Summary
Dit artikel beschrijft het gebruik van een nieuwe, snelle optische imager voor de macroscopische fotoluminescentie lifetime imaging van monsters die lang verval uitzenden. De integratie-, beeldacquisitie- en analyseprocedures worden beschreven, samen met de voorbereiding en karakterisering van de sensormaterialen voor de beeldvorming en de toepassing van de imager bij het bestuderen van biologische monsters.
Abstract
Dit artikel presenteert een nieuwe fotoluminescentie lifetime imager ontworpen om de moleculaire zuurstof (O 2) concentratie in verschillende fosforescerende monsters in kaart te brengen, variërend van solid-state, O 2-gevoelige coatings tot levende dierlijke weefselmonsters gekleurd met oplosbare O 2-gevoelige sondes. In het bijzonder werd de op nanodeeltjes gebaseerde nabij-infrarode sonde NanO2-IR gebruikt, die prikkelbaar is met een 625 nm light-emitting diode (LED) en uitzendt bij 760 nm. Het beeldsysteem is gebaseerd op de Timepix3-camera (Tpx3Cam) en de optomechanische adapter, die ook een beeldversterker herbergt. O2 fosforescentie lifetime imaging microscopie (PLIM) is vaak vereist voor verschillende studies, maar de huidige platforms hebben beperkingen in hun nauwkeurigheid, algemene flexibiliteit en bruikbaarheid.
Het hier gepresenteerde systeem is een snelle en zeer gevoelige imager, die is gebouwd op een geïntegreerde optische sensor en uitleeschipmodule, Tpx3Cam. Het is aangetoond dat het fosforescentiesignalen met hoge intensiteit en stabiele levensduurwaarden produceert uit oppervlaktegekleurde darmweefselmonsters of intraluminaal gekleurde fragmenten van de dikke darm en maakt het mogelijk om weefsel O2-niveaus gedetailleerd in kaart te brengen in ongeveer 20 s of minder. Eerste experimenten met de beeldvorming van hypoxie in getransplanteerde tumoren bij bewusteloze dieren worden ook gepresenteerd. We beschrijven ook hoe de imager opnieuw kan worden geconfigureerd voor gebruik met O2-gevoelige materialen op basis van Pt-porfyrinekleurstoffen met behulp van een 390 nm LED voor de excitatie en een bandpass 650 nm filter voor emissie. Over het algemeen bleek de PLIM-imager nauwkeurige kwantitatieve metingen van levensduurwaarden voor de gebruikte sondes en respectieve tweedimensionale kaarten van de O2-concentratie te produceren. Het is ook nuttig voor de metabole beeldvorming van ex vivo weefselmodellen en levende dieren.
Introduction
O 2 is een van de belangrijkste omgevingsparameters voor levende systemen, en kennis van de verdeling van O 2 en zijn dynamiek is belangrijk voor veel biologische studies 1,2,3. De beoordeling van weefseloxygenatie door middel van fosforescerende sondes 4,5,6,7,8 en PLIM 9,10,11,12,13 wint aan populariteit in biologisch en medisch onderzoek 3,9,14,15,16, 17,18,19. Dit komt omdat PLIM, in tegenstelling tot fluorescentie- of fosforescentie-intensiteitsmetingen, niet wordt beïnvloed door externe factoren zoals sondeconcentratie, fotobleaching, excitatie-intensiteit, optische uitlijning, verstrooiing en autofluorescentie.
De huidige O2 PLIM-platforms worden echter beperkt door hun gevoeligheid, beeldacquisitiesnelheid, nauwkeurigheid en algemene bruikbaarheid. Time-correlated single photon counting (TCSPC), gecombineerd met een rasterscanprocedure, wordt vaak gebruikt in PLIM- en fluorescentie-lifetime imaging microscopie (FLIM) -apparaten20,21,22. Omdat PLIM echter een lange pixelverblijftijd vereist (in het millisecondebereik), is de tijd van beeldacquisitie veel langer dan wat vereist is voor FLIM-toepassingen20,22,23. Andere technieken, zoals gated CCD / CMOS-camera's, missen enkele fotongevoeligheid en hebben lage framesnelheden20,24,25,26. Bovendien worden de bestaande PLIM-systemen meestal gebruikt in het microscopische formaat, terwijl macroscopische systemen minder vaak voorkomen27.
De op TCSPC gebaseerde PLIM-macro-imager28 is opgezet om veel van deze beperkingen te overwinnen. Het ontwerp van de imager werd aanzienlijk vergemakkelijkt door het gebruik van een nieuwe opto-mechanische adapter, Cricket, die het volgende heeft: i) twee C-mount adapters, die een eenvoudige koppeling van de cameramodule aan de achterkant en een objectieflens aan de voorkant bieden; ii) een interne behuizing voor een beeldversterker en een stopcontact voor de laatste aan de buitenzijde van de Krekel; iii) een interne ruimte achter de C-montageadapter aan de voorzijde waar een standaard emissiefilter van 25 mm voor de versterker kan worden ondergebracht; en iv) een ingebouwde lichtbotsende optiek met ringregelaars, die optische uitlijning / scherpstelling tussen de lens en de camera mogelijk maken om scherpe beelden op de camerachip te produceren.
In de geassembleerde imager is de cameramodule gekoppeld aan de achterkant van de Cricket-adapter, die ook een beeldversterker herbergt die bestaat uit een fotokathode gevolgd door een microkanaalplaat (MCP), een versterker en een snelle scintillator, P47-fosfor. Een 760 nm ± 50 nm emissiefilter is gemonteerd in de Cricket en een objectieflens, NMV-50M11'', is bevestigd aan de C-mount adapter aan de voorzijde. Tot slot zijn de lens en de camera optisch uitgelijnd met ringregelaars.
De rol van de versterker is om inkomende fotonen te detecteren en om te zetten in snelle lichtflitsen op de camerachip, die worden geregistreerd en gebruikt om emissieverval en levensduurbeelden te genereren. De cameramodule bestaat uit een geavanceerde TCSPC-gebaseerde optische sensorarray (256 pixels x 256 pixels) en een nieuwe generatie uitleeschip 29,30,31,32,33, die de gelijktijdige registratie van de aankomsttijd (TOA) en de tijd over drempel (TOT) van fotonuitbarstingen bij elke pixel van de beeldchip mogelijk maakt met een tijdresolutie van 1,6 ns en een uitleessnelheid van 80 Mpixel / s.
In deze configuratie heeft de camera met de versterker een enkele fotongevoeligheid. Het is datagedreven en gebaseerd op het speedy pixel detector readout (SPIDR) systeem34. De ruimtelijke resolutie van de imager werd eerder gekarakteriseerd met vlakke fosforescerende O2-sensoren en een resolutieplaatmasker. De instrumentresponsfunctie (IRF) werd gemeten door de beeldvorming van een vlakke fluorescentiesensor onder dezelfde instellingen als voor alle andere metingen. De levensduur van de kleurstof van ongeveer 2,6 ns was kort genoeg om te worden gebruikt voor de IRF-meting in PLIM-modus. De imager kan objecten van maximaal 18 mm x 18 mm groot maken met ruimtelijke en temporele resoluties van respectievelijk 39,4 μm en 30,6 ns (volledige breedte bij half-maximum),28.
De volgende protocollen beschrijven de assemblage van de macro-imager en het daaropvolgende gebruik ervan voor het in kaart brengen van de O 2-concentratie in biologische monsters die zijn gekleurd met de eerder gekarakteriseerde nabij-infrarode O2-sonde, NanO2-IR35. De sonde is een heldere, fotostabiele, celdoorlatende O2-sensing sonde op basis van platina (II) benzoporfyrine (PtBP) kleurstof. Het is prikkelbaar bij 625 nm, zendt uit bij 760 nm en biedt een robuuste optische respons op O 2 in het fysiologische bereik (0% -21% of 0-210 μM van O2). De imager blijkt ook verschillende sensormaterialen te karakteriseren op basis van Pt(II)-porfyrinekleurstoffen. Over het algemeen is de imager compact en flexibel, vergelijkbaar met een gewone fotocamera. In de huidige opzet is de imager geschikt voor verschillende breedveld PLIM-toepassingen. Het vervangen van de LED door een snelle laserbron zal de prestaties van de imager verder verbeteren en kan mogelijk nanoseconde FLIM-toepassingen mogelijk maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met dieren werden uitgevoerd onder vergunningen die zijn afgegeven door de Health Products Regulatory Authority (HPRA, Ierland) in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschappen (2010/63/EU) en zijn goedgekeurd door de Animal Experimentation Ethics Committee van het University College Cork.
1. Monstervoorbereiding
- Kleuring met de sonde van levende weefselmonsters ex vivo
- Gebruik voor ex vivo toepassingen vers geïsoleerde weefselmonsters van 4 weken oude vrouwelijke Balb/c muizen.
- Op de dag van het experiment, euthanaseer een muis door onthoofding en ontleed snel fragmenten van de dikke darm (dikke darm), ongeveer 10 mm groot. Was ze onmiddellijk met PBS-buffer, plaats ze in DMEM-medium aangevuld met 10 mM Hepes-buffer (pH 7,2) en incubeer bij 37 °C36.
- Voor oppervlaktekleuring van de serosale kant van de darm, breng de levende weefselmonsters over in een minischaal, breng 2 ml volledige DMEM met 1 mg / ml NanO2-IR-sonde aan om de weefselmonsters te bedekken en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
OPMERKING: Cellen in post-mortem weefsel blijven vele uren in cultuur leven. NaNO2-IR vertoont een geringe cytotoxiciteit, dus alle experimenten werden binnen 4 uur na weefselisolatie voltooid. - Voor intraluminale ex vivo kleuring van diep weefsel, breng de stukjes van de darm over naar een droge petrischaal en verwijder overtollige DMEM met filterpapier.
- Injecteer 1 μL DMEM met 1 mg/ml NanO2-IR 35 in het lumen met een Hamilton-spuit en incubeer de monsters gedurende15 minuten of gedurende maximaal 4 uur.
OPMERKING: NaNO2-IR vertoont kleine cytotoxische effecten op lange termijn; Daarom moeten alle experimenten binnen 4 uur na weefselisolatie worden voltooid.
- Bereiding van gekleurd tumorweefsel bij levende dieren
- Voor in vivo toepassingen, pre-kleuring CT26-cellen gedurende 18 uur in serumvrij medium met NaNO2-IR-sonde bij 0,05 mg / ml.
- Neem een muis, scheer het injectiegebied in de rechterflank en injecteer met een spuit 200 μL van een mengsel van 1 × 10 5 niet-gekleurde cellen en 1 × 105 cellen voorgekleurd met NanO2-IR .
- Laat tumoren groeien in de muizen, controleer de tumorgrootte met een remklauw en het gewicht van het dier periodiek37. De dieren met getransplanteerde tumoren worden klaar voor beeldvorming op de zevende dag van tumorgroei.
OPMERKING: Het tumorvolume werd berekend met behulp van vergelijking (1):
V = (L × W 2)/2 (1)
waarbij L de diameter van de tumor is en W ide diameter loodrecht op de diameter L. - Offer de dieren op door cervicale dislocatie vlak voor de beeldvorming.
2. PLIM imaging instellen
- Neem de Cricket-adapter en verwijder de C-mount adapter aan de achterkant om toegang te krijgen tot de behuizing van de versterker aan de binnenkant. Plaats de MCP-125 beeldversterker in dit compartiment en plaats de C-mount adapter terug.
- Verwijder de C-mount adapter aan de voorzijde van de Cricket, plaats het 760 nm ± 50 nm emissiefilter en repareer het door de C-mount terug te plaatsen.
- Sluit de Tpx3Cam-cameramodule aan op de achterkant van de Cricket-module via de C-mount-adapter
- Sluit de lens aan op de voorkant van de Cricket-module via de C-mount adapter.
- Monteer de hele camera-assemblage bovenop de optische zwarte doos, naar beneden gericht naar het podium waarop de monsters worden afgebeeld (figuur 1).
- Monteer de 624 nm superheldere LED op een paal die is aangesloten op een breadboard in de zwarte doos.
- Sluit de LED aan op een voeding en een pulsgenerator. Schakel de LED in en richt deze op een effectieve en uniforme excitatie van afgebeelde monsters.
- Sluit de camera aan op een andere pulsgenerator en synchroniseer de pulsen die naar de camera en de LED38 worden verzonden.
- Sluit met behulp van de speciale kabel en aansluiting op de Cricket-eenheid de versterker aan op een standaardvoeding en stel de versterking in op 2,7 V.
- Gebruik de scherpstelmogelijkheden van de lens en cricketadapter om de cameraoptiek op het monsterpodium te richten om duidelijke beelden van monsters met een goed contrast en helderheid te genereren.
- Voor imagergebruik met Pt-porfyrinekleurstoffen vervangt u de 625 nm LED door een 390 nm LED voor excitatie en vervangt u het 760 nm ± 50 nm filter door een 650 nm ± 50 nm filter in de Cricket module.
3. Beeldacquisitie
- Plaats het monster voor de cameralens.
OPMERKING: Gebruik een x-y-z verstelbare trap als monsterhouder om de monsterpositie aan te passen voor een goede scherpstelling. - Doe alle lichten in de kamer uit.
- Schakel de Sophy-software in voor het afstemmen van de operationele parameters, zoals de scherpstelling en monsteruitlijning.
OPMERKING: Sophy-software wordt samen met de camera geleverd om de beeldparameters in te stellen en de gegevens vast te leggen. Zorg ervoor dat de software is aangesloten op de camera door de cameracode te controleren. We gebruikten echter een ander programma voor data-acquisitie. - Selecteer in Modules oneindige frames en stel de pixelbewerkingsmodus in op tijd boven drempel.
- Ga in Modules naar Voorvertoning en selecteer Actieve module. Dit opent het Medpix /Timpix Frames venster.
- Wijzig in dit venster de kleurenschaal en draai de afbeelding in de gewenste richting.
- Schakel de versterker in en start de opname.
OPMERKING: Gebruik het opnamescherm van de Sophy-software om de uitlijning en focus van het monster visueel te bevestigen en om de LED-excitatieparameters voor opname te optimaliseren. - Stop de opname en sluit de Sophy-software.
- Ga naar de terminal en gebruik de op maat ontworpen software om de onbewerkte gegevens in het binaire formaat te verkrijgen en na te bewerken (https://github.com/svihra/TimePix3).
- Voer in de terminal de volgende opdrachten uit om de gegevens vast te leggen:
Cd Document/SPIDR/trunk/Release/
Ls
./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Naam van het bestand} - t {acquisitietijd}
OPMERKING: Controleer bij het typen van "ls" de lijst met bestanden in de huidige map; bevestig dat Tpx3daq wordt gezien. - Wacht tot alle frames zijn opgenomen.
- Als u de gegevens wilt verwerken, voert u de volgende opdrachten uit in de terminal:
cd Documenten/DataProcessing/Timepix3/Timepix3/
wortel
. L dataproces.cpp++
.x DRGUI. C - Wacht tot een RRGui-venster wordt geopend. Selecteer alle variabelen aan de linkerkant en Alle gegevens, Eén bestand en Centroid aan de rechterkant.
- Selecteer het bestand dat u wilt verwerken en voer het gegevensreducer uit.
OPMERKING: Alle verwerkte bestanden verschijnen in dezelfde map als het RAW-bestand.
- Voer in de terminal de volgende opdrachten uit om de gegevens vast te leggen:
4. Data-analyse
- Analyseer de nabewerkte gegevens met een speciaal programma geschreven in C-taal dat de gegevens in een .ics afbeeldingsbestand (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam) schrijft.
- Open de .ics afbeeldingsbestanden met behulp van de vrij beschikbare Time Resolved Imaging-software (zie Materiaaltabel). Gebruik twee exponentiële functies om het fosforescentieverval aan te passen.
- Open de aangepaste .ics afbeeldingsbestanden met de beschikbare beeldanalysesoftware (zie Materiaaltabel).
- Genereer met behulp van opzoektabellen afbeeldingen met een fosforescentielevensduur en codeer ze in pseudokleurenschaal (bijvoorbeeld blauwe kleur voor korte levensduur en rood voor lange levensduur). Gebruik de functie Meten om de gemiddelde levensduurwaarden voor de gehele afbeelding of specifieke interessegebieden (ROI's) te berekenen.
- Zet de levensduurwaarden om in de zuurstofconcentratie met behulp van de vergelijking die wordt verkregen uit de aanpassing van de O 2-kalibratie van de sonde36.
OPMERKING: Vergelijking (2) werd gebruikt voor dit werk:
O 2 [μM] = −86,16 + 770,35 × e−0,049 × LT (2)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor ex vivo beeldvormingstoepassingen werden fragmenten van darmweefsels gekleurd door de topische toepassing van de NanO2-IR-sonde aan de serosale zijde van het weefsel. Voor diepere kleuring werd 1 μL van de sonde in het lumen geïnjecteerd. In het laatste geval schermde de 0,2-0,25 mm dikke darmwand de sonde af van de camera. De twee kleuringsprocessen worden gedemonstreerd in figuur 2A.
De resulterende intensiteit en PLIM-beelden worden weergegeven in figuur 2B-G. De kleuren weerspiegelen duidelijk het verschil in levensduurwaarden en dus het verschil in oxygenatie van de serosale en mucosale zijden van het weefsel. Figuur 2C en figuur 2D verwijzen naar vergelijkbare sets weefsels die topisch (figuur 2C) en intraluminaal (figuur 2D) werden gekleurd. Zoals verwacht vertoonden de weefsels vergelijkbare PLIM-patronen. De intraluminale kleuring van de mucosale kant van het weefsel (figuur 2D) vertoonde echter hogere levensduurwaarden, wat een lagere oxygenatie in het binnenoppervlak van de darm weerspiegelde, vergeleken met de actuele kleuring van de serosale zijde (figuur 2C), die een lagere levensduur vertoonde. Dit weerspiegelt een hogere oxygenatie in het buitenoppervlak van de darm.
Om de stabiliteit van de levensduursignalen en de ademhalingsactiviteit van de darm te onderzoeken, werd een time-lapse PLIM-analyse uitgevoerd op de intraluminaal gekleurde monsters gedurende 2 uur (figuur 2D-G). Een toename van de levensduurwaarden werd waargenomen tussen 15 min (54,4 μs ± 0,9 μs) en 2 h (61,1 μs ± 0,8 μs) van de incubatie, wat een vermindering van de O2-niveaus in het luminale deel van de darm weerspiegelt. Bovendien bewijzen de lage O 2-niveaus na2 uur incubatie dat de weefselademhaling doorging gedurende de hele periode van dissectie, voorbereiding, kleuring, incubatie en beeldvormingsstappen. Bovendien kan de verandering in de vorm van het lumen waargenomen in figuur 2D-G worden toegeschreven aan de verdeling van de sonde die in het lumen wordt geïnjecteerd, wat betekent dat het LT-signaal het gebied weerspiegelt waar de sonde zich bevindt.
Om de toekomstige prestaties van de imager in vivo te beoordelen, werd onmiddellijk na het offeren een eerste studie uitgevoerd naar de beeldvorming van hypoxie in getransplanteerde subcutane tumoren gekweekt bij muizen (figuur 3). In dit geval werden Balb/c-muizen subcutaan in de rechterflank geïnjecteerd met 200 μL van een mengsel van CT26-cellen, die niet gekleurd of gekleurd waren met een 0,05 mg/ml NanO2-IR-sonde. PLIM werd uitgevoerd op de zevende dag van de tumorgroei en de muizen werden geofferd vlak voor de beeldvorming (d.w.z. post-mortem). Beelden van de tumorgebieden in de muizen op de zevende dag van groei zijn weergegeven in figuur 3A, B.
De intensiteit (links) en PLIM (rechts) beelden voor de tumorgebieden in de muizen op de zevende dag van tumorgroei (figuur 3B) tonen de prestaties en gevoeligheid van zowel de imager als de sonde in dergelijke experimenten (meer gedetailleerde statistische gegevens niet getoond). De dieren werden elk 20 s in beeld gebracht. De linkerflanken van de muizen werden geschoren en afgebeeld als een blanco. Ze produceerden geen PLIM-signalen. Daarentegen produceerden regio's met de tumor en de sonde stabiele levensduursignalen van ~ 50 μs. Het doel van dit experiment was om de bruikbaarheid van de imager te evalueren voor in vivo studies met levende dieren en modellen van menselijke ziekten. Hoewel dit deel voorlopige kwalitatieve resultaten liet zien, is een overeenkomstig document in voorbereiding, dat een grondiger kwantitatieve beoordeling biedt.
Vervolgens werd de imager ook gedemonstreerd in de PLIM-beeldvorming van sensormaterialen op basis van Pt(II)-porfyrinekleurstoffen. De chemische structuur van Pt-octaethylporfinekleurstof (PtOEP) en technische details van de bereiding van de overeenkomstige sensormaterialen worden elders beschreven 6,39. De op PtOEP-polystyreen gebaseerde fosforescerende solid-state sensorcoatings werden afgezet op een transparante polyesterfilm (Mylar) terwijl kleine vlekken werden afgebeeld door de film onder te dompelen in PBS-buffer (luchtverzadigde zuurstofrijke toestand) of in PBS met glucose en glucoseoxidase, wat een volledig zuurstofarme toestand biedt. De levensduursignalen verkregen in de zuurstofrijke (25,6 μs ± 0,5 μs) en gedeoxygeneerde omstandigheden (65,7 μs ± 1,5 μs) kwamen overeen met de eerder gerapporteerde resultaten6. De intensiteits- en PLIM-beelden van de zuurstofhoudende en zuurstofarme sensoren zijn weergegeven in figuur 4A, B.
Figuur 1: Experimentele opstelling van de imager38. Overgenomen met toestemming van Sen et al.38. Copyright: The Optical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: O 2 PLIM van de topisch en intraluminaal gekleurde muizendarmmonsters. (A) Illustratie van de twee kleuringsmethoden met behulp van (B) fosforescentie-intensiteit en (C) PLIM-beelden van de darm topisch gekleurd met de NanO2-IR-sonde. (D-G) Timelapse PLIM van de intraluminaal gekleurde darm na 15 min, 30 min, 1 h en 2 h na kleuring. De PLIM-afbeeldingen worden gepresenteerd in een pseudokleurenschaal: de blauwe kleur komt overeen met een lagere levensduur en de rode kleur komt overeen met hogere levensduurwaarden. Schaalstaven = 5 mm. Afkorting: PLIM = fosforescentie lifetime imaging microscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: O2 PLIM van geënte tumoren in de rechterflanken van de muizen . (A) Grafische illustratie van tumorontwikkeling bij levende dieren. Fosforescentie-intensiteit (links) en PLIM (rechts) beelden van tumorgebieden op de (B) zevende dag van tumorgroei. De PLIM-afbeelding wordt gepresenteerd in een pseudokleurenschaal: de blauwe kleur komt overeen met een lagere levensduur en de rode kleur komt overeen met hogere levensduurwaarden. Schaalbalk = 5 mm. Afkorting: PLIM = fosforescentie lifetime imaging microscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Fosforescentie-intensiteit van de op PtOEP gebaseerde sensorspot. Fosforescentie-intensiteit (links) en PLIM (rechts) beelden van de PtOEP-sensorspot in de (A) zuurstofrijke en (B) zuurstofarme toestand. De PLIM-afbeeldingen worden gepresenteerd in een pseudokleurenschaal: het blauw komt overeen met een lagere levensduur en de rode kleur komt overeen met hogere levensduurwaarden. Afkortingen: PLIM = fosforescentie lifetime imaging microscopie; PtOEP = platina octaethylporfyrine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De bovenstaande protocollen geven een gedetailleerde beschrijving van de assemblage van de nieuwe imager en de werking ervan in de microseconde FLIM/PLIM-modus. De TCSPC-gebaseerde nieuwe generatie Tpx3Cam-camera, gekoppeld door middel van de optomechanische adapter Cricket met de beeldversterker, emissiefilter en macrolens, produceert een stabiele, compacte en flexibele optische module die eenvoudig te bedienen is. De imager bleek goed te presteren met een reeks verschillende monsters en analytische taken, waaronder de karakterisering van fosforescerende materialen en levende weefsel O 2-beeldvorming. De nabij-infrarode Pt(II)-benzoporfyrine-gebaseerde cel-permeabele oplosbare sonde NanO2-IR en de red-emitting Pt(II)-porfyrine-gebaseerde solid-state sensoren werden gebruikt in de beeldvormingsexperimenten. Deze sensoren zijn met succes gebruikt voor de uitgebluste fosforescentiedetectie van O2 vanwege hun grote Stokes'-verschuiving, lange emissielevensduur, hoge gevoeligheid, snelle respons en goede fotochemische stabiliteit.
Deze verschillende O2-gevoelige sondes en solid-state coatings, wanneer getest op de macro-imager, produceerden resultaten die in overeenstemming zijn met eerder gepubliceerde gegevens40. De materialen vertoonden een goede uniformiteit, contrast en levensduurreacties op veranderende omgevingsomstandigheden, met name in termen van temperatuur en oxygenatietoestand. De vergelijking van deze resultaten met die geproduceerd op de confocale TCSPC-PLIM-microscoop laat zien dat de nieuwe imager nauwkeurig is, levensduurmetingen van betere kwaliteit heeft en PLIM-beelden verkrijgt met hoge snelheid en gevoeligheid28,38,40.
De imager toonde ook veelbelovende prestaties met fosforescent gekleurde biologische monsters van verschillende typen. Zo werden gedetailleerde O2-concentratiekaarten geproduceerd voor de monsters met suspensies van gekleurde ademhalingscellen, levend postmortaal dierlijk weefsel, hele organen en getransplanteerde tumoren. De imager heeft metingen van levensduurwaarden vanaf het oppervlak en zelfs op diepten tot 0,5 mm in het weefsel28,36,38.
Aangezien de fosforescentielevensduurwaarden sterk worden beïnvloed door temperatuur41, is het noodzakelijk om een strikte temperatuurregeling van de afgebeelde monsters te implementeren, bijvoorbeeld door gebruik te maken van een verwarmde monsterfase en/of een incubatorkamer. Bij het gebruik van UV-excitatie is het belangrijk om de monsterhouders zorgvuldig te kiezen, omdat veel materialen autofluorescentie in dit spectrale gebied bezitten, wat de werkelijke levensduurwaarde van het monster beïnvloedt. Alle PLIM-beeldvorming in deze studie werd uitgevoerd bij een LED-vermogen van 4 V en een pulsbreedte van 50 ns voor een integratietijd van 20 s; Deze parameters kunnen echter naar wens worden aangepast. Ongeveer 104.500 frames worden opgenomen tijdens de 20 s van beeldacquisitietijd. Ten slotte is het belangrijk om de metingen in een donkere kamer uit te voeren om interferentie met omgevingslicht te voorkomen.
Zo kan de PLIM-imager snelle, kwantitatieve levensduurmetingen uitvoeren met macroscopische objecten van aanzienlijke grootte. Hoewel laserscanning PLIM-TCSPS mogelijk is, zou het te langzaam zijn vanwege de lange verblijftijden die nodig zijn voor de zuurstofgevoelige kleurstoffen. Deze imager is echter snel en kan alle pixels tegelijkertijd opnemen. Verder kunnen op intensiteit gebaseerde metingen worden beïnvloed door de fluorescerende / fosforescerende kleurstofconcentratie, een onstabiele LED- of laserintensiteit, fotobleaching, de uitlijning van de optische componenten en verstrooiing van de monsters. De op TCSPC gebaseerde macro-imager is daarentegen in wezen onafhankelijk van deze factoren. Daarom kan het nauwkeurige en kalibratievrije metingen van O2 uitvoeren. De nadelen van de camera zijn de relatief complexe gegevensverwerking en grote gegevensformaten (~ 2 Gb).
In de toekomst kan de imager ook niet alleen worden gebruikt om O2-concentraties in kaart te brengen, maar ook andere chemische en biochemische parameters van geteste monsters, zoals de pH en glucosedynamica, met behulp van de bijbehorende sondes of sensoren. Dit maakt het een nuttig hulpmiddel voor fysiologische studies met verschillende weefsel- en ziektemodellen. De imager kan ook worden geüpgraded om te werken in de nanoseconde FLIM-modus. Dit vereist echter de vervanging van de huidige LED's door een snellere excitatiebron (bijvoorbeeld een ps-laser). Systeembediening in de dubbele PLIM/FLIM-modus is in principe ook mogelijk.
Al met al demonstreert de imager eenvoud en veelzijdigheid, samen met goede functionaliteit en operationele prestaties in widefield TCSPC-PLIM-toepassingen. In de handel verkrijgbare breedveldbeeldcamera's voeren meestal op intensiteit gebaseerde beeldvorming uit, waarbij de fosforescerende intensiteiten kunnen worden beïnvloed door factoren zoals fotobleaching, meetgeometrie, verstrooiing van monsters, enz. De huidige imager is gebaseerd op lifetime imaging, waardoor de metingen eerder kwantitatief dan kwalitatief zijn. Bovendien biedt de integratie van de Tpx3Cam optische camera met de Cricket-adapter en beeldversterker een enkele fotongevoeligheid, eenvoud, flexibiliteit en robuustheid van de metingen. In tegenstelling tot andere systemen kan het naar de locatie van de experimenten worden gebracht en 360 ° worden gedraaid op basis van de vereisten van het monster en de meettaak. Met zijn huidige objectief, dat gemakkelijk te veranderen is voor een andere lens, kan de imager monsters tot 18 mm x 18 mm groot meten in een kwestie van enkele seconden en met een hoge ruimtelijke resolutie van 256 pixels x 256 pixels. In dit artikel worden stapsgewijze procedures beschreven voor het voorbereiden van monsters voor het testen en het gebruik van de imager in de verschillende PLIM-toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Financiële steun voor dit werk van de Science Foundation Ireland, subsidies SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 en 18/SP/3522, en Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) wordt dankbaar erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
References
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
- Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
- Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
- Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
- Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
- Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
- Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
- Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
- Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
- Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
- Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).
- Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
- Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
- Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
- Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. Becker, W. , Springer. Cham, Switzerland. 225-247 (2015).
- Becker, W. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. König, K. , De Gruyter. Berlin, Germany. 23-52 (2018).
- Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800 (2017).
- Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).
- Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).
- Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).
- Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, Springer. Cham, Switzerland. (2017).
- Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).
- Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
- Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
- Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).
- Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).
- Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).
- Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006 (2020).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
- Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
- Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
- Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).
- Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M.
