Summary
적혈구 침강 속도(ESR)는 일상적인 건강 검진 및 의료 진단에 자주 사용되는 물리적 매개변수입니다. 현대의 콜로이드 지식을 바탕으로 전체 침강 곡선에서 물리적으로 의미있는 매개 변수를 추출 할 수있는 이론적 모델이 최근에 개발되었습니다. 여기에서는 시간이 지남에 따라 ESR을 자동으로 수집하는 프로토콜을 제시하고 이 자동화된 데이터 수집에서 이 최신 모델의 매개변수를 추출합니다. 이러한 정제된 매개변수는 또한 의학적 증언을 향상시킬 수 있습니다.
Abstract
적혈구(또는 적혈구) 침강 속도(ESR)는 일상적인 건강 검진 및 의료 진단에 자주 사용되는 혈액의 물리적 파생 매개변수입니다. 예를 들어, 염증의 경우, 피브리노겐 및 기타 혈장 단백질의 증가와 관련하여 더 높은 ESR이 관찰됩니다. 이러한 증가는 피브리노겐의 증가로 인한 적혈구 (RBC)의 더 큰 응집체의 형성 때문인 것으로 여겨졌다. 실제로, 피브리노겐은 RBC의 작용제-촉진 응집체이며 스톡스 체제에서는 혈액이 더 큰 응집체 침전물에서 더 빨리 관찰되는 것으로 가정됩니다. 그러나 이 가설을 기반으로 하는 ESR 측정의 모든 모델에는 다른 시스템에서는 필요하지 않은 추가적인 물리적 가정이 필요합니다. 게다가, 콜로이드 현탁액 분야의 현대 연구는 매력적인 입자가 침투 응집체 (즉, 용기만큼 넓은 응집체)를 형성한다는 것을 입증했습니다. 이러한 콜로이드의 침전은 소위 "콜로이드 겔 붕괴"를 따릅니다. 최근에는 적혈구가 실제로 동일한 동작을 따르는 것으로 나타났습니다. 이 가설은 또한 RBC의 침전 곡선을 효율적이고 분석적으로 모델링할 수 있게 하며, 여기에서 강력하고 물리적으로 의미 있는 설명자를 추출할 수 있습니다. 이 원고는 이러한 분석을 수행하는 방법을 설명하고 이 접근 방식의 이점에 대해 설명합니다.
Introduction
적혈구 침강 속도 (ESR)는 20 세기 동안 증거 기반 의학에 공식적으로 도입 된 의료 체외 임상 도구입니다 1,2,3,4. 현재 전 세계적으로 비특이적 염증 검사로 사용되거나 일부 특정 조건의 진화를 모니터링하기 위해 사용됩니다 5,6,7,8. 이것은 주로 피브리노겐 농도의 증가뿐만 아니라 IgM 1,9,10,11과 같은 다른 혈장 성분에서도 발생합니다. 현재 웨스터그렌 표준 프로토콜에 따르면, ESR 값은 정지 상태에서 수직으로 20cm의 전형적인 크기의 수직 튜브를 떠난 후 주어진 시점(30분 또는 1시간)에서 무세포 혈장층의 측정으로 보고됩니다(12). 그러나, 이 측정 방법은 최대 침강 속도(13)에 도달하기 전의 지연을 포함하여 침전 과정에서 질적으로 상이한 단계들이 보고되었기 때문에 비판을 받아왔다. 이 지연은 건강한 샘플의 약 절반에서 1시간 이상 지속된다14. 이 단계 동안의 속도는 침전의 두 번째, 더 빠른 단계 동안과는 다른 스케일링을 따른다15. 판독값을 처음 1시간 동안의 평균 침강 속도로 제한하면 서로 다른 개인 간의 다양한 혈액 특성의 다른 혼합을 비교합니다.
더욱이, 이 프로토콜의 이면에 있는 일반적인 이론적 고려 사항이 잘못된 것으로 최근에 입증되었습니다16,17,18. 생리적 헤마토크릿(약 25% 이상)에서 적혈구(RBC)는 별도의 응집체로 침전되지 않고, 오히려 일반적으로 언급되는 스톡스 침전(Stokes sedimentation)16,17과는 다른 물리적 방정식을 따르는 적혈구(RBC)의 연속적인, 소위 침투(percolating) 네트워크(percolating)로 침전된다. 침전의 시간 분해 측정(전체 곡선)을 기반으로 한 물리적 설명을 고려하는 것이 일부 새로운 의학적 맥락에서 더 강력하다는 것이 나타났습니다(19,20). 또한, 이러한 측정은 세포 모양이 변경되는 병리학에서 ESR을 변경하는 물리적 메커니즘을 밝히는 데 사용될 수 있습니다19,20. 또한, 느린 ESR은 neuroacanthocytosis 증후군 환자19,20의 코호트 측정에서 나타난 바와 같이 유용한 의학적 해석을 가질 수 있습니다. 이 기사에서는 전체 ESR 동역학을 기반으로 물리적으로 의미 있는 매개변수의 측정을 실제로 구현하는 방법을 검토합니다. 보다 정확하게는, 여기에 제시된 방법은 최대 침강 속도 Um을 추출하며, 그 값은 공여체의 헤마토크릿 효과를 고려하여 보정 될 수 있습니다16,17. 이 매개변수는 기존의 측정치(16,17,19,20)보다 더 정확하고 신뢰할 수 있습니다.
또한, 일부 기초 연구에서, 주어진 환자의 염증 상태를 모니터링하는 대신에, ESR 21,22,23에 대한 헤마토크릿의 효과를 배제하거나, 변형된 ESR 19,20,24,25에서 적혈구의 역할을 조사하는 것은 흥미로울 것이다 다른 기증자 사이. 환자의 직접 전혈 샘플이 아닌 샘플을 비교하는 것이 유용할 수 있습니다. 따라서 자가 혈장 또는 혈장 치환기에서 제어된 헤마토크릿으로 적혈구를 재현탁하는 것이 ESR 측정의 첫 번째 단계로 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 인산염 완충 식염수(PBS)에 55mg/mL 농도의 덱스트란 70kDa 용액은 건강한 세포에 대한 제어 범위 내에서 침강 범위를 생성한다19. 이 원고는 또한 그러한 단계가 어떻게 수행되어야 하는지, 그리고 제시된 분석이 이러한 경우에도 관련이 있음을 보여줍니다.
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Protocol
혈액 샘플 수집 및 실험은 "Ärztekammer des Saarlandes", 윤리 투표 51/18에 의해 승인되었으며 헬싱키 선언에 따라 정보에 입각한 동의를 얻은 후 수행되었습니다. 표준 측정은 Westergren 튜브에서 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)-항응고 혈액(표준 EDTA 농도 1.6mg/mL 혈액, 유럽 표준 NF EN ISO 6710)으로 수행해야 합니다. Westergren 튜브를 채우는 데 필요한 부피는 제조업체에 따라 다릅니다(하부에 더 넓은 저장소가 포함되는 경우가 있음). 부피는 약 1mL의 전혈이어야 하며 재료 표에 표시된 튜브의 경우 800μL이어야 합니다. 그러나 아래에 설명된 방법은 프로브된 샘플의 헤마토크릿이 25%보다 높은 한 특정 현탁액 및 용기 모양에 관계없이 유효합니다16. 따라서 부피, 용기, 현탁 매체 및 첨가제는 수행된 연구의 특정 목적에 따라 선택해야 합니다.
1. 실험 및 측정
알림: s의 침강 속도를 기록amp매분.
- 시료 전처리(필요한 경우): 대조 헤마토크릿 또는 현탁액이 필요한 경우 먼저 세포를 세척하고 시료를 준비합니다(예: 자가 혈청과 혈장을 혼합하여 다양한 피브리노겐 수준의 시료를 준비하는 방법을 보여줍니다). 혈청은 실제로 피브리노겐이 없는 혈장26,27로 근사할 수 있으며, 그렇지 않으면 생리학적 조건에서 적혈구의 응집을 감소시키기 위해 사용할 수 있습니다. 여러 샘플을 준비하기 위해 9mL의 표준 EDTA 튜브에 혈액을 수집하고 9mL의 표준 혈청 튜브(응고 활성제로 실리카 비드 포함)에 혈청을 수집합니다.
- 혈액 샘플(즉, 선택한 예에서 표준 EDTA 및 혈청 튜브 9mL)을 3,000 x g 에서 최소 7분 동안 원심분리하여 패킹된 적혈구의 최적 압축을 위해 합니다. 충분한 양이 있는 경우 상청액을 PBS 또는 원하는 현탁액으로 교체하십시오. 자가 혈장에서 헤마토크릿을 제어하기만 하면 되는 경우 1.1.3단계로 직접 진행합니다. 그렇지 않으면 세척을 위해 상청액을 포함시킨 후 부드럽게 혼합하십시오.
- 세 번 반복하십시오. 어떤 경우에도 원하는 현탁액으로 마지막 세척을 수행하십시오.
- 선택한 예에서 자가 혈장과 혈청의 혼합물을 결정된 비율(예: 혈장-혈청 부피 분율의 25%/75%, 50%/50% 또는 75%/25%)로 준비합니다. 예를 들어, 25%/75% 혈장-혈청 혼합물 2.5mL를 준비할 때 혈청 1.875mL에 혈장 0.625mL를 추가합니다.
- 필요한 양의 포장 된 세포를 추출하고 원하는 액체에 현탁하십시오. 포장된 셀을 고점도 액체로 처리합니다(표준 사전 피펫팅 및/또는 역 피펫팅 또는 용적식 피펫28 사용). 선택한 예에서, 헤마토크릿이 45%인 4mL 샘플의 경우, 1.8mL의 패킹된 세포를 혈장-혈청 혼합물의 2.2mL 내에 현탁시킵니다.
- 샘플의 헤마토크릿이 제어되지 않으면 고속 미세 원심 분리로 측정하십시오 (다른 표준 방법도 적합 함).
- 헤마토크릿 측정을 위해 필요한 양의 시료 추출: 미세 헤마토크릿 모세관의 아래쪽 팁을 액체에 담가 채웁니다. 필요한 양의 샘플이 모세관 흡입에 의해 튜브에서 상승할 때 상단 개구부를 덮어 중지합니다.
- 밀봉 왁스로 모세관을 밀봉하십시오. 마이크로 헤마토크릿 원심분리기에 넣고 15,000 x g(12,000rpm)에서 5분 동안 또는 제조업체의 지침에 따라 실행합니다.
- 모세관의 헤마토크릿 수준을 읽고 참고용으로 기록해 두십시오.
- 샘플의 침전을 기록하기 위한 카메라를 설정합니다. 메모리에 과부하가 걸리거나 배터리가 소모되는 것을 방지하려면 주전원에서 장치에 전원을 공급하고 사진을 컴퓨터나 외장 하드 드라이브에 직접 저장하십시오.
- ESR 튜브가 정지 상태로 유지될 홀더 앞에 안정적인 카메라를 설치합니다. 흰색의 밝은 배경을 사용하십시오 (배경의 흰색 용지가 완벽하게 작동합니다).
- 가급적이면 표시가 없는 빈 Westergren 튜브를 사용하여 카메라의 초점과 시야를 설정하여 s를 얻을 수 있습니다.amp르가 배치될 위치에 가장 높은 해상도를 얻습니다. 가급적이면 사진의 테두리가 수직 및 수평 방향으로 정렬되어 있는지 확인하십시오.
- 픽셀 해상도를 추출하기 위해 크기가 조정된 튜브의 사진을 찍습니다. RGB 사진을 사용하는 것이 좋습니다.
- 카메라의 조명과 노출 시간을 흰색 배경으로 설정하되 채도는 설정하지 않습니다. 그림 1의 예는 Canon EOS M50을 사용하여 얻은 것으로, 노출 시간은 1/15초, 조리개는 F8.0, 텅스텐 화이트 밸런스는 수동 초점이 있는 싱글 샷 모드, ISO 감도 1,000입니다.
- ESR 튜브를 준비하고 배치합니다.
- Westergren 튜브의 하단 용기를 제조업체의 지침에 해당하는 부피로 채 웁니다. 제조업체에서 표시한 대로 하단 용기에 Westergren 튜브를 삽입합니다.
- 첫 번째 튜브가 준비되면 홀더에 넣고 카메라 녹화를 시작합니다. 1분에 한 장의 사진을 녹화하면 일반적으로 ESR 운동 곡선의 좋은 해상도를 얻을 수 있습니다.
- 다음 샘플을 준비하고 배치하십시오. 사진을 찍을 때 샘플 앞에 서지 마십시오.
- 2분, 30시간 및 1시간의 표준 측정과 비교하기 위해 측정을 최소 2시간 동안 실행합니다. 그러나 침전물의 포화와 정지를 보는 것도 좋습니다. 건강한 샘플의 경우 또는 염증의 경우 가장 빠른 샘플의 곡률이 3시간 이내에 보이기 때문에 12시간에서 24시간 사이에 밤새 샘플을 기록하는 것으로 충분합니다13,19. 그러나, 피브리노겐 농도의 감소가 침강 속도를 감소시키는 경우(즉, 선택된 예에서, 높은 혈청 부피 분율), 가장 정확한 정보를 얻기 위해 50시간 이상의 기록이 필요할 수 있다16,19.
2. 이미지 분석
알림: 이미지가 기록되면 ESR 곡선을 추출합니다. Matlab 코드의 예는 보충 파일 1 (MatlabCodeImageAnalysisSampled.m)로 제공됩니다.
- 하나의 튜브만 보이는 관심 영역(ROI)을 선택하거나 식별하며, 하단 경계는 적혈구 무세포 혈장 계면의 가장 낮은 위치 아래에 있지만 샘플 내에 있습니다(그림 1A, B 참조). 필요한 경우 세로 방향이 그림의 첫 번째 구성 요소를 따라 정렬되도록 그림을 회전합니다.
- RGB 그림의 ROI를 회색조 그림 또는 행렬 Gr로 변환합니다. 일반적으로 Gr = 2 * R - B - G로 3색 채널(빨강[R], 녹색[G] 및 파랑[B])을 결합하는 것은 선명한 배경에서 매우 효율적입니다(그림 1C 및 MatlabCodeImageAnalysisSampled.m 라인 121-128 참조).
- 그림을 이진화합니다. 건강한 샘플의 경우 Otsu 임계값29 를 사용하면 일반적으로 일관된 결과를 얻을 수 있습니다(그림 1D 및 MatlabCodeImageAnalysisSampled.m의 133행 참조). 헤마토크릿이 높거나 용혈이 심한 샘플의 경우 튜브 내부의 다양한 상 간에 얻은 정확한 대비에 따라 수동으로 조정하거나 다른 자동 방법(MatlabCodeImageAnalysisSampled.m의 129-131행에서 수행)을 사용하는 것이 더 나을 수 있습니다.
- 수평 방향에 따른 Gr의 픽셀(또는 요소) 값의 평균을 구합니다. 이 단계는 노이즈를 최소화하고 가능한 인터페이스 불규칙성을 효율적으로 평균화합니다( 그림 1E 및 MatlabCodeImageAnalysisSampled.m 라인 137 참조).
- 변동을 계산하기 전에, 특히 튜브에 수평 표시가 있는 경우 이동 평균으로 곡선을 매끄럽게 합니다( 그림 1F 참조). 제공된 예제의 경우 이 프로세스에 ~2.5mm(50픽셀)의 이동 창이 사용되었습니다(MatlabCodeImageAnalysisSampled.m의 138행 참조). 그런 다음 인터페이스 위치를 강도 변화가 가장 큰 지점으로 식별합니다( 그림 1G 참조).
- 각 그림과 각 샘플에 대해 반복합니다. 각 샘플에 대해 시간에 따른 인터페이스의 위치를 적절한 형식으로 저장하여 적절하게 맞는 소프트웨어와 함께 물리적 모델에 맞춥니다.
3. 물리적 모델의 피팅
- 적절하게 맞는 소프트웨어를 사용하여, 헤마토크릿 및 혈주 h0의 초기 높이를 알고, 지연 시간 t0, 무차원 시간 γ 및 물리적 모델17에 대한 잔류 편차 제곱의 합을 최소화하는 적혈구의 최종 충전 부피 분율 Φm의 값을 찾습니다. Matlab 코드(ShapeAnalyzerIntegrated.m)는 이러한 피팅을 수행하는 방법의 예로 보충 파일 2로 제공됩니다. 자세한 내용은 보충 파일 2를 참조하십시오. 다른 문헌16,17에 기재된 바와 같이, 생리학적 헤마토크릿 침전물에서의 적혈구는 연질 입자 겔로서, 여기서 중요한 물리적 파라미터는 공여체 Δρ의 혈장과 적혈구 사이의 밀도의 차이, RBC 특성 직경 rRBC, 실온 η에서의 혈장 점도, 및 공여체의 헤마토크릿 Φ . 이러한 파라미터를 사용하여, 중력 응력이 지연 시간 t0 후에 적혈구에 의해 형성된 다공성 네트워크를 통해 플라즈마가 위쪽으로 흐르기 위한 주요 구동 과정이라고 가정하면, 시간적 진화16,17을 얻는다.
와 함께
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적혈구의 평균 디스크 반경입니다. 이를 수행하는 Matlab 코드의 예는 첨부 파일로 제공됩니다 (ShapeAnalyzerIntegrated.m은 SedimFit.m [보충 파일 3]에 정의 된 함수에 적합합니다). 또는 G/γ 단위가 1/t인 적합 파라미터로 직접 사용할 수도 있습니다. - 그림에서 정량적 곡선이 추출되면 샘플의 물리적 매개변수를 저장합니다. 30분, 1시간 또는 2시간의 기존 ESR 값은 참조를 위해 곡선에서 추출할 수 있습니다(ShapeAnalyzerIntegrated.m 라인 123-132 참조).
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적혈구의 평균 디스크 반경입니다. 이를 수행하는 Matlab 코드의 예는 첨부 파일로 제공됩니다 (ShapeAnalyzerIntegrated.m은 SedimFit.m [보충 파일 3]에 정의 된 함수에 적합합니다). 또는 G/γ 단위가 1/t인 적합 파라미터로 직접 사용할 수도 있습니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
올바르게 획득된 이미지 시퀀스의 예는 Supplementary Movie 1(MovieS1.avi)로 제공됩니다. 다양한 조건에 대한 모형의 일련의 특성 적합치가 그림 2에 나와 있습니다. 피브리노겐 농도는 혈장 Fib0 중의 피브리노겐 농도로부터 결정하였으며, 혈청이 피브리노겐을 전혀 갖지 않는다고 가정하였다. 그러므로, Fib = C Fib0, 여기서 C는 혈장-혈청 혼합물의 혈장 부피 분율입니다. 이전 연구16에서, Fib0는 자를란트 대학병원(Homburg, Germany)의 임상화학실험실에서 표준방법에 의해 측정하였다. 이러한 양을 독립적으로 측정할 필요가 있는 경우, 피브리노겐 농도를 결정하는 편리한 방법은 (반)자동 볼 응고계를 포함하며, 이는 또한 공여자(30)로부터 구연산염-항응고된 혈액 샘플을 얻는 것을 필요로 할 수 있다. 이러한 곡선을 생성한 연구의 ESR 곡선은 평균 0.996 및 표준 편차 0.004(35개 곡선 중 하나만 R 2 < 0.99)인 피어슨 계수 R2
[0.974, 0.9996]에 맞출 수 있습니다. 최종적으로 추출된 매개변수는 RBC 상 Φm의 최종 헤마토크릿, 지연 시간 t0 - 겔이 파쇄되고 붕괴되기 시작하는 데 필요함 - 및 붕괴 시작 시 도달한 최대 순간 속도
입니다. 무차원 파라미터 γ는 적혈구의 압축 네트워크에서 공극 면적의 역수(입자 반경의 배수로 표시됨)와 관련되며, Δρ는 공여체의 혈장과 적혈구 사이의 밀도 차이이고, a는 적혈구 특성 직경, η는 실온에서의 혈장 점도, Φ는 공여체의 헤마토크릿입니다. 피팅은 실제로 Δρ, a, η 및 Φ를 고정한 다음 최적의 γ, Φm 및 t0을 결정하여 수행됩니다. 헤마토크릿은 다른 표준 방법을 통해 독립적으로 측정되어야 하는 반면, 다른 하나는 표준 값(Δρ
80kg/m3 31,32, η1.5 mPa s 33 및 4μm)으로 고정될 수 있습니다. 다른 파라미터들의 임의의 편차는 단순히 대응하는 인자에 의해 결정된 γ 값을 수정할 것이지만, Um의 최종 결정을 변화시키지 않을 것이며, 이는 그 점에서 강건한 파라미터이다.
헤마토크릿 및 피브리노겐 수준의 함수로서 매개변수의 경향을 보여주는 이전 기초 연구에서 수집된 매개변수 값의 모음이 그림 3 과 그림 4에 나와 있습니다.
그림 1: 이미지 처리 . (A) 하나의 샘플에 대해 강조 표시된 관련 ROI와 함께 여러 샘플의 이상적인 보기. (B) 선택한 ROI를 확대합니다. (C) 컬러 ROI를 그레이 레벨로 변환. (D) Otsu 임계값으로 얻은 이진화된 사진. (E) 높이의 함수로서 이진 그림의 수평 평균 강도 (이미지 처리의 일반적인 규칙에 따라 원점은 그림의 맨 위에 있는 것으로 간주됩니다. 프로토콜의 단계 2.4 참조). (F) 50 픽셀 수직 이웃에서 이동 평균을 수행하여 평활화 강도(프로토콜의 단계 2.5 참조). (G) 수직 방향에 따른 평활 강도의 변화. 절대 최대값의 위치는 인터페이스의 위치로 사용됩니다(프로토콜의 2.5단계 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 특성 적합. (A) 다양한 조정된 조혈구를 사용하여 건강한 기증자에 대해 얻은 곡선 및 적합. 곡선은 이전 연구17에서 채택되었습니다. (B) 다양한 피브리노겐 농도로 건강한 기증자에 대해 얻은 곡선 및 적합. 다양한 피브리노겐 농도는 자가 혈장과 혈청을 다양한 비율로 혼합하여 얻었다. 곡선과 데이터는 이전 연구16에서 가져온 것입니다. 오차 막대(픽셀 해상도 또는 맞춤 통계량에서 얻음)는 기호 크기보다 작습니다. 이 수치는 Dasanna et al.16(4개의 독립적인 혈액 도면에서 18개 샘플) 및 Darras et al.17(7개의 독립적인 혈액 도면에서 16개 샘플)의 허가를 받아 재인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 다양한 헤마토크리트에 대해 추출된 매개변수의 특성 값. (A) 추출된 최대 침강 속도의 변화 Wm은 샘플 헤마토크릿 Φ의 함수입니다. 원은 개별 측정값입니다. 다른 색상은 다른 건강한 기증자와 관련이 있습니다. 연속적인 빨간색 선은 Φm 및 γ의 평균값으로 얻은 모델에 의해 예측된 추세입니다. Φ = 0.45의 헤마토크릿에 대한 Um 의 보정된 값도 개별 값에 대한 삼각형과 모델의 예측 상수에 대한 직선으로 표시됩니다. 이 수정된 값은 모델에 
따라 로 계산되었습니다. (B) 매개변수 γ에 대해 얻은 값. (C) 매개변수 Φm에 대해 얻은 값. (d) 파라미터 t0에 대해 얻어진 값. 적합 통계량에서 얻은 개별 데이터의 오차 막대는 기호 크기보다 작습니다. 이 수치는 Darras et al.17의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 다양한 피브리노겐 농도에 대해 추출 된 매개 변수의 특성 값. (A) 샘플 피브리노겐 농도의 함수로서 추출된 최대 침강 속도 Um의 변화. 다른 색상은 다른 건강한 기증자와 관련이 있습니다. (B) 매개변수 γ에 대해 얻은 값. (C) 매개변수 Φm에 대해 얻은 값. (d) 파라미터 t0에 대해 얻어진 값. 적합 통계량에서 얻은 개별 데이터의 오차 막대는 기호 크기보다 작습니다. 이 그림은 Dasanna et al.16의 허가를 받아 재인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 동영상 1: 적절하게 획득한 이미지 시퀀스의 예. 이 사진에는 두 명의 다른 기증자(동일한 혈액형)의 다양한 샘플 유형이 나와 있습니다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 모든 샘플이 중복됨: 기증자 1의 전혈, 기증자 1의 적혈구 현탁액, 덱스트란 70kDa(55mg/mL PBS), 45%에서 조절된 헤마토크릿, 기증자 2의 전혈, 덱스트란에서 기증자 2의 적혈구 현탁액(45% 헤마토크릿), 기증자 2의 혈장에서 기증자 1의 적혈구 현탁액(45% 헤마토크릿), 및 기증자 1의 혈장에서 기증자 2의 적혈구 현탁액(45% 헤마토크릿). 샘플은 광범위한 침강 속도를 가지며 Dextran의 현탁액도 약간의 용혈을 보여줍니다. 그러나 제공된 코드 MatlabCodeImageAnalysisSampled.m은 모든 것을 효율적으로 분석합니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: MatlabCodeImageAnalysisSampled.m. 이미지 분석에 사용되는 기본 코드(프로토콜의 2단계). 특정 장치에서 코드를 실행하려면 8행을 수정해야 합니다. 분석 할 Westergren 튜브의 사진이 들어있는 폴더의 경로를 포함해야하며 사진의 접두사 (있는 경우)로 끝나야합니다. 압축된 사진 세트는 Zenodo(DOI: 10.5281/zenodo.7290177)에서 오픈 액세스 다운로드가 가능합니다. 코드, 특히 각 샘플의 속성(14-61행에 정의됨)은 이미 이러한 그림을 분석하도록 조정되었습니다. 이 그림 집합의 경우 사용된 접두사는 'IMG_'입니다. 따라서 문자열 줄 8은 '\IMG_'(또는 Linux 시스템의 경우 '/IMG_')로 끝나야 합니다. 코드의 마지막 부분(166-179행)도 각 샘플에 대해 추출된 침전 곡선을 자동으로 표시합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: ShapeAnalyzerIntegrated.m. 물리적 모델에 맞는 데 사용되는 기본 코드(프로토콜의 3단계). 이 코드를 실행하려면 MatlabCodeImageAnalysisSampled.m의 출력 텍스트 파일이 포함된 폴더에 SedimFit.m과 함께 복사하여 붙여넣기만 하면 됩니다. 분석할 파일의 이름(.txt 확장명 제외)은 9줄에 나열되어야 합니다. 튜브의 초기 헤마토크릿과 높이도 각각 12 번과 15 번 라인에 포함되어야합니다. 이 코드는 Zenodo(DOI: 10.5281/zenodo.7290177)의 오픈 액세스 사진에서 추출한 곡선을 분석하기 위해 이미 준비되어 있습니다. 앞서 언급한 라인 코드가 수정되면 Matlab 편집기 도구 모음에서 '실행' 버튼을 클릭하기만 하면 됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3: SedimFit.m. ShapeAnalyzerIntegrated.m에 의해 조정된 물리적 모델. 이 파일은 물리적 파라미터를 추출하기 위해 실험 곡선에 피팅되는 함수를 정의하는 Matlab 함수입니다. 이 폴더는 분석이 실행될 때 ShapeAnalyzerIntegrated.m과 같은 폴더에 있어야 합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
자동화된 프로토콜이 효율적으로 작동하려면 명확한 배경과 적절한 조명이 있어야 합니다. 배경이 어두우면 효율적인 이진화 임계값이 존재하지 않을 수 있습니다. 일반적으로 시간이 지남에 따라 발생하는(증가하는) 일부 용혈이 있는 샘플의 경우 선택한 이진화 임계값이 초기 및 최종 사진 모두와 관련이 있는지 먼저 확인하는 것이 중요합니다.
그림의 이진화 과정과 관련하여 ROI 및 이진화 임계값의 선택은 가장 민감한 단계입니다. 세 가지 다른 그림(침전 과정의 시작, 중간 및 끝)에서 서로 다른 임계값을 수동으로 테스트하여 임계값 선택이 실제로 전체 프로세스에 대한 관련 이진화를 제공하는지 확인하는 것이 유용할 수 있습니다. 샘플이 강한 용혈을 경험하는 경우, 명확한 계면이 여전히 관찰될 수 있는 공정의 시작으로 샘플 분석을 제한해야 할 수 있습니다. 모든 ESR 측정의 경우 튜브에 기포가 존재하지 않도록 하는 것도 중요합니다. 그러나 튜브 상단에서 작은 기포가 관찰되는 경우 기포 아래에서 시작하여 초기 인터페이스 바로 위에서 ROI가 여전히 관련 측정을 제공할 수 있습니다. 그러나 이 경우 튜브의 오른쪽과 왼쪽에 약간의 배경 공간을 포함하여 항상 배경의 회색 수준을 가진 상당한 양의 픽셀을 고려하면서 Otsu 임계값을 결정할 수 있도록 하는 것이 중요합니다.
모든 ESR 측정과 마찬가지로 이 방법은 충전된 적혈구와 무세포 혈장 사이의 명확한 경계면을 볼 수 있다는 가정에 의존합니다. 검체에 상당한 양의 용혈이 발생하거나 검체의 헤마토크릿이 너무 희석된 경우(25%17 미만) 이러한 계면은 더 이상 관찰되지 않습니다. 이러한 조건에서 ESR 측정을 수행하는 것은 불가능합니다.
앞서 언급한 바와 같이, 이 방법은 겔 붕괴 Um의 관련 속도를 제공하는 것을 보장하며, 이는 환자(17)의 초기 헤마토크릿에 따라 교정될 수 있다. 그림 3A는 Um 의 원시 측정치와 함께 Φ 0 = 0.45의 정규화 된 헤마토크릿에 대한 보정 된 값을 보여줍니다. 보정은 Φ0에 대한 전반적인 의존성뿐만 아니라 대부분의 데이터 분산을 제거한다는 것을 알 수 있습니다. 관련 물리적 모델을 직접 기반으로 Um 을결정하는 것은 또한 기술이 평활 매개 변수를 임의로 선택하는 임의의 곡선 평활화보다 더 객관적임을 의미합니다. 그 중에서도 이 방법은 비정상적으로 낮은 ESR 값이 관찰되는 의학적 맥락에서 더 강력한 것으로 나타났습니다19,20.
이 측정의 또 다른 본질적인 관심은 보다 강력하고 물리적으로 해석 가능한 데이터를 제공한다는 것입니다. 예를 들어, 낮아진 ESR의 경우, 붕괴의 지연 시간 t0가 연장되는지, 적혈구의 네트워크가 γ을 통해 비정상적으로 무질서한지, 또는 셀의 최종 압축 Φm이 어떻게든 방해를 받는지(16,19,20)를 구별할 수 있다.
흥미롭게도, 최대 침강 속도의 측정은 이전 연구13,14,15에서 이미 강조된 바와 같이 피브리노겐 수준에 더 강력하고 민감합니다. 이것은 ESR이 종종 피브리노겐 수치 상승과 관련된 염증을 모니터링하는 데 사용되기 때문에 중요한 특징입니다. 이러한 민감도는 본질적으로 겔 붕괴 시점으로부터 Um을 분리함으로써 발생하며, 이는 중요한 랜덤 성분34,35,36을 갖는 것으로 알려져 있다. 보다 정확하게는, 그림 4D16에서 강조된 바와 같이, 더 높은 농도의 피브리노겐에 대해, 지연 시간의 본질적인 무작위 변동 (150 mg / mL 이상의 측정은 단일 기증자 사이에서도 12 분에서 30 분 사이 임)은이 매개 변수에 대한 기본 의존성과 동일한 크기 순서를 갖는다 (150 mg / dL과 300 mg / dL 사이; 측정의 평균 추세는 0.45 h에서 0.4 h로 만 감소한다 [ 즉, 27분에서 24분]). 이 지연 시간은 실제로 30분 또는 1시간(이 지연 시간이 때때로 도달하거나 초과할 수 있는 기간)의 기존 높이 측정에 포함되기 때문에 최대 속도 Um (각 기증자에 대한 체계적이고 중요한 추세 제시)을 추출하면 보다 강력하고 의미 있는 매개변수 13,14,15,34,35를 제공합니다. 36.
더욱이, 파라미터 Um은 앞서 기술된 실제 결과에 
따라 초기 헤마토크릿에 대해 효율적으로 보정될 수 있다(17). 이전 연구(17)에서 모든 건강한 공여자에 대한 데이터를 결합할 때, γ = 0.50 ± 0.06 및 Φ m = 0.86 ± 0.04의 값이 얻어지며, 이는 그림 3에 도시된 바와 같이 공여자의 헤마토크릿 Φ의 함수로서 Um의 경향을 잘 재현한다. 그러나 실제적인 경우에는 피브리노겐 수치가 기증자마다 크게 변할 수 있고 이러한 매개변수에 상당한 영향을 미치기 때문에 특정 기증자에 대해 얻은 γ 및 Φm값으로 ESR을 수정하는 것이 더 엄격할 수 있습니다(그림 4).
논의된 사항을 고려하고 일상적인 의료 절차에 포함시키면 체외 임상 도구로서의 ESR의 정확성과 다양성이 더욱 향상될 것입니다.
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Disclosures
저자는 이 기사의 내용과 관련이 있다고 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 독일 연구 재단의 연구 단위 FOR 2688 - Wa1336/12와 Marie Skłodowska-Curie 보조금 계약 번호 860436-EVIDENCE의 지원을 받았습니다. T.J.와 C.W.는 프랑스 독일 대학교(DFH/UFA)의 자금 지원을 인정합니다. AD는 Saarland University의 Young Investigator Grant의 자금 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (for blood sample) | SARSTEDT | 267001 or 265 | Anticoagulated blood sample to characterize |
| Camera EOS M50 | Canon | Kit EF-M18-150 IS STM | Any camera should work, provided that sector alimentation, connection to computer for automated shooting and adapted objective are available |
| Centrifuge | HERMLE | 302.00 V03 - Z 36 HK | Requirements: at least 3000 x g ofr 7 min. |
| Micro-centrifuge | MLW | TH21 | or any other way to determine the hematocrit |
| Micro-hematocrit capilaries | Fisher scientific | 11884040 | or other capillaries/containers for hematocrit determination |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4, 298 Osm |
| Pipettes (e.g. positive displacement pipette) | Gilson | FD10006 | Pipette required to manipulate blood and/or packed cells.Other models are of course suitable, but be careful to treat blood and pakced cells as highly viscous fluids. |
| Wax sealing plate | Hirschmann | 9120101 | Sealing wax for the micro-hematocrit capillaries |
| Westergren tubes | Praxindo | A9244560 | Any other standard Wetsergren tube should work too |
| White background with illumination | / | / | White sheet(s) of paper behind the samples, with usual room light is perfcetly sufficient. |
References
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