Summary
Среда, не содержащая фенола красного/фетального бычьего сыворотки, является лучшим вариантом, чем продвинутый RPMI, для элиминации экзогенных гормонов без изменения нормальной функции бокаловидных клеток конъюнктивы при изучении половых различий.
Abstract
Синдром сухого глаза является многофакторным заболеванием, влияющим на здоровье глазной поверхности, с гораздо более высокой распространенностью среди женщин. Разрушение гелеобразующего муцина, который секретируется бокаловидными клетками конъюнктивы (CGC) на поверхности глаза, способствует возникновению множественных заболеваний глазной поверхности. Элиминация экзогенных половых гормонов имеет важное значение для получения устойчивых результатов при исследовании in vitro половых различий в CGC. В данной работе описан метод минимизации присутствия экзогенных гормонов при изучении половых различий в CGC при сохранении их физиологической функции. CGC от посмертных доноров обоих полов культивировали из кусочков конъюнктивы в среде RPMI с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (называемой полной средой) до слияния. Примерно за 48 ч до начала экспериментов CGC переводили в среду RPMI без фенолового красного или FBS, но с 1% BSA (так называемая среда без фенол-красного). Нормальную клеточную функцию изучали путем измерения увеличения внутриклеточного [Ca2+] ([Ca2+]i) после стимуляции карбахолом (Cch, 1 x 10-4 M) с помощью фура-2/ацетоксиметиловой (AM) микроскопии. Результат показывает, что CGC сохраняли нормальную функцию в средах, не содержащих фенол-красного, через 48 ч. Не было выявлено существенной разницы в ответе [Ca2+]i между средой RPMI, не содержащей фенолового красного, и полной средой при стимуляции Cch. Поэтому мы рекомендуем использовать свободную от фенола красную среду RPMI с 1% БСА для элиминации экзогенных гормонов без изменения нормальной функции CGC при исследовании половых различий.
Introduction
Половые различия влияют на множественные процессы глазной поверхности 1,2,3. Клиническим проявлением этих половых различий является разница в распространенности многих заболеваний глазной поверхности у мужчин и женщин, таких как сухость глаз и конъюнктивит 4,5,6. Фактические данные свидетельствуют о том, что половые различия возникают на нескольких биологических уровнях, включая различные профили генов на X- и Y-хромосомах7 и влияние гормонов8. Изучение молекулярных основ половых различий может обеспечить лучшее понимание болезней и, в конечном итоге, улучшить персонализированную медицину.
Глазная поверхность состоит из вышележащей слезной пленки, роговицы и конъюнктивы. Половые различия наблюдаются во многих компонентах глазной поверхности, включая слезную пленку 9,10, роговицу 11, слезную железу 12,13 и мейбомиевые железы, которые также выделяют слезы 12. В многочисленных механистических исследованиях изучалось влияние половых гормонов на роговицу и связанные с ней компоненты14,15; Тем не менее, мало что известно о половых различиях в конъюнктиве и ее бокаловидных клетках. Конъюнктива – это слизистая оболочка, которая покрывает склеру и внутреннюю поверхность века. Эпителий конъюнктивы состоит из неороговевающих, многослойных, слоистых плоскоклеточных клеток16.
Среди многослойных плоскоклеточных клеток конъюнктивы имеются бокаловидные клетки (CGC), вкрапленные на апикальной поверхности эпителия. Эти бокаловидные клетки характеризуются большим количеством секреторных гранул, расположенных на апикальном полюсе17. CGC синтезируют и секретируют гелеобразующий муцин MUC5AC для увлажнения глазной поверхности и смазывания ее во время моргания17. Секреция муцина жестко регулируется внутриклеточным [Ca2+] ([Ca2+]i) и активацией Ras-зависимой внеклеточной сигнально-регулируемой киназы (ERK1/2)18. Неспособность выделять муцин приводит к сухости глазной поверхности и последствиям патологических отклонений. Однако на воспаленной глазной поверхности обширная секреция муцина, стимулируемая медиаторами воспаления, приводит к восприятию липкости и зуда в глазах19. Эти состояния с нарушенной секрецией муцина в конечном итоге приведут к ухудшению состояния глазной поверхности.
Роль бокаловидных клеток как основного источника глазного муцина давно признана20, однако половые различия в регуляции муцина как при физиологических, так и при патологических состояниях остаются неоткрытыми. Система in vitro была бы полезна для мониторинга функции бокаловидных клеток без гормонального эффекта или с точно контролируемым уровнем половых гормонов. Несмотря на то, что сформировалась клеточная линия эпителия конъюнктивы 21, не существует бокаловиднойклеточной линии с функциональной секрецией муцина. Таким образом, мы модифицировали разработанную нами первичную культуру CGC человека, чтобы создать метод анализа половых различий in vitro16, и представили его следующим образом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Вся человеческая ткань была передана в глазной банк с предварительного информированного согласия и разрешения донора для использования в научных исследованиях. Использование тканей конъюнктивы человека было рассмотрено Массачусетским комитетом по изучению глаз и ушей и определено как исключенное и не соответствующее определению исследований с участием людей.
1. Первичная культура бокаловидных клеток человека
- Из банка глаз получить ткань конъюнктивы человека16.
- Приготовьте питательную среду, питательную среду RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ глютамина, 2 мМ заменимых аминокислот (NEAA), 2 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл пенициллина-стрептомицина и 2 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеэтансульфоновой кислоты (HEPES).
- Проведите первичную клеточную культуру, как описано ниже.
- Стерильным скальпелем измельчите ткань на3 кусочка размером 1 мм и выложите семена на культуральные планшеты в колпаке. Высевают по четыре штуки в каждую лунку 6-луночного планшета в 1 мл полной среды RPMI. Несмотря на то, что ориентация кусочка ткани не влияет на рост клеток, убедитесь, что кусочки прилегают к культуральной пластине, чтобы обеспечить рост с помощью лезвия скальпеля.
- Поместите кусочки ткани в инкубатор, содержащий 95% воздуха и 5%CO2 при температуре 37 °C. Обновляйте одну и ту же питательную среду через день до тех пор, пока бокаловидные клетки не достигнут 70%-80% слияния примерно через 14 дней. Снимите тканевую пробку примерно через 72 часа после посева.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эпителий конъюнктивы человека в основном содержит слоистые плоскоклеточные клетки и бокаловидные клетки. RPMI является селективной средой для бокаловиков. В редких случаях в культуре CGC у человека фибробласты могут расти примерно на 7-й день. Способ очистки культуры был описан в предыдущей публикации 22. - Проверяют чистоту культуры ГХ с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии (ИФМ), нацеленной на цитокератин (КФК)7 и лектин Helix pomatia-1 (HPA-1)22 в соответствии со стандартным методом ИФМ, описанным в19; Смотрите репрезентативные результаты.
2. Пассаж бокаловидных клеток конъюнктивы человека и экспериментальная подготовка
- Промойте клетки PBS (pH = 7,4) и отделите клетки с помощью трипсинизации с использованием 0,05% трипсина в 1x ЭДТА. Каждую минуту наблюдайте за клетками под микроскопом. После того, как клетки отделятся от дна, деактивируйте трипсин, используя полную среду RPMI.
- Центрифугируют клетки при 150 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируйте клеточные гранулы в полной питательной среде RPMI и пересадите в чашки для культивирования со стеклянным дном для измерения [Ca2+]i . Общий объем среды составляет 300 мкл на чашку. Держите носитель в центре стеклянной части блюда.
- Элиминация гормонов в питательных средах: питательная среда может содержать половые гормоны, особенно FBS. Поскольку феноловый краситель, содержащийся в RPMI-1640, обладает эстрогенной активностью 23,24, замените среду RPMI на среду RPMI, не содержащую фенолового красного, и отрегулируйте pH до 7,45 с помощью pH-полосок после приготовления полной среды. HEPES, содержащийся в полной среде, поддерживает pH в относительно небольшом диапазоне.
3. Анализ фура-2/ацетоксимил (АМ) для измерения [Ca2+]i
- Выполните загрузку Fura-2/AM, как описано ниже.
- Инкубируют клетки в чашках со стеклянным дном в течение 1 ч при температуре 37 °C, атмосфере окружающей среды и защищают от света бикарбонатным буфером Кребса-Рингера (KRB; содержащий 119 мМ NaCl, 4,8 мМ KCl, 1,0 мМ CaCl 2, 1,2 мМ MgSO4 и 25 мМ NaHCO3) с 0,5% HEPES (таблица 1), плюс 0,5% БСА, 0,5 мкМ фура-2/AM, 8 мкМ плуроновой кислоты F127 и 250 мкМ сульфинпиразона.
- Перед использованием отрегулируйте pH до 7,45 с помощью pH-метра. После загрузки фура-2/AM промыть ячейки KRB, содержащим 250 мкМ сульфинпиразона, непосредственно перед измерением [Ca2+]i .
- Выполните измерение [Ca2+]i , как описано ниже.
- Поместите чашки с клетками, загруженными фурой-2, под микроскоп, найдите репрезентативное поле, содержащее от 20 до 50 клеток, при 200-кратном увеличении и используйте функцию Freehand , чтобы нарисовать контур вокруг каждой ячейки, чтобы указать программному обеспечению, что является фоновой флуоресценцией, а что нет.
- Подождите, пока программное обеспечение автоматически вычтет фоновую флуоресценцию из измерения, и нажмите кнопку «Начать эксперимент ».
- Затем подождите от 8 до 15 с, чтобы установить базальный уровень кальция в клетках, прежде чем осторожно пипетировать интересующий агонист. Продолжайте измерение в течение не менее 120 с после добавления агониста или до тех пор, пока уровень кальция не вернется к исходному уровню.
- Выполните анализ данных, как описано ниже.
- Используйте изменение пика [Ca2+]i для представления действия стимулов. Рассчитайте средний базальный уровень кальция в каждой клетке за первые 8-15 секунд измерений. Если это число равно или превышает 500 нМ, удалите эту клетку из набора данных, так как она подвергается апоптозу или некрозу.
- После того, как базальный уровень каждой клетки будет рассчитан, вычтите это количество из максимального измеренного значения [Ca2+]i для той же клетки. Усредните изменение пика [Ca2+]I для всех клеток в данной чашке.
- Чтобы обеспечить согласованность, запишите ответы на каждый стимул в двух экземплярах и вычислите среднее значение изменений пика [Ca2+]i , полученное из дубликатов, как одну точку данных из индивидуальной выборки человека. Сравните данные из разных групп, используя соответствующий метод анализа данных, основанный на дизайне исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CGC человека в первичной культуре вырастают до 80% слияния примерно за 14 дней. Тип клеток подтверждали иммунофлуоресцентным окрашиванием антителами к маркерам бокаловидных клеток CK7 и HPA-125 (рис. 1). Несмотря на то, что удаление FBS из среды может устранить половые гормоны, недостаток FBS потенциально может повлиять на клеточный ответ. Для верификации метода элиминации гормонов в качестве стимула использовали холинергический агонист (карбахол, Cch 1 × 10-4 M), имитирующий физиологическую секрецию бокаловидных клеток, опосредованную различными нервными окончаниями, окружающими бокаловидные клетки26. Различий в величине изменения кальция по сравнению с контрольной полной средой RPMI не наблюдалось, что указывает на то, что этот метод может быть применен для изучения половых различий в клеточном ответе.
Анализ Фура-2/АМ, описанный в разделе протокола, проводили на чашках, обработанных полной средой RPMI + 10% FBS, расширенной средой RPMI (RPMI поставляла запатентованную концентрацию инсулина) с добавлением 1% BSA и RPMI без фенола красного цвета с 1% BSA. Результаты получены от четырех особей. При сравнении клеток, инкубированных в РПМИ без фенола красного, с 1% БСА и полной средой РПМИ не выявлено. Тем не менее, при сравнении средней группы с прогрессирующей средней группой RPMI и полной средней группой RPMI наблюдалось значительное увеличение [Ca2+]i ответа на Cch 1 × 10-4 M (рис. 2). Таким образом, RPMI, не содержащий фенола красного, с 1% BSA не влияет на клеточный ответ бокаловидных клеток, даже превосходя передовую среду RPMI в текущих исследовательских условиях.
Рисунок 1: Первичная культура бокаловидной клетки конъюнктивы человека. Бокаловидные клетки конъюнктивы проводили на покровные стекла через 14 суток в культуре и проводили иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием первичных антител против CK7 (красный) и флуоресцеин-конъюгированного лектина HPA-1 (зеленый). (A) Изображения были сделаны с 200-кратным увеличением, и (B) изображения были сделаны с 630-кратным увеличением. CK7 представлен в виде перинуклеарного флуоресцентного сигнала (левая панель); HPA-1 представляет собой пунктуационный узор перинучетко (средняя панель). Положительный иммунофлуоресцентный сигнал как CK7, так и HPA-1 указывает на бокаловидную клетку. Отрицательным контролем является инкубация при отсутствии первичного антитела (С). Масштабные линейки = 50 мкм (A) и 8 мкм (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Влияние различных сред на Cch-индуцированный [Ca2+]i ответ. Клетки инкубировали с RPMI, не содержащим фенола, с 1% BSA, средами RPMI с 10% FBS или расширенными RPMI с 1% BSA в течение 48 ч инкубации перед добавлением 1 × 10-4 M Cch. [Ca2+]i измеряли с помощью анализа Fura2, а изменение пика [Ca2+]i рассчитывали и показывали на графике. Черная полоса указывает на полную среду с феноловым красным и 10% FBS. Оранжевая полоса указывает на продвинутую среду с 1% BSA, а серая полоса указывает на RPMI без фенолового красного и с 1% BSA. Данные являются средними ± SEM, n = 4. В множественных групповых сравнениях использовался односторонний ANOVA с коррекцией Даннета, p < 0,05 был установлен как статистически значимый. * указывает на существенную разницу между группами. Сокращения: Cch = карбахол; [Около2+] i = внутриклеточная концентрацияCa2+. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Компонент на складе | Количество на 250 мл KRB | Конечная концентрация |
| Глюкоза | 0,25 г | 0,1% по весовой массе |
| 1 М NaCl | 30 мл | 119 мМ |
| 0,5 м NaHCO3 | 12,5 мл | 25 мМ |
| 1 М 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеэтансульфоновая кислота (HEPES) | 2,5 мл | 10 мМ |
| 1 М KCl | 1,2 мл | 4,8 мМ |
| 1 М KH2PO4 | 300 мкл | 1,2 мМ |
| 1 М MgSO4 | 300 мкл | 1,2 мМ |
| 1 М CaCl2 | 250 мкл | 1 мМ |
Таблица 1: Материал и формула для KRB. Аббревиатура: ж/в, вес/объем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изучение половых различий в тканях глаза помогает понять процессы заболеваний, особенно синдрома сухого глаза и аллергического конъюнктивита, которые непропорционально поражают один пол 4,5,6. Несмотря на то, что для этих исследований можно использовать животные модели, данные, полученные непосредственно из тканей человека, имеют важное значение из-за высочайшего сходства с человеческими клетками in vivo. Ткани конъюнктивы, используемые в текущих экспериментальных условиях, получены от умерших доноров в возрасте 70-85 лет (постменопауза), что облегчает контроль гормонального эффекта ante mortem. В этой статье мы представили экономически эффективный метод изучения половых различий в CGC человека.
Критическим этапом для получения согласованных данных является удаление ФБС и фенолового красного в течение 48 ч перед экспериментами по устранению эффектов половых гормонов. Действия половых гормонов в клетках можно разделить на нетранскрипционные и транскрипционные эффекты. Нетранскрипционные эффекты быстро опосредованы G-белками в течение от нескольких секунд до нескольких минут, а транскрипционный эффект, при котором активируются определенные гены, занимает от 30 минут до нескольких часов27; период полувыведения эстрогено-индуцированного рецептора эстрогена альфа (ERα) составляет 2-6 ч28,29. Несмотря на то, что о скорости оборота других типов белков, индуцированных половыми гормонами, сообщается редко, результаты существующих исследований показывают, что белки, индуцированные половыми гормонами, синтезируются и расщепляются в течение нескольких часов. Таким образом, 48 ч – это достаточное время, чтобы вымыть потенциальное действие гормонов, содержащихся в ФБС, сохраняя при этом нормальную клеточную функцию. Используя текущий метод, мы успешно сообщили о половых различиях в экспрессии рецепторов половых гормонов и клеточных функциях в CGC30.
FBS является важным фактором для того, чтобы культуры бокаловидных клеток оставались здоровыми и жизнеспособными. Замена обычного термически инактивированного FBS на FBS, очищенный древесным углем, является еще одним возможным способом устранения половых гормонов в системе культивирования. Ограничением использования древесного угля зачистного ФБС является стоимость и сложный состав ФБС. Полное удаление FBS также устраняет потенциальную несогласованность с неопределенными средними компонентами FBS.
Критическим этапом измерения [Ca2+]i является стабилизация pH и температуры. Несмотря на добавку HEPES, мы заметили сдвиг pH в буфере KRB с течением времени при хранении при комнатной температуре. Таким образом, для длительного эксперимента рекомендуется корректировка рН буфера, примерно каждые 3 ч. Тот же метод [Ca2+]i также применим к другим типам клеток, таким как стратифицированные плоскоклеточные клетки конъюнктивы, клетки эндотелия сосудов, клетки микроглии и нейроны для изучения действия различных стимулов.
Связывание Fura-2 со свободным кальцием в клетке вызывает изменение его пиковой длины волны поглощения с 380 нм (несвязанный) до 340 нм (связанный). Тем не менее, длина волны излучения остается на длине волны 510 нм, и эти излучения фиксируются камерой в виде черно-белых изображений. Зафиксировано соотношение интенсивности излучения, возбуждаемого светом 340 нм и 380 нм. Помимо сравнения соотношения 340/380 с кривой стенда для вычисления концентрации [Ca2+]i , можно также сообщить об изменении соотношения без необходимости создания стандартной кривой, следовательно, без фактической концентрации. Исследователи могут выбрать любой из этих способов в зависимости от настройки оборудования и плана эксперимента.
В заключение, культивируемые первичные бокаловидные клетки конъюнктивы могут быть использованы в качестве модели для изучения половых различий при заболеваниях глазной поверхности. Инкубация в течение 48 ч в среде RPMI, не содержащей фенола красного, с 1% БСА перед проведением любых экспериментов является последовательным и экономически эффективным методом устранения потенциальных эффектов гормонов в питательных средах и может быть использована в качестве базальной среды для контроля уровня гормонов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликт интересов у авторов отсутствует.
Acknowledgments
Работа финансируется за счет гранта Национального института глаза EY019470 (D.A.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
- Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
- Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians' Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
- Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
- Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
- Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3 (2020).
- Yang, J. -H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
- Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
- Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
- Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
- Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
- Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
- Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
- Suzuki, T., et al. Estrogen's and progesterone's impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
- Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
- Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
- Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
- Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
- Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
- García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220 (2022).
- Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C.
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
- García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
- Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
- Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
- Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
- Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
- Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305 (2022).
