Summary
В этой статье описывается использование нового быстрого оптического тепловизора для макроскопической фотолюминесцентной визуализации образцов с длительным распадом. Описаны процедуры интеграции, получения и анализа изображений, а также подготовка и характеристика материалов датчиков для визуализации и применения тепловизора при изучении биологических образцов.
Abstract
В этой статье представлен новый фотолюминесцентный пожизненный тепловизор, предназначенный для картирования концентрации молекулярного кислорода (O 2) в различных фосфоресцирующих образцах, начиная от твердотельных покрытий, чувствительных к O 2 и заканчивая образцами живых тканей животных, окрашенными растворимыми зондами, чувствительными к O2. В частности, был использован зонд ближнего инфракрасного диапазона NanO2-IR на основе наночастиц, который возбуждается светодиодом (LED) с длиной волны 625 нм и излучает на длине волны 760 нм. Система обработки изображений основана на камере Timepix3 (Tpx3Cam) и оптико-механическом адаптере, в котором также находится усилитель изображения. Микроскопия с фосфоресценцией O2 в течение всего срока службы (PLIM) обычно требуется для различных исследований, но современные платформы имеют ограничения в своей точности, общей гибкости и удобстве использования.
Представленная здесь система представляет собой быстрый и высокочувствительный тепловизор, который построен на интегрированном оптическом датчике и чип-модуле считывания Tpx3Cam. Показано, что он производит высокоинтенсивные сигналы фосфоресценции и стабильные значения времени жизни из окрашенных на поверхности образцов кишечной ткани или внутрипросветно окрашенных фрагментов толстой кишки и позволяет детально картировать уровни O2 в ткани примерно за 20 с или менее. Представлены также первоначальные эксперименты по визуализации гипоксии в трансплантированных опухолях у животных, находящихся в бессознательном состоянии. Мы также описываем, как тепловизор может быть перенастроен для использования с чувствительными к O2 материалами на основе красителей Pt-порфирина, используя светодиод 390 нм для возбуждения и полосовой фильтр 650 нм для излучения. В целом, было обнаружено, что тепловизор PLIM производит точные количественные измерения значений срока службы используемых зондов и соответствующие двумерные карты концентрацииO2 . Он также полезен для метаболической визуализации моделей тканей ex vivo и живых животных.
Introduction
O 2 является одним из ключевых параметров окружающей среды для живых систем, и знание распределения O 2 и его динамики важно для многих биологических исследований 1,2,3. Оценка оксигенации тканей с помощью фосфоресцирующих зондов 4,5,6,7,8 и PLIM 9,10,11,12,13 набирает популярность в биологических и медицинских исследованиях 3,9,14,15,16, 17,18,19. Это связано с тем, что PLIM, в отличие от измерений интенсивности флуоресценции или фосфоресценции, не зависит от внешних факторов, таких как концентрация зонда, фотообесцвечивание, интенсивность возбуждения, оптическое выравнивание, рассеяние и автофлуоресценция.
Однако современные платформы O2 PLIM ограничены своей чувствительностью, скоростью получения изображений, точностью и общим удобством использования. Коррелированный во времени подсчет одиночных фотонов (TCSPC) в сочетании с процедурой растрового сканирования часто используется в устройствах PLIM и флуоресцентной микроскопии с пожизненным отображением (FLIM)20,21,22. Однако, поскольку PLIM требует длительного времени выдержки пикселя (в миллисекундном диапазоне), время получения изображения намного больше, чем требуется для приложений FLIM20,22,23. Другие методы, такие как закрытые ПЗС/КМОП-камеры, не имеют однофотонной чувствительности и имеют низкую частоту кадров20,24,25,26. Более того, существующие PLIM-системы в основном используются в микроскопическом формате, в то время как макроскопические системы менее распространены27.
Макросканер28 PLIM на базе TCSPC был создан для преодоления многих из этих ограничений. Конструкция тепловизора была значительно облегчена за счет использования нового оптико-механического адаптера Cricket, который имеет следующее: i) два адаптера с байонетом C, которые обеспечивают легкое соединение модуля камеры с тыльной стороны и объектива с передней стороны; ii) внутренний корпус для ЭОП и розетка для последнего на внешней стороне сверчка; iii) внутреннее пространство за передним адаптером C-mount, где перед усилителем может быть размещен стандартный эмиссионный фильтр диаметром 25 мм; и iv) встроенная светоколлиматорная оптика с кольцевыми регуляторами, которые обеспечивают оптическое выравнивание/фокусировку между объективом и камерой для получения четких изображений на чипе камеры.
В собранном тепловизоре модуль камеры соединен с задней стороной адаптера Cricket, в котором также находится усилитель изображения, состоящий из фотокатода, за которым следуют микроканальная пластина (MCP), усилитель и быстрый сцинтиллятор, люминофор P47. Внутри Cricket установлен эмиссионный фильтр с длиной волны 760 нм ± 50 нм, а объектив NMV-50M11'' прикреплен к переднему адаптеру C-mount. Наконец, объектив и камера оптически выровнены с помощью кольцевых регуляторов.
Роль усилителя заключается в обнаружении входящих фотонов и преобразовании их в быстрые вспышки света на чипе камеры, которые регистрируются и используются для генерации затуханий излучения и изображений времени жизни. Модуль камеры включает в себя усовершенствованную матрицу оптических датчиков на основе TCSPC (256 пикселей x 256 пикселей) и чип считывания нового поколения 29,30,31,32,33, которые позволяют одновременно записывать время прибытия (TOA) и пороговое время (TOT) фотонных всплесков на каждом пикселе микросхемы изображения с временным разрешением 1,6 нс и скоростью считывания 80 Мпиксель/с.
В такой конфигурации камера с усилителем имеет однофотонную чувствительность. Он управляется данными и основан на системе34 быстрого считывания детектора пикселей (SPIDR). Пространственное разрешение тепловизора ранее характеризовалось планарными фосфоресцирующими датчиками O2 и маской разрешающей пластины. Функция отклика прибора (IRF) измерялась путем визуализации планарного флуоресцентного датчика при тех же настройках, которые использовались для всех других измерений. Время жизни красителя около 2,6 нс было достаточно коротким, чтобы его можно было использовать для измерения IRF в режиме PLIM. Тепловизор может отображать объекты размером до 18 мм x 18 мм с пространственным и временным разрешением 39,4 мкм и 30,6 нс (полная ширина при полумаксимуме) соответственно28.
Следующие протоколы описывают сборку макротепловизора и его последующее использование для картирования концентрации O 2 в биологических образцах, окрашенных с помощью ранее охарактеризованного зонда O2 ближнего инфракрасного диапазона NanO2-IR35. Зонд представляет собой яркий, фотостойкий, проницаемый для клеток датчик O2 на основе красителя бензопорфирина (PtBP) платины (II). Он возбудим при 625 нм, излучает при 760 нм и обеспечивает надежный оптический ответ на O 2 в физиологическом диапазоне (0% -21% или 0-210 мкМ O2). Также продемонстрировано, что тепловизор характеризует различные сенсорные материалы на основе Pt(II)-порфириновых красителей. В целом, тепловизор компактный и гибкий, похожий на обычную фотографическую камеру. В текущей конфигурации тепловизор подходит для различных широкопольных PLIM-приложений. Замена светодиода быстрым лазерным источником еще больше улучшит производительность тепловизора и потенциально может позволить наносекундные приложения FLIM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с животными проводились в соответствии с разрешениями, выданными Управлением по регулированию товаров медицинского назначения (HPRA, Ирландия) в соответствии с Директивой Совета Европейских сообществ (2010/63/EU) и были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Университетского колледжа Корка.
1. Пробоподготовка
- Окрашивание зондом живых образцов тканей ex vivo
- Для применения ex vivo используйте свежевыделенные образцы тканей от 4-недельной самки мышей Balb/c.
- В день эксперимента усыпляют мышь путем обезглавливания и быстро рассекают фрагменты толстой кишки (толстой кишки) размером примерно 10 мм. Немедленно промойте их буфером PBS, поместите в среду DMEM с добавлением 10 мМ буфера Hepes (pH 7,2) и инкубируйте при 37 ° C36.
- Для поверхностного окрашивания серозной стороны кишечника перенесите образцы живой ткани в мини-чашку, нанесите 2 мл полного DMEM, содержащего 1 мг / мл зонда NanO2-IR, чтобы покрыть образцы тканей, и инкубируйте в течение 30 минут при 37 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки в посмертной ткани остаются живыми в течение многих часов в культуре. NaNO2-IR проявляет незначительную цитотоксичность, поэтому все эксперименты были завершены в течение 4 ч после выделения ткани. - Для глубокого внутрипросветного окрашивания ex vivo перенесите кусочки кишечника в сухую чашку Петри и удалите излишки DMEM с помощью фильтровальной бумаги.
- Введите 1 мкл DMEM, содержащего 1 мг / мл NanO2-IR 35, в просвет с помощью шприца Гамильтона и инкубируйте образцы в течение15 мин или до 4 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: NaNO2-IR проявляет незначительные долгосрочные цитотоксические эффекты; Поэтому все эксперименты должны быть завершены в течение 4 ч после выделения тканей.
- Препарирование окрашенной опухолевой ткани у живых животных
- Для применения in vivo предварительно окрашивают клетки CT26 в течение 18 ч в среде, не содержащей сыворотки, содержащей зонд NaNO2-IR в дозе 0,05 мг/мл.
- Возьмите мышь, побрейте область инъекции в правом боку и введите шприцем 200 мкл смеси из 1 × 105 неокрашенных клеток и 1 × 105 клеток, предварительно окрашенных NanO2-IR.
- Позволяют опухолям расти у мышей, периодически контролируя размер опухоли штангенциркулем и вес животного37. Животные с привитыми опухолями становятся готовыми к визуализации на седьмой день роста опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем опухоли был рассчитан с использованием уравнения (1):
V = (Д × Вт 2)/2 (1)
где L — диаметр опухоли, а W is — диаметр, перпендикулярный диаметру L. - Принесите в жертву животных при вывихе шейки матки непосредственно перед визуализацией.
2. Настройка визуализации PLIM
- Возьмите адаптер Cricket и снимите его адаптер C-mount с задней стороны, чтобы получить доступ к корпусу усилителя внутри. Вставьте усилитель изображения MCP-125 в этот отсек и вставьте адаптер C-mount обратно.
- Снимите адаптер C-mount на передней стороне C-mount, вставьте эмиссионный фильтр 760 нм ± 50 нм и закрепите его, вернув крепление C-mount.
- Подключите модуль камеры Tpx3Cam к задней стороне модуля Cricket через адаптер C-mount
- Подключите объектив к передней стороне модуля Cricket через адаптер C-mount.
- Установите всю камеру в сборе поверх оптического черного ящика лицевой стороной вниз к столику, на котором будут изображены образцы (рис. 1).
- Установите сверхяркий светодиод с длиной волны 624 нм на стойку, подключенную к макетной плате внутри черного ящика.
- Подключите светодиод к источнику питания и генератору импульсов. Включите светодиод и сфокусируйте его, чтобы обеспечить эффективное и равномерное возбуждение изображенных образцов.
- Подключите камеру к другому генератору импульсов и синхронизируйте импульсы, посылаемые на камеру, и светодиод38.
- С помощью специального кабеля и розетки на блоке Cricket подключите усилитель к стандартному источнику питания и установите усиление на 2.7 В.
- Используя возможности фокусировки объектива и адаптера Cricket, сфокусируйте оптику камеры на предмете образца, чтобы получить четкие изображения образцов с хорошей контрастностью и яркостью.
- Для использования тепловизора с красителями Pt-порфирином замените светодиод с длиной волны 625 нм на светодиод с длиной волны 390 нм для возбуждения, а фильтр с длиной волны 760 нм ± 50 нм замените фильтр с длиной волны 650 нм ± 50 нм в модуле Cricket.
3. Получение изображения
- Поместите образец перед объективом камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте регулируемый столик x-y-z в качестве держателя образца, чтобы отрегулировать положение образца для хорошей фокусировки. - Выключите весь свет в комнате.
- Включите программное обеспечение Sophy для настройки рабочих параметров, таких как фокусировка и выравнивание образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение Sophy поставляется вместе с камерой для настройки параметров изображения и записи данных. Убедитесь, что программное обеспечение подключено к камере, проверив код камеры. Однако для сбора данных мы использовали другую программу. - В разделе «Модули» выберите бесконечные кадры и установите режим работы пикселов на превышение порогового значения.
- В разделе "Модули" перейдите в раздел "Предварительный просмотр" и выберите "Активный модуль". Откроется окно Medpix/Timpix Frames.
- В этом окне измените цветовую шкалу и поверните изображение в нужную ориентацию.
- Включите усилитель и начните запись.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте экран записи программного обеспечения Sophy для визуального подтверждения выравнивания и фокусировки образца и оптимизации параметров возбуждения светодиода для записи. - Остановите запись и закройте программное обеспечение Sophy.
- Перейдите в терминал и используйте специально разработанное программное обеспечение для получения необработанных данных в двоичном формате и их последующей обработки (https://github.com/svihra/TimePix3).
- В терминале выполните следующие команды для записи данных:
Cd Document/SPIDR/trunk/Release/
ls
./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Имя файла} - t {время получения}
ПРИМЕЧАНИЕ: После ввода «ls» проверьте список файлов в текущем каталоге; подтвердите, что Tpx3daq просматривается. - Подождите, пока все кадры будут записаны.
- Для обработки данных выполните в терминале следующие команды:
cd Документы/Обработка данных/Timepix3/Timepix3/
корень
. L dataprocess.cpp++
.x DRGUI. C - Дождитесь открытия окна RRGui . Выберите все переменные слева и « Все данные», « Один файл» и « Центроид » справа.
- Выберите файл для обработки и запустите редуктор данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все обработанные файлы будут отображаться в той же папке, что и необработанный файл.
- В терминале выполните следующие команды для записи данных:
4. Анализ данных
- Проанализируйте обработанные данные с помощью специальной программы, написанной на языке C, которая запишет данные в файл изображения .ics (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).
- Откройте файлы изображений .ics с помощью свободно доступного программного обеспечения Time Resolved Imaging (см. Таблицу материалов). Используйте две экспоненциальные функции, чтобы соответствовать распадам фосфоресценции.
- Откройте файлы изображений .ics с помощью доступного программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов).
- Используя таблицы подстановки, генерируйте фосфоресцентные изображения и кодируйте их в псевдоцветовой шкале (например, синий цвет для коротких сроков службы и красный для длительных сроков службы). Используйте функцию «Измерение» для расчета средних значений времени жизни для всего изображения или отдельных областей интереса (ROI).
- Преобразуйте значения срока службы в концентрацию кислорода с помощью уравнения, полученного в результате подгонки калибровки O2 зонда36.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой работы использовалось уравнение (2):
O 2 [мкМ] = −86,16 + 770,35 × e−0,049 × LT (2)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для визуализации ex vivo фрагменты кишечных тканей окрашивали путем местного применения зонда NanO2-IR на серозной стороне ткани. Для более глубокого окрашивания в просвет вводили 1 мкл зонда. В последнем случае стенка кишечника толщиной 0,2-0,25 мм экранировала зонд от камеры. Два процесса окрашивания показаны на рисунке 2А.
Результирующие изображения интенсивности и PLIM представлены на рисунке 2B-G. Цвета четко отражают разницу в значениях жизни и, следовательно, разницу в оксигенации серозной и слизистой сторон ткани. Рисунки 2C и 2D относятся к аналогичным наборам тканей, которые были окрашены местно (рис. 2C) и внутрипросветно (рис. 2D). Как и ожидалось, ткани показали схожие паттерны PLIM. Однако внутрипросветное окрашивание слизистой оболочки ткани (рис. 2D) показало более высокие значения продолжительности жизни, отражающие более низкую оксигенацию внутренней поверхности кишечника, по сравнению с местным окрашиванием серозной стороны (рис. 2C), которое показало более низкие сроки жизни. Это отражает более высокую оксигенацию наружной поверхности кишечника.
Для изучения стабильности сигналов времени жизни и дыхательной активности кишечника был проведен покадровый PLIM-анализ внутрипросветно окрашенных образцов в течение 2 ч (рис. 2D-G). Увеличение значений продолжительности жизни наблюдалось между 15 мин (54,4 мкс ± 0,9 мкс) и 2 ч (61,1 мкс ± 0,8 мкс) инкубации, что отражает снижение уровняO2 в просветной части кишечника. Кроме того, низкие уровни O 2 после2 часов инкубации доказывают, что тканевое дыхание продолжалось в течение всего периода вскрытия, подготовки, окрашивания, инкубации и визуализации. Кроме того, изменение формы просвета, наблюдаемое на рисунке 2D-G, можно объяснить распределением зонда, введенного в просвет, что означает, что сигнал LT отражает область, в которой расположен зонд.
Чтобы оценить будущую производительность тепловизора in vivo, было проведено первоначальное исследование визуализации гипоксии в трансплантированных подкожных опухолях, выращенных у мышей, сразу после жертвоприношения (рис. 3). В этом случае мышам Balb/c вводили подкожно в правый бок 200 мкл смеси клеток CT26, которые были неокрашены или окрашены зондом NanO2-IR в дозе 0,05 мг/мл. PLIM проводили на седьмой день роста опухоли, а мышей приносили в жертву непосредственно перед визуализацией (т.е. посмертно). Изображения опухолевых участков у мышей на седьмой день роста показаны на рисунке 3A,B.
Изображения интенсивности (слева) и PLIM (справа) для опухолевых участков у мышей на седьмой день роста опухоли (рис. 3B) демонстрируют производительность и чувствительность как тепловизора, так и зонда в таких экспериментах (более подробные статистические данные не показаны). Животные были изображены в течение 20 секунд каждый. Левые бока мышей были выбриты и изображены как заготовка. Они не производили сигналов PLIM. Напротив, области с опухолью и зондом производили стабильные пожизненные сигналы ~ 50 мкс. Цель этого эксперимента состояла в том, чтобы оценить удобство использования тепловизора для исследований in vivo с живыми животными и моделями заболеваний человека. Несмотря на то, что эта часть показала предварительные качественные результаты, в настоящее время готовится соответствующий документ, в котором дается более тщательная количественная оценка.
Далее тепловизор также был продемонстрирован в PLIM-визуализации сенсорных материалов на основе Pt(II)-порфириновых красителей. Химическая структура красителя Pt-октаэтилпорфина (PtOEP) и технические детали получения соответствующих сенсорных материалов описаны в другом месте 6,39. Фосфоресцирующие твердотельные покрытия датчиков на основе полистирола PtOEP, нанесенные на прозрачную полиэфирную пленку (майлар) в виде небольших пятен, визуализировали путем погружения пленки в буфер PBS (насыщенное кислородом состояние) или в PBS, содержащий глюкозу и глюкозооксидазу, что обеспечивает полностью дезоксигенированное состояние. Сигналы времени жизни, полученные в оксигенированных (25,6 мкс ± 0,5 мкс) и дезоксигенированных условиях (65,7 мкс ± 1,5 мкс), соответствовали результатам, о которых сообщалось ранее6. Изображения интенсивности и PLIM оксигенированных и дезоксигенированных датчиков приведены на рисунке 4A, B.
Рисунок 1: Экспериментальная установка тепловизора38. Перепечатано с разрешения Sen et al.38. Авторские права: Оптическое общество. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: O 2 PLIM местно и внутрипросветно окрашенных образцов кишечника мыши. (A) Иллюстрация двух методов окрашивания с использованием (B) интенсивности фосфоресценции и (C) PLIM-изображений кишечника, местно окрашенных с помощью зонда NanO2-IR. (Д-Г) Таймлапс PLIM внутрипросветно окрашенной кишки через 15 мин, 30 мин, 1 ч и 2 ч после окрашивания. Изображения PLIM представлены в псевдоцветовой шкале: синий цвет соответствует более низкому времени жизни, а красный цвет соответствует более высоким значениям времени жизни. Масштабные линейки = 5 мм. Аббревиатура: PLIM = люминесцентная микроскопия с визуализацией в течение всего срока службы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: O2 PLIM трансплантированных опухолей в правых боках мышей . (A) Графическая иллюстрация развития опухоли у живых животных. Интенсивность фосфоресценции (слева) и PLIM (справа) изображения опухолевых участков на (B) седьмой день роста опухоли. Изображение PLIM представлено в псевдоцветовой шкале: синий цвет соответствует меньшему времени жизни, а красный цвет соответствует более высоким значениям времени жизни. Масштабная линейка = 5 мм. Аббревиатура: PLIM = люминесцентная микроскопия с визуализацией в течение всего срока службы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Интенсивность фосфоресценции пятна датчика на основе PtOEP. Интенсивность фосфоресценции (слева) и PLIM (справа) пятно датчика PtOEP в (A) оксигенированном и (B) дезоксигенированном состояниях. Изображения PLIM представлены в псевдоцветовой шкале: синий соответствует более низкому времени жизни, а красный цвет соответствует более высоким значениям времени жизни. Сокращения: PLIM = люминесцентная микроскопия с визуализацией в течение всего срока службы; PtOEP = октаэтилпорфирин платины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Приведенные выше протоколы дают подробное описание сборки нового тепловизора и его работы в микросекундном режиме FLIM/PLIM. Камера нового поколения Tpx3Cam на базе TCSPC в сочетании с оптико-механическим адаптером Cricket с усилителем изображения, эмиссионным фильтром и макрообъективом создает стабильный, компактный и гибкий оптический модуль, которым легко управлять. Было показано, что тепловизор хорошо справляется с рядом различных образцов и аналитических задач, которые включали характеристику фосфоресцирующих материалов и визуализацию живых тканей O2 . В экспериментах по визуализации использовались ближний инфракрасный проницаемый растворимый зонд NanO2-IR на основе Pt(II)-бензопорфирина и твердотельные датчики на основе Pt(II)-порфирина с красным излучением. Эти датчики успешно используются для обнаружения погашенной фосфоресценцииO2 из-за их большого сдвига Стокса, длительного срока службы излучения, высокой чувствительности, быстрого отклика и хорошей фотохимической стабильности.
Эти различные чувствительные к O2 зонды и твердотельные покрытия при испытании на макросканере дали результаты, которые согласуются с ранее опубликованными данными40. Материалы продемонстрировали хорошую однородность, контрастность и реакцию на изменение условий окружающей среды, особенно с точки зрения температуры и состояния оксигенации. Сравнение этих результатов с результатами, полученными на конфокальном микроскопе TCSPC-PLIM, показывает, что новый тепловизор точен, имеет более качественные показания срока службы и получает изображения PLIM с высокой скоростью и чувствительностью28,38,40.
Тепловизор также продемонстрировал многообещающую производительность с фосфоресцирующими окрашенными биологическими образцами разных типов. Таким образом, были получены подробные карты концентрацииО2 для образцов, содержащих суспензии окрашенных дыхательных клеток, живые посмертные ткани животных, целые органы и пересаженные опухоли. Тепловизор обеспечил измерения значений времени жизни с поверхности и даже на глубине до 0,5 мм внутри ткани28,36,38.
Поскольку значения времени жизни фосфоресценции сильно зависят от температуры41, необходимо осуществлять строгий контроль температуры визуализируемых образцов, например, с помощью нагреваемого столика для образцов и/или камеры инкубатора. При использовании УФ-возбуждения важно тщательно выбирать держатели образцов, так как многие материалы обладают автофлуоресценцией в этой спектральной области, что влияет на истинную ценность срока службы образца. Все изображения PLIM в этом исследовании выполнялись при мощности светодиода 4 В и ширине импульса 50 нс при времени интегрирования 20 с; Однако эти параметры могут быть скорректированы по мере необходимости. Приблизительно 104 500 кадров записываются в течение 20 секунд времени получения изображения. Наконец, важно выполнять измерения в темной камере, чтобы избежать помех окружающего света.
Таким образом, тепловизор PLIM может выполнять быстрые количественные измерения срока службы макроскопических объектов значительного размера. Хотя лазерное сканирование PLIM-TCSPS возможно, оно было бы слишком медленным из-за длительного времени выдержки, необходимого для чувствительных к кислороду красителей. Этот тепловизор, однако, быстрый и может записывать все пиксели одновременно. Кроме того, на измерения, основанные на интенсивности, могут влиять концентрация флуоресцентного/фосфоресцирующего красителя, нестабильная интенсивность светодиода или лазера, фотообесцвечивание, выравнивание оптических компонентов и рассеяние от образцов. В отличие от этого, макросканер на основе TCSPC практически не зависит от этих факторов. Таким образом, он может выполнять точные измерения O2 без калибровки. К недостаткам камеры можно отнести ее относительно сложную обработку данных и большие размеры данных (~2 Гб).
В будущем тепловизор также может быть использован не только для картирования концентраций O2 , но и других химических и биохимических параметров испытуемых образцов, таких как рН и динамика глюкозы, с использованием соответствующих зондов или датчиков. Это делает его полезным инструментом для физиологических исследований с различными моделями тканей и заболеваний. Тепловизор также может быть модернизирован для работы в наносекундном режиме FLIM. Однако для этого требуется замена современных светодиодов более быстрым источником возбуждения (например, ps-лазером). Также принципиально возможна работа системы в режиме двойного PLIM/FLIM.
В целом, тепловизор демонстрирует простоту и универсальность, а также хорошую функциональность и эксплуатационные характеристики в широкоугольных приложениях TCSPC-PLIM. Коммерчески доступные широкоугольные тепловизоры в основном выполняют визуализацию на основе интенсивности, в которой на интенсивность фосфоресцирования могут влиять такие факторы, как фотообесцвечивание, геометрия измерения, рассеяние от образцов и т. д. Нынешний тепловизор основан на пожизненной визуализации, что делает измерения скорее количественными, чем качественными. Кроме того, интеграция оптической камеры Tpx3Cam с адаптером Cricket и усилителем изображения обеспечивает однофотонную чувствительность, простоту, гибкость и надежность измерений. В отличие от других систем, его можно доставить к месту проведения экспериментов и повернуть на 360° в зависимости от требований образца и задачи измерения. С его текущим объективом, который легко заменить на другой объектив, тепловизор может измерять образцы размером до 18 мм x 18 мм за считанные секунды и с высоким пространственным разрешением 256 x 256 пикселей. В этом документе описываются пошаговые процедуры подготовки образцов к испытаниям и использования тепловизора в различных приложениях PLIM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Финансовая поддержка этой работы со стороны Научного фонда Ирландии, грантов SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 и 18/SP/3522, а также Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) с благодарностью признается.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
References
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
- Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
- Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
- Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
- Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
- Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
- Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
- Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
- Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
- Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
- Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).
- Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
- Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
- Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
- Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. Becker, W. , Springer. Cham, Switzerland. 225-247 (2015).
- Becker, W. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. König, K. , De Gruyter. Berlin, Germany. 23-52 (2018).
- Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800 (2017).
- Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).
- Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).
- Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).
- Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, Springer. Cham, Switzerland. (2017).
- Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).
- Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
- Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
- Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).
- Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).
- Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).
- Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006 (2020).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
- Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
- Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
- Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).
- Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M.
