Summary
Fenol kırmızısı içermeyen/fetal sığır serumu içermeyen ortam, cinsiyete dayalı farklılıkların incelenmesinde konjonktival goblet hücrelerinin normal işlevini değiştirmeden eksojen hormonları ortadan kaldırmak için gelişmiş RPMI'den daha iyi bir seçenektir.
Abstract
Kuru göz, oküler yüzey sağlığını etkileyen çok faktörlü bir hastalıktır ve kadınlarda görülme sıklığı çok yüksektir. Konjonktival goblet hücreleri (CGC'ler) tarafından oküler yüzeye salgılanan jel oluşturan müsinin bozulması, çoklu oküler yüzey hastalıklarına katkıda bulunur. Ekzojen seks hormonlarının eliminasyonu, CGC'lerdeki cinsiyete dayalı farklılıkların in vitro çalışması sırasında tutarlı sonuçlar elde etmek için gereklidir. Bu makale, fizyolojik işlevlerini korurken CGC'lerdeki cinsiyete dayalı farklılıkların incelenmesinde eksojen hormonların varlığını en aza indirmek için bir yöntemi açıklamaktadır. Her iki cinsiyetten postmortem insan donörlerinden alınan CGC'ler, RPMI ortamındaki konjonktiva parçalarından% 10 fetal sığır serumu (FBS) (tam ortam olarak adlandırılır) ile birleşene kadar kültürlendi. Deneylerin başlamasından yaklaşık 48 saat önce, CGC'ler fenol kırmızısı veya FBS olmadan,% 1 BSA (fenol-kırmızı içermeyen ortam olarak adlandırılır) ile RPMI ortamına aktarıldı. Normal hücresel fonksiyon, fura 2 / asetoksimetil () mikroskobu kullanılarak karbakol (Cch, 1 x 10-4 M) stimülasyonundan sonra hücre içi [Ca 2+] ([Ca2 +] i) artışı ölçülerek incelenmiştir. Sonuç, CGC'lerin 48 saat sonra fenol kırmızısı içermeyen ortamda normal işlevini sürdürdüğünü göstermektedir. Cch stimülasyonu üzerine fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamı ile tam ortam arasında [Ca2+] i yanıtında anlamlı bir fark gözlenmedi. Bu nedenle, cinsiyete dayalı farklılıkların incelenmesinde CGC'lerin normal işlevini değiştirmeden eksojen hormonları ortadan kaldırmak için% 1 BSA ile fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamının kullanılmasını öneririz.
Introduction
Cinsiyete dayalı farklılıklar oküler yüzeyin çoklu süreçlerini etkiler 1,2,3. Bu cinsiyete dayalı farklılıkların klinik tezahürü, kuru göz ve konjonktivit gibi birçok oküler yüzey hastalığının erkekler ve kadınlar arasındaki prevalansındaki farklılıktır 4,5,6. Kanıtlar, cinsiyete dayalı farklılıkların, X ve Y kromozomları7 üzerindeki farklı gen profilleri ve hormonların8 etkileri dahil olmak üzere çoklu biyolojik seviyelerden kaynaklandığını göstermektedir. Cinsiyete dayalı farklılıkların moleküler temelini incelemek, hastalığın daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir ve nihayetinde kişiselleştirilmiş tıbbı geliştirebilir.
Oküler yüzey, üstteki gözyaşı filmi, kornea ve konjonktivadan oluşur. Gözyaşı filmi 9,10, kornea11, gözyaşı bezi 12,13 ve gözyaşı salgılayan meibomian bezleri 12 dahil olmak üzere oküler yüzeyin birçok bileşeninde cinsiyete dayalı farklılıklar gözlenir. Çok sayıda mekanik çalışma, seks hormonlarının kornea ve ilişkili bileşenleri üzerindeki etkisini araştırmıştır14,15; Bununla birlikte, konjonktiva ve kadeh hücrelerindeki cinsiyete dayalı farklılıklar hakkında çok az şey bilinmektedir. Konjonktiva, sklerayı ve göz kapağının iç yüzeyini kaplayan bir mukoza zarıdır. Konjonktiva epiteli, keratinize olmayan, çok katmanlı, tabakalı skuamöz hücrelerdenoluşur 16.
Konjonktivanın tabakalı skuamöz hücreleri arasında, epitelin apikal yüzeyine serpiştirilmiş goblet hücreleri (CGC'ler) vardır. Bu goblet hücreleri, apikal kutup17'de bulunan çok sayıda salgı granülü ile karakterize edilir. CGC'ler, oküler yüzeyi nemlendirmek ve yanıp sönme sırasında yağlamak için jel oluşturan müsin MUC5AC'yi sentezler ve salgılar17. Müsin sekresyonu, hücre içi [Ca 2 +] ([Ca 2+] i) ve Ras'a bağımlı hücre dışı sinyal regüle kinazın (ERK1 /2) aktivasyonu tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir18. Müsin salgılanamaması, oküler yüzeyin kuruluğuna ve patolojik anormalliklerin sekellerine neden olur. Bununla birlikte, iltihaplı bir oküler yüzeyde, enflamatuar mediatörler tarafından uyarılan geniş müsin salgısı, gözün yapışkanlığı ve kaşıntısı algısına yol açar19. Müsin salgısının bozulduğu bu koşullar sonunda oküler yüzeyin bozulmasına yol açacaktır.
Goblet hücrelerinin oküler müsinin ana kaynağı olarak rolü uzun zamandır bilinmektedir20, ancak hem fizyolojik hem de patolojik durumlarda müsin regülasyonundaki cinsiyete dayalı farklılıklar keşfedilmemiştir. Bir in vitro sistem, kadeh hücrelerinin işlevini hormonal etki olmadan veya hassas bir şekilde kontrol edilen bir seks hormonu seviyesiyle izlemek için yararlı olacaktır. Konjonktival epitel hücre hattı21 gelişmiş olmasına rağmen, fonksiyonel müsin sekresyonu olan goblet hücre hattı mevcut değildir. Bu nedenle, in vitro16'da cinsiyete dayalı farkı analiz etmek için bir yöntem oluşturmak için geliştirdiğimiz birincil insan CGC kültürümüzü değiştirdik ve aşağıdaki gibi sunduk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm insan dokusu, bilimsel araştırmalarda kullanılmak üzere bağışçının önceden bilgilendirilmiş onayı ve izni ile göz bankasına bağışlandı. İnsan konjonktival dokusunun kullanımı Massachusetts Göz ve Kulak İnsan Çalışmaları Komitesi tarafından gözden geçirildi ve muaf olduğu ve insan deneklerle yapılan araştırma tanımına uymadığı belirlendi.
1. Birincil insan kadeh hücre kültürü
- Göz bankasından insan konjonktival dokusuelde edin 16.
- % 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM glutamin, 2 mM esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 2 mM sodyum piruvat, 100 μg / mL penisilin-streptomisin ve 2 mM 4- (2-hidroksietil) -1- piperazineetansülfonik asit (HEPES) ile desteklenmiş kültür ortamı, RPMI-1640 kültür ortamını hazırlayın.
- Birincil hücre kültürünü aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
- Dokuyu steril bir neşter ile1 mm 3 parçaya bölün ve bir kültür başlığındaki kültür plakalarına tohumlayın. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dört parça tohumlayın, 1 mL tam RPMI ortamında. Doku parçasının oryantasyonu hücre büyümesini etkilemese de, neşter bıçağını kullanarak büyümeyi sağlamak için parçaların kültür plakasına yapıştığından emin olun.
- Doku parçalarını 37 °C'de %95 hava ve %5CO2 içeren inkübatöre yerleştirin. Goblet hücreleri yaklaşık 14 gün içinde% 70 -% 80 birleşmeye ulaşana kadar aynı kültür ortamını her iki günde bir yenileyin. Tohumlamadan yaklaşık 72 saat sonra doku tıkacını çıkarın.
NOT: İnsan konjonktival epiteli esas olarak tabakalı skuamöz hücreler ve goblet hücreleri içerir. RPMI, goblet hücreleri için seçici bir ortamdır. Nadiren insan CGC kültüründe, fibroblastlar 7. gün civarında büyüyebilir. Kültürü saflaştırma yöntemi önceki bir yayında açıklanmıştır 22. - Sitokeratin (CK)7 ve Helix pomatia lektin-1 (HPA-1)22'yi hedefleyen immünofloresan mikroskobu (IFM) kullanarak GC kültürünün saflığını,19'da açıklanan standart IFM yöntemini izleyerek doğrulayın; Temsili sonuçlara bakın.
2. İnsan konjonktival goblet hücre geçişi ve deneysel hazırlık
- Hücreleri PBS (pH = 7.4) ile durulayın ve 1x EDTA'da% 0.05 tripsin kullanarak hücreleri tripsinizasyon ile ayırın. Hücreleri her dakika mikroskop altında gözlemleyin. Hücreler alttan ayrıldıktan sonra, tam RPMI ortamını kullanarak tripsini devre dışı bırakın.
- Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 150 × g'da santrifüjleyin. Hücre peletini tam RPMI kültür ortamında yeniden süspanse edin ve [Ca2 +] i ölçümü için cam tabanlı kültür kaplarına yeniden tohumlayın. Ortamın toplam hacmi çanak başına 300 μL'dir. Ortamı yemeğin cam kısmının ortasında tutun.
- Kültür ortamındaki hormonların eliminasyonu: Kültür ortamı, özellikle FBS olmak üzere seks hormonları içerebilir. RPMI-1640'ta bulunan fenol kırmızısı östrojenik aktiviteye 23,24 sahip olduğundan, RPMI ortamını fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamıyla değiştirin ve tüm ortamı hazırladıktan sonra pH şeritleri kullanarak pH'ı 7.45'e ayarlayın. Komple ortamda bulunan HEPES, pH'ı nispeten küçük bir aralıkta tutar.
3. [Ca2+]i ölçümü için fura-2/asetoksimetil () testi
- Fura-2/yüklemesini aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
- Hücreleri cam alt tabaklarda 37 ° C'de, ortam atmosferinde 1 saat inkübe edin ve Krebs-Ringer bikarbonat tamponu (KRB; 119 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.0 mM CaCl 2, 1.2 mMMgSO4 ve 25 mM NaHCO3 içeren) ile ışıktan korunarak %0.5 HEPES (Tablo 1) artı %0.5 BSA, 0.5 μM fura-2/, 8 μM pluronik asit F127 ve 250 μM sülfinpirazon.
- Kullanmadan önce bir pH metre kullanarak pH'ı 7.45'e ayarlayın. Fura-2/ile yükledikten sonra, hücreleri [Ca 2+]i ölçümünden hemen önce250 μM sülfinpirazon içeren KRB ile yıkayın.
- Aşağıda açıklandığı gibi [Ca2+]i ölçümü gerçekleştirin.
- Fura-2 yüklü hücreleri içeren tabakları mikroskop altına yerleştirin, 20x büyütmede 20 hücre ile 50 hücre arasında temsili bir alan bulun ve yazılıma arka plan floresansının ne olduğunu ve ne olmadığını belirtmek için her hücrenin etrafına bir taslak çizmek için Freehand işlevini kullanın.
- Yazılımın arka plan floresansını ölçümden otomatik olarak çıkarmasını bekleyin ve Deneyi Başlat düğmesine tıklayın.
- Ardından, ilgilenilen agonisti dikkatlice pipetlemeden önce hücrelerdeki bazal kalsiyum seviyelerini belirlemek için 8 saniye ile 15 saniye arasında bekleyin. Agonisti ekledikten sonra veya kalsiyum seviyeleri taban çizgisine dönene kadar en az 120 saniye boyunca ölçmeye devam edin.
- Aşağıda açıklandığı gibi veri analizi gerçekleştirin.
- Uyaranların eylemlerini temsil etmek için tepe [Ca2+]i'deki değişikliği kullanın. Ölçümlerin ilk 8-15 saniyesinden itibaren her hücredeki ortalama bazal kalsiyum seviyesini hesaplayın. Bu sayı 500 nM'ye eşit veya üzerindeyse, apoptoz veya nekroz geçiren bu hücreyi veri kümesinden çıkarın.
- Her hücrenin bazal seviyesi hesaplandıktan sonra, bu miktarı aynı hücre için ölçülen maksimum [Ca2 +] i'den çıkarın. Belirli bir tabaktaki tüm hücreler için tepe [Ca2+] I'deki değişimin ortalamasını alın.
- Tutarlılığı sağlamak için, her bir uyaranın yanıtlarını iki kopya olarak kaydedin ve kopyalardan elde edilen tepe [Ca2 +] i'deki değişikliklerin ortalama değerini, bireysel insan örneğinden tek bir veri noktası olarak hesaplayın. Çalışma tasarımına dayalı olarak uygun bir veri analizi yöntemi kullanarak farklı gruplardan elde edilen verileri karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Birincil kültürdeki insan CGC'leri yaklaşık 14 gün içinde %80 birleşmeye ulaşır. Hücre tipi, goblet hücre belirteçleri CK7 veHPA-1 25'e karşı antikorlarla immünofloresan boyama ile doğrulandı (Şekil 1). FBS'nin ortamdan çıkarılması seks hormonlarını ortadan kaldırabilse de, FBS eksikliği potansiyel olarak hücresel yanıtı etkileyebilir. Hormon eliminasyon yöntemini doğrulamak için, goblet hücrelerini çevreleyen farklı sinir uçlarının aracılık ettiği fizyolojik goblet hücresi sekresyonunu taklit etmek için uyaran olarak bir kolinerjik agonist (karbakol, Cch 1 × 10-4 M) kullanıldı26. Kontrol tam RPMI ortamından kalsiyumdaki değişimin büyüklüğünde bir fark gözlenmedi, bu da bu yöntemin hücre tepkisindeki cinsiyete dayalı farkı incelemek için uygulanabileceğini gösteriyor.
Protokol bölümünde tarif edilen Fura-2 / testi, tam RPMI +% 10 FBS ortamı, gelişmiş RPMI ortamı,% 1 BSA ile desteklenmiş gelişmiş RPMI ortamı (RPMI, tescilli bir insülin konsantrasyonu sağladı) ve% 1 BSA ile fenol kırmızısı içermeyen RPMI ile muamele edildi. Sonuçlar dört kişiden elde edilmiştir. Fenol kırmızısı içermeyen RPMI'de inkübe edilen hücreler %1 BSA ve tam RPMI ortamı ile karşılaştırıldığında anlamlı bir fark bulunmadı. Bununla birlikte, gelişmiş RPMI orta grubu tam RPMI orta grubu ile karşılaştırıldığında, Cch 1 × 10-4 M'ye önemli ölçüde artmış [Ca 2+] i yanıtı gözlenmiştir (Şekil 2). Özetle, %1 BSA'lı fenol kırmızısı içermeyen RPMI, goblet hücrelerinin hücresel tepkisini etkilemez, hatta mevcut araştırma ortamında gelişmiş RPMI ortamından daha iyi performans gösterir.
Şekil 1: İnsan konjonktival goblet hücresi primer kültürü. Konjonktival goblet hücreleri, kültürde 14 gün sonra lamellere geçirildi ve CK7'ye (kırmızı) karşı primer antikor ve floresein konjuge lektin HPA-1 (yeşil) kullanılarak immünofloresan boyama yapıldı. (A) Görüntüler 200x büyütme altında ve (B) görüntüler 630x büyütme altında çekilmiştir. CK7, perinükleer bir floresan sinyali (sol panel) olarak sunulur; HPA-1, perinuclear (orta panel) bir noktalama deseni sunar. Hem CK7 hem de HPA-1'in pozitif immünofloresan sinyali bir goblet hücresini gösterir. Negatif kontrol, primer antikorun (C) yokluğunda inkübasyondur. Ölçek çubukları = 50 μm (A) ve 8 μm (B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farklı ortamların Cch kaynaklı [Ca2 +] i yanıtı üzerindeki etkileri. Hücreler, 1 ×ila 10-4 M Cch eklenmeden önce 48 saat inkübasyon için %1 BSA'lı fenol kırmızısı içermeyen RPMI, %10 FBS'li RPMI ortamı veya %1 BSA'lı gelişmiş RPMI ile inkübe edildi. [Ca 2 +] i, Fura2 testi ile ölçüldü ve pik [Ca2 +] i'deki değişim hesaplandı ve grafikte gösterildi. Siyah çubuk, fenol kırmızısı ve %10 FBS içeren tam ortamı gösterir. Turuncu çubuk, %1 BSA ile ileri ortayı gösterir ve gri çubuk, fenol kırmızısı içermeyen ve %1 BSA ile RPMI'yi gösterir. Veriler ortalama ± SEM, n = 4'tür. Çoklu grup karşılaştırmalarında Dunnett düzeltmeli tek yönlü varyans analizi kullanıldı, p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak belirlendi. * Gruplar arasında anlamlı fark olduğunu gösterir. Kısaltmalar: Cch = karbakol; [Ca2+] i = hücre içiCa2+ konsantrasyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Stok Bileşeni | 250 mL KRB için miktar | Son Konsantrasyon |
| Glikoz | 0.25 gr | %0,1 a/v |
| 1 milyon NaCl | 30 mL | 119 milyon |
| 0,5 M NaHCO3 | 12,5 mL | 25 milyon |
| 1 M4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) | 2,5 mL | 10 milyon |
| 1 milyon KCl | 1,2 mL | 4,8 milyon |
| 1 M KH2PO4 | 300 μL | 1,2 milyon |
| 1 MMgS04 | 300 μL | 1,2 milyon |
| 1 M CaCl2 | 250 μL | 1 milyon |
Tablo 1: KRB için malzeme ve formül. Kısaltma: w/v, ağırlık/hacim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oküler dokulardaki cinsiyete dayalı farklılıkların araştırılması, bir cinsiyeti orantısız bir şekilde etkileyen hastalıkların, özellikle kuru göz ve alerjik konjonktivitin süreçlerini anlamaya yardımcı olur 4,5,6. Bu çalışmalar için hayvan modelleri kullanılabilse de, doğrudan insan dokusundan elde edilen veriler, in vivo insan hücrelerine en yüksek benzerlik nedeniyle önemlidir. Mevcut deney ortamında kullanılan konjonktival dokular, 70-85 yaş aralığında (postmenopozal) ölen donörlerden alınmıştır ve bu da hormonal etkinin ante mortem kontrolünü kolaylaştırmaktadır. Burada, insan CGC'lerindeki cinsiyete dayalı farklılıkları incelemek için uygun maliyetli bir yöntem sunduk.
Tutarlı veriler elde etmek için kritik adım, seks hormonlarının etkilerini ortadan kaldırmak için deneylerden önce 48 saat boyunca FBS ve fenol kırmızısının çıkarılmasıdır. Seks hormonlarının hücrelerdeki etkileri, transkripsiyonel olmayan ve transkripsiyonel etkiler olarak kategorize edilebilir. Transkripsiyonel olmayan etkilere birkaç saniye ila dakika içinde G-proteinleri aracılığıyla hızla aracılık edilir ve belirli genlerin aktive edildiği transkripsiyonel etki 30 dakika ila birkaç saat sürer27; östrojen kaynaklı östrojen reseptörü alfa'nın (ERα) yarılanma ömrü 2-6 saat28,29'dur. Diğer seks hormonu kaynaklı proteinlerin devir hızları nadiren rapor edilse de, mevcut çalışmalardan elde edilen sonuçlar, seks hormonu kaynaklı proteinlerin saatler içinde sentezlendiğini ve parçalandığını göstermektedir. Bu nedenle, normal hücresel fonksiyonu korurken FBS'de bulunan hormonların potansiyel etkisini yıkamak için 48 saat yeterlidir. Mevcut yöntemi kullanarak, CGC'lerde cinsiyet hormonu reseptörlerinin ve hücresel fonksiyonların ekspresyonunda cinsiyete dayalı farklılıkları başarıyla bildirdik30.
FBS, goblet hücre kültürlerinin sağlıklı ve canlı kalması için önemli bir faktördür. Normal ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS'yi kömürle soyulmuş FBS ile değiştirmek, kültür sistemindeki seks hormonlarını ortadan kaldırmanın başka bir olası yoludur. Kömürden sıyrılmış FBS kullanmanın sınırlaması, FBS'nin maliyeti ve karmaşık bileşimidir. FBS'nin tamamen kaldırılması, FBS'nin tanımlanmamış ortam bileşenlerinden kaynaklanan olası tutarsızlığı da ortadan kaldırır.
[Ca2+]i ölçümü için kritik adım, pH ve sıcaklığın stabilize edilmesidir. HEPES takviyesine rağmen, oda sıcaklığında saklandığında zamanla KRB tamponunda pH'da bir kayma olduğunu fark ettik. Bu nedenle, uzun bir deney için yaklaşık her 3 saatte bir tamponun pH'ının yeniden ayarlanması önerilir. Aynı [Ca2 +] i yöntemi, farklı uyaranların etkisini incelemek için konjonktivanın tabakalı skuamöz hücreleri, vasküler endotel hücreleri, mikroglial hücreler ve nöronlar gibi diğer hücre türleri için de geçerlidir.
Fura-2'nin hücredeki serbest kalsiyuma bağlanması, tepe absorpsiyon dalga boyunda 380 nm'den (bağlanmamış) 340 nm'ye (bağlı) bir değişikliğe neden olur. Bununla birlikte, emisyon dalga boyu 510 nm'de kalır ve bu emisyonlar kamera tarafından siyah beyaz görüntüler olarak yakalanır. 340 nm ve 380 nm ışık tarafından uyarılan emisyon yoğunluğunun oranı kaydedilir. Bir [Ca2+]i konsantrasyonunu hesaplamak için 340/380 oranını bir stand eğrisiyle karşılaştırmanın yanı sıra, standart bir eğri oluşturmak zorunda kalmadan, dolayısıyla gerçek bir konsantrasyon olmadan oranın kat değişimi de rapor edilebilir. Araştırmacılar, ekipman kurulumlarına ve deneysel tasarıma göre her iki yolu da seçebilirler.
Sonuç olarak, kültürlenmiş primer konjonktival goblet hücreleri, oküler yüzey hastalıklarının cinsiyete dayalı farklılıklarını incelemek için bir model olarak kullanılabilir. Herhangi bir deney yapmadan önce% 1 BSA ile fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamında 48 saat inkübasyon, kültür ortamındaki hormonların potansiyel etkilerini ortadan kaldırmak için tutarlı ve uygun maliyetli bir yöntemdir ve hormon seviyelerini kontrol etmek için bazal bir ortam olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Çalışma, Ulusal Göz Enstitüsü Hibe EY019470 (DAM) tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
- Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
- Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians' Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
- Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
- Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
- Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3 (2020).
- Yang, J. -H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
- Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
- Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
- Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
- Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
- Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
- Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
- Suzuki, T., et al. Estrogen's and progesterone's impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
- Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
- Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
- Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
- Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
- Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
- García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220 (2022).
- Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C.
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
- García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
- Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
- Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
- Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
- Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
- Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305 (2022).
