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Immunology and Infection

Préparation, caractéristiques, toxicité et évaluation de l’efficacité du vaccin nasal auto-assemblé contre les tumeurs en nanoémulsion in vitro et in vivo

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64299
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1National Engineering Research Centre of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University of Chinese PLA

Summary

Ici, nous présentons des méthodes détaillées pour la préparation et l’évaluation du vaccin tumoral nanoémulsion nasale auto-assemblé in vitro et in vivo.

Abstract

Les peptides d’épitopes ont attiré l’attention dans le domaine des vaccins contre les tumeurs en raison de leur sécurité, de leur haute spécificité et de leur production pratique; en particulier, certains épitopes restreints par le CMH I peuvent induire une activité cytotoxique efficace des lymphocytes T pour éliminer les cellules tumorales. De plus, l’administration nasale est une technique d’administration efficace et sûre pour les vaccins contre les tumeurs en raison de sa commodité et de l’amélioration de l’observance du patient. Cependant, les peptides épitopiques ne conviennent pas à l’administration nasale en raison de leur faible immunogénicité et de leur manque d’efficacité d’administration. Les nanoémulsions (NE) sont des systèmes thermodynamiquement stables qui peuvent être chargés d’antigènes et livrés directement à la surface de la muqueuse nasale. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) est le pentapeptide de base de la laminine, un peptide liant l’intégrine exprimé par les cellules épithéliales respiratoires humaines. Dans cette étude, un vaccin tumoral intranasal auto-assemblé à peptide NE contenant le peptide synthétique IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) a été préparé par une méthode d’émulsification à basse énergie. La combinaison d’IKVAV et d’OVA257-264 peut améliorer l’absorption de l’antigène par les cellules épithéliales de la muqueuse nasale. Ici, nous établissons un protocole pour étudier les caractéristiques physico-chimiques par microscopie électronique à transmission (MET), microscopie à force atomique (AFM) et diffusion dynamique de la lumière (DLS); stabilité en présence de protéine mucine; toxicité en examinant la viabilité cellulaire des cellules BEAS-2B et des tissus nasaux et pulmonaires des souris C57BL/6; absorption cellulaire par microscopie confocale à balayage laser (CLSM); profils de libération par imagerie de petits animaux in vivo; et l’effet protecteur et thérapeutique du vaccin en utilisant un modèle porteur de tumeur E.G7. Nous prévoyons que le protocole fournira des indices techniques et théoriques pour le développement futur de nouveaux vaccins muqueux peptidiques à épitopes de lymphocytes T.

Introduction

En tant que l’une des innovations les plus critiques en matière de santé publique, les vaccins jouent un rôle clé dans la lutte contre le fardeau mondial des maladies humaines1. Par exemple, à l’heure actuelle, plus de 120 vaccins candidats contre les maladies COVID-19 sont testés, dont certains ont été approuvés dans de nombreux pays2. Des rapports récents indiquent que les vaccins anticancéreux ont effectivement amélioré les progrès des traitements cliniques contre le cancer parce qu’ils dirigent le système immunitaire des patients cancéreux à reconnaître les antigènes comme étrangers au corps3. De plus, plusieurs épitopes de lymphocytes T situés à l’intérieur ou à l’extérieur des cellules tumorales peuvent être utilisés pour concevoir des vaccins peptidiques, qui ont montré des avantages dans le traitement des cancers métastatiques en raison de l’absence de toxicité significative associée à la radiothérapie et à la chimiothérapie 4,5. Depuis le milieu des années 1990, les essais précliniques et cliniques pour le traitement des tumeurs ont été menés principalement à l’aide de vaccins peptidiques antigéniques, mais peu de vaccins présentent un effet thérapeutique adéquat sur les patients cancéreux6. En outre, les vaccins anticancéreux avec des épitopes peptidiques ont une faible immunogénicité et une efficacité d’administration insuffisante, ce qui peut être dû à la dégradation rapide des peptides extracellulaires qui diffusent rapidement à partir du site d’administration, ce qui conduit à une absorption insuffisante de l’antigène par les cellules immunitaires7. Par conséquent, il est nécessaire de surmonter ces obstacles avec la technologie d’administration des vaccins.

OVA 257-264, l’épitope257-264 liant le CMH de classe I exprimé en protéine de fusion, est un épitopemodèle 8 fréquemment utilisé. En outre, OVA257-264 est crucial pour la réponse immunitaire adaptative contre les tumeurs, qui dépend de la réponse cytotoxique des lymphocytes T (CTL). Il est médié par des cellules T CD8+ spécifiques de l’antigène dans la tumeur, qui sont induites par le peptide OVA257-264 . Elle se caractérise par une insuffisance de granzyme B, qui est libérée par les lymphocytes T cytotoxiques, conduisant à l’apoptose des cellules cibles8. Cependant, l’administration libre du peptide OVA257-264 peut induire peu d’activité CTL parce que l’absorption de ces antigènes se produit dans des cellules non spécifiques plutôt que dans des cellules présentatrices d’antigènes (APC). L’insuffisance d’une stimulation immunitaire appropriée entraîne une activité CTL5. Par conséquent, l’induction d’une activité CTL efficace exige des progrès considérables.

En raison de la barrière fournie par les cellules épithéliales et de la sécrétion continue de mucus, les antigènes vaccinaux sont rapidement éliminés de la muqueuse nasale 9,10. La mise au point d’un vecteur vaccinal efficace capable de traverser le tissu muqueux est cruciale car les cellules présentatrices de l’antigène sont situées sous l’épithélium9 de la muqueuse. L’injection intranasale de vaccins induit théoriquement une immunité muqueuse pour lutter contre l’infection des muqueuses11. En outre, l’administration nasale est une méthode d’administration efficace et sûre pour les vaccins en raison de sa commodité, de l’évitement de l’administration intestinale et de l’amélioration de l’observance du patient7. Par conséquent, l’administration nasale est un bon moyen d’administration pour le nouveau nanovaccin à épitopes peptidiques.

Plusieurs biomatériaux synthétiques ont été conçus pour combiner les épitopes des interactions cellule-tissu et cellule-cellule. Certaines protéines bioactives, comme l’Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), ont été introduites dans le cadre de la structure de l’hydrogel pour conférer une bioactivité12. Ce peptide contribue probablement à l’attachement, à la migration et à la croissancedes cellules 13 et se lie aux intégrines α 3β1 et α6β1 pour interagir avec différents types de cellules cancéreuses. IKVAV est un peptide d’adhésion cellulaire dérivé de la protéine de membrane basale de laminine αchaîne 1 qui était à l’origine utilisé pour modéliser le microenvironnement neuronal et provoquer la différenciation neuronale14. Par conséquent, il est important de trouver un véhicule d’administration efficace pour ce nouveau vaccin pour lutter contre la maladie.

Des systèmes d’émulsion récemment signalés, tels que W805EC et MF59, ont également été composés pour l’administration dans les cavités nasales d’un vaccin antigrippal inactivé ou d’antigène de surface recombinant de l’hépatite B et illustrés pour déclencher à la fois l’immunité muqueuse et systémique15. Les nanoémulsions (NE) présentent les avantages d’une administration facile et d’une coformation pratique avec des adjuvants efficaces par rapport aux systèmes d’administration de particulesmuqueuses 16. Il a été rapporté que les vaccins à nanoémulsion modifient le phénotype allergique d’une manière durable, différente de la désensibilisation traditionnelle, ce qui entraîne des effets suppressifs à long terme17. D’autres ont rapporté que les nanoémulsions combinées à des antigènes immunodominants spécifiques du Mtb pourraient induire de puissantes réponses des cellules muqueuses et conférer une protection significative18. Par conséquent, un nouveau nanovaccin intranasal auto-assemblé avec le peptide synthétique IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, le peptide constitué d’IKVAV lié à OVA257-264) a été conçu. Il est important d’évaluer systématiquement ce nouveau nanovaccin.

L’objectif de ce protocole est d’évaluer systématiquement les caractéristiques physico-chimiques, la toxicité et la stabilité du nanovaccin, de détecter si l’absorption d’antigènes et les effets protecteurs et thérapeutiques sont renforcés à l’aide de moyens techniques, et de préciser les principaux contenus expérimentaux. Dans cette étude, nous avons établi une série de protocoles pour étudier les caractéristiques physico-chimiques et la stabilité, déterminer l’ampleur de la toxicité de l’I-OVA NE en cellules BEAS-2B par CCK-8 et observer la capacité de présentation de l’antigène des cellules BEAS-2B au vaccin à l’aide de la microscopie confocale, évaluer les profils de libération de ce nouveau nanovaccin in vivo et in vitro, et détecter l’effet protecteur et thérapeutique de ce vaccin en utilisant un modèle murin porteur de tumeur E.G7-OVA.

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Protocol

Les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux lignes directrices sur les animaux de laboratoire pour l’examen éthique du bien-être animal (GB / T 35892-2018) et ont été approuvées par le Comité du bien-être et de l’éthique des animaux de laboratoire de la troisième Université médicale militaire. Les souris ont été euthanasiées par injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de pentobarbital sodique à 1 %.

1. Préparation de l’I-OVA NE

  1. Mélangez 1 mg de monophosphoryl lipid A (MPLA) avec 100 μL de DMSO, vortex pendant 5 min, et laissez-le reposer pendant 4 h à température ambiante (RT) pour se dissoudre complètement.
  2. Ajouter Tween 80 et I-OVA quantitativement et mélanger.
    NOTE: Tween 80 et I-OVA ont été mélangés à un rapport de masse de 25: 119.
  3. Ajouter le squalène dans le mélange préparé à l’étape 1.2 (7:3, Smix: squalène).
  4. Ajouter 100 μL de solution de MPLA (10 mg/mL) au mélange préparé à l’étape 1.3.
  5. Préparer le vaccin à base de nanoémulsion à l’aide de méthodes d’émulsification à faible énergie19: ajouter la solution mélangée aux gouttelettes d’eau à environ 70% du volume total et remuer doucement pour obtenir un mélange transparent et facile à écouler.
    NOTE: Le contrôle BNE (émulsion blanche) a été préparé par la même méthode, en remplaçant l’eau par I-OVA.

2. Caractérisation physico-chimique et stabilité

REMARQUE : Évaluer la distribution de la taille des gouttelettes, le potentiel zêta et d’autres données physico-chimiques du vaccin I-OVA NE, en suivant les étapes 2.1 à 2.3; effectuer la caractérisation morphologique du vaccin I-OVA Ne en suivant les étapes 2.4 à 2.7; et examiner la structure 3D du vaccin I-OVA NE en suivant les étapes 2.8 à 2.9.

  1. Mélanger 50 mg de protéines de mucine avec 100 mL d’eau pour injection afin de préparer une solution de mucine à 0,05 %.
  2. Diluer 4 mg/mL D’I-OVA NE 200 fois avec 0,05 mg/mL de protéine de mucine ou d’eau désionisée.
  3. Observez la taille des particules, le potentiel zêta, l’indice de polydispersité (PDI) et la mobilité électrophorétique à 25 °C à l’aide d’un nanoanalyseur19.
  4. Diluer 10 μL d’I-OVA NE 200 fois avec 2 mL d’eau désionisée.
  5. Placer 5 μL de vaccin I-OVA NE prédilué (étape 2.4) sur une grille de cuivre recouverte de carbone et la recouvrir de 10 μL d’acide phosphotungstique à 1 % pendant 3 minutes.
  6. Retirez l’excès d’acide phosphotungstique avec du papier filtre.
  7. Obtenez des images à l’aide de TEM. Placer un échantillon de 10 μL dilué 50 fois sur une grille de carbone cuivre à 100 mailles et le laisser reposer à température ambiante (RT) pendant 5 minutes avant d’ajouter 10 μL d’acide phosphotungstique (1%, pH 7,4). Examiner tous les échantillons par TEM à une tension de 120 kV.
  8. Caractériser la morphologie moléculaire de l’I-OVA NE à l’aide d’un microscope à force atomique à haute résolution. Obtenir les images couleur d’I-OVA NE dans les conditions suivantes : pour les sondes en tungstène (constante de force : 0,06 N·m-1) ; Plage de balayage: 450 nm x 450 nm; Mode de tapotement: mode d’imagerie; et méthode de balayage: balayage point par point à RT.

3. Essais de toxicité in vitro et in vivo

REMARQUE : La toxicité in vitro du vaccin I-OVA NE NE a été évaluée qu’aux étapes 3.1 à 3.9, et la toxicité in vivo du vaccin contre les OVA d’électronétiques a été évaluée selon les étapes 3.10 à 3.13.

  1. Raviver les cellules épithéliales humaines BEAS-2B en suivant les étapes 3.1.1-3.1.4 et les cultiver dans un milieu de croissance complet à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 .
    NOTE: Pour préparer le milieu de croissance complet, ajouter du sérum fœtal bovin (FBS) et de la pénicilline/streptomycine au milieu RPMI-1640 à des concentrations finales de 10% et 1%, respectivement.
    1. Allumez le bain-marie et réglez la température à 37 °C. Retirer les flacons cellulaires congelés dans de l’azote liquide et décongeler rapidement au bain-marie à 37 °C.
    2. Après décongélation, pipeter rapidement les cellules dans un tube à centrifuger stérile de 15 mL, ajouter 2 mL du milieu de croissance complet et centrifuger à 129 x g pendant 5 min.
    3. Retirer le surnageant, ajouter 2 mL du milieu de croissance complet pour remettre les cellules en suspension et centrifuger à 129 x g pendant 5 min.
    4. Retirer le surnageant, ajouter 6 mL de milieu de croissance complet pour remettre les cellules en suspension et transférer les cellules dans une fiole de culture T25 pour mettre les cellules en culture à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .
  2. Lorsque la densité cellulaire atteint 80% à 90%, jetez le milieu de culture et lavez les cellules deux fois avec 2 ml de PBS. Ajouter 1 mL de trypsine à 0,25% pour digérer les cellules pendant 1-2 min. Lorsque l’arrondi des cellules est observé, ajouter immédiatement 4 mL du milieu de croissance complet pour neutraliser la trypsine.
  3. Mélanger et aspirer les échantillons dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml et centrifuger à 129 x g pendant 5 min.
  4. Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu complet RPMI-1640. Utilisez 20 μL pour le comptage cellulaire et diluez les cellules à 1 x 105 cellules/mL.
  5. Plaquer les cellules BEAS-2B à une densité de 1 x 104 cellules/puits dans des plaques de 96 puits dans 100 μL de milieu complet RPMI-1640 et préincuber les plaques pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 .
  6. Jeter le surnageant et ajouter 100 μL d’I-OVA NE, 100 μL d’I-OVA+BNE (physiquement mélangé) et 100 μL d’I-OVA prédilué avec un milieu de croissance complet à diverses concentrations finales (0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 4 mg/mL, 8 mg/mL), avec BNE comme témoin. Incuber pendant 24 h à 37 °C.
    REMARQUE : Ajouter 100 μL de milieu de croissance complet aux groupes témoins négatifs et 100 μL de suspension cellulaire (1 x 105/mL) aux groupes témoins positifs.
  7. Retirer le milieu et ajouter 90 μL de milieu de croissance complet et 10 μL de solution CCK-8 à chaque puits de la plaque.
  8. Incuber la plaque pendant 2 h à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 .
  9. Mesurer l’absorbance de chaque puits à 450 nm à l’aide d’un lecteur de plaques marqué par des enzymes.
  10. Calculer le rapport de survie des cellules BEAS-2B comme indiqué dans l’équation suivante :
    (Échantillon OD450 − témoin négatif OD450/témoin positif OD450− témoin négatif OD450) × 100 %
  11. Divisez au hasard les souris C57BL/6 âgées de 6 semaines en cinq groupes (n = 5 dans chaque groupe) et anesthésiez-les avec de l’isoflurane à 4 % pour l’induction. Maintenir l’anesthésie avec 2% d’isoflurane. Utilisez une pommade au sulfate de néomycine sur les yeux des souris pour prévenir la sécheresse.
  12. Utilisez des embouts de pipette de 10 μL pour effectuer l’immunisation nasale des souris avec 10 μL/narine d’I-OVA, I-OVA+BNE et IOVA NE à 4 mg/mL pendant les 3 jours. Utiliser le BNE et le PBS comme témoins expérimentaux.
    REMARQUE: Fournir un soutien thermique jusqu’à ce que l’animal se rétablisse de l’anesthésie.
  13. Euthanasier toutes les souris par injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de pentobarbital sodique à 1 % au jour 4.
  14. Couper des échantillons de tissus nasaux d’environ 3 mm d’épaisseur avec des ciseaux et retirer les tissus pulmonaires.
  15. Fixer les tissus nasaux et les tissus pulmonaires entiers dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 24 h. Déshydrater les tissus à l’aide d’un gradient d’alcool et de xylène en série, puis les incorporer dans de la paraffine. Trancher les blocs de cire finis sur une trancheuse à paraffine d’une épaisseur de 4 μm.
  16. Colorer les sections avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E). Ensuite, observez la toxicité des muqueuses, y compris l’hyperémie, l’œdème, l’infiltration de neutrophiles et les dommages structurels dans la muqueuse nasale et le tissu pulmonaire, au microscope (100x et 200x)7.

4. Absorption cellulaire in vitro

  1. Plaquer des cellules BEAS-2B à une densité de 5 x 10 5 cellules/puits dans des plaques de 12 puits avec des lames de recouvrement dans 2 mL du milieu de croissance complet et préincuber les plaques pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur à5 % de CO2 .
  2. Ajouter 100 μL d’I-OVA NE marqué FITC (pureté : 98,3 %, produit par la société, 4 mg/mL) ou I-OVA (4 mg/mL) à 900 μL de suspension cellulaire et placer à 37 °C pendant 90 min.
    REMARQUE : Préparez l’I-OVA NE étiqueté FITC comme décrit à l’étape 4.1. Ajouter 1 mL de milieu de croissance complet aux groupes témoins.
  3. Laver trois fois avec 0,1 M de PBS (1 mL/puits) pendant 30 min à 37 °C après le traitement.
  4. Fixez ces échantillons avec 4% de paraformaldéhyde pendant 20 minutes dans l’obscurité. Après fixation, retirer le paraformaldéhyde et laver 3 fois avec 0,1 M PBS (1 mL/puits) pendant 30 min à 37 °C.
  5. Préincuber les échantillons avec du DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) à une concentration finale de 10 μg/mL pendant 10 min dans l’obscurité, puis laver 5 fois avec 0,1 M PBS (1 mL/puits) pendant 30 min à 37 °C après le traitement.
  6. Obtenez l’absorption cellulaire par CLSM avec les paramètres suivants : Taille de l’image : 512 px x 512 px, Vitesse de numérisation : 8 ; Pas de ligne: 1; Moyenne : 2.

5. Dissémination in vivo

  1. Anesthésier les souris nues avec 4% de gaz isoflurane et maintenir l’anesthésie à 2% d’isoflurane. Immuniser les souris nues par voie intranasale avec 10 μL d’I-OVA marqué PE à 4 mg/mL ou d’I-OVA marqué PE à 4 mg/mL dans chaque narine.
  2. À 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3, 6 h, 9 h, 12 h et 24 h, capturer toutes les souris sous anesthésie par le système IVIS.
  3. Effectuez un balayage de l’arrière-plan immédiatement avant l’administration intranasale pour fournir une valeur seuil (Min = 1,06 x 106) pour ajuster les images recueillies à tous les points temporels.
  4. Cliquez sur le logiciel Living Image pour lancer la séquence et cliquez sur Initialiser pour initialiser le système IVIS
  5. Lorsqu’il est initialisé, le voyant d’état de température dans le panneau de contrôle d’acquisition IVIS est rouge. Lorsque le voyant d’état de température passe au vert, l’imagerie peut être effectuée.
  6. Cliquez sur Assistant Création d’image , puis choisissez Fluorescence dans la boîte de dialogue qui s’affiche.
  7. Ajustez les paramètres suivants : Temps d’exposition : auto sec, Binning : 8, F/Stop : 2, Champ de vision : D.
  8. Sélectionnez le filtre d’excitation 620 nm et le filtre d’émission 670 nm. Cliquez sur Acquérir la séquence pour acquérir l’image.
  9. Traitez les images en direct de toutes les souris et les données de radiance avec le logiciel Living Image.
    1. Après avoir acquis l’image, cliquez sur Outils de retour sur investissement dans la palette d’outils, sélectionnez Cercle et créez un cercle de retour sur investissement.
    2. Cliquez sur Mesurer les ROI pour obtenir une valeur quantitative pour la zone de ROI.

6. Efficacité antitumorale in vivo

  1. Rafraîchir et cultiver les cellules E.G7-OVA du lymphome de souris à partir de EL4 avec un milieu de croissance complet en suivant les étapes 2.1.1-2.1.4.
    NOTE: Pour préparer le milieu de croissance complet de la cellule E.G7-OVA, mélanger le milieu RPMI 1640 avec 2 mM de L-glutamine ajusté pour contenir 1,5 g / L de bicarbonate de sodium, 4,5 g / L de glucose, 10 mM HEPES et 1,0 mM de pyruvate de sodium et complété par 0,05 mM de 2-mercaptoéthanol et 0,4 mg / mL G418, 90%, et du sérum bovin fœtal, 10%.
  2. Sous-culture des cellules dans un rapport de 1:2 lorsque les cellules atteignent une densité comprise entre 1 x 106 cellules/mL et 1 x 107 cellules/mL.
  3. Évaluer l’effet protecteur préventif sur les souris tel que décrit aux étapes 6.3.1-6.3.4..
    1. Divisez au hasard les souris C57BL/6 âgées de 6 semaines en cinq groupes (n = 8 dans chaque groupe). Anesthésier les souris nues avec 4% de gaz isoflurane et maintenir l’anesthésie avec 2% d’isoflurane. Rasez partiellement les poils du dos et la pommade au sulfate de néomycine sur les yeux des souris pour éviter la sécheresse.
    2. Immuniser par voie intranasale les souris avec 10 μL de 1 mg/ml d’i-ova, de BNE+I-OVA ou d’I-OVA NE dans chaque narine, de BNE (dilué quatre fois avec du PBS) ou un témoin PBS 3 fois avec un intervalle de 7 jours entre chaque immunisation.
    3. Inoculer hypodermiquement toutes les souris dans le dos droit avec 5 x 105 cellules E. G7-OVA le 7ème jour après la vaccination finale.
    4. À 0, 6, 9, 12, 15 et 18 jours après l’immunisation finale, surveiller les volumes tumoraux en mesurant deux axes de la tumeur à l’aide d’étriers numériques et enregistrer la survie des souris à 30 jours (après l’immunisation finale).
  4. Évaluer l’effet protecteur thérapeutique sur les souris après inoculation de cellules E.G7-OVA comme décrit aux étapes 6.4.1-6.4.3. Pour le regroupement et la manipulation des souris, voir l’étape 6.3.1.
    1. Au jour 0, injecter les souris C57BL/6 par voie sous-cutanée dans le dos droit avec des cellules E.G7-OVA (5 x 105 cellules/souris).
    2. À 0, 7 et 14 jours après l’injection, immuniser toutes les souris immunisées par voie intranasale avec 10 μL d’I-OVA, de BNE + I-OVA, d’I-OVA NE (tous à des concentrations de 1 mg/mL), de BNE ou de PBS trois fois dans chaque narine.
    3. À 0, 6, 9, 12, 15 et 18 jours après l’injection, surveillez le volume tumoral et enregistrez la survie à 30 jours des souris.
      REMARQUE: Si le volume de la tumeur dépasse 3 000 mm3, les souris doivent être euthanasiées pour des raisons humaines, et ces souris seront considérées comme mortes dans la courbe de survie. Le volume tumoral est calculé par une formule ellipsoïdale modifiée comme indiqué dans l’équation suivante:
      Volume = π/6 x L xP 2
      où L représente la longueur de la tumeur et W représente la largeur de la tumeur (unité de longueur: mm, unité de volume: mm3).

7. Analyse statistique

  1. Analysez les différences de données entre les différents groupes à l’aide d’un logiciel statistique approprié avec ANOVA unidirectionnelle, comparaisons multiples de Tukey ou test t de Student. Utilisez la méthode de Kaplan-Meier pour estimer les résultats de survie et comparer les groupes avec les statistiques de log-rank. Exprimez tous les résultats sous forme de moyenne ± écart-type. La signification des valeurs P < 0,05, P < 0,01 et P < 0,001 est représentée à l’aide de *, **, et ***, respectivement, sur les graphiques.

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Representative Results

Conformément au protocole, nous avons terminé la préparation et l’évaluation expérimentale in vitro et in vivo de l’administration du nanovaccin nasal contre la tumeur. La MET, l’AFM et le DLS sont des moyens efficaces pour évaluer les caractéristiques de base du potentiel zêta de surface et la taille des particules du nanovaccin (Figure 1). Les cellules épithéliales BEAS-2B sont un modèle de dépistage utile pour les essais de toxicité in vitro des vaccins nasaux (Figure 2A). Les microphotographies colorées avec H&E montrent que l’I-OVA NE présentait aucune toxicité muqueuse évidente, y compris des lésions tissulaires, des saignements ou une infiltration de cellules inflammatoires (Figure 2B). L’absorption efficace de l’antigène par les cellules BEAS-2B dans les fosses nasales est une condition préalable à la présentation de l’antigène pour provoquer des réponses immunitaires ultérieures (Figure 3). Le système IVIS aide à élucider l’effet à libération prolongée de l’I-OVA NE in vitro et suggère que ce nanovaccin peut retarder la libération rapide, prolonger le temps dans la région nasale et améliorer l’absorption des peptides dans les cellules (Figure 4). Les modèles de protection préventive et les modèles de protection thérapeutique reflètent directement l’effet protecteur du vaccin I-OVA NE et la capacité du vaccin I-OVA NE à inhiber la croissance tumorale et à prolonger le temps de survie médian des souris (Figure 5). Les résultats expérimentaux ci-dessus ont été publiés par Yang et al.7.

Figure 1
Figure 1 : Caractéristiques physiques et stabilité de l’I-OVA NE. (A) Micrographie électronique à transmission (MET), barre d’échelle = 100 nm. (B) Micrographie de microscopie à force atomique (AFM). Les axes X et Y ont tous deux une longueur totale de 450 nm. (C) Calibre diamètre et répartition. (D) Potentiel zêta et distribution des analyses I-OVA NE effectuées à l’aide de Nano ZS. (E) Taille des particules, (F) indices de polydispersité, (G) potentiels zêta et (H) mobilité d’électrophorèse de l’I-OVA NE dans les analyses de stabilité de la mucine effectuées à l’aide de Nano ZS. Cette figure a été adaptée avec la permission de Yang et al.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Toxicité in vitro et in vivo de l’I-OVA NE. (A) Viabilité relative de cellules BEAS-2B en culture exposées à différentes concentrations peptidiques d’I-OVA, BNE+I-OVA et I-OVA NE pendant 24 h. Le BNE a été utilisé comme témoin. Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± ET (n = 3). (B) Examen microscopique des coupes pathologiques de la muqueuse nasale et des tissus pulmonaires fixés 5 h après la provocation. Les images ont été capturées à un grossissement de 100x et 200x. Cette figure a été adaptée avec la permission de Yang et al.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Absorption cellulaire de l’I-OVA NE. Imagerie confocale in vitro par fluorescence de cellules BEAS-2B traitées pendant 1 h avec I-OVA ou I-OVA NE. Le PBS a été utilisé comme témoin, l’I-OVA a été marqué avec FITC (fluorescence verte) et les noyaux ont été colorés avec DAPI (fluorescence bleue) (barre d’échelle = 50 μm). Cette figure a été adaptée avec la permission de Yang et al.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Libération in vitro d’I-OVA NE. (A) Imagerie par fluorescence in vivo d’I-OVA marqués au PE dans la cavité nasale de la souris. Intensité relative de fluorescence enregistrée à 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3 h, 6 h, 9 h, 12 h et 24 h après l’administration nasale d’I-OVA ou d’I-OVA NE. (B) Quantification de l’intensité de fluorescence. Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± ET (n = 5). *: P < 0,05; **: P <0,01; et ***: P < 0,001. Cette figure a été adaptée avec la permission de Yang et al.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Efficacité antitumorale in vivo de l’I-OVA NE. (A) Courbes moyennes de croissance tumorale des souris vaccinées dans les modèles de protection préventive. (B) Taux de survie en pourcentage des souris vaccinées dans les modèles de protection préventive. (C) Courbes moyennes de croissance tumorale des souris vaccinées dans les modèles de protection thérapeutique. (D) Taux de survie en pourcentage des souris vaccinées dans les modèles de protection thérapeutique. *: P < 0,05; **: P < 0,01; et ***: P < 0,001. Cette figure a été adaptée avec la permission de Yang et al.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les nanovaccins fonctionnalisés avec des membranes immunocytaires présentent de grands avantages dans la thérapie ciblée sur la maladie, et les effets secondaires sont minimisés par des propriétés telles que le tropisme tumoral unique, l’identification de cibles spécifiques, une circulation prolongée, des interactions intercellulaires améliorées et une faible toxicité systémique. Ils peuvent également être facilement intégrés à d’autres modules de traitement pour traiter les cancers en coopération16,20. Les attributs souhaitables peuvent être obtenus en contrôlant les propriétés physiques et chimiques telles que la mesure, la forme et la charge électrique. Par conséquent, les nanovaccins sont devenus importants dans un large éventail d’applications21. Ces propriétés sont des facteurs décisifs majeurs en ce qui concerne l’absorption et la toxicité, et les nanovaccins ne peuvent être rendus non toxiques que par manipulation22. Par conséquent, ce protocole pour l’étude des caractéristiques physico-chimiques, y compris la forme, la taille et la charge, est vital. La TEM est un instrument très précis largement utilisé dans la communauté scientifique depuis de nombreuses années23. Il est devenu un outil essentiel pour comprendre les propriétés des matériaux nanostructurés et manipuler leurs comportements. De plus, la microscopie à force atomique (AFM) est apparue comme une technique puissante pour la caractérisation nanomécanique d’échantillons biologiques24. Il peut fournir des informations 3D et nanométriques haute résolution tout en analysant les détails de surface au niveau atomique. En plus de déterminer les changements dans la distribution granulométrique, DLS peut mesurer à la fois la taille et la charge pour fournir des informations sur l’état d’agrégation des nanoparticules dans la solution25.

Il a été rapporté que des valeurs élevées de potentiel zêta sont essentielles pour la bonne stabilité des suspensions colloïdales26. Dans cette étude, nous avons utilisé ces protocoles pour évaluer les caractéristiques physico-chimiques des nanovaccins avec TEM, AFM et DLS. De plus, la surface de la muqueuse nasale contient une grande quantité de mucus, qui fournit la lubrification, l’humidité et une barrière protectrice chimique. Cela peut être dû à l’interaction entre le mucus et certains antigènes ou systèmes d’administration, entraînant l’accumulation et la « capture » d’antigènes ou de systèmes d’administration et leur élimination ultérieure, réduisant considérablement l’efficacité de la livraison7. Il est bien connu que la stabilité des nanovaccins est vitale pour l’administration nasale. Par conséquent, nous avons utilisé Nano ZS pour déterminer une série de paramètres de stabilité, y compris la taille des particules, les indices de polydispersité, les potentiels zêta et la mobilité de l’électrophorèse, après traitement avec 0,5% de protéine de mucine.

Les tests d’histocompatibilité in vivo et de viabilité cellulaire in vitro ont montré que ce nouveau nanovaccin était non toxique dans la gamme des concentrations testées27. Les cellules épithéliales bronchiques normales humaines (BEAS-2B) sont des lignées cellulaires standard utilisées pour étudier les voies respiratoires humaines28. En raison de son faible coût, de sa rapidité et de ses préoccupations éthiques minimales, l’évaluation de la toxicité in vitro est une méthode importante. Dans cette étude, le test de viabilité cellulaire in vitro a été déterminé par un test CCK8. En outre, l’évaluation de la toxicité in vivo est généralement effectuée sur des modèles animaux tels que les souris et les rats. L’examen histopathologique est souvent effectué sur des tissus exposés à des nanoparticules, tels que le cœur, l’œil, le cerveau, le foie, les reins, les poumons et la rate29. Par conséquent, nous avons utilisé ces méthodes pour évaluer la toxicité de ce nouveau nanovaccin in vitro et in vivo.

L’absorption et la prolongation de l’antigène sont des conditions préalables à l’introduction de l’antigène pour déclencher une réponse immunitaire ultérieure30. Il est nécessaire de déterminer l’absorption cellulaire de BEAS-2B et les profils de libération du nouveau nanovaccin in vivo et in vitro. Le CLSM est la mise en œuvre commerciale la plus courante de la technologie concernée, que l’on trouve dans la grande majorité des laboratoires d’imagerie et qui a un large éventail d’applications. Ces instruments sont largement utilisés et relativement faciles à utiliser; Cependant, ils ne sont généralement pas optimaux pour la collecte de données quantitatives.

Dans notre protocole, l’absorption cellulaire a été détectée par CLSM en raison de la résolution claire, de la capacité de section optique et de la polyvalence de l’imagerie3D 31. En outre, IVIS a été utilisé pour obtenir les profils de libération in vivo du nouveau nanomatériau, car il peut fournir une chambre d’imagerie avec une lumière extérieure exclue pour la bioluminescence quantitative et l’imagerie de fluorescence in vivo et in vitro. Par conséquent, dans ce protocole, nous avons utilisé ces méthodes pour déterminer les profils d’absorption et de libération cellulaires de nouveaux nanovaccins in vivo et in vitro.

Il est également important d’évaluer l’efficacité tumorale du nouveau nanovaccin. Dans notre étude, le modèle porteur de tumeur E.G7 a été utilisé pour déterminer les effets thérapeutiques et protecteurs du vaccin. Les cellules EL4 sont dérivées des lymphocytes T de souris C57BL/6 atteintes d’une tumeur maligne de haut grade. Les cellules E.G7 sont dérivées de cellules de lymphome EL4 transfectées par électroporation32. Dans notre étude, ce nanovaccin a induit une immunité protectrice chez des souris porteuses de tumeurs E.G7-OVA. En résumé, il est nécessaire d’établir une série de protocoles pour étudier les caractéristiques physico-chimiques, la stabilité, la toxicité, les profils de libération, l’absorption cellulaire et les effets antitumoraux des nanovaccins in vitro et in vivo. Ces protocoles fourniront des résultats utiles pour le nouveau nanovaccin nasal.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui auraient pu sembler influencer le travail rapporté dans cet article.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par les projets spéciaux n ° 31670938, 32070924, 32000651 du programme de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine, n ° 2014jcyjA0107 et n ° 2019jcyjA-msxmx0159 du programme de projet de la Fondation des sciences naturelles de Chongqing, n ° 2020XBK24 et n ° 2020XBK26 des projets spéciaux de l’Université médicale de l’armée, et n ° 202090031021 et n ° 202090031035 du programme national d’innovation et d’entrepreneuriat pour les étudiants.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates Corning Incorporated, USA CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA  Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits Dojindo, Japan CK04
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D9542
fetal bovine serum (FBS) Hyclone (Life Technology, USA) SH30088.03
FITC-labeled I-OVA Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		 NA
HF 90/240 Incubator Heal Force, Switzerland NA
HPLC  Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. E2695
Inverted Microscope Nikon,Japan DSZ5000X
IPC-208 Chong Qing University, China NA
IVIS system  Caliper Life Science Limited Company NA
JEM-1230 TEM JEOL Limited Company of Japan 1230 TEM
Malvern NANO ZS Malvern Instruments Ltd., UK NA
MPLA  Invivogen
Lit. Co.		 tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. H31022262
OVA257–264 Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		 NA
RPMI 1640 medium Hyclone (Life Technology, USA) SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		 NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope Zeiss, Germany Zeiss LSM800

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References

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Préparation, caractéristiques, toxicité et évaluation de l’efficacité du vaccin nasal auto-assemblé contre les tumeurs en nanoémulsion in <em>vitro</em> et <em>in vivo</em>
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Zhang, Z., Cai, D., Ge, S., Luo, X., … More

Zhang, Z., Cai, D., Ge, S., Luo, X., Zeng, X., Ye, Y., Song, Z., Peng, L., Li, H., Zou, Q., Zeng, H., Sun, H., Yang, Y. Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (187), e64299, doi:10.3791/64299 (2022).

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