir araçtır23. Nanoyapılı malzemelerin özelliklerini anlamak ve davranışlarını manipüle etmek için önemli bir araç haline gelmiştir. Ek olarak, atomik kuvvet mikroskobu (AFM), biyolojik örneklerin nanomekanik karakterizasyonu için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır24. Yüksek çözünürlüklü 3D ve nano ölçekli bilgiler sağlarken, aynı zamanda atomik düzeyde yüzey ayrıntılarını analiz edebilir. Partikül boyutu dağılımındaki değişiklikleri belirlemeye ek olarak, DLS, çözelti25'teki nanopartiküllerin toplanma durumu hakkında bilgi sağlamak için hem boyutu hem de yükü ölçebilir.
Kolloidal süspansiyonların iyi stabilitesi için yüksek zeta potansiyel değerlerinin gerekli olduğu bildirilmiştir26. Bu çalışmada, bu protokolleri TEM, AFM ve DLS ile nanoaşıların fizikokimyasal özelliklerini değerlendirmek için kullandık. Ayrıca, burun mukozasının yüzeyi, yağlama, nem ve kimyasal koruyucu bir bariyer sağlayan çok miktarda mukus içerir. Bu belki de mukus ve bazı antijenler veya dağıtım sistemleri arasındaki etkileşimden kaynaklanmaktadır, bu da antijenlerin veya dağıtım sistemlerinin birikmesine ve "yakalanmasına" ve daha sonra çıkarılmasına neden olarak dağıtım verimliliğini büyük ölçüde azaltmaktadır7. Nanoaşıların stabilitesinin nazal uygulama için hayati önem taşıdığı iyi bilinmektedir. Bu nedenle, %0,5 müsin proteini ile işlemden sonra partikül boyutu, polidispersite indeksleri, zeta potansiyelleri ve elektroforez hareketliliği dahil olmak üzere bir dizi stabilite parametresini belirlemek için Nano ZS'yi kullandık.
İn vivo histouyumluluk ve in vitro hücre canlılığı testleri, bu yeni nanoaşının test edilen konsantrasyonlar aralığında toksik olmadığını göstermiştir27. İnsan normal bronşiyal epitel (BEAS-2B) hücreleri, insan solunum yollarını incelemek için kullanılan standart hücre hatlarıdır28. Düşük maliyeti, hızı ve minimum etik kaygıları nedeniyle, in vitro toksisite değerlendirmesi önemli bir yöntemdir. Bu çalışmada, in vitro hücre canlılığı testi bir CCK8 testi ile belirlenmiştir. Ek olarak, in vivo toksisite değerlendirmesi genellikle fareler ve sıçanlar gibi hayvan modellerinde yapılır. Histopatolojik inceleme genellikle kalp, göz, beyin, karaciğer, böbrek, akciğer ve dalak gibi nanopartiküllere maruz kalan dokular üzerinde yapılır29. Bu nedenle, bu yeni nanoaşının in vitro ve in vivo toksisitesini değerlendirmek için bu yöntemleri kullandık.
Antijen alımı ve uzaması, daha sonraki bir immün yanıtı tetiklemek için antijen sunumunun ön koşullarıdır30. BEAS-2B'nin hücresel alımının ve yeni nanoaşının in vivo ve in vitro salınım profillerinin belirlenmesi gerekmektedir. CLSM, görüntüleme laboratuvarlarının büyük çoğunluğunda bulunabilen ve çok çeşitli uygulamalara sahip olan ilgili teknolojinin en yaygın ticari uygulamasıdır. Bu aletler yaygın olarak kullanılır ve kullanımı nispeten kolaydır; Bununla birlikte, genellikle nicel veri toplama için en uygun değildirler.
Protokolümüzde, 3D görüntüleme31 ile net çözünürlük, optik kesitleme yeteneği ve çok yönlülük nedeniyle hücresel alım CLSM tarafından tespit edildi. Ek olarak, IVIS, yeni nanomalzemenin in vivo salınım profillerini elde etmek için kullanıldı, çünkü kantitatif biyolüminesans ve floresan görüntüleme in vivo ve in vitro için dışlanmış dış ışığa sahip bir görüntüleme odası sağlayabilir. Bu nedenle, bu protokolde, yeni nanoaşıların hücresel alım ve salınım profillerini in vivo ve in vitro olarak belirlemek için bu yöntemleri kullandık.
Yeni nanoaşının tümör etkinliğini değerlendirmek de önemlidir. Çalışmamızda aşının terapötik ve koruyucu etkilerini belirlemek için E.G7 tümör taşıyan model kullanılmıştır. EL4 hücreleri, yüksek dereceli maligniteye sahip C57BL/6 farelerin T lenfositlerinden türetilir. E.G7 hücreleri, elektroporasyon32 ile transfekte edilen EL4 lenfoma hücrelerinden türetilir. Çalışmamızda, bu nanoaşı, E.G7-OVA tümör taşıyan farelerde koruyucu bağışıklığı indükledi. Özetle, nanoaşıların in vitro ve in vivo fizikokimyasal özelliklerini, stabilitesini, toksisitesini, salınım profillerini, hücresel alımını ve antitümör etkilerini incelemek için bir dizi protokol oluşturmak gereklidir. Bu protokoller yeni nazal nanoaşı için yararlı sonuçlar sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu makalede bildirilen çalışmayı etkileyebilecek bilinen rakip finansal çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan etmektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Programı No. 31670938, 32070924, 32000651, Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı Proje Programı'nın No. 2014jcyjA0107 ve No. 2019jcyjA-msxmx0159, Ordu Tıp Üniversitesi Özel projelerinin No. 2020XBK24 ve No. 2020XBK26 ve üniversite öğrencileri için Ulusal İnovasyon ve Girişimcilik Programı'nın No. 202090031021 ve No. 202090031035 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | Bio-Rad 6.0 | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30088.03 | |
| FITC-labeled I-OVA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | NA | |
| HPLC | Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. | E2695 | |
| Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| IPC-208 | Chong Qing University, China | NA | |
| IVIS system | Caliper Life Science Limited Company | NA | |
| JEM-1230 TEM | JEOL Limited Company of Japan | 1230 TEM | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | NA | |
| MPLA | Invivogen Lit. Co. |
tlrl-mpla | |
| Neomycin Sulfate Ointment | Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. | H31022262 | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30809.01 | |
| Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope | Zeiss, Germany | Zeiss LSM800 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Mohammed, I., et al. The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).
- Tsung, K., Norton, J. A. In situ vaccine, immunological memory and cancer cure. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).
- Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. Development of peptide-based vaccines for cancer. Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).
- Mochizuki, S., et al. Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs. Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).
- Kalita, P., Tripathi, T. Methodological advances in the design of peptide-based vaccines. Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).
- Yang, Y., et al. A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression. International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).
- Ren, Y., et al. OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).
- Suzuki, K., et al. Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery. Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).
- Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).
- Lam, J. Y., et al. A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants. Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).
- Chai, Y., et al. Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).
- Paiva Dos Santos, B., et al. Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications. Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).
- Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).
- Makidon, P. E., et al. Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine. PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).
- Lin, X., et al. Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine. Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).
- O'Konek, J. J., et al. Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy. Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).
- Ahmed, M., et al. A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).
- Sun, H., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- Chen, C., et al. Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy. Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).
- Prasanna, P., et al. Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).
- George, S., et al. Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos. ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).
- Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. Electron Crystallography. Singh, D., Condurache-Bota, S. , IntechOpen. London, UK. (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zielinska, A., et al. Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology. Molecules. 25 (16), 3731 (2020).
- Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).
- Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy. Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).
- Zhang, J., et al. Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).
- Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles. International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas. DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).
