Summary
在基于性别的差异研究中，无酚红/无胎牛血清培养基是比晚期 RPMI 更好的选择，可在不改变结膜杯状细胞正常功能的情况下消除外源激素。
Abstract
干眼症是一种影响眼表健康的多因素疾病，女性的患病率要高得多。结膜杯状细胞 （CGC） 分泌到眼表的凝胶形成粘蛋白被破坏会导致多种眼表疾病。在CGC基于性别的差异的体外研究期间，消除外源性激素对于获得一致的结果至关重要。本文描述了一种在CGCs基于性别的差异研究中最大限度地减少外源性激素存在的方法，同时保持其生理功能。将来自死后人类供体的CGC在含有10%胎牛血清（FBS）（称为完全培养基）的RPMI培养基中从结膜碎片中培养，直至汇合。在实验开始前近48小时，将CGC转移到不含酚红或FBS但含有1%BSA（称为无酚红培养基）的RPMI培养基中。通过使用呋喃 2/乙酰氧基甲基 （AM） 显微镜测量卡巴酚 （Cch， 1 x 10-4 M） 刺激后细胞内 [Ca 2+] （[Ca2+]i） 的增加来研究正常细胞功能。结果表明，CGCs在无酚红培养基中48 h后仍能维持正常功能。在Cch刺激下，无酚红RPMI培养基和完全培养基之间的[Ca2+]i反应没有显著差异。因此，在基于性别的差异研究中，我们推荐使用含有 1% BSA 的不含酚红的 RPMI 培养基来消除外源激素，而不会改变 CGC 的正常功能。
Introduction
基于性别的差异影响眼表的多个过程 1,2,3。这些基于性别的差异的临床表现是男性和女性之间许多眼表疾病患病率的差异，例如干眼症和结膜炎4,5,6。有证据表明，基于性别的差异源于多个生物学水平，包括 X 和 Y 染色体7 上基因的不同特征以及激素的影响8。研究基于性别的差异的分子基础可以更好地了解疾病，并最终改善个性化医疗。
眼表包括覆盖的泪膜、角膜和结膜。在眼表的多个组成部分中观察到基于性别的差异，包括泪膜 9,10、角膜 11、泪腺12,13 和也分泌泪液的睑板腺12。许多机制研究调查了性激素对角膜及其相关成分的影响14,15;然而，人们对结膜及其杯状细胞的性别差异知之甚少。结膜是覆盖硬膜和眼睑内表面的粘膜。结膜上皮由非角化、多层、分层的鳞状细胞组成16。
在结膜的分层鳞状细胞中，有散布在上皮顶端表面的杯状细胞（CGC）。这些杯状细胞的特征在于位于顶极17的大量分泌颗粒。CGCs合成并分泌凝胶形成粘蛋白MUC5AC，以滋润眼表并在眨眼时润滑眼表17。粘蛋白分泌受到细胞内 [Ca 2+] （[Ca2+]i） 和 Ras 依赖性细胞外信号调节激酶 （ERK1/2）18 的激活的严格调节。不能分泌粘蛋白会导致眼表干燥和病理异常的后遗症。然而，在发炎的眼表上，炎症介质刺激的大量粘蛋白分泌导致眼睛的粘稠感和瘙痒感19.这些粘蛋白分泌紊乱的情况最终会导致眼表恶化。
杯状细胞作为眼粘蛋白主要来源的作用早已得到认可20，然而，生理和病理状态下粘蛋白调节的性别差异仍未被发现。体外系统可用于监测杯状细胞的功能，而没有激素效应或精确控制性激素水平。尽管结膜上皮细胞系已经发育了21 种，但没有具有功能性粘蛋白分泌的杯状细胞系可用。因此，我们修改了我们开发的原代人类CGC培养物，以建立一种分析体外性别差异的方法16，并呈现如下。
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Protocol
所有人体组织均经捐献者事先知情同意和授权捐献至眼库，用于科学研究。马萨诸塞州眼耳人类研究委员会审查了人类结膜组织的使用，并确定为豁免，不符合人类受试者研究的定义。
1. 原代人杯状细胞培养
- 从眼库中，获得人结膜组织16.
- 制备培养基，补充有10%胎牛血清（FBS），2mM谷氨酰胺，2mM非必需氨基酸（NEAA），2mM丙酮酸钠，100μg/ mL青霉素 - 链霉素和2mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）的RPMI-1640培养基。
- 如下所述进行原代细胞培养。
- 用无菌手术刀将组织切成 1 mm3 块，然后接种到培养罩中的培养板上。在 6 孔板的每个孔中接种 4 块，放入 1 mL 完全 RPMI 培养基中。虽然组织片的方向不会影响细胞生长，但要确保片粘附在培养板上，以确保使用手术刀刀片生长。
- 将组织块放入含有95%空气和5%CO2 的培养箱中，温度为37°C。 每隔一天刷新一次相同的培养基，直到杯状细胞在大约 14 天内达到 70%-80% 汇合度。接种后约72小时取出组织塞。
注：人结膜上皮主要含有分层的鳞状细胞和杯状细胞。RPMI是杯状细胞的选择性培养基。在人CGC培养物中，成纤维细胞很少在第7天左右生长。纯化培养物的方法在先前的出版物 22中进行了描述。 - 按照19中描述的标准IFM方法，使用靶向细胞角蛋白（CK）7和Helix pomatia lectin-1（HPA-1）22的免疫荧光显微镜（IFM）验证GC培养物的纯度;查看代表性结果。
2.人结膜杯状细胞传代及实验制备
- 用PBS（pH = 7.4）冲洗细胞，并使用0.05%胰蛋白酶在1x EDTA中分离细胞。在显微镜下每分钟观察一次细胞。一旦细胞从底部分离，使用完全的RPMI培养基使胰蛋白酶失活。
- 在室温下以150× g 离心细胞5分钟。将细胞沉淀重悬于完全RPMI培养基中，并重新接种到玻璃底培养皿上进行[Ca2 + ] i 测量。培养基的总体积为每培养皿 300 μL。将介质放在培养皿玻璃部分的中心。
- 消除培养基中的激素：培养基中可能含有性激素，尤其是FBS。由于RPMI-1640中所含的酚红具有雌激素活性23,24，因此在制备完全培养基后，用不含酚红的RPMI培养基代替RPMI培养基，并使用pH条将pH调节至7.45。完全培养基中所含的HEPES将pH值保持在相对较小的范围内。
3. 用于 [Ca2+]i 测量的呋喃-2/乙酰氧基甲基 （AM） 测定
- 如下所述执行 Fura-2/AM 加载。
- 将细胞在玻璃底培养皿中在37°C，环境气氛下孵育1小时，并用Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液（KRB;含有119mM NaCl，4.8mM KCl，1.0mM CaCl 2,1.2mM MgSO4和25mM NaHCO3）与0.5%HEPES（表1）加0.5%BSA，0.5μMfura-2 / AM， 8μM噗酸F127和250μM磺胺吡喃酮。
- 使用前使用 pH 计将 pH 值调节至 7.45。加载呋喃-2 / AM后，在[Ca2 + ] i 测量之前立即用含有250μM磺胺吡咪酮的KRB洗涤细胞。
- 如下所述进行 [Ca2+]i 测量。
- 将含有装有 fura-2 的细胞的培养皿置于显微镜下，以 200 倍放大倍率定位包含 20 至 50 个细胞的代表性区域，并使用 手绘 功能在每个细胞周围绘制轮廓，以向软件指示什么是背景荧光，什么不是背景荧光。
- 等待软件自动从测量中减去背景荧光，然后单击“ 开始实验 ”按钮。
- 然后，等待 8 秒和 15 秒以建立细胞中的基础钙水平，然后小心地移入感兴趣的激动剂。添加激动剂后继续测量至少 120 秒或直到钙水平恢复到基线。
- 如下所述执行数据分析。
- 使用峰值 [Ca2+]i 的变化来表示刺激的作用。从测量的前 8-15 秒计算每个细胞中的平均基础钙水平。如果该数字等于或高于 500 nM，则从数据集中删除该细胞，因为它正在经历细胞凋亡或坏死。
- 计算出每个细胞的基础水平后，从同一细胞的最大测量值 [Ca2+]i 中减去该量。平均给定培养皿中所有细胞的峰 [Ca2+]I 变化。
- 为确保一致性，将每个刺激的响应记录一式两份，并计算从重复项获得的峰值 [Ca2+]i 变化的平均值，作为单个人类样本的一个数据点。根据研究设计，使用适当的数据分析方法比较不同组的数据。
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Representative Results
原代培养物中的人 CGC 在大约 14 天内增长到 80% 汇合度。通过对杯状细胞标志物CK7和HPA-125 的抗体进行免疫荧光染色来确认细胞类型（图1）。尽管从培养基中去除FBS可以消除性激素，但缺乏FBS可能会影响细胞反应。为了验证激素消除方法，使用胆碱能激动剂（卡巴胆碱，Cch 1 × 10-4 M）作为刺激物，以模拟由杯状细胞周围的不同神经末梢介导的生理性杯状细胞分泌26。从对照完全RPMI培养基中观察到钙变化的幅度没有差异，表明该方法可用于研究细胞反应中基于性别的差异。
方案部分中描述的 Fura-2/AM 测定是在用完全 RPMI + 10% FBS 培养基、补充有 1% BSA 的高级 RPMI 培养基（RPMI 提供专有浓度的胰岛素）和含有 1% BSA 的无酚红 RPMI 处理的培养皿上进行的。结果来自四个人。将无酚红RPMI与1%BSA和完全RPMI培养基一起孵育的细胞进行比较时，未发现显著差异。然而，当将晚期RPMI培养基组与完全RPMI培养基组进行比较时，观察到对Cch 1×10-4 M的[Ca2+]i反应显着增加（图2）。总之，含 1% BSA 的无酚红 RPMI 不会影响杯状细胞的细胞反应，甚至在当前研究环境中优于先进的 RPMI 培养基。
图1：人结膜杯状细胞原代培养物。 培养 14 天后，将结膜杯状细胞传代到盖玻片上，并使用针对 CK7 的一抗（红色）和荧光素偶联的凝集素 HPA-1（绿色）进行免疫荧光染色。（A） 图像以 200 倍放大倍率拍摄，（B） 图像以 630 倍放大倍率拍摄。CK7 表现为核周荧光信号（左图）;HPA-1 在核周呈点状模式（中图）。CK7 和 HPA-1 的阳性免疫荧光信号提示杯状细胞。阴性对照是在没有一抗 （C） 的情况下孵育。比例尺 = 50 μm （A） 和 8 μm （B）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：不同介质对 Cch 诱导的 [Ca2+]i 反应的影响。 将细胞与含 1% BSA 的无酚红 RPMI、含 10% FBS 的 RPMI 培养基或含 1% BSA 的高级 RPMI 孵育 48 小时，然后加入 1 × 10-4 M Cch。 [Ca 2+]i通过Fura2测定法测量，计算峰[Ca2+]i的变化并显示在图中。黑条表示含有酚红和 10% FBS 的完全培养基。橙色条表示含有 1% BSA 的高级培养基，灰色条表示不含酚红和 1% BSA 的 RPMI。数据是 SEM ±平均值，n = 4。单因素方差分析与Dunnett校正用于多组比较，p<0.05被设置为具有统计学意义。* 表示组间差异显著。缩写：Cch = carbachol;[钙2+]i = 细胞内 Ca2+ 浓度。请点击这里查看此图的较大版本.
| 库存组件 | 250 mL KRB 的量 | 最终浓度 |
| 葡萄糖 | 0.25 克 | 0.1% w/v |
| 1 M 氯化钠 | 30毫升 | 119 毫米 |
| 0.5 M NaHCO3 | 12.5毫升 | 25 毫米 |
| 1 M 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES） | 2.5毫升 | 10 毫米 |
| 1 M 氯化钾 | 1.2毫升 | 4.8毫米 |
| 1 米 KH2PO4 | 300微升 | 1.2毫米 |
| 1 M 硫酸镁4 | 300微升 | 1.2毫米 |
| 1 M 氯化钙2 | 250微升 | 1 毫米 |
表1：KRB的材料和配方。 缩写：w/v，重量/体积。
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Discussion
研究眼部组织中基于性别的差异有助于了解疾病的过程，尤其是干眼症和过敏性结膜炎，它们不成比例地影响一种性别 4,5,6。尽管动物模型可用于这些研究，但由于与体内人类细胞具有最高的相似性，直接从人体组织获得的数据是必不可少的。当前实验环境中使用的结膜组织来自年龄范围为 70-85 岁（绝经后）的已故供体，因此更容易在生前控制激素效应。在这里，我们提出了一种具有成本效益的方法来研究人类CGC中基于性别的差异。
获得一致数据的关键步骤是在实验前去除FBS和酚红48小时，以消除性激素的影响。性激素在细胞中的作用可分为非转录效应和转录效应。非转录效应在几秒钟到几分钟内通过 G 蛋白快速介导，某些基因被激活的转录效应需要 30 分钟到几个小时27;雌激素诱导的雌激素受体α（ERα）的半衰期为2-6小时28,29。尽管很少报道其他类型的性激素诱导蛋白质的周转率，但现有研究的结果表明，性激素诱导的蛋白质在数小时内合成和降解。因此，48小时足以洗去FBS中所含激素的潜在影响，同时维持正常的细胞功能。使用目前的方法，我们成功地报告了 CGCs30 中性激素受体表达和细胞功能的基于性别的差异。
FBS是杯状细胞培养物保持健康和活力的重要因素。用木炭剥离的FBS代替正常的热灭活FBS是消除培养系统中性激素的另一种可能方法。使用木炭剥离FBS的局限性在于FBS的成本和复杂的成分。完全去除FBS还可以消除FBS中未定义培养基成分的潜在不一致。
[Ca2+]i 测量的关键步骤是稳定pH值和温度。尽管添加了 HEPES，但我们注意到在室温下储存时，KRB 缓冲液中的 pH 值会随着时间的推移而发生变化。因此，建议在长时间的实验中重新调整缓冲液的pH值，大约每3小时一次。同样的[Ca2+]i 方法也适用于其他类型的细胞，如结膜分层鳞状细胞、血管内皮细胞、小胶质细胞和神经元，以研究不同刺激的作用。
Fura-2 与细胞中游离钙的结合导致其峰值吸收波长从 380 nm（未结合）变为 340 nm（结合）。然而，发射波长保持在 510 nm，这些发射被相机捕获为黑白图像。记录了340 nm和380 nm光激发的发射强度之比。除了将 340/380 比率与林分曲线进行比较以计算 [Ca2+]i 浓度外，还可以报告比率的倍数变化，而无需创建标准曲线，因此无需实际浓度。研究人员可以根据他们的设备设置和实验设计选择任何一种方式。
综上所述，培养的原代结膜杯状细胞可作为研究眼表疾病性别差异的模型。在进行任何实验之前，在含有1%BSA的无酚红RPMI培养基中孵育48小时是一种一致且具有成本效益的方法，可消除培养基中激素的潜在影响，并可用作控制激素水平的基础培养基。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作由美国国家眼科研究所资助EY019470（DAD）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
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