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Medicine

Blutsenkungsgeschwindigkeit: Eine physikgetriebene Charakterisierung im medizinischen Kontext

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64502
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3
1Experimental Physics, Saarland University, 2Department of Physics and Materials Science, University of Luxembourg, 3Theoretical Medicine and Biosciences, Saarland University

Summary

Die Blutsenkungsgeschwindigkeit (BSG) ist ein physikalischer Parameter, der häufig bei routinemäßigen Gesundheitsuntersuchungen und medizinischen Diagnosen verwendet wird. Vor kurzem wurde ein theoretisches Modell entwickelt, das es ermöglicht, physikalisch bedeutsame Parameter aus der gesamten Sedimentationskurve zu extrahieren, basierend auf modernen kolloidalen Erkenntnissen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um den ESR im Laufe der Zeit automatisch zu erfassen und die Parameter dieses aktuellen Modells aus dieser automatisierten Datenerfassung zu extrahieren. Diese verfeinerten Parameter dürften auch die medizinische Aussage verbessern.

Abstract

Die Blutsenkungsgeschwindigkeit (BSG) der Erythrozyten (oder roten Blutkörperchen) ist ein physikalisch abgeleiteter Parameter des Blutes, der häufig bei routinemäßigen Gesundheitsuntersuchungen und medizinischen Diagnosen verwendet wird. So wird beispielsweise bei einer Entzündung aufgrund des damit verbundenen Anstiegs von Fibrinogen und anderen Plasmaproteinen ein höherer BSG beobachtet. Es wurde angenommen, dass dieser Anstieg auf die Bildung größerer Aggregate roter Blutkörperchen (RBCs) zurückzuführen ist, die durch den Anstieg des Fibrinogens verursacht werden. In der Tat ist Fibrinogen eine wirkstofffördernde Aggregation von Erythrozyten und im Stokes-Regime, von der angenommen wird, dass sie in Blut beobachtet wird, sedimentieren größere Aggregate schneller. Alle Modelle von ESR-Messungen, die auf dieser Hypothese basieren, erfordern jedoch weitere spezifische physikalische Annahmen, die in keinem anderen System erforderlich sind. Darüber hinaus haben moderne Studien auf dem Gebiet kolloidaler Suspensionen festgestellt, dass attraktive Partikel perkolierende Aggregate bilden (d.h. Aggregate, die so breit wie der Behälter sind). Auf die Sedimentation dieser Kolloide folgt dann ein sogenannter "kolloidaler Gelkollaps". Kürzlich wurde gezeigt, dass Erythrozyten tatsächlich dem gleichen Verhalten folgen. Diese Hypothese erlaubt es auch, die Sedimentationskurve von Erythrozyten effizient und analytisch zu modellieren, aus denen robuste und physikalisch aussagekräftige Deskriptoren extrahiert werden können. Dieses Manuskript beschreibt, wie eine solche Analyse durchgeführt wird, und diskutiert die Vorteile dieses Ansatzes.

Introduction

Die Blutsenkungsgeschwindigkeit (BSG) ist ein medizinisches klinisches In-vitro-Instrument, das im zwanzigsten Jahrhundert offiziell in der evidenzbasierten Medizin eingeführt wurde 1,2,3,4. Er wird derzeit weltweit als unspezifischer Entzündungstest oder zur Überwachung der Entwicklung bestimmter Erkrankungen eingesetzt 5,6,7,8. Dies ist vor allem auf einen Anstieg der Fibrinogenkonzentration, aber auch in anderen Plasmabestandteilen wie IgM 1,9,10,11 zurückzuführen. Nach dem aktuellen Westergren-Standardprotokoll werden ESR-Werte als Messung der zellfreien Plasmaschicht zu einem bestimmten Zeitpunkt (30 min oder 1 h) nach dem Verlassen eines vertikalen Röhrchens mit einer typischen Größe von 20 cm vertikal im Ruhezustand angegeben12. Diese Messmethode steht jedoch in der Kritik, da qualitativ unterschiedliche Stadien im Sedimentationsprozess berichtet wurden, einschließlich einer Verzögerung vor Erreichen der maximalen Setzgeschwindigkeit13. Diese Verzögerung dauert bei etwa der Hälfte der gesunden Proben mehr als 1 h14. Die Geschwindigkeit während dieser Phase gehorcht einer anderen Skalierung als während der zweiten, schnelleren Phase der Sedimentation15. Durch die Beschränkung der Ablesung auf die durchschnittliche Absetzgeschwindigkeit während der ersten Stunde wird dann eine unterschiedliche Mischung verschiedener Bluteigenschaften zwischen verschiedenen Individuen verglichen.

Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass die üblichen theoretischen Überlegungen hinter diesem Protokoll falsch waren16,17,18. Bei physiologischem Hämatokrit (über ca. 25%) sedimentieren die roten Blutkörperchen (RBCs) nicht als separate Aggregate, sondern als kontinuierliches, sogenanntes perkolierendes Netzwerk von Erythrozyten 17,18, das einem anderen Satz physikalischer Gleichungen gehorcht als die üblicherweise erwähnte Stokes-Sedimentation 16,17. Es konnte gezeigt werden, dass die Betrachtung einer physikalischen Beschreibung, die auf den zeitaufgelösten Messungen der Sedimentation (ganze Kurve) basiert, in einigen neuen medizinischen Kontexten robuster war19,20. Darüber hinaus könnten diese Messungen verwendet werden, um die physikalischen Mechanismen zu beleuchten, die die BSG bei Pathologien verändern, bei denen die Zellform verändert ist19,20. Darüber hinaus kann eine langsame BSG eine nützliche medizinische Interpretation haben, wie die Messungen einer Kohorte von Patienten mit Neuroacanthozytose-Syndromzeigen 19,20. Dieser Artikel gibt einen Überblick darüber, wie die Messung physikalisch sinnvoller Parameter auf der Grundlage der gesamten ESR-Kinetik praktisch implementiert werden kann. Genauer gesagt extrahiert die hier vorgestellte Methode die maximale Sedimentationsgeschwindigkeit Um, deren Wert korrigiert werden kann, um den Effekt des Hämatokrit des Donorszu berücksichtigen 16,17. Dieser Parameter ist genauer und damit zuverlässiger als die herkömmliche Messung16,17,19,20.

Darüber hinaus ist es in der Grundlagenforschung interessant, den Einfluss des Hämatokrits auf den BSGauszuschließen 21,22,23 oder die Rolle der Erythrozyten bei einem modifizierten BSG zu untersuchen, anstatt den Entzündungszustand eines bestimmten Patienten zu überwachen 19,20,24,25 zwischen verschiedenen Spendern. Es kann sinnvoll sein, Proben zu vergleichen, bei denen es sich nicht direkt um Vollblutproben von Patienten handelt. Daher könnte die Resuspendierung von Erythrozyten mit einem kontrollierten Hämatokrit im autologen Plasma oder in einem Plasmasubstituenten als erster Schritt der BSG-Messung verwendet werden. Beispielsweise erzeugen Lösungen von Dextran 70 kDa mit einer Konzentration von 55 mg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) einen Sedimentationsbereich innerhalb des Kontrollbereichs für gesunde Zellen19. Dieses Manuskript zeigt auch, wie solche Schritte durchgeführt werden sollten und dass die vorgestellte Analyse auch in diesen Fällen relevant ist.

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Protocol

Die Blutentnahme und die Experimente wurden von der Ärztekammer des Saarlandes, ethics votum 51/18, genehmigt und nach Einholung der Einverständniserklärung von Helsinki durchgeführt. Standardmessungen sollten mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-antikoaguliertem Blut (Standard-EDTA-Konzentration von 1,6 mg/ml Blut, europäische Norm NF EN ISO 6710) in Westergren-Röhrchen durchgeführt werden. Das Volumen, das zum Befüllen der Westergren-Röhre erforderlich ist, hängt vom Hersteller ab (da die unteren Teile manchmal ein breiteres Reservoir enthalten). Das Volumen sollte etwa 1 ml Vollblut und 800 μl für die in der Materialtabelle angegebenen Röhrchen betragen. Die unten beschriebene Methode ist jedoch unabhängig von der spezifischen Suspensions- und Behälterform gültig, solange der Hämatokrit der untersuchten Proben höher als 25 % ist16. Volumina, Behälter, Suspensionsmedium und Additive sollten daher entsprechend den spezifischen Zielen der durchgeführten Forschung ausgewählt werden.

1. Experimente und Messungen

Anmerkungen: Notieren Sie die Sedimentationsgeschwindigkeit der Probe jede Minute.

  1. Probenvorbereitung (falls erforderlich): Wenn ein Kontrollhämatokrit oder eine Suspensionsflüssigkeit erforderlich ist, beginnen Sie mit dem Waschen der Zellen und der Vorbereitung der Proben (als Beispiel zeigen wir, wie Proben mit unterschiedlichen Fibrinogengehalten durch Mischen von autologem Serum und Plasma hergestellt werden). Serum kann in der Tat als fibrinogenfreies Plasma26,27 angenähert werden und kann verwendet werden, um die Aggregation von Erythrozyten unter ansonsten physiologischen Bedingungen zu verringern. Um mehrere Proben vorzubereiten, wird das Blut in Standard-EDTA-Röhrchen von 9 ml und das Serum in Standard-Serumröhrchen (mit Siliziumdioxidkügelchen als Gerinnungsaktivatoren) von 9 ml gesammelt.
    1. Zentrifugieren Sie die Blutproben (d. h. 9 ml Standard-EDTA- und Serumröhrchen im ausgewählten Beispiel) bei 3.000 x g für mindestens 7 Minuten, um eine optimale Verdichtung der verpackten Erythrozyten zu gewährleisten. Ersetzen Sie den Überstand durch PBS oder die gewünschte Suspensionsflüssigkeit, wenn eine ausreichende Menge vorhanden ist. Wenn es lediglich erforderlich ist, den Hämatokrit im autologen Plasma zu kontrollieren, fahren Sie direkt mit Schritt 1.1.3 fort. Andernfalls nach Einschluss des Überstands zum Waschen vorsichtig mischen.
    2. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal. Führen Sie die letzte Wäsche in jedem Fall mit der gewünschten Suspensionsflüssigkeit durch.
      1. Im gewählten Beispiel werden Mischungen aus Eigenplasma und Serum mit bestimmten Anteilen (z. B. 25 %/75 %, 50 %/50 % oder 75 %/25 % des Plasma-Serum-Volumenanteils) hergestellt. Wenn Sie beispielsweise 2,5 ml des 25%/75%igen Plasma-Serum-Gemisches zubereiten, fügen Sie 0,625 ml Plasma zu 1,875 ml Serum hinzu.
    3. Extrahieren Sie das erforderliche Volumen der gepackten Zellen und suspendieren Sie es in der gewünschten Flüssigkeit. Verarbeiten Sie die gepackten Zellen als hochviskose Flüssigkeit (unter Verwendung von Standard-Vorpipettieren und/oder Rückwärtspipettieren oder einer Verdrängungspipette28). Im gewählten Beispiel werden für eine 4-ml-Probe bei einem Hämatokrit von 45 % 1,8 ml gepackte Zellen innerhalb von 2,2 ml des Plasma-Serum-Gemisches suspendiert.
  2. Wenn der Hämatokrit der Probe nicht kontrolliert wird, wird er durch Hochgeschwindigkeits-Mikrozentrifugation bestimmt (andere Standardmethoden sind ebenfalls geeignet).
    1. Extrahieren Sie die erforderliche Probenmenge für die Hämatokritbestimmung: Füllen Sie die Mikrohämatokritkapillaren, indem Sie die untere Spitze in die Flüssigkeit tauchen. Stoppen Sie es, indem Sie die obere Öffnung abdecken, wenn die erforderliche Probenmenge im Röhrchen durch Kapillarabsaugung ansteigt.
    2. Versiegeln Sie die Kapillaren mit Siegellack. Legen Sie sie in die Mikrohämatokritzentrifuge und lassen Sie sie 5 Minuten lang bei 15.000 x g (12.000 U/min) oder gemäß den Anweisungen des Herstellers laufen.
    3. Lesen Sie den Hämatokritwert an der Kapillare ab und notieren Sie ihn als Referenz.
  3. Stellen Sie eine Kamera auf, um die Sedimentation der Proben aufzuzeichnen. Um eine Überlastung des Speichers oder eine Entladung des Akkus zu vermeiden, versorgen Sie das Gerät über das Stromnetz mit Strom und speichern Sie die Bilder direkt auf einem Computer oder einer externen Festplatte.
    1. Stellen Sie eine stabile Kamera vor der Halterung auf, wo die ESR-Röhrchen ruhen. Verwenden Sie einen weißen, beleuchteten Hintergrund (weiße Blätter im Hintergrund funktionieren perfekt).
    2. Verwenden Sie leere Westergren-Röhren, vorzugsweise ohne Markierungen, um den Fokus und das Sichtfeld der Kamera so einzustellen, dass die höchste Auflösung an der Stelle erreicht wird, an der die Proben platziert werden. Achten Sie vorzugsweise darauf, dass die Ränder der Bilder in vertikaler und horizontaler Richtung ausgerichtet sind.
    3. Machen Sie ein Foto einer skalierten Röhre, um die Pixelauflösung zu extrahieren. Die Verwendung von RGB-Bildern wird empfohlen.
    4. Stellen Sie das Licht und die Belichtungszeit der Kamera so ein, dass sie einen weißen Hintergrund, aber keine Sättigung haben. Das Beispiel in Abbildung 1 wurde mit einer Canon EOS M50 mit einer Belichtungszeit von 1/15 s, einer Blende von F8,0, einem Tungsten-Weißabgleich, im Einzelbildmodus mit manuellem Fokus und einer ISO-Empfindlichkeit von 1.000 aufgenommen.
  4. Bereiten Sie die ESR-Röhrchen vor und platzieren Sie sie.
    1. Füllen Sie den unteren Behälter der Westergren-Röhre mit dem Volumen, das den Anweisungen des Herstellers entspricht. Setzen Sie das Westergren-Rohr wie vom Hersteller angegeben in den Bodenbehälter ein.
    2. Sobald die erste Röhre fertig ist, legen Sie diese in die Halterung und starten Sie die Kameraaufnahme. Die Aufnahme eines Bildes pro Minute ergibt in der Regel eine gute Auflösung der kinetischen ESR-Kurve.
    3. Bereiten Sie die nächsten Proben vor und platzieren Sie sie. Achten Sie darauf, dass Sie nicht vor einer Probe stehen, wenn ein Bild aufgenommen wird.
    4. Lassen Sie die Messungen mindestens 2 h laufen, um sie mit den Standardmessungen in 30 min, 1 h und 2 h zu vergleichen. Es ist jedoch auch besser, die Sättigung und den Stillstand der Sedimentation zu sehen. Für gesunde Proben oder im Falle einer Entzündung ist die Aufzeichnung der Proben über Nacht, zwischen 12 h und 24 h, mehr als ausreichend, da die Krümmung der schnellsten Proben innerhalb von 3 h sichtbar ist13,19. Wenn jedoch eine Bedingung die Sedimentationsgeschwindigkeit verringert, wie dies bei einer Abnahme der Fibrinogenkonzentration der Fall ist (d. h. im gewählten Beispiel ein hoher Serumvolumenanteil), können Aufzeichnungen von 50 Stunden oder mehr erforderlich sein, um die genauesten Informationen zu erhalten16,19.

2. Bildanalyse

Anmerkungen: Sobald die Bilder aufgezeichnet sind, extrahieren Sie die ESR-Kurve. Ein Beispiel für Matlab-Code finden Sie als Ergänzungsdatei 1 (MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).

  1. Wählen oder identifizieren Sie eine Region of Interest (ROI), in der nur ein Röhrchen sichtbar ist, wobei sich der untere Rand unter der untersten Position der Grenzfläche des erythrozytzellfreien Plasmas, aber innerhalb der Probe befindet (siehe Abbildung 1A, B). Drehen Sie das Bild bei Bedarf so, dass die vertikale Richtung entlang der ersten Komponente des Bildes ausgerichtet ist.
  2. Konvertieren Sie den ROI des RGB-Bildes in ein Graustufenbild oder eine Matrix Gr. In der Regel ist die Kombination der dreifarbigen Kanäle (Rot [R], Grün [G] und Blau [B]) als Gr = 2 * R - B - G mit einem klaren Hintergrund sehr effizient (siehe Abbildung 1C und MatlabCodeImageAnalysisSampled.m Zeilen 121-128).
  3. Binarisieren Sie das Bild. Bei einer fehlerfreien Stichprobe führt die Verwendung des Otsu-Schwellenwerts29 in der Regel zu einem konsistenten Ergebnis (siehe Abbildung 1D und Zeile 133 von MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Für Proben mit einem hohen Hämatokrit oder mit einer gewissen Hämolyse kann es besser sein, ihn manuell anzupassen oder eine andere automatische Methode zu verwenden (wie in den Zeilen 129-131 von MatlabCodeImageAnalysisSampled.m beschrieben), abhängig vom genauen Kontrast, der zwischen den verschiedenen Phasen im Röhrchen erzielt wird.
  4. Ermitteln Sie den Durchschnitt der Pixel- (oder Element-) Werte von Gr entlang der horizontalen Richtung. Dieser Schritt minimiert das Rauschen und mittelt effizient die möglichen Schnittstellenunregelmäßigkeiten (siehe Abbildung 1E und MatlabCodeImageAnalysisSampled.m Zeile 137).
  5. Bevor Sie die Variationen berechnen, glätten Sie die Kurve mit einem gleitenden Durchschnitt, insbesondere wenn die Röhren einige horizontale Markierungen enthalten (siehe Abbildung 1F). Für die bereitgestellten Beispiele wurde ein bewegliches Fenster von ~2,5 mm (50 Pixel) für diesen Prozess verwendet (siehe Zeile 138 von MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Identifizieren Sie dann die Grenzflächenposition als den Punkt mit der höchsten Intensitätsvariation (siehe Abbildung 1G).
  6. Wiederholen Sie dies für jedes Bild und jede Probe. Speichern Sie für jedes Beispiel die Positionen der Schnittstelle entlang der Zeit in einem geeigneten Format, um das physische Modell mit einer geeigneten Software anzupassen.

3. Anpassung des physikalischen Modells

  1. Unter Verwendung einer geeigneten Software, die den Hämatokrit und die Anfangshöhe der Blutsäule h 0 kennt, finden Sie die Werte der Verzögerungszeit t0, der dimensionslosen Zeit γ und des endgültigen gepackten Volumenanteils Φmder Erythrozyten, der die Summe der quadrierten Restabweichungen für das physikalische Modell17 minimiert. Ein Matlab-Code (ShapeAnalyzerIntegrated.m) wird als Supplementary File 2 als Beispiel für die Durchführung einer solchen Anpassung bereitgestellt. Weitere Anweisungen finden Sie in der Ergänzungsdatei 2. Wie an anderer Stelle16,17 beschrieben, weisen Erythrozyten am physiologischen Hämatokritsediment als weiches Partikelgel auf, wobei die wichtigen physikalischen Parameter der Dichteunterschied zwischen dem Plasma und den Erythrozyten des Donors Δρ, der charakteristische Erythrozytdurchmesser rRBC, die Plasmaviskosität bei Raumtemperatur η und der Hämatokrit Φ des Donors sind . Unter Verwendung dieser Parameter und unter der Annahme, dass die Gravitationsspannung der Hauptantriebsprozess für das Plasma ist, um nach einer Verzögerungszeit t0 durch das von den Erythrozyten gebildete poröse Netzwerk nach oben zu fließen, erhält man die zeitliche Entwicklung16,17:
    Equation 1
    mit Equation 2, Equation 3und Equation 4 ist der mittlere Bandscheibenradius eines Erythrozyten. Ein Beispiel für einen Matlab-Code, der dies ausführt, wird als Anhang bereitgestellt (ShapeAnalyzerIntegrated.m passt zu der in SedimFit.m [Supplementary File 3] definierten Funktion). Alternativ kann G/γ auch direkt als Anpassungsparameter mit Einheiten von 1/t verwendet werden.
  2. Sobald die quantitative Kurve aus dem Bild extrahiert wurde, speichern Sie die physikalischen Parameter der Probe. Herkömmliche ESR-Werte nach 30 min, 1 h oder 2 h können weiterhin als Referenz aus der Kurve extrahiert werden (siehe ShapeAnalyzerIntegrated.m, Zeilen 123-132).

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Representative Results

Ein Beispiel für eine korrekt aufgenommene Bildsequenz ist als Supplementary Movie 1 (MovieS1.avi) dargestellt. In Abbildung 2 ist eine Reihe von charakteristischen Anpassungen des Modells für verschiedene Bedingungen dargestellt. Die Fibrinogenkonzentration wurde aus der Fibrinogenkonzentration im Plasma Fib0 bestimmt, unter der Annahme, dass das Serum überhaupt kein Fibrinogen enthält. Daher ist Fib = C Fib0, wobei C der Plasmavolumenanteil im Plasma-Serum-Gemisch ist. In vorangegangenen Studien16 wurde Fib0 mit Standardmethoden im Labor für Klinische Chemie des Universitätsklinikums des Saarlandes (Homburg, Deutschland) bestimmt. Wenn es notwendig ist, eine solche Menge unabhängig zu messen, umfasst ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Fibrinogenkonzentration (halb-)automatisierte Kugelkoagulometer, die auch die Entnahme einer Citrat-antikoagulierten Blutprobe des Spenders erfordern können30. Die ESR-Kurven aus den Studien, die diese Kurven generierten, konnten mit einem Pearson-Koeffizienten R 2 [0,974, 0,9996] mit einem Durchschnitt von 0,996 und einer Standardabweichung von 0,004 (nur eine Kurve von 35 ergab einen R2Equation 11 < 0,99) angepasst werden. Die schließlich extrahierten Parameter sind der endgültige Hämatokrit in der Erythrozytenphase Φm, die Verzögerungszeit t0 - die erforderlich ist, damit das Gel bricht und zu kollabieren beginnt - und die maximale MomentangeschwindigkeitEquation 6, die zu Beginn des Kollapses erreicht wird. Der dimensionslose Parameter γ ist mit der Umkehrung der Porenfläche im Verdichtungsnetzwerk der Erythrozyten verbunden (ausgedrückt in Vielfachen des Partikelradius), Δρ ist der Dichteunterschied zwischen dem Plasma und den Erythrozyten des Donors, a ist der charakteristische Durchmesser der Erythrozyten, η ist die Plasmaviskosität bei Raumtemperatur und Φ ist der Hämatokrit des Donors. Die Anpassung erfolgt tatsächlich, indem Δρ,a,η und Φ fixiert und dann die beste γ, Φm und t0, bestimmt werden. Der Hämatokrit sollte unabhängig über eine andere Standardmethode bestimmt werden, während die andere Methode auf Standardwerte (ΔρEquation 10080kg/m3 31,32, ηEquation 100 1,5 mPa s 33 und aEquation 1004 μm) festgelegt werden kann. Jede Abweichung der anderen Parameter würde lediglich den ermittelten Wert von γ um einen entsprechenden Faktor verändern, aber nicht die endgültige Bestimmung von Um, die dann in dieser Hinsicht ein robuster Parameter ist.

In Abbildung 3 und Abbildung 4 sind Sammlungen von Parameterwerten dargestellt, die in früheren Grundlagenstudien gesammelt wurden und die Trends der Parameter in Abhängigkeit von den Hämatokrit- und Fibrinogenspiegeln zeigen.

Figure 1
Abbildung 1: Bildverarbeitung. (A) Ideale Ansicht mehrerer Proben mit relevanten ROIs, hervorgehoben für eine Probe. (B) Zoomen Sie auf den ausgewählten ROI. (C) Umrechnung des farbigen ROI in Graustufen. (D) Binarisiertes Bild, das mit dem Otsu-Schwellenwert erhalten wurde. (E) Die horizontal gemittelte Intensität des Binärbildes in Abhängigkeit von der Höhe (nach der in der Bildverarbeitung üblichen Konvention wird der Ursprung oben im Bild betrachtet; siehe auch Schritt 2.4 des Protokolls). (F) Geglättete Intensität durch Ausführen eines gleitenden Durchschnitts in einer vertikalen Nachbarschaft von 50 Pixeln (siehe auch Schritt 2.5 des Protokolls). (G) Variationen der geglätteten Intensität entlang der vertikalen Richtung. Die Position des absoluten Maximalwertes wird als Position der Schnittstelle angenommen (siehe auch Schritt 2.5 des Protokolls). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Charakteristische Passungen. (A) Kurven und Passungen, die für einen gesunden Spender ermittelt wurden, mit verschiedenen angepassten Hämatokritwerten. Die Kurven stammen aus einer früheren Studie17. (B) Kurven und Passungen, die für einen gesunden Spender mit unterschiedlichen Fibrinogenkonzentrationen ermittelt wurden. Verschiedene Fibrinogenkonzentrationen wurden durch Mischen von autologem Plasma und Serum in verschiedenen Anteilen erhalten. Die Kurven und Daten stammen aus einer früheren Studie16. Fehlerbalken (ermittelt aus der Pixelauflösung oder der Einpassungsstatistik) sind kleiner als die Symbolgröße. Die Abbildungen wurden mit Genehmigung von Dasanna et al.16 (18 Proben aus vier unabhängigen Blutabnahmen) und Darras et al.17 (16 Proben aus sieben unabhängigen Blutabnahmen) nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Kennwerte der extrahierten Parameter für verschiedene Hämatokritwerte. (A) Variation der extrahierten maximalen Sedimentationsgeschwindigkeit Umin Abhängigkeit vom Hämatokrit Φ der Probe. Kreise sind Einzelmaße; Unterschiedliche Farben beziehen sich auf verschiedene gesunde Spender. Die durchgehende rote Linie ist der vom Modell vorhergesagte Trend, der mit den Durchschnittswerten von Φm und γ erhalten wird. Der korrigierte Wert von Umfür einen Hämatokrit von Φ = 0,45 wird ebenfalls dargestellt, sowohl als Dreiecke für Einzelwerte als auch als Gerade für die vorhergesagte Konstante des Modells. Dieser korrigierte Wert wurde gemäß dem Modell als Equation 10berechnet. (B) Werte, die für den Parameter γ erhalten wurden. (C) Werte, die für den Parameter Φm erhalten wurden. (D) Werte, die für den Parameter t0 erhalten wurden. Fehlerbalken für einzelne Daten, die aus der Anpassungsstatistik abgerufen werden, sind kleiner als die Symbolgröße. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Darras et al.17 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Kennwerte der extrahierten Parameter für verschiedene Fibrinogenkonzentrationen. (A) Variation der extrahierten maximalen Sedimentationsgeschwindigkeit Umin Abhängigkeit von der Fibrinogenkonzentration der Probe. Unterschiedliche Farben beziehen sich auf verschiedene gesunde Spender. (B) Werte, die für den Parameter γ erhalten wurden. (C) Werte, die für den Parameter Φm erhalten wurden. (D) Werte, die für den Parameter t0 erhalten wurden. Fehlerbalken für einzelne Daten, die aus der Anpassungsstatistik abgerufen werden, sind kleiner als die Symbolgröße. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Dasanna et al.16 abgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzungsfilm 1: Beispiel für eine korrekt aufgenommene Bildsequenz. Auf diesen Bildern sind verschiedene Probentypen von zwei verschiedenen Spendern (gleiche Blutgruppe) zu sehen. Von links nach rechts, alle Proben mit Duplikaten: Vollblut von Spender 1, Suspension der Erythrozyten von Spender 1 in Dextran 70 kDa (55 mg/ml PBS) mit kontrolliertem Hämatokrit bei 45%, Vollblut von Spender 2, Suspension der Roten Zyten von Spender 2 in Dextran (45 % Hämatokrit), Suspension der Erythrozyten von Spender 1 im Plasma von Spender 2 (45 % Hämatokrit), und Suspension von Erythrozyten von Spender 2 im Plasma von Spender 1 (45% Hämatokrit). Die Proben weisen ein breites Spektrum an Sedimentationsgeschwindigkeiten auf, und die Suspensionen in Dextran zeigen auch eine gewisse Hämolyse. Der bereitgestellte Code MatlabCodeImageAnalysisSampled.m analysiert jedoch alle effizient. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: MatlabCodeImageAnalysisSampled.m. Hauptcode, der für die Bildanalyse verwendet wird (Schritt 2 des Protokolls). Um den Code auf einem bestimmten Gerät ausführen zu können, sollte Zeile 8 geändert werden. Es sollte den Pfad zu dem Ordner enthalten, der die Bilder der zu analysierenden Westergren-Röhren enthält, und mit dem Präfix der Bilder enden, falls vorhanden. Eine Reihe komprimierter Bilder steht auf Zenodo zum freien Download zur Verfügung (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). Der Code und insbesondere die Eigenschaften jeder Probe (definiert in den Zeilen 14-61) wurden bereits angepasst, um diese Bilder zu analysieren. Für dieses Bildset wurde das Präfix "IMG_" verwendet. Daher sollte die Zeichenfolge 8 mit '\IMG_' (oder '/IMG_' auf Linux-Systemen) enden. Der letzte Teil des Codes (Zeilen 166-179) zeichnet auch automatisch die extrahierten Sedimentationskurven für jede Probe auf. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: ShapeAnalyzerIntegrated.m. Hauptcode, der verwendet wird, um das physikalische Modell anzupassen (Schritt 3 des Protokolls). Um diesen Code auszuführen, kopieren Sie ihn einfach und fügen Sie ihn zusammen mit SedimFit.m in den Ordner ein, der die Ausgabetextdateien von MatlabCodeImageAnalysisSampled.m enthält. Die Namen der zu analysierenden Dateien (ohne die Erweiterung .txt) sollten in Zeile 9 aufgeführt werden. Der anfängliche Hämatokrit und die Höhe des Tubus sollten ebenfalls in den Zeilen 12 bzw. 15 enthalten sein. Dieser Code ist bereits vorbereitet, um die Kurven zu analysieren, die aus den Open-Access-Bildern auf Zenodo extrahiert wurden (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). Sobald die oben genannten Zeilencodes geändert wurden, klicken Sie einfach auf die Schaltfläche "Ausführen" in der Symbolleiste des Matlab-Editors. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 3: SedimFit.m. Physikalisches Modell, das von ShapeAnalyzerIntegrated.m angepasst wurde. Diese Datei ist eine Matlab-Funktion, die die Funktionen definiert, die an die experimentellen Kurven angepasst werden, um die physikalischen Parameter zu extrahieren. Sie sollte sich beim Ausführen der Analyse im selben Ordner wie ShapeAnalyzerIntegrated.m befinden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Damit das automatisierte Protokoll effizient funktioniert, ist es wichtig, einen klaren Hintergrund und eine gute Beleuchtung zu haben. Ein dunkler Hintergrund kann das Vorhandensein eines effizienten Binarisierungsschwellenwerts verhindern. Bei Proben mit einer gewissen Hämolyse, die in der Regel im Laufe der Zeit auftritt (zunimmt), ist es wichtig, zunächst zu überprüfen, ob die gewählte Binarisierungsschwelle sowohl für das Anfangs- als auch für das Endbild relevant ist.

Wenn es um den Binarisierungsprozess des Bildes geht, ist die Wahl des ROI und der Binarisierungsschwelle der empfindlichste Schritt. Es kann sinnvoll sein, verschiedene Schwellenwerte manuell auf drei verschiedenen Bildern (zu Beginn, in der Mitte und am Ende des Sedimentationsprozesses) zu testen, um sicherzustellen, dass die Wahl des Schwellenwerts tatsächlich die relevante Binarisierung für den gesamten Prozess liefert. Wenn die Probe eine starke Hämolyse erfährt, kann es notwendig sein, die Analyse der Probe auf den Beginn des Prozesses zu beschränken, wenn noch eine klare Grenzfläche zu beobachten ist. Wie bei jeder ESR-Messung ist es auch hier wichtig, das Vorhandensein von Blasen im Röhrchen zu vermeiden. Wenn jedoch einige kleine Blasen an der Oberseite der Röhre beobachtet werden, kann ein ROI, der unter den Blasen beginnt und direkt über der ursprünglichen Grenzfläche liegt, immer noch die relevante Messung liefern. In diesem Fall ist es jedoch wichtig, rechts und links der Röhre etwas Hintergrundraum einzubauen, damit der Otsu-Schwellenwert unter Berücksichtigung einer signifikanten Anzahl von Pixeln mit dem Grauwert des Hintergrunds bestimmt werden kann.

Die Methode beruht, wie bei allen BSG-Messungen, auf der Annahme, dass eine klare Grenzfläche zwischen gepackten Erythrozyten und zellfreiem Plasma zu erkennen ist. Wenn die Probe eine signifikante Menge an Hämolyse erfährt oder wenn der Hämatokrit der Probe zu verdünnt ist (unter 25 %17), wird eine solche Grenzfläche nicht mehr beobachtet. Eine ESR-Messung ist unter diesen Bedingungen dann nicht mehr möglich.

Wie bereits erwähnt, stellt dieses Verfahren sicher, dass die relevante Geschwindigkeit des Gelkollapses Um bereitgestellt wird, die entsprechend dem anfänglichen Hämatokrit des Patienten korrigiert werden kann17. Abbildung 3A zeigt neben den Rohmessungen von Um auch die korrigierten Werte für einen normierten Hämatokrit von Φ 0 = 0,45. Es ist ersichtlich, dass die Korrektur die Gesamtabhängigkeit von Φ0 sowie den größten Teil der Datenstreuung beseitigt. Die direkte Bestimmung von Umauf der Grundlage des relevanten physikalischen Modells impliziert auch, dass die Technik objektiver ist als eine beliebige Kurvenglättung mit einer willkürlichen Auswahl von Glättungsparametern. Unter anderem hat sich gezeigt, dass diese Methode in medizinischen Kontexten, in denen ungewöhnlich niedrige BSG-Werte beobachtet werden, robuster ist19,20.

Ein weiteres wesentliches Interesse dieser Messung ist, dass sie robustere und physikalisch interpretierbare Daten liefert. Zum Beispiel erlaubt es im Falle eines abgesenkten BSG zu unterscheiden, ob die Verzögerungszeit t0 des Kollapses verlängert ist, ob das Netzwerk der Erythrozyten durch γ ungewöhnlich ungeordnet ist oder ob die endgültige Verdichtung Φm der Zellen irgendwie behindert wird16,19,20.

Interessanterweise ist die Messung der maximalen Sedimentationsgeschwindigkeit auch robuster und empfindlicher gegenüber Fibrinogenwerten, wie bereits in früheren Studien hervorgehobenwurde 13,14,15. Dies ist ein wichtiges Merkmal, da die BSG häufig zur Überwachung von Entzündungen verwendet wird, die mit erhöhten Fibrinogenspiegeln verbunden sind. Diese Sensitivität ergibt sich im Wesentlichen aus der Entkopplung von Um zum Zeitpunkt des Gelkollapses, von dem bekannt ist, dass es eine wichtige Zufallskomponente34,35,36 aufweist. Genauer gesagt, wie in Abbildung 4D16 hervorgehoben, hat die intrinsische zufällige Variation der Verzögerungszeit (bei der Messungen über 150 mg/ml zwischen 12 min und 30 min liegen, selbst bei einem einzelnen Donor) für höhere Fibrinogenkonzentrationen die gleiche Größenordnung wie die zugrunde liegende Abhängigkeit von diesem Parameter (zwischen 150 mg/dl und 300 mg/dl; der durchschnittliche Trend der Messungen verringert sich nur von 0,45 h auf 0,4 h [ d.h. 27 min bis 24 min]). Da diese Verzögerungszeit tatsächlich in der traditionellen Höhenmessung bei 30 min oder 1 h enthalten ist (Dauer, die diese Verzögerungszeit manchmal erreichen oder überschreiten kann), liefert die Extraktion der maximalen Geschwindigkeit Um (die einen systematischen und signifikanten Trend für jeden Spender darstellt) einen robusteren und aussagekräftigeren Parameter13,14,15,34,35, 36. Der Teufel

Darüber hinaus kann der Parameter Um gemäß dem zuvor beschriebenen praktischen Ergebnis Equation 1117 effizient für den initialen Hämatokrit korrigiert werden. Bei der Kombination der Daten aller gesunden Spender in einer früheren Studie17 erhält man Werte von γ = 0,50 ± 0,06 und Φ m = 0,86 ± 0,04, die den Trend von Um in Abhängigkeit vom Hämatokrit Φ des Spenders gut wiedergeben, wie in Abbildung 3 dargestellt. In der Praxis kann es jedoch strenger sein, die BSG mit den für einen bestimmten Spender ermittelten γ- und Φm-Wertenzu korrigieren, da sich die Fibrinogenspiegel auch zwischen den Spendern erheblich ändern und einen erheblichen Einfluss auf diese Parameter haben können (Abbildung 4).

Unter Berücksichtigung der erörterten Punkte und ihrer Einbeziehung in medizinische Routineverfahren wird sich die Genauigkeit und Vielseitigkeit der BSG als klinisches In-vitro-Instrument weiter verbessern.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die sie für den Inhalt dieses Artikels als relevant erklären müssen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch die Forschergruppe FOR 2688 - Wa1336/12 der Deutschen Forschungsgemeinschaft und durch die Marie-Skłodowska-Curie-Fördervereinbarung Nr. 860436-EVIDENCE unterstützt. T. J. und C. W. bedanken sich für die Förderung durch die Deutsch-Französische Hochschule (DFH/UFA). A. D. bedankt sich für die Förderung durch das Young Investigator Grant der Universität des Saarlandes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (for blood sample) SARSTEDT 267001 or 265 Anticoagulated blood sample to characterize
Camera EOS M50 Canon Kit EF-M18-150 IS STM Any camera should work, provided that sector alimentation, connection to computer for automated shooting and adapted objective are available
Centrifuge HERMLE 302.00 V03 - Z 36 HK Requirements: at least 3000 x g ofr 7 min.
Micro-centrifuge MLW TH21 or any other way to determine the hematocrit
Micro-hematocrit capilaries Fisher scientific 11884040 or other capillaries/containers for hematocrit determination
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher 10010023 1x PBS, pH 7.4, 298 Osm
Pipettes (e.g. positive displacement pipette) Gilson FD10006 Pipette required to manipulate blood and/or packed cells.Other models are of course suitable, but be careful to treat blood and pakced cells as highly viscous fluids.
Wax sealing plate Hirschmann 9120101 Sealing wax for the micro-hematocrit capillaries
Westergren tubes Praxindo A9244560 Any other standard Wetsergren tube should work too
White background with illumination / / White sheet(s) of paper behind the samples, with usual room light is perfcetly sufficient.

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References

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Medizin Heft 193
Blutsenkungsgeschwindigkeit: Eine physikgetriebene Charakterisierung im medizinischen Kontext
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Darras, A., John, T., Wagner, C., Kaestner, L. Erythrocyte Sedimentation Rate: A Physics-Driven Characterization in a Medical Context. J. Vis. Exp. (193), e64502, doi:10.3791/64502 (2023).

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