Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

في المختبر طريقة لدراسة الاختلافات الجنسية في الخلايا الكأسية الملتحمة

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/64456
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Ophthalmology Schepens Eye Research Institute, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

Summary

يعد الوسط الخالي من الفينول الأحمر / الخالي من مصل الجنين البقري خيارا أفضل من RPMI المتقدم للتخلص من الهرمونات الخارجية دون تغيير الوظيفة الطبيعية لخلايا كأس الملتحمة في دراسة الاختلافات القائمة على الجنس.

Abstract

جفاف العين هو مرض متعدد العوامل يؤثر على صحة سطح العين ، مع انتشار أعلى بشكل كبير لدى النساء. يساهم اضطراب الميوسين المكون للهلام الذي تفرزه الخلايا الكأسية الملتحمة (CGCs) على سطح العين في أمراض سطح العين المتعددة. يعد التخلص من الهرمونات الجنسية الخارجية أمرا ضروريا للحصول على نتائج متسقة أثناء الدراسة المختبرية للاختلافات القائمة على الجنس في CGCs. تصف هذه الورقة طريقة لتقليل وجود الهرمونات الخارجية في دراسة الاختلافات القائمة على الجنس في CGCs مع الحفاظ على وظيفتها الفسيولوجية. تم استزراع CGCs من المتبرعين البشريين بعد الوفاة من كلا الجنسين من قطع من الملتحمة في وسط RPMI مع مصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (يشار إليه باسم الوسط الكامل) حتى التقاء. قبل ما يقرب من 48 ساعة من بدء التجارب ، تم نقل CGCs إلى وسط RPMI بدون الفينول الأحمر أو FBS ولكن مع 1٪ BSA (يشار إليه باسم الوسط الخالي من الفينول الأحمر). تمت دراسة الوظيفة الخلوية الطبيعية عن طريق قياس الزيادة في تحفيز [Ca 2+] ([Ca 2+] i) داخل الخلايا بعد تحفيز الكرباكول (Cch ، 1 × 10-4 M) باستخدام المجهر fura 2 / acetoxymethyl (AM). أظهرت النتيجة أن CGCs حافظت على الوظيفة الطبيعية في الوسائط الخالية من الفينول الأحمر بعد 48 ساعة. لم يلاحظ فرق كبير في استجابة [Ca2+]i بين وسط RPMI الخالي من الفينول الأحمر والوسط الكامل عند تحفيز Cch. لذلك ، نوصي باستخدام وسيط RPMI الخالي من الفينول الأحمر مع 1٪ BSA للتخلص من الهرمونات الخارجية دون تغيير الوظيفة الطبيعية ل CGCs في دراسة الاختلافات القائمة على الجنس.

Introduction

تؤثر الاختلافات القائمة على الجنس على عمليات متعددة لسطح العين1،2،3. المظهر السريري لهذه الاختلافات القائمة على الجنس هو الاختلاف في انتشار العديد من أمراض سطح العين بين الرجال والنساء ، مثل جفاف العين والتهاب الملتحمة4،5،6. تشير الدلائل إلى أن الاختلافات القائمة على الجنس تنشأ من مستويات بيولوجية متعددة ، بما في ذلك الملامح المختلفة للجينات على كروموسومات X و Y7 وتأثيرات الهرمونات8. يمكن أن توفر دراسة الأساس الجزيئي للاختلافات القائمة على الجنس فهما أفضل للمرض ، وفي النهاية ، تحسين الطب الشخصي.

يتكون سطح العين من الغشاء المسيل للدموع والقرنية والملتحمة. لوحظت الاختلافات القائمة على الجنس في مكونات متعددة من سطح العين ، بما في ذلك الفيلم المسيل للدموع9،10 ، والقرنية11 ، والغدة الدمعية 12،13 ، وغدد ميبوميان التي تفرز أيضا الدموع 12. حققت العديد من الدراسات الميكانيكية في تأثير الهرمونات الجنسية على القرنية والمكونات المرتبطة بها14,15 ؛ ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن الاختلافات القائمة على الجنس في الملتحمة وخلاياها الكأسية. الملتحمة هي غشاء مخاطي يغطي الصلبة والسطح الداخلي للجفن. تتكون ظهارة الملتحمة من خلايا حرشفية طبقية غير كيراتينيةمتعددة الطبقات 16.

من بين الخلايا الحرشفية الطبقية للملتحمة ، توجد خلايا كأسية (CGCs) تتخللها على السطح القمي للظهارة. تتميز هذه الخلايا الكأسية بعدد كبير من الحبيبات الإفرازية الموجودة في القطب القمي17. تقوم CGCs بتصنيع وإفراز الميوسين المكون للهلام MUC5AC لترطيب سطح العين وتليينه أثناء الوميض17. يتم تنظيم إفراز الميوسين بإحكام بواسطة [Ca 2+] ([Ca2+] i) وتنشيط كيناز تنظيم الإشارة خارج الخلية المعتمد على Ras (ERK1 / 2) 18. عدم القدرة على إفراز الميوسين يؤدي إلى جفاف سطح العين وعقابيل التشوهات المرضية. ومع ذلك ، على سطح العين الملتهب ، يؤدي إفراز الميوسين المكثف الذي يحفزه الوسطاء الالتهابيون إلى إدراك الالتصاق والحكة في العين19. هذه الظروف مع إفراز الميوسين المضطرب ستؤدي في النهاية إلى تدهور سطح العين.

منذ فترة طويلة تم التعرف على دور الخلايا الكأسية كمصدر رئيسي للميوسين العيني20 ، ومع ذلك ، فإن الاختلافات القائمة على الجنس في تنظيم الميوسين في كل من الحالات الفسيولوجية والمرضية لا تزال غير مكتشفة. سيكون النظام في المختبر مفيدا لمراقبة وظيفة الخلايا الكأسية دون التأثير الهرموني أو بمستوى متحكم فيه بدقة من الهرمونات الجنسية. على الرغم من أن خط الخلية الطلائية الملتحمة قد طور21 ، لا يوجد خط خلية كأسية مع إفراز الميوسين الوظيفي المتاح. لذلك ، قمنا بتعديل ثقافة CGC البشرية الأولية المتقدمة لدينا لإنشاء طريقة لتحليل الاختلاف القائم على الجنس في المختبر16 ، وتقديمه على النحو التالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم التبرع بجميع الأنسجة البشرية إلى بنك العيون بموافقة مسبقة مستنيرة وإذن من المتبرع لاستخدامها في البحث العلمي. تمت مراجعة استخدام أنسجة الملتحمة البشرية من قبل لجنة الدراسات البشرية للعين والأذن في ماساتشوستس وتقرر أنها معفاة ولا تفي بتعريف البحث مع البشر.

1. زراعة الخلايا الكأسية البشرية الأولية

  1. من بنك العين ، احصل على أنسجة الملتحمة البشرية16.
  2. تحضير وسط الاستزراع ، وسط زراعة RPMI-1640 المكمل بمصل بقري جنيني 10٪ (FBS) ، 2 مللي مول جلوتامين ، 2 مللي مول أحماض أمينية غير أساسية (NEAA) ، 2 مللي مول بيروفات الصوديوم ، 100 ميكروغرام / مل بنسلين ستربتومايسين ، و 2 مللي مول 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1- حمض بيبيرازينإيثان سلفونيك (HEPES).
  3. نفذ زراعة الخلايا الأولية كما هو موضح أدناه.
    1. فرم الأنسجة إلى قطع 1 مم3 بمشرط معقم والبذور على أطباق الثقافة في غطاء الاستزراع. قم بزرع أربع قطع في كل بئر من صفيحة ذات 6 آبار ، في 1 مل من وسائط RPMI الكاملة. على الرغم من أن اتجاه قطعة الأنسجة لا يؤثر على نمو الخلايا ، تأكد من أن القطع تلتصق بلوحة الثقافة لضمان النمو باستخدام شفرة المشرط.
    2. ضع قطع الأنسجة في الحاضنة التي تحتوي على 95٪ هواء و 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية. قم بتحديث نفس وسط المزرعة كل يومين حتى تصل الخلايا الكأسية إلى التقاء 70٪ -80٪ في حوالي 14 يوما. قم بإزالة سدادة الأنسجة بعد حوالي 72 ساعة من البذر.
      ملاحظة: تحتوي ظهارة الملتحمة البشرية بشكل أساسي على خلايا حرشفية طبقية وخلايا كأسية. RPMI هو وسيط انتقائي للخلايا الكأسية. نادرا في ثقافة CGC البشرية ، قد تنمو الخلايا الليفية في حوالي اليوم 7. تم وصف طريقة تنقية الثقافة في منشور سابق 22.
    3. التحقق من نقاء ثقافة GC باستخدام المجهر المناعي (IFM) الذي يستهدف السيتوكيراتين (CK)7 و Helix pomatia lectin-1 (HPA-1)22 باتباع طريقة IFM القياسية الموصوفة في19 ؛ انظر النتائج التمثيلية.

2. مرور خلية كأس الملتحمة البشرية والتحضير التجريبي

  1. شطف الخلايا مع PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4) وفصل الخلايا مع التربسين باستخدام 0.05 ٪ التربسين في 1x EDTA. مراقبة الخلايا كل دقيقة تحت المجهر. بمجرد فصل الخلايا عن القاع ، قم بإلغاء تنشيط التربسين باستخدام وسائط RPMI كاملة.
  2. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 150 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط زراعة RPMI الكامل وأعد زرعها في أطباق الاستزراع ذات القاع الزجاجي لقياس [Ca2+]i . الحجم الإجمالي للوسط هو 300 ميكرولتر لكل طبق. احتفظ بالوسائط في وسط الجزء الزجاجي من الطبق.
  3. القضاء على الهرمونات في وسط الثقافة: قد يحتوي وسط المزرعة على هرمونات جنسية ، وخاصة FBS. نظرا لأن الفينول الأحمر الموجود في RPMI-1640 له نشاط استروجيني 23,24 ، استبدل وسط RPMI بوسط RPMI الخالي من الفينول الأحمر واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.45 باستخدام شرائط الأس الهيدروجيني بعد تحضير الوسط الكامل. يحافظ HEPES الموجود في الوسط الكامل على درجة الحموضة إلى نطاق صغير نسبيا.

3. مقايسة Fura-2 / acetoxymethyl (AM) لقياس [Ca2+] i

  1. قم بإجراء تحميل Fura-2 / AM كما هو موضح أدناه.
    1. احتضان الخلايا في أطباق زجاجية القاع لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، والجو المحيط ، ومحمية من الضوء باستخدام مخزن بيكربونات كريبس رينجر (KRB ؛ يحتوي على 119 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 4.8 مللي متر KCl ، 1.0 مللي متر CaCl2 ، 1.2 mM MgSO 4 ، و 25 mM NaHCO3) مع 0.5٪ HEPES (الجدول 1) ، بالإضافة إلى 0.5٪ BSA ، 0.5 ميكرومتر fura-2 / AM، 8 ميكرومتر حمض بلورونيك F127 ، و 250 ميكرومتر سلفينبيرازوني.
    2. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.45 باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني قبل الاستخدام. بعد التحميل باستخدام fura-2 / AM ، اغسل الخلايا باستخدام KRB الذي يحتوي على 250 ميكرومتر سلفينبيرازون مباشرة قبل قياس [Ca2+] i .
  2. قم بإجراء قياس [Ca2+]i كما هو موضح أدناه.
    1. ضع الأطباق التي تحتوي على الخلايا المحملة ب fura-2 تحت المجهر ، وحدد موقع حقل تمثيلي يحتوي على ما بين 20 خلية و 50 خلية بتكبير 200x ، واستخدم وظيفة Freehand لرسم مخطط تفصيلي حول كل خلية للإشارة إلى البرنامج ما هو مضان الخلفية وما هو ليس مضان.
    2. انتظر حتى يقوم البرنامج تلقائيا بطرح مضان الخلفية من القياس وانقر فوق الزر "بدء التجربة ".
    3. بعد ذلك ، انتظر ما بين 8 ثوان و 15 ثانية لتحديد مستويات الكالسيوم الأساسية في الخلايا قبل أن يتم امتصاصها بعناية في ناهض الاهتمام. استمر في القياس لمدة 120 ثانية على الأقل بعد إضافة الناهض أو حتى تعود مستويات الكالسيوم إلى خط الأساس.
  3. قم بإجراء تحليل البيانات كما هو موضح أدناه.
    1. استخدم التغيير في الذروة [Ca2+]i لتمثيل تصرفات المحفزات. احسب متوسط مستوى الكالسيوم الأساسي في كل خلية من أول 8-15 ثانية من القياسات. إذا كان هذا الرقم يساوي أو يزيد عن 500 نانومتر ، فقم بإزالة تلك الخلية من مجموعة البيانات لأنها تخضع لموت الخلايا المبرمج أو النخر.
    2. بمجرد حساب المستوى الأساسي لكل خلية ، اطرح هذا المبلغ من الحد الأقصى المقاس [Ca2+] i لنفس الخلية. متوسط التغير في الذروة [Ca2+]I لجميع الخلايا في طبق معين.
    3. لضمان الاتساق ، سجل استجابات كل حافز في نسختين ، واحسب متوسط قيمة التغييرات في الذروة [Ca2+] i التي تم الحصول عليها من التكرارات كنقطة بيانات واحدة من العينة البشرية الفردية. مقارنة البيانات من مجموعات مختلفة باستخدام طريقة تحليل البيانات المناسبة بناء على تصميم الدراسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تنمو CGCs البشرية في الثقافة الأولية إلى التقاء 80٪ في حوالي 14 يوما. تم تأكيد نوع الخلية من خلال تلطيخ التألق المناعي بالأجسام المضادة لعلامات الخلايا الكأسية CK7 و HPA-125 (الشكل 1). على الرغم من أن إزالة FBS من الوسط يمكن أن يقضي على الهرمونات الجنسية ، إلا أن نقص FBS يمكن أن يؤثر على الاستجابة الخلوية. للتحقق من طريقة التخلص من الهرمونات ، تم استخدام ناهض كوليني (carbachol ، Cch 1 × 10-4 M) كحافز لتقليد إفراز الخلايا الكأسية الفسيولوجية بوساطة النهايات العصبية المختلفة المحيطة بالخلاياالكأسية 26. لم يلاحظ أي فرق في حجم التغير في الكالسيوم من وسط التحكم الكامل RPMI ، مما يشير إلى أنه يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة الاختلاف القائم على الجنس في استجابة الخلية.

تم إجراء اختبار Fura-2 / AM الموصوف في قسم البروتوكول على الأطباق المعالجة بمتوسط RPMI + 10٪ FBS الكامل ، ومتوسط RPMI المتقدم (يوفر RPMI تركيزا خاصا من الأنسولين) مع 1٪ BSA ، و RPMI الخالي من الفينول الأحمر مع 1٪ BSA. يتم الحصول على النتائج من أربعة أفراد. لم يتم العثور على فرق كبير عند مقارنة الخلايا المحتضنة في RPMI الخالي من الفينول الأحمر مع 1٪ BSA ووسط RPMI كامل. ومع ذلك ، لوحظت زيادة كبيرة في استجابة [Ca2+] i ل Cch 1 × 10-4 M عند مقارنة المجموعة المتوسطة RPMI المتقدمة بمجموعة RPMI المتوسطة الكاملة (الشكل 2). باختصار ، لا يؤثر RPMI الخالي من الفينول الأحمر مع 1٪ BSA على الاستجابة الخلوية للخلايا الكأسية ، حتى أنه يتفوق على وسيط RPMI المتقدم في إعداد البحث الحالي.

Figure 1
الشكل 1: المزرعة الأولية لخلية كأس الملتحمة البشرية. تم تمرير الخلايا الكأسية الملتحمة على أغطية بعد 14 يوما في المزرعة ، وتم إجراء تلطيخ التألق المناعي باستخدام الجسم المضاد الأولي ضد CK7 (أحمر) ، وتم إجراء محاضر الفلوريسئين المترافق HPA-1 (أخضر). (أ) تم التقاط الصور تحت تكبير 200x، و (B) تم التقاط الصور تحت تكبير 630x. يقدم CK7 كإشارة فلورسنت حول النواة (اللوحة اليسرى) ؛ يقدم HPA-1 نمط علامات الترقيم حول النواة (اللوحة الوسطى). تشير إشارة التألق المناعي الإيجابية لكل من CK7 و HPA-1 إلى وجود خلية كأسية. السيطرة السلبية هي الحضانة في غياب الجسم المضاد الأساسي (C). أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر (أ) و 8 ميكرومتر (ب). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تأثيرات الوسائط المختلفة على استجابة Cch [Ca2+] i. تم تحضين الخلايا باستخدام RPMI الخالي من الفينول الأحمر مع 1٪ BSA ، أو وسائط RPMI مع 10٪ FBS ، أو RPMI المتقدم مع 1٪ BSA لمدة 48 ساعة حضانة قبل إضافة 1 × 10-4 M Cch. تم قياس [Ca 2+] i بواسطة مقايسة Fura2 وتم حساب التغير في الذروة [Ca2+] i وعرضه في الرسم البياني. يشير الشريط الأسود إلى وسط كامل مع الفينول الأحمر و 10٪ FBS. يشير الشريط البرتقالي إلى وسط متقدم مع 1٪ BSA ، ويشير الشريط الرمادي إلى RPMI بدون الفينول الأحمر ومع 1٪ BSA. البيانات هي متوسط ± SEM ، ن = 4. تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع تصحيح Dunnett في مقارنات مجموعات متعددة ، تم تعيين p < 0.05 على أنه ذو دلالة إحصائية. * يشير إلى اختلاف كبير بين المجموعات. الاختصارات: Cch = كارباكول. [كاليفورنيا2+] i = تركيز الكالسيوم2+ داخل الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مكون المخزون المبلغ مقابل 250 مل من KRB التركيز النهائي
الجلوكوز 0.25 غ 0.1٪ وزن / فولت
1 م كلوريد الصوديوم 30 مل 119 مللي متر
0.5 متر هيدروكسي هيدروكسي3 12.5 مل 25 مللي متر
1 م 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1- حمض بيبيرازينيإيثان سلفونيك (HEPES) 2.5 مل 10 مللي متر
1 مليون كيلو لتر 1.2 مل 4.8 مللي متر
1 م ك.ح2ص.ب4 300 ميكرولتر 1.2 مللي متر
1 م مغسو4 300 ميكرولتر 1.2 مللي متر
1 م كلوريد 2 250 ميكرولتر 1 مللي متر

الجدول 1: المواد والصيغة ل KRB. الاختصار: w / v ، الوزن / الحجم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يساعد التحقيق في الاختلافات القائمة على الجنس في أنسجة العين على فهم عمليات الأمراض ، وخاصة جفاف العين والتهاب الملتحمة التحسسي ، والتي تؤثر بشكل غير متناسب على جنس واحد4،5،6. على الرغم من أنه يمكن استخدام النماذج الحيوانية لهذه الدراسات ، إلا أن البيانات التي يتم الحصول عليها مباشرة من الأنسجة البشرية ضرورية بسبب أعلى تشابه مع الخلايا البشرية في الجسم الحي. أنسجة الملتحمة المستخدمة في الإعداد التجريبي الحالي هي من متبرعين متوفين تتراوح أعمارهم بين 70-85 سنة (بعد انقطاع الطمث) ، مما يسهل التحكم في التأثير الهرموني قبل الوفاة. هنا ، قدمنا طريقة فعالة من حيث التكلفة لدراسة الاختلافات القائمة على الجنس في CGCs البشرية.

الخطوة الحاسمة للحصول على بيانات متسقة هي إزالة FBS والفينول الأحمر لمدة 48 ساعة قبل التجارب للقضاء على آثار الهرمونات الجنسية. يمكن تصنيف تأثيرات الهرمونات الجنسية في الخلايا إلى تأثيرات غير نسخية ونسخية. يتم التوسط في التأثيرات غير النسخية بسرعة من خلال بروتينات G في بضع ثوان إلى دقائق ، ويستغرق تأثير النسخ الذي يتم فيه تنشيط جينات معينة من 30 دقيقة إلى عدة ساعات27 ؛ عمر النصف لمستقبلات هرمون الاستروجين الناجم عن الإستروجين ألفا (ERα) هو 2-6 ح28,29. على الرغم من أن معدلات دوران أنواع أخرى من البروتينات التي يسببها هرمون الجنس نادرا ما يتم الإبلاغ عنها ، تشير نتائج الدراسات الحالية إلى أن البروتينات التي يسببها هرمون الجنس يتم تصنيعها وتحللها في غضون ساعات. لذلك ، 48 ساعة هي وقت كاف لغسل التأثير المحتمل للهرمونات الموجودة في FBS مع الحفاظ على الوظيفة الخلوية الطبيعية. باستخدام الطريقة الحالية ، نجحنا في الإبلاغ عن الاختلافات القائمة على الجنس في التعبير عن مستقبلات هرمون الجنس والوظائف الخلوية في CGCs30.

FBS هو عامل أساسي لمزارع الخلايا الكأسية لتبقى صحية وقابلة للحياة. يعد استبدال FBS العادي المعطل بالحرارة ب FBS المجرد من الفحم طريقة أخرى ممكنة للقضاء على الهرمونات الجنسية في نظام الثقافة. الحد من استخدام FBS المجرد من الفحم هو التكلفة والتكوين المعقد ل FBS. إزالة FBS تماما يزيل أيضا التناقض المحتمل من المكونات المتوسطة غير المحددة ل FBS.

الخطوة الحاسمة لقياس [Ca2+]i هي تثبيت درجة الحموضة ودرجة الحرارة. على الرغم من مكمل HEPES ، فقد لاحظنا تحولا في درجة الحموضة في المخزن المؤقت KRB بمرور الوقت عند تخزينه في درجة حرارة الغرفة. وبالتالي ، يوصى بإعادة ضبط الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت لتجربة طويلة ، كل 3 ساعات تقريبا. تنطبق نفس طريقة [Ca2+] i أيضا على أنواع أخرى من الخلايا مثل الخلايا الحرشفية الطبقية للملتحمة وخلايا بطانة الأوعية الدموية والخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية لدراسة عمل المحفزات المختلفة.

يؤدي ارتباط Fura-2 بالكالسيوم الحر في الخلية إلى تغيير في الطول الموجي لامتصاص الذروة من 380 نانومتر (غير مرتبط) إلى 340 نانومتر (مرتبط). ومع ذلك ، يظل الطول الموجي للانبعاث عند 510 نانومتر ويتم التقاط هذه الانبعاثات بواسطة الكاميرا كصور بالأبيض والأسود. يتم تسجيل نسبة شدة الانبعاث المثارة بمقدار 340 نانومتر و 380 نانومتر للضوء. إلى جانب مقارنة نسبة 340/380 بمنحنى الحامل لحساب تركيز [Ca2+] i ، يمكن للمرء أيضا الإبلاغ عن تغيير طية النسبة دون الحاجة إلى إنشاء منحنى قياسي ، وبالتالي ، بدون تركيز فعلي. يمكن للمحققين اختيار أي من الاتجاهين بناء على إعداد معداتهم والتصميم التجريبي.

في الختام ، يمكن استخدام الخلايا الكأسية الملتحمة الأولية المستزرعة كنموذج لدراسة الاختلافات القائمة على الجنس لأمراض سطح العين. الحضانة لمدة 48 ساعة في وسط RPMI الخالي من الفينول الأحمر مع 1٪ BSA قبل إجراء أي تجارب هي طريقة متسقة وفعالة من حيث التكلفة للقضاء على الآثار المحتملة للهرمونات في وسائط الثقافة ويمكن استخدامها كوسيط قاعدي للتحكم في مستويات الهرمون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يتم تمويل العمل من قبل منحة المعهد الوطني للعيون EY019470 (D.A.D).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin with 1x EDTA Gibco (Grand Island, NY) 25300-054
4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) BP310-500
Advanced RPMI media Gibco (Grand Island, NY) 12633020
carbachol Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) 144.86
Fetal Bovin Serum R&D (Minneapolis, MN) S11150H
Fura-2- acetoxymethyl ester  Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) F1221
Human conjunctival tissue Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) N/A
inorganic salt for KRB buffer Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) Any brand will work
L-glutamine  Lonza Group (Basel, Switzerland) 17-605F
non-essential amino acids Gibco (Grand Island, NY) 11140-050
penicillin/streptomycin Gibco (Grand Island, NY) 15140-122
phenol red-free RPMI media  Gibco (Grand Island, NY) 11835055
Pluronic acid F127 MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) P2443-250G
RPMI-1640 culture medium Gibco (Grand Island, NY) 21875034
scalpel Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 12460451 Any sterile surgical scalpel can work
sodium pyruvate Gibco (Grand Island, NY) 11360-070
sulfinpyrazone MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) S9509-5G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
  2. Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
  3. Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
  4. Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians' Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
  5. Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
  6. Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
  7. Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3 (2020).
  8. Yang, J. -H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
  9. Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
  10. Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
  11. Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
  12. Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
  13. Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
  14. Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
  15. Suzuki, T., et al. Estrogen's and progesterone's impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
  16. Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
  17. Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
  18. Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
  19. Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
  20. Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
  21. García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220 (2022).
  22. Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
  23. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).
  24. Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
  25. García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
  26. Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
  27. Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
  28. Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
  29. Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
  30. Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305 (2022).

Tags

طريقة في المختبر ، دراسة ، الاختلافات القائمة على الجنس ، خلايا كأس الملتحمة ، جفاف العين ، المرض ، صحة سطح العين ، الانتشار ، النساء ، الميوسين المكون للهلام ، إفراز ، الهرمونات الجنسية الخارجية ، النتائج المتسقة ، الوظيفة الفسيولوجية ، المتبرعون البشريون بعد الوفاة ، الثقافة ، متوسط RPMI ، مصل الجنين البقري (FBS) ، الفينول الأحمر ، BSA ، الوظيفة الخلوية ، داخل الخلايا [Ca2+] ، تحفيز الكرباكول
<em>في المختبر</em> طريقة لدراسة الاختلافات الجنسية في الخلايا الكأسية الملتحمة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bair, J. A., Dartt, D. A., Yang, M.… More

Bair, J. A., Dartt, D. A., Yang, M. In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells. J. Vis. Exp. (197), e64456, doi:10.3791/64456 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter