Summary
Et nødvendigt skridt i udvikling af anticancer aptamer er at teste dets binding til målet. Vi demonstrerer et flowcytometrisk baseret assay for at studere denne binding og understreger vigtigheden af at inkludere en negativ kontrolaptamer og kræftceller, der er positive eller negative for det pågældende protein.
Abstract
En vigtig udfordring ved udvikling af en anticancer aptamer er effektivt at bestemme selektiviteten og specificiteten af den udviklede aptamer til målproteinet. På grund af sine mange fordele i forhold til monoklonale antistoffer har aptamerudvikling vundet enorm popularitet blandt kræftforskere. Systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX) er den mest almindelige metode til udvikling af aptamere, der er specifikke for proteiner af interesse. Efter SELEX fremskynder et hurtigt og effektivt bindende assay identifikationsprocessen, hvilket bekræfter aptamerens selektivitet og specificitet.
Dette papir forklarer et trin-for-trin flow cytometrisk baseret bindingsassay af en aptamer, der er specifik for epitelcellulært adhæsionsmolekyle (EpCAM). Transmembranglykoproteinet EpCAM er overudtrykt i de fleste karcinomer og spiller roller i kræftinitiering, progression og metastase. Derfor er det en værdifuld kandidat til målrettet lægemiddellevering til tumorer. For at evaluere selektiviteten og specificiteten af aptameren til det membranbundne EpCAM kræves EpCAM-positive og -negative celler. Derudover kræves en ikke-bindende EpCAM-aptamer med en lignende længde og 2-dimensionel (2D) struktur som EpCAM-bindende aptamer. Bindingsanalysen omfatter forskellige buffere (blokeringsbuffer, vaskebuffer, inkubationsbuffer og FACS-buffer) og inkubationstrin.
Aptameren inkuberes med cellelinjerne. Efter inkubations- og vasketrinnene evalueres cellerne ved hjælp af et følsomt flowcytometriassay. Analyse af resultaterne viser bindingen af den EpCAM-specifikke aptamer til EpCAM-positive celler og ikke de EpCAM-negative celler. I EpCAM-positive celler er dette afbildet som et båndskift i bindingen af EpCAM-aptameren til højre sammenlignet med den ikke-bindende aptamerkontrol. I EpCAM-negative celler overlapper de tilsvarende bånd af EpCAM-bindende og -ikke-bindende aptamerer. Dette viser selektiviteten og specificiteten af EpCAM-aptameren. Mens denne protokol er fokuseret på EpCAM-aptameren, gælder protokollen for andre offentliggjorte aptamere.
Introduction
Kræft er stadig en af de hyppigste årsager til dødelighedpå verdensplan 1. På trods af den betydelige forbedring i kræftbehandling i de seneste årtier er udvikling af kræftmedicin stadig et meget debatteret emne. Dette skyldes, at kemoterapi, som grundpillen i kræftbehandling, ledsages af alvorlige bivirkninger, der begrænser patientens overholdelse af behandlingen. Desuden har kemoterapi-induceret kræftresistens over for behandling begrænset dets anvendelse som det eneste valg af medicinsk intervention. Anvendelsen af monoklonale antistoffer (mAbs) introducerede et forbedret respons påkræftbehandlinger 2. Begrundelsen for at bruge mAbs var at forbedre effekten af kemoterapeutika og minimere deres bivirkninger. Administrationen af mAbs blev dog også en udfordring. Dette skyldtes ikke kun de mAb-inducerede immunologiske reaktioner, men også de dyreafhængige og dyre produktionsomkostninger og vanskelige opbevaringsforhold3. Introduktion af aptamere i 1990'erne4 skabte nye forhåbninger inden for kræftbehandling, da anvendelsen af aptamere kunne løse de udfordringer, der er forbundet med mAbs.
Aptamerer er korte nukleinsyresekvenser, der specifikt produceres til et bestemt mål. Systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX) er en almindelig metode i aptamerproduktion. I SELEX inkuberes proteinet af interesse med et bibliotek af tilfældige nukleotidsekvenser, og gennem en række iterative cyklusser renses aptameren, der er specifik for dette protein. Aptamere har lignende målselektivitet og specificitet som mAbs, og derfor viser lægemiddeludvikling på dette område lovende fremtidige anvendelser. Aptamers specifikke for kræft biomarkører kunne anvendes som enkeltmedicin og kræftdiagnostiske værktøjer 5,6,7. På grund af deres nano-størrelse struktur, disse aptamers kunne også fungere som lægemiddelbærere til at levere cytotoksiske midler specifikt til tumoren8. Dette ville øge effekten af målrettet lægemiddellevering og mindske kemoterapi-associerede, off-target bivirkninger. Desuden har disse nanolægemidler en høj vævsindtrængning, hvilket gør dem til en ønskelig kandidat til levering og behandling af dyb tumormedicin. Aptamere kan også designes til at målrette mod transportørerne udtrykt på blod-hjerne-barrieren (BBB) for at forbedre lægemiddelafgivelsen til hjernetumorer9. Et godt eksempel på en sådan aptamer er bifunktionelle aptamere, der er målrettet mod transferrinreceptoren (TfR)10 for at forbedre lægemiddelafgivelsen på tværs af BBB og levere en cytotoksisk lægemiddelnyttelast til tumorceller11.
På trods af alle fordelene ved aptamerer har lægemiddeludvikling på dette område endnu ikke givet et markedsført, vellykket kræftlægemiddel. En af grundene til dette kunne være manglen på standard og reproducerbare metoder, der kunne følges globalt af forskere på området. I dette papir demonstreres en trin-for-trin protokol for en aptamerbinding til et naturligt protein udtrykt på celleoverfladen. Denne protokol er et forudsætningstrin i den prækliniske vurdering af anticancer-aptammere. Analysen udføres for at vise selektiviteten og specificiteten af den oprensede aptamer indsamlet fra SELEX eller en offentliggjort aptamersekvens til bekræftelse af selektivitet og specificitet. Dette flowcytometriske assay er et hurtigt, pålideligt, følsomt assay, der nøjagtigt viser aptamerens selektivitet og specificitet, hvor aptameren testes mod proteiner på celleoverfladen12,13,14. Denne metode demonstreres ved hjælp af bindingen af en aptamer, der er specifik for EpCAM, vist i dette papir15. EpCAM, som et transmembranglykoprotein, spiller roller i tumorcellesignalering, progression, migration og metastase16,17. For at vise selektiviteten og specificiteten af denne aptamer blev EpCAM-positive og -negative kræftceller anvendt. Den tidligere udviklede EpCAM-specifikke aptamer, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′) og en negativ kontrolaptamer, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), blev brugt som henholdsvis EpCAM-bindende og -ikke-bindende aptamere10. 3'-enden af både TEPP og TENN blev mærket med en TYE665 fluorophore.
TEPP er en bifunktionel aptamer, der er målrettet mod EpCAM fra den ene ende og TfR i den anden. Dette har gjort TEPP til en passende kandidat til lægemiddellevering til EpCAM+ hjernetumorer. Ved hjælp af sin TfR-specifikke ende krydser TEPP blod-hjerne-barrieren og ved hjælp af den EpCAM-specifikke ende finder tumoren og leverer sin last (f.eks. Cytotoksiske lægemidler) til tumoren. TENN har en lignende længde og 2D-struktur som TEPP, men den har ikke affinitet for EpCAM eller TfR og er derfor en passende negativ kontrolaptamer. Ved hjælp af TEPP og TENN er test af bindingen af en aptamer til målproteinet ved hjælp af flowcytometri vist i dette papir. Denne protokol gælder for udviklingen af cellespecifikke aptamerer. Det gælder også for yderligere supplerende og bekræftende analyser af de aptamersekvenser, der er tilgængelige i litteraturen. Protokollen kan også bruges af dem, der er nye inden for aptamerfeltet, der ser på at bruge en tidligere offentliggjort aptamer til deres forsknings- og udviklingsformål (F &U). I dette papir studeres to aptamersekvenser, der er tilgængelige i litteraturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Før eksperimentet påbegyndes, skal du bære personlige værnemidler, herunder en laboratoriefrakke, handsker og beskyttelsesbriller. Se materialetabellen for detaljer om materialer, reagenser, udstyr og software, der bruges i denne protokol.
1. Buffere, der kræves til analysen
- Forbered de buffere, der kræves til dette forsøg - SELEX-bufferen, der kræves til aptamerfoldning, blokeringsbuffer (BB), vaskebuffer (WB) og bindingsbuffer (BiB) (tabel 1) - frisk på forsøgsdagen, og opbevar dem på is eller ved 4 °C.
BEMÆRK: Hver aptamer kræver en unik foldetilstand. Dette inkluderer SELEX-bufferen og foldetemperaturforholdene. Der skal udvises forsigtighed for fuldt ud at replikere metoderne fra det originale papir, der beskriver aptameren10. I dette eksperiment fremstilles alle buffere i Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS). Det buffervolumen, der kræves i hvert eksperiment, afhænger af antallet af cellelinjer, antallet af replikater og antallet af aptamerkoncentrationer, der testes.
| Ingredienser | Volumen kræves | ||
| Vare | Koncentration | ||
| SELEX-buffer | MgCl2 | 5 mM | 50 μL pr. prøve + 10 % pipetteringsfejl |
| Blokerende buffer | MgCl2 | 5 mM | 500 μL pr. cellelinje |
| BSA a | 1 mg/ml | ||
| tRNA b | 0,1 mg/ml | ||
| FBS c | 10% (v/v) | ||
| Vask buffer | MgCl2 | 5 mM | 1 ml til første vask + 100 μL pr. prøveemne + 10 % pipetteringsfejl |
| Bindende buffer | MgCl2 | 5 mM | 50 μL pr. prøve + 10 % pipetteringsfejl |
| BSA | 2 mg/ml | ||
| Trna | 0,2 mg/ml | ||
| FBS | 20% (v/v) | ||
Tabel 1: Buffere, der kræves til det bindende assay. en Bovin serumalbumin, bOverførsel ribonukleinsyre, cFøtal Bovin Serum.
2. Fremstilling af aptamere
BEMÆRK: Aptamerne, der anvendes i analysen, er mærket med et fluorescensreportermolekyle, og derfor skal man sørge for at beskytte dem mod lys.
- Før eksperimentet skal du forberede et 100 μM lager (lager A) af test- og kontrolaptamere ved hjælp af pyrogen- og RNase-frit ultrarent vand (figur 1).
BEMÆRK: Ved langtidskonservering skal lager A opbevares i fryser ved -20 °C. - Bestand B forberedes som arbejdskoncentrationen af aptamere ved at fortynde bestand A ved hjælp af SELEX-bufferen (tabel 1). For at følge denne protokol fortyndes bestand A til en bestand på 1.000 nM for at forberede lager B (figur 1).
- For at gøre aptameren klar til dannelsen af den 3-dimensionelle (3D) struktur fortyndes lager B i et 250 μL rør med SELEX-buffer for at forberede det krævede volumen og koncentration af aptameren til foldning.
BEMÆRK: De foldede aptamere udsættes for et lige stort volumen celler. Derfor bør koncentrationen af aptameren, der er indstillet til foldning, være 2x mere koncentreret end den ønskede endelige koncentration. Brug ligning (1) til at beregne de krævede mængder og koncentrationer. Husk at overveje en ekstra 10% volumen for pipetteringsfejlen.
Koncentrationslagre A × Lagerbeholdning A =Koncentrationslagre B ×Lagerbeholdning B (1)
Figur 1: Et diagram, der viser trinene i fremstillingen af aptamers. 1 Bestand 1opbevares ved -20 °C med henblik på langtidskonservering. 2 Arbejdskoncentrationer fremstilles i SELEX-buffer og opbevares ikke. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Vedligeholdelse af kræftceller
BEMÆRK: Før undersøgelsen påbegyndes, skal du sørge for, at cellerne er ved deres tidlige passagenumre, viser deres typiske morfologiske egenskaber og er mycoplasmafrie. For at teste aptamerens selektivitet og specificitet kræves cellelinjer, der er høje, moderate og lave / negative ekspressorer af proteinet af interesse.
- Cellerne sås i en T75-kulturkolbe under anvendelse af passende dyrkningsbetingelser. De dyrkes i en 5 % CO2 -befugtet inkubator ved 37 °C.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (komplet medium) brugt. - Når cellerne når ~ 80% sammenløb, skal du føre dem til en ny kolbe, der indeholder frisk komplet medium.
BEMÆRK: Afhængigt af proteinet af interesse og cellelinjen kan 80% sammenløb give en passende cellepopulation til bindingsanalysen. For cellelinjerne i dette eksperiment, MDA-MB-231 og HEK 293T, er 80% sammenløb egnet. På dette stadium skal du fortsætte til afsnit 4, det bindende assay. Kontroller altid udtrykket af det protein, der er af interesse, ved hjælp af mAbs, der er specifikt for det pågældende protein.
4. Bindende analyse
BEMÆRK: Figur 2 opsummerer de trin, der kræves i bindingsanalysen i vedhængende celler.
- I et klasse II biosikkerhedsskab opsamles cellerne i hver kolbe i rør som følger:
- Saml og kassér mediet i kolben, tilsæt 2 ml PBS, spred det over cellerne, og saml og kassér derefter PBS. Gentag dette trin to gange mere for at fjerne alle spor af medier, der kan inaktivere trypsin. Tilsæt 1 ml 0,25% trypsin / EDTA til hver kolbe og inkuber i 5-10 minutter ved 37 oC. Visualiser løsrivelsen af celler under et mikroskop.
- Tilsæt 1 ml komplet medium til cellerne, og pipetter cellerne op og ned for at lave en enkeltcellesuspension. Cellerne pipetteres i et passende rør og centrifugeres ved 200 × g i 5 min.
BEMÆRK: For ikke-klæbende celler opsamles cellerne i et rør, centrifuge (200 × g, 5 min) og fortsæt til trin 4.1.3. - Supernatanten kasseres, og cellerne gensuspenderes i 1 ml frisk medium. Tæl cellerne ved hjælp af trypanblå farvning ved at fortynde et bestemt volumen cellesuspension med trypanblå. Fordel ~ 15 μL af blandingen mellem et hæmocytometer og et dækglas. Tæl cellerne som tidligere beskrevet18 ved hjælp af ligning (2):
(2)
BEMÆRK: Brug det mindst mulige volumen cellesuspension, og noter fortyndingsfaktoren. For eksempel giver blanding af lige store mængder cellesuspension og 0,04% trypanblå en fortyndingsfaktor på 2. Sørg for høj levedygtighed (levende celler / samlede celler × 100) på ~ 90% for de fleste klæbende cellelinjer, før du fortsætter. Døde celler optager ikke specifikt aptamerer og ændrer resultaterne19. Det er muligt at bruge andre celletællingsteknikker, såsom at bruge en celletæller. - Saml det krævede antal celler, og sørg for at have 10 × 104 celler pr. Testprøve. Overvej en ekstra 10% volumen for pipetteringsfejl.
BEMÆRK: Det er vigtigt altid at holde det samme celleantal mellem eksperimenter og replikater. - Inkubere cellerne ved 37 °C i 2 timer for at muliggøre stabilisering af proteinet af interesse på cellemembranen efter enzymatisk løsrivelse.
BEMÆRK: Denne inkubationsperiode kan variere afhængigt af proteinet af interesse.
- I løbet af denne 2 timers inkubation:
- Centrifugens temperatur indstilles til 4 °C. Lad tRNA og lagre af aptamer ved stuetemperatur eller på is tø op. For at beskytte fluorescensreportermolekylet skal du beskytte aptamerrørene mod lys.
BEMÆRK: TRNA's rolle er at blokere nukleinsyrebindingsstederne. - Forbered SELEX-bufferen, BB, WB og BiB (se afsnit 1), og hold dem alle på is eller ved 4 °C. Indstil termocyklistmaskinen på en tom cyklus. Placer en 96-brønds sort plade og flowcytometrirør på is.
BEMÆRK: Indstilling af termocyklisten på en tom cyklus forbereder køle- og varmesystemet og hjælper med at generere mere reproducerbare resultater.
- Centrifugens temperatur indstilles til 4 °C. Lad tRNA og lagre af aptamer ved stuetemperatur eller på is tø op. For at beskytte fluorescensreportermolekylet skal du beskytte aptamerrørene mod lys.
- Efter 2 timers inkubation centrifugeres cellerne ved 500 × g i 5 min. Supernatanten kasseres, og cellerne gensuspenderes i 500 μL BB. Inkubere cellerne ved 4 °C i 30 minutter med intermitterende blanding.
- I løbet af denne 30 minutters inkubation skal du udføre aptamerfoldning som følger:
- Der fyldes op med 2x koncentrationerne af aptamere (se punkt 2), og bland og inkuber derefter aptamerne i termocylindermaskinen i henhold til de krævede foldebetingelser. Til denne EpCAM-aptamer skal du bruge følgende foldebetingelser på 95 °C, 5 min. efterfulgt af 22 °C, 10 min og 37 °C, 15 min.
BEMÆRK: Medtag altid en negativ kontrol (dvs. SELEX-buffer uden aptamers).
- Der fyldes op med 2x koncentrationerne af aptamere (se punkt 2), og bland og inkuber derefter aptamerne i termocylindermaskinen i henhold til de krævede foldebetingelser. Til denne EpCAM-aptamer skal du bruge følgende foldebetingelser på 95 °C, 5 min. efterfulgt af 22 °C, 10 min og 37 °C, 15 min.
- Efter 30 minutters inkubation centrifugeres cellerne (500 × g, 5 min, 4 °C), supernatanten fjernes, der tilsættes 1 ml WB, og cellerne centrifugeres igen (500 × g, 5 min, 4 °C). Supernatanten fjernes, og cellerne genoptages i et passende volumen af BiB.
- Pipetter 50 μL af de resuspenderede celler i hver brønd af en iskold, 96-brønds sort plade. Hold cellerne på is for at hæmme internalisering af proteinet af interesse.
- Pipetter 50 μL af aptamerne på et 50 μL volumen celler, bland og inkuber i mørke ved 4 °C i 30 min. Centrifuger pladen ved 500 × g, 5 min, 4 °C, og fjern forsigtigt supernatanten.
- Pelleten forsigtigt gensuspenderes i WB og centrifugeres ved 500 × g i 5 min. Vasketrinnet (4.7) 2x gentages, og der resuspenderes 100 μL WB til flowcytometrisk analyse.
BEMÆRK: Se figur 3 for et diagram over interaktioner mellem aptamerer og celler.
(2)
Figur 2: Et diagram, der viser trinene i udførelsen af et aptamer-proteinbindende assay. Forkortelser: SELEX = systematisk udvikling af ligander ved EXponential berigelse; BB = blokerende buffer; WB = vaskebuffer; BiB = bindende buffer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Et diagram, der viser de forskellige typer celler og aptamerer, der kræves for at udføre aptamerbindingsanalysen. Forkortelse: EpCAM = epitel cellulært adhæsionsmolekyle. Denne figur blev oprettet ved hjælp af Biorender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Flowcytometri og dataanalyse
BEMÆRK: Før du tænder flowcytometeret, skal du sørge for, at der ikke er "bobler" i membranfilterenhederne til nedlukningsopløsningen, rengøringsopløsningen og kappevæsken (0,9% NaCl). "Blød ud" bobler, hvis der er bobler i kapslerne. Sørg for, at affaldsbeholderen er tom, og beholdere med kappevæske, vand og 1% blegemiddel i ultrarent vand er fulde.
- Tænd for flowcytometeret og derefter computeren.
BEMÆRK: Detaljerne om at køre flowcytometeret, der er forklaret her, er specifikke for maskinen og softwaren, der er demonstreret i videoen (se Materialetabel). Anden software ville kræve passende træning at bruge. - Åbn flowcytometrianalysesoftwaren, log ind på programmet, og kør Fluidics Start op under fanen Cytometer.
- Hvis du vil oprette et nyt eksperiment, skal du klikke på Ny mappe under fanen eksperiment og navngive mappen/eksperimentet korrekt.
- Klik på ny mappe for at fremhæve, og klik derefter på Nyt eksperiment under fanen eksperiment igen, og navngiv eksperimentet korrekt.
- Hvis du vil tilføje den første prøve/prøve, skal du klikke på Ny prøve under fanen eksperiment og navngive denne prøve korrekt (navn på cellelinje/kontrolprøve/eksperimentprøve).
- Hvis du vil tilføje en rørprøve, skal du fremhæve prøven (gruppe) og klikke på Nyt rør under fanen Eksperiment. Tilføj det relevante antal rør og navn.
- Hvis du vil forberede de nødvendige grafer, skal du åbne et nyt regneark under fanen regneark . Når det nye regnearksvindue dukker op, skal du åbne følgende ved hjælp af regnearksskærmen (hold musen over logoet / billederne for at finde navnene):
- Forbered en dot blot-graf over forward scatter (FSC) versus side scatter (SCC) for at vælge populationen af interesse. Definer den første port ved at identificere og vælge populationen af interesse (P1) i et fremadgående og sidespredningstæthedsplot. Ekskluder affaldet, som udgør befolkningen med det laveste fremadgående spredningssignal.
BEMÆRK: FSC-parameteren registrerer celler eller hændelser baseret på deres størrelse, og SCC diskriminerer dem baseret på deres granularitet20. - Forbered en dot blot-graf over FSC-området (FSC-A) versus FSC-højde (FSC-H) for at vælge enkeltcellepopulationen. Definer den anden port ved at udelukke dubletcellepopulationer, da dubletceller påvirker resultaterne og konklusionerne betydeligt. Udeluk dubletter ved hjælp af FSC-H versus FSC-A-tæthedsplot, hvor celler af samme størrelse viser et lignende område og højde. Derfor bliver singlets grupperet diagonalt og adskilt fra dubletter.
BEMÆRK: FSC er nogenlunde proportional med cellestørrelsen. Spændingsimpulserne er defineret som FSC-H, signalets intensitet, FSC-bredde, der afspejler cellestørrelse og signalets varighed, og FSC-A, som er H × W. Dubletter har en dobbelt bredde og arealværdi; derfor er gating for singlets baseret på at detektere disproportioner mellem H, W og A forårsaget af dubletter. - Forbered et histogram af antallet af begivenheder mod fluoroforen af interesse.
- Forbered en dot blot-graf over forward scatter (FSC) versus side scatter (SCC) for at vælge populationen af interesse. Definer den første port ved at identificere og vælge populationen af interesse (P1) i et fremadgående og sidespredningstæthedsplot. Ekskluder affaldet, som udgør befolkningen med det laveste fremadgående spredningssignal.
- Før du starter flowcytometri, skal du sikre dig, at anskaffelsesdashboardet til styring af prøveoptagelsen, inspektøren og cytometeret for at justere spændingsparametre samt regnearket med alle graferne er åbne.
BEMÆRK: Mindst 100 μL af en 10 × 104 cellesuspension i et flowcytometrirør er nødvendig for at udføre analysen. Især i tilfælde af lavere levedygtigheder kan propidiumiodidfarvning udføres for at vælge den levedygtige cellepopulation21,22. - For at køre den første prøve skal du på venstre side af skærmen sørge for, at pilen, der peger på røret, er grøn. Hvis denne pil ikke er grøn, skal du klikke på pilen for at gøre den grøn.
- Ved hjælp af en pipette overføres hver prøve fra den sorte plade med 96 brønde til et flowcytometrirør. Kør den ubehandlede, ufarvede kontrolprøve ved lav hastighed.
- På anskaffelsesdashboardet skal du vælge et passende antal hændelser, der skal registreres (30.000), ændre flowhastigheden til lav og klikke på Hent data.
- Juster spændingen for FSC- og SCC-parametrene. Sørg for, at cellepopulationen er centraliseret i prikplottet, og at ingen celler rører ved nogen af grafens akser for at undgå at miste cellerne af interesse.
- Forøg anskaffelseshastigheden til medium eller høj for at analysere prøverne hurtigere, men ikke overstige mere end 200 hændelser / s. Klik derefter på Optag data.
- Udfør gating for P1 (figur 4A) og enkeltcellepopulationen (figur 4B). Konstruer histogrammet af hændelser mod det anvendte fluorkrom, og vælg P1 baseret på dataene (allophycocyanin (APC) i dette tilfælde) (figur 4C).
- Når du har justeret spændingen, gating og registreret dataene, skal du tage prøven ud og klikke på Next Tube.
- Indsæt det næste eksempel, og gentag registreringsdata for alle kontrol- og testprøver (figur 3).
- Når alle data er indsamlet, vaskes flowcytometeret ved at køre tre rør med 50% blegemiddel, FACS-skylning og ultrarent vand, hver i 5 minutter ved en høj strømningshastighed.
- Klik derefter på Fluidics Luk ned fra rullemenuen Cytometer.
- Før du lukker softwaren og slukker for maskinen og computeren, skal du eksportere resultaterne som .fcs-filer til et USB-drev for at overføre og analysere dem på følgende måde:
- I analysesoftwaren skal du trykke på knappen NY for at oprette et nyt dokument og et nyt vindue til at håndtere analysen. Træk eksempelfilerne til det nye vindue.
- Dobbeltklik for at åbne den ufarvede prøve. Vælg P1-populationen, dobbeltklik på P1-populationen for at oprette en FSC-H versus FSC-A-graf, og gate enkeltcellepopulationen.
- Dobbeltklik på de lukkede enkeltceller for at oprette et histogram af begivenheder mod det anvendte fluorkrom.
- I det oprindelige vindue skal du vælge P1 og enkelte celler og trække dem til Alle prøver, så alle prøver nu indeholder den samme gating.
- Klik på knappen Layouteditor for at åbne vinduet Layouts . Træk to prøver (kontrolelement og test) over hinanden for at oprette et overlejringshistogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et vigtigt aspekt af ny lægemiddelopdagelse og -udvikling er at sikre selektiviteten og specificiteten af lægemiddelkandidaten. Dette betyder, at lægemiddelkandidaten skal være i stand til at skelne mellem forskellige celler og kun påvirke cellepopulationen af interesse (selektivitet). Selektivitet studeres ved hjælp af cellelinjer, der adskiller sig med hensyn til ekspression af proteinet af interesse. I denne undersøgelse blev MDA-MB-231 og HEK 293T cellelinjer valgt som EpCAM-positive og -negative celler. Specificitet er en anden determinant, der viser, at proteinet af interesse kun reagerer på en enkelt lægemiddelkandidat. Her blev det ved hjælp af en EpCAM ikke-bindende aptamer, TENN, vist, at kun TEPP var knyttet til EpCAM. I EpCAM-positive celler (MDA-MB-231) viser overlejring af histogrammerne, der repræsenterer celler behandlet med TEPP og TENN, at de TEPP-behandlede celler forskydes til højre sammenlignet med de TENN-behandlede celler. Dette viser bindingen af aptameren, TEPP, til proteinet af interesse, EpCAM (figur 4D). I HEK 293T-celler med negativ kontrol afspejler overlejring af histogrammer af TEPP og TENN ikke noget skift (figur 4E). Dette betyder, at i EpCAM-ekspressive celler blev TEPP som EpCAM-aptamer bundet til dets receptor, og desuden blev der ikke observeret nogen binding i EpCAM-negative celler. Disse resultater bekræfter selektiviteten og specificiteten af den udviklede aptamer.
Figur 4: Gating og histogrammer, der viser bindingen af cellerne til aptameren. (A) Udvælgelse af populationen af celler, (B) de enkelte celler og (C) histogrammet af cellerne fastgjort til aptameren (200 nM). Bindingen af EpCAM aptamer (TEPP) versus en ikke-EpCAM-bindende aptamer (TENN) i (D) EpCAM+ MDA-MB-231-celler og (E) EpCAM- HEK 293T-celler sammenlignes. Forkortelser: EpCAM = epitel cellulært adhæsionsmolekyle; FSC-A = fremad scatter-peak område; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-H = fremadgående spredningshøjde; APC = allophycocyanin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den største udfordring med at udvikle nye aptamers er manglen på standardretningslinjer, der gælder for forskellige trin i denne proces. McKeague et al. har for nylig demonstreret nogle af de tilknyttede udfordringer, som fører til uklare præsentationer af data i publikationer og manglende replikering af forskningen. De foreslog grundlæggende retningslinjer, der var nødvendige for overvejelse ved karakterisering af aptamers19. Et aptamer bindende assay er et kritisk skridt i screening og / eller karakterisering af aptamers23, som er meget udbredt af forskere på området. Da der ikke findes nogen enkelt retningslinje til visning af den trinvise protokol, demonstreres en flowcytometrimetode, som almindeligvis bruges til at studere aptamer-proteinbindingen, i den ledsagende videoprotokol.
Der er flere metoder, der måler interaktionen mellem aptameren og dens mål. Flowcytometri er en af disse metoder. Andre eksempler omfatter fluorescenspolarisering, overfladeplasmonresonans, kapillær elektroforese og isotermisk titreringskalorimetri24. Valg af den rigtige metode afhænger af anvendelsen af aptameren. Det er dog vigtigt at vide, at hver metode har sine begrænsninger, og at anvendelsen af flere assays er mere gavnlig for karakteriseringen af små molekyleaptamerer24. Metoden beskrevet her har flere fordele. Det er en af de mest pålidelige, præcise og nøjagtige metoder og er også hurtig og omkostningseffektiv. Den flowcytometriske analyse af aptamerbinding kan anvendes i forskellige trin i aptamerudvikling, herunder kandidatscreening, afkortning og optimering, karakterisering og validering.
Med fluorescensmærkning er der valg om enten at mærke eller bruge den iboende fluorescens af målet eller mærke aptameren24. Efter forfatternes erfaring er det pålideligt og let at konfigurere ved hjælp af mærkede aptamers. Aptamers kan mærkes med en fluorophore i enhver ende (3' eller 5')25; Slutningen med mindre guanin er dog mere gunstig, da guanin kan slukke fluorescensen og dens påvisning26. En ulempe ved denne metode er, at aptameren skal mærkes til en fluorofor. Selvom denne metode afspejler aptamerens binding til det specifikke protein, viser den ikke placeringen af interaktionsstedet. Derfor kan yderligere undersøgelser, såsom fluorescensmikroskopi, være nødvendige for at bekræfte aptamer-proteininteraktionsstedet25.
Der er nogle kritiske noter, der skal overvejes, mens du udfører denne analyse. Det er vigtigt at overveje, at hver aptamer har specifikke krav til håndtering og foldning. Dette omfatter valg af rekonstitutions- og fortyndingsbuffere og foldebetingelserne. Rekonstitution af frysetørrede aptamerer forekommer i renset sterilt pyrogen- og RNase-frit ultrarent vand. Dette er for at minimere koncentrationen af ioner omkring nukleotiderne. Ionkoncentration påvirker stærkt dannelsen af 2D-strukturer af aptamerer og deres affinitet og stabilitet. Med henblik på yderligere rekonstitution af aptamerstammen bør der derfor drages omsorg for korrekt fremstilling af andre buffere og metalkationiske opløsninger, såsom MgCl225,27. Den optimale koncentration af metalkationisk opløsning beskytter aptamerens negative ladning endnu, hæmmer ikke aptamerens interaktion med dens mål.
Da aptameren desuden har potentiale for en ikke-specifik, off-target binding, spiller anvendelsen af blokeringsbuffer en afgørende rolle i det bindende assay. Ud over den negativt ladede BSA, som almindeligvis anvendes til antistoffer, kræves også laksesæd-DNA eller tRNA her. Denne blanding blokerer de positivt ladede proteiner og nukleinsyrebindingssteder. Dette blokeringstrin er specifikt vigtigt for selektiviteten og specificiteten af aptamere over for kræftceller på grund af deres negative ladning sammenlignet med neutrale og positivt ladede normale celler28. Desuden er 3D-foldning af aptamere afhængig af andre faktorer såsom temperatur. Betydningen af forhold, der påvirker 3D-dannelsen af aptameren, herunder valget af rør og varigheden af PCR-faser, er blevet gennemgået25. Desuden skal inkubationstiden for aptameren med målet optimeres for hver specifik aptamer. Inkubationstemperaturen er også meget vigtig. Vedligeholdelse af en temperatur på 4 °C er især kritisk for celleoverfladeproteiner, der let kan internaliseres, såsom EpCAM25.
Den anden vigtige faktor i dette assay er anvendelsen af ordentlig kontrol. Kræftceller, der enten udtrykker eller ikke udtrykker målproteinet, bør bruges til at evaluere aptamerens selektivitet. I hvert eksperiment kræves der ud over den relevante aptamer en negativ kontrolaptamer (en tilfældig sekvens eller en krypteret sekvens) for at vise aptamerens specificitet. Ideelt set bør denne kontrol have en lignende længde af nukleotider og gennemgå lignende foldning som aptameren. I dette eksperiment blev der anvendt en negativ kontrol (TENN), en aptamer med en lignende struktur som TEPP, der viste sig at have en lav bindingsaffinitet med EpCAM,10.
Protokollen, der præsenteres her, er et kvalitativt assay og kan yderligere anvendes til kvantitativ vurdering af bindende affinitet og bestemmelse af dissociationskonstanten (Kd) 29,30,31. Det er dog vigtigt at vise reproducerbarheden af resultaterne ved hjælp af tekniske og biologiske replikater. For at opnå dette er det meget vigtigt at overveje større determinanter for korrekt at udføre denne analyse. Dette kan omfatte, men er ikke begrænset til, anvendelse af et lavt antal mycoplasmafrie celler, der dyrkes korrekt under deres optimale forhold, ved hjælp af et konstant antal celler, der skal eksponeres med aptameren i hver replikat, anvendelse af korrekte temperatur- og foldebetingelser, opretholdelse af lignende eksperimentelle betingelser for både aptameren og kontrollen, opretholdelse af minimal eksponering af aptamerne for miljømæssigt lys ved hjælp af optimeret aptamercelleeksponeringstid og temperatur, opretholdelse af en temperatur på 4 ° C for cellerne, hvilket inkluderer forkøling af centrifugen, 96-brøndspladen og flowcytometrirørene og nøjagtig forberedelse af bufferne med en ionkoncentration så tæt på de påståede koncentrationer som muligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Institute for Mental and Physical Health and Clinical Translation (IMPACT) SEED-finansiering, "Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship" -programmet ved Deakin University og "Australian Government Research Training Program Scholarship".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
| Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
| T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
References
- Cancer. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022).
- Liu, J. K. H. The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations. Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).
- Nakhjavani, M., Shigdar, S. Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer. Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).
- Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery. Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).
- Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy. Theranostics. 5 (4), 322 (2015).
- Feng, X., et al. The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy. Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).
- Huang, J., et al.
- Ashrafuzzaman, M. Aptamers as both drugs and drug-carriers. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options. Drug Discovery Today. , (2022).
- Macdonald, J., et al. Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases. ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).
- Macdonald, J., et al. Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells. Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).
- Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof. Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).
- Rahimizadeh, K., et al. Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures. Molecules. 22 (12), 2070 (2017).
- Chen, M., et al. Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).
- Shigdar, S., et al. The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer. PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).
- Ni, J., et al. Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression. Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).
- Ni, J., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).
- McKeague, M., et al. Tissue Culture. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press. 395-397 (1973).
- McKeague, M., et al. The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection. Aptamers. 6, 10-18 (2022).
- Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4. Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).
- McKinnon, K. M.
- Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
- Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications. Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).
- McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
- Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays. Aptamers. 23, (2019).
- Mao, H., et al. The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method. Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).
- McKeague, M., et al. Analysis of in vitro aptamer selection parameters. Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).
- Chen, B., et al. Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes. Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).
- Shigdar, S., et al. RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133. Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).
- Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method. Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).
- Yu, X. -X., et al. Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells. Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).
