Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Erythrocytsedimenteringshastighed: En fysikdrevet karakterisering i en medicinsk sammenhæng

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64502
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3
1Experimental Physics, Saarland University, 2Department of Physics and Materials Science, University of Luxembourg, 3Theoretical Medicine and Biosciences, Saarland University

Summary

Erythrocytsedimenteringshastighed (ESR) er en fysisk parameter, der ofte anvendes i rutinemæssige sundhedstjek og medicinsk diagnose. En teoretisk model, der gør det muligt at udtrække fysisk meningsfulde parametre fra hele sedimentationskurven, baseret på moderne kolloid viden, er for nylig blevet udviklet. Her præsenterer vi en protokol til automatisk at indsamle ESR over tid og udtrække parametrene for denne nylige model fra denne automatiserede dataindsamling. Disse raffinerede parametre vil sandsynligvis også forbedre det medicinske vidnesbyrd.

Abstract

Erytrocyt (eller røde blodlegemer) sedimenteringshastighed (ESR) er en fysisk afledt parameter for blod, som ofte bruges i rutinemæssige sundhedstjek og medicinsk diagnose. For eksempel observeres i tilfælde af inflammation en højere ESR på grund af den tilhørende stigning i fibrinogen og andre plasmaproteiner. Det blev antaget, at denne stigning skyldtes dannelsen af større aggregater af røde blodlegemer (RBC'er) forårsaget af stigningen i fibrinogen. Faktisk er fibrinogen en agentfremmende aggregering af RBC'er og i Stokes-regimet antages at blive observeret i blodstørre aggregatsediment hurtigere. Imidlertid kræver alle modeller af ESR-målinger baseret på denne hypotese yderligere specifikke fysiske antagelser, der ikke kræves i noget andet system. Desuden har moderne undersøgelser inden for kolloide suspensioner fastslået, at attraktive partikler danner perkolerende aggregater (dvs. aggregater så brede som beholderen). Sedimenteringen af disse kolloider følger derefter et såkaldt "kolloidt gelkollaps". For nylig har det vist sig, at RBC'er faktisk følger den samme adfærd. Denne hypotese gør det også muligt effektivt og analytisk at modellere sedimentationskurven for RBC'er, hvorfra robuste og fysisk meningsfulde deskriptorer kan ekstraheres. Dette manuskript beskriver, hvordan man udfører en sådan analyse, og diskuterer fordelene ved denne tilgang.

Introduction

Erythrocytsedimenteringshastigheden (ESR) er et medicinsk in vitro klinisk værktøj, formelt introduceret i evidensbaseret medicin i løbet af det tyvende århundrede 1,2,3,4. Det bruges i øjeblikket over hele verden som en uspecifik inflammatorisk test eller til at overvåge udviklingen af nogle specifikke tilstande 5,6,7,8. Dette skyldes hovedsageligt en stigning i fibrinogenkoncentrationen, men også i andre plasmakomponenter såsom IgM 1,9,10,11. I henhold til den nuværende Westergren-standardprotokol rapporteres ESR-værdier som måling af det cellefrie plasmalag på et givet tidspunkt (30 min eller 1 time) efter at have forladt et lodret rør med en typisk størrelse på 20 cm lodret i hvile12. Denne målemetode er imidlertid blevet kritiseret, da kvalitativt forskellige stadier i sedimenteringsprocessen er blevet rapporteret, herunder en forsinkelse, før den maksimale bundfældningshastighed13 nås. Denne forsinkelse varer mere end 1 time i ca. halvdelen af raske prøver14. Hastigheden i denne fase adlyder en anden skalering end under den anden, hurtigere fase af sedimentationen15. Ved at begrænse aflæsningen til den gennemsnitlige bundfældningshastighed i løbet af den første time sammenlignes derefter en anden blanding af forskellige blodegenskaber mellem forskellige individer.

Desuden er det for nylig blevet påvist, at de sædvanlige teoretiske overvejelser bag denne protokol var fejlagtige16,17,18. Ved fysiologisk hæmatokrit (over ca. 25%) sedimenterer røde blodlegemer (RBC'er) ikke som separate aggregater, men snarere som et kontinuerligt, såkaldt perkolerende netværk af RBC'er 17,18, der adlyder et andet sæt fysiske ligninger end den normalt nævnte Stokes-sedimentering 16,17. Det har vist sig, at det at overveje en fysisk beskrivelse baseret på de tidsopløste målinger af sedimentationen (hele kurven) var mere robust i nogle nye medicinske sammenhænge19,20. Desuden kunne disse målinger bruges til at kaste lys over de fysiske mekanismer, der ændrer ESR i patologier, hvor celleformer ændres19,20. Derudover kan en langsom ESR have en nyttig medicinsk fortolkning, som angivet i målingerne af en kohorte af patienter med neuroacanthocytosesyndrom 19,20. Denne artikel gennemgår, hvordan man praktisk implementerer måling af fysisk meningsfulde parametre baseret på hele ESR-kinetikken. Mere præcist ekstraherer den her præsenterede metode den maksimale sedimentationshastighed Um, hvis værdi kan korrigeres for at overveje effekten af donorens hæmatokrit16,17. Denne parameter er mere nøjagtig og dermed mere pålidelig end den traditionelle måling16,17,19,20.

Derudover er det i nogle grundlæggende undersøgelser interessant at udelukke effekten af hæmatokrit på ESR 21,22,23 eller at undersøge RBC'ernes rolle i en modificeret ESR 19,20,24,25 i nogle grundlæggende undersøgelser mellem forskellige donorer. Det kan være nyttigt at sammenligne prøver, der ikke er direkte fulde blodprøver fra patienter. Derfor kan resuspendering af RBC'er med en kontrolleret hæmatokrit i det autologe plasma eller i en plasmasubstituent anvendes som det første trin i ESR-måling. For eksempel producerer opløsninger af Dextran 70 kDa med en koncentration på 55 mg/ml i fosfatbufret saltvand (PBS) et sedimenteringsområde inden for kontrolområdet for raske celler19. Dette manuskript viser også, hvordan sådanne trin skal udføres, og at den præsenterede analyse også er relevant i disse tilfælde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Indsamling af blodprøver og eksperimenter blev godkendt af "Ärztekammer des Saarlandes", ethics votum 51/18, og udført efter informeret samtykke i henhold til Helsingfors-erklæringen. Standardmålinger bør udføres med ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA)-antikoaguleret blod (standard EDTA-koncentration på 1,6 mg/ml blod, europæisk norm NF EN ISO 6710) i Westergren-rør. Det volumen, der kræves for at fylde Westergren-røret, afhænger af producenten (da nedre dele undertiden indeholder et bredere reservoir); Volumenet skal være ca. 1 ml fuldblod og 800 μL for de rør, der er angivet i materialetabellen. Metoden beskrevet nedenfor er dog gyldig uanset den specifikke suspension og beholderform, så længe hæmatokriten i de undersøgte prøver er højere end 25%16. Volumener, beholdere, suspensionsmedium og additiver bør derfor udvælges i overensstemmelse med de specifikke mål for den udførte forskning.

1. Eksperimenter og målinger

BEMÆRK: Registrer sedimenteringshastigheden for prøven hvert minut.

  1. Prøveforberedelse (hvis nødvendigt): Hvis der kræves en kontrolhæmatokrit eller suspenderende væske, skal du starte med at vaske cellerne og forberede prøverne (som et eksempel viser vi, hvordan man forbereder prøver med forskellige fibrinogenniveauer ved at blande autologt serum og plasma). Serum kan faktisk tilnærmes som fibrinogenfrit plasma26,27 og kan bruges til at reducere aggregeringen af RBC'er under ellers fysiologiske forhold. For at forberede flere prøver opsamles blodet i standard EDTA-rør på 9 ml og serumet i standard serumrør (med silicaperler som koagulationsaktivatorer) på 9 ml.
    1. Centrifuger blodprøverne (dvs. 9 ml standard EDTA og serumglas i det valgte eksempel) ved 3.000 x g i mindst 7 minutter for optimal komprimering af de pakkede erytrocytter. Supernatanten erstattes med PBS eller den ønskede suspensionsvæske, hvis der er en tilstrækkelig mængde til rådighed. Hvis det blot er nødvendigt at kontrollere hæmatokriten i autologt plasma, fortsættes direkte til trin 1.1.3. I modsat fald blandes forsigtigt efter at supernatanten er taget op til vask.
    2. Gentag tre gange. Udfør under alle omstændigheder den sidste vask med den ønskede suspenderingsvæske.
      1. I det valgte eksempel fremstilles blandinger af autologt plasma og serum med bestemte proportioner (f.eks. 25%/75%, 50%/50% eller 75%/25% plasmavolumenfraktion). For eksempel, når du fremstiller 2,5 ml af 25% / 75% plasma-serumblandingen, tilsættes 0,625 ml plasma til 1,875 ml serum.
    3. Uddrag det krævede volumen af pakkede celler og suspender det i den ønskede væske. De pakkede celler behandles som en højviskøs væske (ved hjælp af standard forpipettering og/eller omvendt pipettering eller en positiv fortrængningspipette28). I det valgte eksempel, for en 4 ml prøve ved en hæmatokrit på 45%, suspenderes 1,8 ml pakkede celler inden for 2,2 ml af plasma-serumblandingen.
  2. Hvis prøvens hæmatokrit ikke kontrolleres, bestemmes den ved højhastighedsmikrocentrifugering (andre standardmetoder er også egnede).
    1. Uddrag den nødvendige mængde prøve til bestemmelse af hæmatokrit: fyld mikrohæmatokritkapillærerne ved at nedsænke dens nedre spids i væsken. Stop det ved at dække den øverste åbning, når den nødvendige mængde prøve stiger i røret ved kapillærsugning.
    2. Forsegl kapillærerne med tætningsvoks. Anbring dem i mikrohæmatokritcentrifugen og kør den ved 15.000 x g (12.000 o / min) i 5 minutter eller i henhold til producentens anvisninger.
    3. Læs hæmatokritniveauet på kapillæret og skriv det ned til reference.
  3. Opsæt et kamera til optagelse af prøvernes sedimentering. For at undgå at overbelaste hukommelsen eller dræne batteriet skal du tænde for enheden fra lysnettet og gemme billederne direkte på en computer eller ekstern harddisk.
    1. Opsæt et stabilt kamera foran holderen, hvor ESR-rørene bliver i ro. Brug en hvid, oplyst baggrund (hvide ark papir i baggrunden fungerer perfekt).
    2. Brug tomme Westergren-rør, helst uden markeringer, til at indstille kameraets fokus og synsfelt for at opnå den højeste opløsning, hvor prøverne skal placeres. Sørg helst for, at billedernes kanter er justeret i lodret og vandret retning.
    3. Tag et billede af et skaleret rør for at udtrække pixelopløsningen. Det anbefales at bruge RGB-billeder.
    4. Indstil kameraets lys og eksponeringstid til at have en hvid baggrund, men ingen mætning. Eksemplet i figur 1 er opnået ved hjælp af et Canon EOS M50 med en eksponeringstid på 1/15s, en blænde på F8.0, Wolfram hvidbalance, i single shot-tilstand med manuel fokus og en ISO-hastighed på 1.000.
  4. Forbered og placer ESR-rørene.
    1. Fyld den nederste beholder på Westergren-røret med det volumen, der svarer til producentens anvisninger. Indsæt Westergren-røret i den nederste beholder som angivet af producenten.
    2. Så snart det første rør er klar, skal du placere det i holderen og starte kameraoptagelsen. Optagelse af et billede hvert minut giver normalt en god opløsning af ESR-kinetisk kurve.
    3. Forbered og placer de næste prøver. Sørg for ikke at stå foran nogen prøve, når der tages et billede.
    4. Lad målingerne køre i mindst 2 timer for at sammenligne med standardmålinger ved 30 min, 1 time og 2 timer. Det er dog også bedre at se mætning og anholdelse af sedimenteringen. For raske prøver eller i tilfælde af betændelse er det mere end tilstrækkeligt at registrere prøverne natten over mellem 12 timer og 24 timer, da krumningen af de hurtigste prøver er synlig inden for 3 timer13,19. Hvis en tilstand imidlertid nedsætter sedimentationshastigheden, som et fald i fibrinogenkoncentrationen gør (dvs. i det valgte eksempel høj serumvolumenfraktion), kan det være nødvendigt med optagelser på 50 timer eller mere for at opnå de mest nøjagtige oplysninger16,19.

2. Billedanalyse

BEMÆRK: Når billederne er optaget, skal du udtrække ESR-kurven. Et eksempel på Matlab-kode findes som supplerende fil 1 (MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).

  1. Vælg eller identificer et område af interesse (ROI), hvor kun et rør er synligt, idet den nederste kant er placeret under den laveste position af den erytrocytcellefrie plasmagrænseflade, men inden for prøven (se figur 1A, B). Drej om nødvendigt billedet, så den lodrette retning justeres langs den første komponent i billedet.
  2. Konverter RGB-billedets investeringsafkast til et gråtonebillede eller matrix Gr. Normalt er kombinationen af de trefarvede kanaler (rød [R], grøn [G] og blå [B]) som Gr = 2 * R - B - G meget effektiv med en klar baggrund (se figur 1C og MatlabCodeImageAnalysisSampled.m linjer 121-128).
  3. Binariser billedet. For en sund prøve giver brug af Otsu-tærsklen29 normalt et konsistent resultat (se figur 1D og linje 133 i MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). For prøver med en høj hæmatokrit eller med en vis hæmolyse kan det være bedre at justere det manuelt eller bruge en anden automatisk metode (som gjort i linjerne 129-131 i MatlabCodeImageAnalysisSampled.m), afhængigt af den nøjagtige kontrast opnået mellem de forskellige faser inde i røret.
  4. Få gennemsnittet af pixelværdierne (eller elementerne) for Gr langs vandret retning. Dette trin minimerer støj og beregner effektivt gennemsnittet af de mulige uregelmæssigheder i grænsefladen (se figur 1E og MatlabCodeImageAnalysisSampled.m linje 137).
  5. Før variationerne beregnes, skal kurven udjævnes med et glidende gennemsnit, især hvis rørene indeholder nogle vandrette markeringer (se figur 1F). For de angivne eksempler blev der brugt et bevægeligt vindue på ~ 2,5 mm (50 pixels) til denne proces (se linje 138 i MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Identificer derefter grænsefladepositionen som det punkt med den højeste intensitetsvariation (se figur 1G).
  6. Gentag for hvert billede og hvert eksempel. For hver prøve skal du gemme grænsefladens positioner langs tid i et passende format, der passer til den fysiske model med enhver passende tilpasset software.

3. Tilpasning af den fysiske model

  1. Brug en passende egnet software, der kender hæmatokriten og den indledende højde af blodsøjlen h 0, find værdierne for forsinkelsestiden t0, den dimensionsløse tid γ og den endelige pakkede volumenfraktion Φmaf erytrocytterne, der minimerer summen af kvadrerede restafvigelser for den fysiske model17. En Matlab-kode (ShapeAnalyzerIntegrated.m) leveres som supplerende fil 2 som et eksempel på, hvordan man udfører en sådan tilpasning. Se supplerende fil 2 for yderligere instruktioner. Som beskrevet andetsteds16,17, erytrocytter ved fysiologisk hæmatokritsediment som en blød partikelgel, hvor de vigtige fysiske parametre er forskellen i densitet mellem plasma og RBC'er fra donoren Δρ, RBC-karakteristisk diameter rRBC, plasmaviskositeten ved stuetemperatur η og donorens hæmatokrit Φ . Ved hjælp af disse parametre og under forudsætning af, at gravitationsspændingen er den vigtigste drivende proces for plasmaet til at strømme opad gennem det porøse netværk dannet af erytrocytterne efter en forsinkelsestid t0, opnår man den tidsmæssige udvikling16,17:
    Equation 1
    med Equation 2, Equation 3og Equation 4 er den gennemsnitlige diskradius for en erytrocyt. Et eksempel på en Matlab-kode, der udfører dette, leveres som en vedhæftet fil (ShapeAnalyzerIntegrated.m passer til den funktion, der er defineret i SedimFit.m [Supplementary File 3]). Alternativt kan G/γ også bruges direkte som tilpasningsparameter med enheder på 1/t.
  2. Når den kvantitative kurve er ekstraheret fra billedet, gemmes prøvens fysiske parametre. Traditionelle ESR-værdier ved 30 min, 1 time eller 2 timer kan stadig ekstraheres fra kurven som reference (se ShapeAnalyzerIntegrated.m linjer 123-132).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et eksempel på en billedsekvens, der er korrekt erhvervet, leveres som supplerende film 1 (MovieS1.avi). En række karakteristiske pasformer af modellen er vist for forskellige forhold i figur 2. Fibrinogenkoncentrationen blev bestemt ud fra fibrinogenkoncentrationen i plasma Fib0, idet det antages, at serumet slet ikke har noget fibrinogen. Derfor Fib = C Fib0, hvor C er plasmavolumenfraktionen i plasma-serumblandingen. I tidligere undersøgelser16 blev Fib0 bestemt ved standardmetoder i laboratoriet for klinisk kemi på Saarland Universitetshospital (Homburg, Tyskland). Hvis det er nødvendigt at måle en sådan mængde uafhængigt, omfatter en bekvem metode til bestemmelse af fibrinogenkoncentrationen (halv)automatiske kuglekoagulometre, hvilket også kan kræve, at der indhentes en citrat-antikoaguleret blodprøve fra donoren30. ESR-kurverne fra de undersøgelser, der genererede disse kurver, kunne udstyres med en Pearson-koefficient R 2 [0,974, 0,9996] med et gennemsnit på 0,996 og en standardafvigelse på 0,004 (kun en kurve ud af 35 gav en R2Equation 11 < 0,99). De parametre, der til sidst ekstraheres, er den endelige hæmatokrit i RBC-fasen Φm, forsinkelsestiden t0-der kræves for at gelen kan bryde sammen og begynde at kollapse - og den maksimale øjeblikkelige hastighedEquation 6, nået i starten af sammenbruddet. Den dimensionsløse parameter γ er forbundet med det inverse af poreområdet i komprimeringsnetværket af RBC'er (udtrykt i multipla af partikelradius), Δρ er forskellen i densitet mellem donorens plasma og RBC'er, a er RBC-karakteristisk diameter, η er plasmaviskositeten ved stuetemperatur, og Φ er donorens hæmatokrit. Tilpasningen udføres faktisk ved at fastsætte Δρ,a,η og Φ og derefter bestemme de bedste γ, Φm og t0. Hæmatokriten skal bestemmes uafhængigt via en anden standardmetode, mens den anden kan fastgøres til standardværdier (ΔρEquation 10080 kg / m3 31,32, ηEquation 100 1,5 mPa s 33 og aEquation 1004 μm). Enhver afvigelse fra de øvrige parametre ville blot ændre den fundne værdi af γ med en tilsvarende faktor, men ville ikke ændre den endelige bestemmelse af Um, som i så fald er en robust parameter i denne henseende.

Samlinger af parameterværdier indsamlet i tidligere grundlæggende undersøgelser, der viser parametrenes tendenser som funktion af hæmatokrit- og fibrinogenniveauerne, er vist i figur 3 og figur 4.

Figure 1
Figur 1: Billedbehandling . (A) Ideel visning af flere stikprøver med relevante ROI'er, fremhævet for en prøve. (B) Zoom på det valgte investeringsafkast. (C) Konvertering af det farvede investeringsafkast til gråt niveau. (D) Binariseret billede opnået med Otsu-tærsklen. (E) Det binære billedes horisontalt gennemsnitlige intensitet som funktion af højden (i henhold til den sædvanlige konvention i billedbehandling anses oprindelsen for at være øverst i billedet; se også trin 2.4 i protokollen.) (F) Udglattet intensitet ved at udføre et glidende gennemsnit på et 50 pixel lodret kvarter (se også trin 2.5 i protokollen). G) Variationer i den udjævnede intensitet i lodret retning. Placeringen af den absolutte maksimale værdi tages som grænsefladens position (se også trin 2.5 i protokollen). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Karakteristiske pasformer. (A) Kurver og anfald opnået for en sund donor med forskellige justerede hæmatokritter. Kurverne er tilpasset fra et tidligere studie17. (B) Kurver og anfald opnået for en sund donor med forskellige fibrinogenkoncentrationer. Forskellige fibrinogenkoncentrationer blev opnået ved blanding af autologt plasma og serum i forskellige proportioner. Kurverne og dataene er fra et tidligere studie16. Fejlbjælker (hentet fra pixelopløsning eller tilpasningsstatistik) er mindre end symbolstørrelsen. Figurerne er genoptrykt med tilladelse fra Dasanna et al.16 (18 prøver fra fire uafhængige blodprøver) og Darras et al.17 (16 prøver fra syv uafhængige blodprøver). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Karakteristiske værdier af de ekstraherede parametre for forskellige hæmatokrit . (A) Variation af den ekstraherede maksimale sedimentationshastighed Umsom funktion af prøvehæmatokrit Φ. Cirkler er individuelle målinger; Forskellige farver er relateret til forskellige sunde donorer. Den kontinuerlige røde linje er den tendens, der forudsiges af modellen, opnået med gennemsnitsværdierne Φm og γ. Den korrigerede værdi af Umfor en hæmatokrit på Φ = 0, 45 vises også, både som trekanter for individuelle værdier og som en lige linje for den forudsagte konstant af modellen. Denne korrigerede værdi er beregnet i henhold til modellen som Equation 10. B) Værdier opnået for parameteren γ. C) Værdier opnået for parameteren Φm. D) Værdier opnået for parameteren t0. Fejlbjælker for individuelle data fra tilpasningsstatistikker er mindre end symbolstørrelsen. Denne figur er blevet tilpasset med tilladelse fra Darras et al.17. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Karakteristiske værdier for de ekstraherede parametre for forskellige fibrinogenkoncentrationer . (A) Variation af den ekstraherede maksimale sedimentationshastighed Umsom funktion af prøvefibrinogenkoncentrationen. Forskellige farver er relateret til forskellige sunde donorer. B) Værdier opnået for parameteren γ. C) Værdier opnået for parameteren Φm. D) Værdier opnået for parameteren t0. Fejlbjælker for individuelle data fra tilpasningsstatistikker er mindre end symbolstørrelsen. Denne figur er genoptrykt med tilladelse fra Dasanna et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende film 1: Eksempel på en korrekt erhvervet billedsekvens. Forskellige prøvetyper er vist på disse billeder fra to forskellige donorer (samme blodtype). Fra venstre mod højre, alle prøver med dubletter: fuldblod fra donor 1, suspension af RBC'er fra donor 1 i Dextran 70 kDa (55 mg/ml PBS) med kontrolleret hæmatokrit ved 45%, fuldblod fra donor 2, suspension af RBC'er fra donor 2 i Dextran (45% hæmatokrit), suspension af RBC'er fra donor 1 i plasma fra donor 2 (45% hæmatokrit), og suspension af RBC'er fra donor 2 i plasma fra donor 1 (45% hæmatokrit). Prøverne har en bred vifte af sedimenteringshastigheder, og suspensionerne i Dextran viser også en vis hæmolyse. Den medfølgende kode MatlabCodeImageAnalysisSampled.m analyserer dog effektivt dem alle. Klik her for at downloade denne film.

Supplerende fil 1: MatlabCodeImageAnalysisSampled.m. Hovedkode, der bruges til billedanalysen (trin 2 i protokollen). For at køre koden på en bestemt enhed skal linje 8 ændres. Den skal indeholde stien til mappen, der indeholder billederne af Westergren-rørene, der skal analyseres, og slutter med præfikset for billederne, hvis nogen. Et sæt komprimerede billeder er tilgængelige til download med åben adgang på Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). Koden, og især egenskaberne for hver prøve (defineret i linjerne 14-61), er allerede tilpasset til at analysere disse billeder. For dette billedsæt var det anvendte præfiks 'IMG_'. Derfor skal strenglinjen 8 slutte med '\IMG_' (eller '/IMG_' på Linux-systemer). Den sidste del af koden (linjerne 166-179) plotter også automatisk de ekstraherede sedimentationskurver for hver prøve. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: ShapeAnalyzerIntegrated.m. Hovedkode, der bruges til at passe til den fysiske model (trin 3 i protokollen). For at køre denne kode skal du blot kopiere og indsætte den i mappen, der indeholder outputtekstfilerne fra MatlabCodeImageAnalysisSampled.m sammen med SedimFit.m. Navnene på de filer, der skal analyseres (uden .txt udvidelse), skal vises i linje 9. Den oprindelige hæmatokrit og højden af røret skal også være indeholdt i henholdsvis linjer 12 og 15. Denne kode er allerede forberedt til at analysere kurverne udtrukket fra open-access billeder på Zenodo (DOI: 10.5281 / zenodo.7290177). Når de førnævnte linjekoder er blevet ændret, skal du blot klikke på knappen 'Kør' i Matlab Editor-værktøjslinjen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: SedimFit.m. Fysisk model justeret af ShapeAnalyzerIntegrated.m. Denne fil er en Matlab-funktion, der definerer de funktioner, der er monteret på de eksperimentelle kurver for at udtrække de fysiske parametre. Det skal være i samme mappe som ShapeAnalyzerIntegrated.m, når analysen køres. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at den automatiserede protokol skal fungere effektivt, er det vigtigt at have en klar baggrund og korrekt belysning. En mørk baggrund kan forhindre eksistensen af en effektiv binariseringstærskel. For prøver med en vis hæmolyse, som normalt forekommer (øges) over tid, er det vigtigt først at kontrollere, at den valgte binariseringstærskel er relevant for både de indledende og endelige billeder.

Når det kommer til billedets binariseringsproces, er valget af ROI og binariseringstærskel det mest følsomme trin. Det kan være nyttigt manuelt at teste forskellige tærskelværdier på tre forskellige billeder (i begyndelsen, midten og slutningen af sedimenteringsprocessen) for at sikre, at valget af tærskelværdien faktisk giver den relevante binarisering for hele processen. Hvis prøven oplever stærk hæmolyse, kan det være nødvendigt at begrænse analysen af prøven til begyndelsen af processen, når en klar grænseflade stadig kan observeres. Som for enhver ESR-måling er det også vigtigt at undgå tilstedeværelsen af bobler i røret. Men hvis der observeres nogle små bobler øverst i røret, kan et investeringsafkast, der starter under boblerne og lige oven på den indledende grænseflade, stadig give den relevante måling. I dette tilfælde er det dog vigtigt at inkludere noget baggrundsplads til højre og venstre for røret, så Otsu-tærsklen kan bestemmes, mens man altid overvejer en betydelig mængde pixels med baggrundens grå niveau.

Metoden, som med alle ESR-målinger, bygger på antagelsen om, at der kan ses en klar grænseflade mellem pakkede erytrocytter og cellefrit plasma. Hvis prøven oplever en betydelig mængde hæmolyse, eller hvis prøvens hæmatokrit er for fortyndet (under 25%17), vil en sådan grænseflade ikke længere blive observeret. En ESR-måling under disse forhold er derefter umulig at udføre.

Som tidligere nævnt sikrer denne metode at tilvejebringe den relevante hastighed af gelkollapset Um, som kan korrigeres i henhold til patientens indledende hæmatokrit17. Figur 3A sammen med de rå målinger af Um viser også de korrigerede værdier for en normaliseret hæmatokrit på Φ 0 = 0, 45. Det kan ses, at korrektionen fjerner den samlede afhængighed af Φ0 samt det meste af dataspredningen. Bestemmelse af Umbaseret direkte på den relevante fysiske model indebærer også, at teknikken er mere objektiv end en vilkårlig kurveudjævning med vilkårlige valg af udjævningsparametre. Denne metode har blandt andet vist sig at være mere robust i medicinske sammenhænge, hvor der observeres unormalt lave ESR-værdier19,20.

En anden iboende interesse i denne måling er, at den giver mere robuste og fysisk fortolkelige data. For eksempel i tilfælde af en sænket ESR gør det det muligt at skelne mellem, om forsinkelsestiden t0 for sammenbruddet forlænges, hvis netværket af RBC'er er usædvanligt uordnet gennem γ, eller hvis den endelige komprimering Φm af cellerne på en eller anden måde hindres16,19,20.

Interessant nok er målingen af den maksimale sedimentationshastighed også mere robust og følsom over for fibrinogenniveauer, som allerede fremhævet i tidligere undersøgelser13,14,15. Dette er en vigtig funktion, da ESR ofte bruges til at overvåge inflammation, som er forbundet med forhøjede niveauer af fibrinogen. Denne følsomhed opstår i det væsentlige ved afkobling af Um fra tidspunktet for gelkollaps, som vides at have en vigtig tilfældig komponent34,35,36. Mere præcist, som fremhævet i figur 4D16, for højere koncentrationer af fibrinogen, har den iboende tilfældige variation af forsinkelsestiden (hvor målinger over 150 mg/ml er mellem 12 min og 30 min, selv blandt en enkelt donor) samme størrelsesorden som dens underliggende afhængighed af denne parameter (mellem 150 mg / dL og 300 mg / dl; den gennemsnitlige tendens i målingerne falder kun fra 0,45 timer til 0,4 timer [ dvs. 27 min til 24 min]). Da denne forsinkelsestid faktisk er inkluderet i den traditionelle højdemåling ved 30 min eller 1 time (varigheder, som denne forsinkelsestid undertiden kan nå eller overstige), giver ekstraktion af den maksimale hastighed Um (hvilket præsenterer en systematisk og signifikant tendens for hver donor) derefter en mere robust og meningsfuld parameter 13,14,15,34,35, 36.

Desuden kan parameteren Um effektivt korrigeres for den oprindelige hæmatokrit i henhold til det praktiske resultat Equation 11 beskrevet tidligere17. Når man kombinerer data for alle de raske donorer i en tidligere undersøgelse17, opnås værdier på γ = 0,50 ± 0,06 og Φ m = 0,86 ± 0,04, hvilket pænt gengiver tendensen i Um som funktion af donorhæmatokrit Φ , som vist i figur 3. I praksis kan det imidlertid være strengere at korrigere ESR med de γ- og Φm-værdier, der er opnået for en bestemt donor, da fibrinogenniveauerne også kan ændre sig betydeligt mellem donorer og have en betydelig indflydelse på disse parametre (figur 4).

I betragtning af de diskuterede punkter og inddragelse af dem i rutinemæssige medicinske procedurer vil nøjagtigheden og alsidigheden af ESR som et in vitro klinisk værktøj forbedres yderligere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære relevante for indholdet af denne artikel.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af forskningsenheden FOR 2688 - Wa1336/12 fra den tyske forskningsfond og af Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftale nr. 860436-EVIDENCE. T.J. og C.W. anerkender finansiering fra det fransk-tyske universitet (DFH/UFA). A.D. anerkender finansiering fra Young Investigator Grant fra Saarland Universitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (for blood sample) SARSTEDT 267001 or 265 Anticoagulated blood sample to characterize
Camera EOS M50 Canon Kit EF-M18-150 IS STM Any camera should work, provided that sector alimentation, connection to computer for automated shooting and adapted objective are available
Centrifuge HERMLE 302.00 V03 - Z 36 HK Requirements: at least 3000 x g ofr 7 min.
Micro-centrifuge MLW TH21 or any other way to determine the hematocrit
Micro-hematocrit capilaries Fisher scientific 11884040 or other capillaries/containers for hematocrit determination
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher 10010023 1x PBS, pH 7.4, 298 Osm
Pipettes (e.g. positive displacement pipette) Gilson FD10006 Pipette required to manipulate blood and/or packed cells.Other models are of course suitable, but be careful to treat blood and pakced cells as highly viscous fluids.
Wax sealing plate Hirschmann 9120101 Sealing wax for the micro-hematocrit capillaries
Westergren tubes Praxindo A9244560 Any other standard Wetsergren tube should work too
White background with illumination / / White sheet(s) of paper behind the samples, with usual room light is perfcetly sufficient.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bedell, S. E., Bush, B. T. Erythrocyte sedimentation rate. From folklore to facts. The American Journal of Medicine. 78, 1001-1009 (1985).
  2. Grzybowski, A., Sak, J. Edmund Biernacki (1866-1911): Discoverer of the erythrocyte sedimentation rate. On the 100th anniversary of his death. Clinics in Dermatology. 29 (6), 697-703 (2011).
  3. Kushner, I., Mackiewicz, A. The Acute Phase Response: An Overview. Acute Phase Proteins. , CRC Press. (1993).
  4. Tishkowski, K., Gupta, V. Erythrocyte Sedimentation Rate. StatPearls Publishing. , Treasure Island, FL. (2022).
  5. Menees, S. B., Powell, C., Kurlander, J., Goel, A., Chey, W. D. A meta-analysis of the utility of C-reactive protein, erythrocyte sedimentation rate, fecal calprotectin, and fecal lactoferrin to exclude inflammatory bowel disease in adults with IBS. The Americal Journal of Gastroenterology. 110 (3), 444-454 (2015).
  6. Brigden, M. L. Clinical utility of the erythrocyte sedimentation rate. Americal Family Physician. 60 (5), 1443-1450 (1999).
  7. Liu, S., et al. Preliminary case-control study to evaluate diagnostic values of C-reactive protein and erythrocyte sedimentation rate in differentiating active Crohn's disease from intestinal lymphoma, intestinal tuberculosis and Behcet's syndrome. The American Journal of the Medical Sciences. 346 (6), 467-472 (2013).
  8. Greidanus, N. V., et al. Use of erythrocyte sedimentation rate and C-reactive protein level to diagnose infection before revision total knee arthroplasty: A prospective evaluation. The Journal of Bone and Joint Surgery. 89 (7), 1409-1416 (2007).
  9. Flormann, D., Kuder, E., Lipp, P., Wagner, C., Kaestner, L. Is there a role of C-reactive protein in red blood cell aggregation. International Journal of Laboratory Hematology. 37 (4), 474-482 (2015).
  10. Brust, M., et al. The plasma protein fibrinogen stabilizes clusters of red blood cells in microcapillary flows. Scientific Reports. 4, 4348 (2014).
  11. Gray, S. J., Mitchell, E. B., Dick, G. F. Effect of purified protein fractions on sedimentation rate of erythrocytes. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 51 (3), 403-404 (1942).
  12. Kratz, A., et al. ICSH recommendations for modified and alternate methods measuring the erythrocyte sedimentation rate. International Journal of Laboratory Hematology. 39 (5), 448-457 (2017).
  13. Hung, W. T., Collings, A. F., Low, J. Erythrocyte sedimentation rate studies in whole human blood. Physics in Medicine and Biology. 39 (11), 1855-1873 (1994).
  14. Woodland, N. B., Cordatos, K., Hung, W. T., Reuben, A., Holley, L. Erythrocyte sedimentation in columns and the significance of ESR. Biorheology. 33 (6), 477-488 (1996).
  15. Holley, L., Woodland, N., Hung, W. T., Cordatos, K., Reuben, A. Influence of fibrinogen and haematocrit on erythrocyte sedimentation kinetics. Biorheology. 36 (4), 287-297 (1999).
  16. Dasanna, A. K., et al. Erythrocyte sedimentation: Effect of aggregation energy on gel structure during collapse. Physical Review. E. 105 (2-1), 024610 (2022).
  17. Darras, A., et al. Erythrocyte sedimentation: collapse of a high-volume-fraction soft-particle gel. Physical Review Letters. 128 (8), 088101 (2022).
  18. Darras, A., et al. Imaging erythrocyte sedimentation in whole blood. Frontiers in Physiology. 12, 729191 (2022).
  19. Darras, A., et al. Acanthocyte sedimentation rate as a diagnostic biomarker for neuroacanthocytosis syndromes: Experimental evidence and physical justification. Cells. 10 (4), 788 (2021).
  20. Rabe, A., et al. The erythrocyte sedimentation rate and its relation to cell shape and rigidity of red blood cells from chorea-acanthocytosis patients in an off-label treatment with dasatinib. Biomolecules. 11 (5), 727 (2021).
  21. Giavarina, D., Capuzzo, S., Pizzolato, U., Soffiati, G. Length of erythrocyte sedimentation rate (ESR) adjusted for the hematocrit: reference values for the TEST 1 method. Clinical Laboratory. 52 (5-6), 241-245 (2006).
  22. Bull, B. S. Is a standard ESR possible. Laboratory Medicine. 6 (11), 31-39 (1975).
  23. Bull, B. S., Brecher, G. An evaluation of the relative merits of the Wintrobe and Westergren sedimentation methods, including hematocrit correction. American Journal of Clinical Pathology. 62 (4), 502-510 (1974).
  24. Reinhart, W. H., Singh, A., Straub, P. W. Red blood cell aggregation and sedimentation: the role of the cell shape. British Journal of Haematology. 73 (4), 551-556 (1989).
  25. Jan, K., Usami, S., Smith, J. A. Influence of oxygen tension and hematocrit reading on ESRs of sickle cells: Role of RBC aggregation. Archives of Internal Medicine. 141 (13), 1815-1818 (1981).
  26. Issaq, H. J., Xiao, Z., Veenstra, T. D. Serum and plasma proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3601-3620 (2007).
  27. Yu, Z., et al. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One. 6 (7), 21230 (2011).
  28. Proper Pipetting Techniques - DE. , Available from: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/lab-plasticware-supplies/lab-plasticware-supplies-learning-center/lab-plasticware-supplies-resource-library/fundamentals-of-pipetting/proper-pipetting-techniques.html (2023).
  29. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transaction on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
  30. Solomon, C., et al. A comparison of fibrinogen measurement methods with fibrin clot elasticity assessed by thromboelastometry, before and after administration of fibrinogen concentrate in cardiac surgery patients. Transfusion. 51 (8), 1695-1706 (2011).
  31. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLoS One. 12 (7), 0180520 (2017).
  32. Trudnowski, R. J., Rico, R. C. Specific gravity of blood and plasma at 4 and 37 degrees C. Clinical Chemistry. 20 (5), 615-616 (1974).
  33. Késmárky, G., Kenyeres, P., Rábai, M., Tóth, K. Plasma viscosity: A forgotten variable. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 39 (1-4), 243-246 (2008).
  34. Teece, L. J., et al. Gels under stress: The origins of delayed collapse. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 458, 126-133 (2014).
  35. Lindström, S. B., Kodger, T. E., Sprakel, J., Weitz, D. A. Structures, stresses, and fluctuations in the delayed failure of colloidal gels. Soft Matter. 8 (13), 3657-3664 (2012).
  36. Bartlett, P., Teece, L. J., Faers, M. A. Sudden collapse of a colloidal gel. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 85, 021404 (2012).

Tags

Medicin nr. 193
Erythrocytsedimenteringshastighed: En fysikdrevet karakterisering i en medicinsk sammenhæng
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Darras, A., John, T., Wagner, C.,… More

Darras, A., John, T., Wagner, C., Kaestner, L. Erythrocyte Sedimentation Rate: A Physics-Driven Characterization in a Medical Context. J. Vis. Exp. (193), e64502, doi:10.3791/64502 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter