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Medicine

Velocidade de Hemossedimentação: Uma Caracterização Física em um Contexto Médico

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64502
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3
1Experimental Physics, Saarland University, 2Department of Physics and Materials Science, University of Luxembourg, 3Theoretical Medicine and Biosciences, Saarland University

Summary

A velocidade de hemossedimentação (VHS) é um parâmetro físico, frequentemente utilizado em exames de saúde de rotina e diagnóstico médico. Um modelo teórico que permite extrair parâmetros fisicamente significativos de toda a curva de sedimentação, baseado no conhecimento coloidal moderno, foi recentemente desenvolvido. Aqui, apresentamos um protocolo para coletar automaticamente a VHS ao longo do tempo, e extrair os parâmetros desse modelo recente dessa coleta automatizada de dados. Esses parâmetros refinados também tendem a melhorar o testemunho médico.

Abstract

A velocidade de sedimentação eritrocitária (ou eritrócitos) (VHS) é um parâmetro físico derivado do sangue que é frequentemente usado em exames de saúde de rotina e diagnóstico médico. Por exemplo, no caso de inflamação, observa-se uma VHS mais elevada devido ao aumento associado do fibrinogênio e de outras proteínas plasmáticas. Acreditava-se que esse aumento se devesse à formação de maiores agregados de hemácias (hemácias) causada pelo aumento do fibrinogênio. De fato, o fibrinogênio é uma agregação de hemácias promotora de agentes e, no regime de Stokes, supõe-se que seja observada em sedimentos de agregados maiores do sangue mais rapidamente. No entanto, todos os modelos de medidas de VHS baseados nessa hipótese requerem pressupostos físicos específicos, não exigidos em nenhum outro sistema. Além disso, estudos modernos no campo das suspensões coloidais estabeleceram que partículas atrativas formam agregados percolantes (ou seja, agregados tão largos quanto o recipiente). A sedimentação desses coloides segue-se então a um chamado "colapso do gel coloidal". Recentemente, foi demonstrado que as hemácias realmente seguem o mesmo comportamento. Essa hipótese também permite modelar de forma eficiente e analítica a curva de sedimentação de hemácias, a partir da qual descritores robustos e fisicamente significativos podem ser extraídos. Este artigo descreve como realizar tal análise e discute os benefícios dessa abordagem.

Introduction

A velocidade de hemossedimentação (VHS) é uma ferramenta clínica médica in vitro, formalmente introduzida na medicina baseada em evidências durante o século XX1,2,3,4. Atualmente, é utilizada mundialmente como teste inflamatório inespecífico, ou para monitorar a evolução de algumas condições específicas5,6,7,8. Isso se deve principalmente ao aumento da concentração de fibrinogênio, mas também de outros componentes plasmáticos, como a IgM 1,9,10,11. De acordo com o protocolo padrão de Westergren atual, os valores de VHS são relatados como a medida da camada de plasma livre de células em um determinado momento (30 min ou 1 h) após deixar um tubo vertical de tamanho típico de 20 cm verticalmente em repouso12. No entanto, esse método de medição tem sido criticado, uma vez que qualitativamente diferentes etapas do processo de sedimentação têm sido relatadas, incluindo um atraso antes de atingir a velocidade máxima de sedimentação13. Esse atraso dura mais de 1 h em aproximadamente metade das amostras saudáveis14. A velocidade durante essa fase obedece a uma escala diferente da segunda fase mais rápida da sedimentação15. Restringir a leitura à velocidade média de sedimentação durante a primeira hora compara uma mistura diferente de várias propriedades do sangue entre indivíduos diferentes.

Além disso, recentemente foi demonstrado que as considerações teóricas usuais por trás desse protocolo estavam erradas16,17,18. No hematócrito fisiológico (acima de aproximadamente 25%), as hemácias (hemácias) não se sedimentam como agregados separados, mas sim como uma rede contínua, denominada percolante, de hemácias 17,18, obedecendo a um conjunto de equações físicas diferente da usualmente citada sedimentação de Stokes 16,17. Demonstrou-se que considerar uma descrição física baseada nas medidas resolvidas no tempo da sedimentação (curva inteira) foi mais robusto em alguns contextos médicos novos19,20. Além disso, essas medidas poderiam ser usadas para esclarecer os mecanismos físicos que alteram a VHS em patologias nas quais as formas celulares são alteradas19,20. Além disso, uma VHS lenta pode ter uma interpretação médica útil, como indicado nas medidas de uma coorte de pacientes com síndrome de neuroacantocitose19,20. Este artigo revisa como implementar na prática a medição de parâmetros fisicamente significativos, com base em toda a cinética de VHS. Mais precisamente, o método aqui apresentado extrai a velocidade máxima de sedimentação Um, cujo valor pode ser corrigido para considerar o efeito do hematócrito do doador16,17. Esse parâmetro é mais preciso e, portanto, mais confiável que a medida tradicional16,17,19,20.

Além disso, em algumas pesquisas fundamentais, ao invés de monitorar o estado inflamatório de um determinado paciente, é interessante excluir o efeito do hematócrito sobre a VHS 21,22,23, ou investigar o papel das hemácias em uma VHS modificada 19,20,24,25 entre diferentes doadores. Pode ser útil comparar amostras que não são diretamente amostras de sangue cheias de pacientes. Portanto, a ressuspensão de hemácias com hematócrito controlado no plasma autólogo ou substituinte plasmático pode ser usada como o primeiro passo da medida da VHS. Por exemplo, soluções de Dextran 70 kDa com concentração de 55 mg/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS) produzem uma faixa de sedimentação dentro da faixa de controle para células saudáveis19. Este manuscrito também mostra como tais etapas devem ser conduzidas, e que a análise apresentada também é relevante nesses casos.

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Protocol

A coleta de amostras de sangue e os experimentos foram aprovados pela "Ärztekammer des Saarlandes", ética votum 51/18, e realizados após a obtenção do consentimento informado de acordo com a Declaração de Helsinque. As medições padrão devem ser realizadas com sangue anticoagulado com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (concentração padrão de EDTA de 1,6 mg/mL de sangue, norma europeia NF EN ISO 6710), em tubos de Westergren. O volume necessário para encher o tubo de Westergren depende do fabricante (já que as peças inferiores às vezes contêm um reservatório mais largo); O volume deve ser de cerca de 1 mL de sangue pleno, e 800 μL para os tubos indicados na Tabela de Materiais. O método descrito a seguir é, no entanto, válido independentemente da suspensão específica e da forma do recipiente, desde que o hematócrito das amostras sondadas seja superior a 25%16. Volumes, recipientes, meio de suspensão e aditivos devem, portanto, ser selecionados de acordo com os objetivos específicos da pesquisa realizada.

1. Experimentos e medições

NOTA: Registrar a taxa de sedimentação da amostra a cada minuto.

  1. Preparação da amostra (se necessário): Se for necessário um hematócrito de controle ou líquido de suspensão, comece lavando as células e preparando as amostras (como exemplo, mostramos como preparar amostras com vários níveis de fibrinogênio, misturando soro autólogo e plasma). O soro pode, sim, ser aproximado como plasma livre de fibrinogênio26,27 e pode ser usado para diminuir a agregação de hemácias, em condições fisiológicas. Para preparar várias amostras, coletar o sangue em tubos padrão de EDTA de 9 mL e o soro em tubos de soro padrão (com esferas de sílica como ativadores de coagulação) de 9 mL.
    1. Centrifugar as amostras de sangue (ou seja, 9 mL de EDTA padrão e tubos de soro no exemplo escolhido) a 3.000 x g por pelo menos 7 min, para a compactação ideal dos eritrócitos compactados. Substitua o sobrenadante por PBS ou pelo líquido de suspensão desejado, se houver uma quantidade suficiente disponível. Se for simplesmente necessário controlar o hematócrito no plasma autólogo, avance directamente para o passo 1.1.3. Caso contrário, misture suavemente após a inclusão do sobrenadante para lavagem.
    2. Repita três vezes. Realize a última lavagem com o líquido de suspensão desejado em qualquer caso.
      1. No exemplo escolhido, prepare misturas de plasma autólogo e soro com proporções determinadas (por exemplo, 25%/75%, 50%/50% ou 75%/25% da fração de volume plasmático-sérico). Por exemplo, ao preparar 2,5 mL da mistura plasma-soro de 25%/75%, adicione 0,625 mL de plasma a 1,875 mL de soro.
    3. Extraia o volume necessário de células embaladas e suspenda-o no líquido desejado. Processar as células embaladas como um líquido altamente viscoso (usando pré-pipetagem e/ou pipetagem reversa padrão ou uma pipeta de deslocamento positivo28). No exemplo escolhido, para uma amostra de 4 mL no hematócrito de 45%, suspender 1,8 mL de concentrado de hemácias dentro de 2,2 mL da mistura plasma-soro.
  2. Se o hematócrito da amostra não for controlado, determiná-lo por microcentrifugação de alta velocidade (outros métodos padrão também são adequados).
    1. Extrair a quantidade necessária de amostra para determinação do hematócrito: preencher os capilares do micro-hematócrito mergulhando sua ponta inferior no líquido. Pará-lo cobrindo a abertura superior quando a quantidade necessária de amostra subir no tubo por sucção capilar.
    2. Sele os capilares com cera selante. Coloque-os na centrífuga de micro-hematócrito e execute-o a 15.000 x g (12.000 rpm) por 5 min, ou de acordo com as instruções do fabricante.
    3. Leia o nível do hematócrito no capilar e anote-o para referência.
  3. Configure uma câmera para registrar a sedimentação das amostras. Para evitar sobrecarregar a memória ou drenar a bateria, ligue o dispositivo da rede elétrica e salve as imagens diretamente em um computador ou disco rígido externo.
    1. Configure uma câmera estável na frente do suporte, onde os tubos ESR serão deixados em repouso. Use um fundo branco e iluminado (folhas de papel brancas no fundo funcionam perfeitamente).
    2. Usando tubos Westergren vazios, de preferência sem marcações, defina o foco e o campo de visão da câmera para obter a maior resolução onde as amostras serão colocadas. De preferência, certifique-se de que as bordas das imagens estejam alinhadas no sentido vertical e horizontal.
    3. Tire uma foto de um tubo dimensionado para extrair a resolução de pixels. Recomenda-se o uso de imagens RGB.
    4. Defina a luz e o tempo de exposição da câmera para ter um fundo branco, mas sem saturação. O exemplo da Figura 1 foi obtido usando uma Canon EOS M50, com um tempo de exposição de 1/15s, uma abertura de F8.0, balanço de branco de tungstênio, no modo single shot com foco manual, e uma velocidade ISO de 1.000.
  4. Prepare e coloque os tubos de ESR.
    1. Encha o recipiente inferior do tubo Westergren com o volume correspondente às instruções do fabricante. Insira o tubo Westergren no recipiente inferior conforme indicado pelo fabricante.
    2. Assim que o primeiro tubo estiver pronto, coloque-o no suporte e inicie a gravação da câmera. Gravar uma imagem a cada minuto geralmente dá uma boa resolução da curva cinética da VHS.
    3. Prepare e coloque as próximas amostras. Certifique-se de não ficar na frente de qualquer amostra quando uma foto é tirada.
    4. Deixe as medições correrem por pelo menos 2 h, a fim de comparar com as medidas padrão em 30 min, 1 h e 2 h. No entanto, também é melhor ver a saturação e a parada da sedimentação. Para amostras saudáveis, ou em caso de inflamação, o registro das amostras durante a noite, entre 12 h e 24 h, é mais do que suficiente, uma vez que a curvatura das amostras mais rápidas é visível dentro de 3 h13,19. No entanto, se uma condição diminui a velocidade de sedimentação, como ocorre uma diminuição na concentração de fibrinogênio (i.e., no exemplo escolhido, fração de volume sérico elevado), registros de 50 h ou mais podem ser necessários para obter a informação mais precisa16,19.

2. Análise das imagens

NOTA: Uma vez que as imagens são gravadas, extraia a curva ESR. Um exemplo de código Matlab é fornecido como Arquivo Suplementar 1 (MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).

  1. Selecione ou identifique uma região de interesse (ROI) onde apenas um tubo é visível, sendo a borda inferior localizada sob a posição mais baixa da interface de plasma livre de células eritrocitárias, mas dentro da amostra (ver Figura 1A, B). Se necessário, gire a imagem para que a direção vertical seja alinhada ao longo do primeiro componente da imagem.
  2. Converta o ROI da imagem RGB em uma imagem em escala de cinza ou matriz Gr. Normalmente, combinar os canais de três cores (vermelho [R], verde [G] e azul [B]) como Gr = 2 * R - B - G é muito eficiente com um fundo claro (veja a Figura 1C e as linhas 121-128 de MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).
  3. Binarize a imagem. Para uma amostra íntegra, o uso do limiar de Otsu29 geralmente fornece um resultado consistente (consulte a Figura 1D e a linha 133 de MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Para amostras com hematócrito alto ou com alguma hemólise, talvez seja melhor ajustá-lo manualmente ou usar outro método automático (como feito nas linhas 129-131 do MatlabCodeImageAnalysisSampled.m), dependendo do contraste exato obtido entre as várias fases dentro do tubo.
  4. Obtenha a média dos valores de pixel (ou elementos) de Gr ao longo da direção horizontal. Esta etapa minimiza o ruído e calcula com eficiência as possíveis irregularidades da interface (consulte a Figura 1E e a linha 137 do MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).
  5. Antes de calcular as variações, suavize a curva com uma média móvel, especialmente se os tubos contiverem algumas marcações horizontais (veja a Figura 1F). Para os exemplos fornecidos, uma janela móvel de ~2,5 mm (50 pixels) foi usada para esse processo (consulte a linha 138 de MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Em seguida, identifique a posição da interface como o ponto com maior variação de intensidade (ver Figura 1G).
  6. Repita para cada imagem e cada amostra. Para cada amostra, salve as posições da interface ao longo do tempo em um formato apropriado para ajustar o modelo físico com qualquer software adequadamente ajustado.

3. Ajuste do modelo físico

  1. Utilizando qualquer software adequadamente ajustado, conhecendo o hematócrito e a altura inicial da coluna sanguínea h 0, encontramos os valores do tempo de atraso t0, o tempo adimensional γ e a fração de volume do enxurrado final Φmdos eritrócitos que minimiza a soma dos desvios residuais quadrados para o modelo físico17. Um código Matlab (ShapeAnalyzerIntegrated.m) é fornecido como Arquivo Suplementar 2 como um exemplo de como executar tal ajuste. Consulte o Arquivo Suplementar 2 para obter mais instruções. Como descritoalhures 16,17, os eritrócitos no sedimento do hematócrito fisiológico são um gel de partículas moles, onde os parâmetros físicos importantes são a diferença de densidade entre o plasma e as hemácias do doador Δρ, o diâmetro característico das hemácias r hemácias, a viscosidade plasmática à temperatura ambiente η e o hematócrito Φ do doador . Utilizando esses parâmetros, e assumindo que o estresse gravitacional é o principal processo direcionador para o fluxo plasmático ascendente através da rede porosa formada pelos eritrócitos após um tempo de atraso t0, obtém-se a evolução temporal16,17:
    Equation 1
    com Equation 2, Equation 3e Equation 4 sendo o raio médio do disco de um eritrócito. Um exemplo de um código Matlab executando isso é fornecido como um anexo (ShapeAnalyzerIntegrated.m se ajusta à função definida em SedimFit.m [Arquivo Suplementar 3]). Alternativamente, G/γ também pode ser usado diretamente como um parâmetro de ajuste com unidades de 1/t.
  2. Uma vez extraída a curva quantitativa da imagem, salve os parâmetros físicos da amostra. Os valores tradicionais de ESR em 30 min, 1 h ou 2 h ainda podem ser extraídos da curva para referência (consulte as linhas 123-132 do ShapeAnalyzerIntegrated.m).

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Representative Results

Um exemplo de uma sequência de imagens adquirida corretamente é fornecido como Filme Suplementar 1 (MovieS1.avi). Uma série de ajustes característicos do modelo é mostrada para várias condições na Figura 2. A concentração de fibrinogênio foi determinada a partir da concentração de fibrinogênio no plasma Fib0, assumindo que o soro não possui fibrinogênio. Assim, Fib = C Fib0, onde C é a fração de volume plasmático na mistura plasma-soro. Em estudos anteriores16, Fib0 foi determinada por métodos padrão no Laboratório de Química Clínica do Hospital Universitário de Saarland (Homburg, Alemanha). Se for necessário medir essa quantidade de forma independente, um método conveniente para determinar a concentração de fibrinogênio inclui coagulômetros de esfera (semi)automatizados, que também podem exigir a obtenção de uma amostra de sangue anticoagulada com citrato do doador30. As curvas VHS dos estudos que geraram essas curvas puderam ser ajustadas com um coeficiente de Pearson R 2 [0,974, 0,9996], com média de 0,996 e desvio padrão de 0,004 (apenas uma curva de 35 deu um R2Equation 11 < 0,99). Os parâmetros eventualmente extraídos são o hematócrito final na fase Φm da hemácia, o tempo de atraso t0 - necessário para que o gel se fraturasse e começasse a colapsar - e a velocidade Equation 6instantânea máxima, atingida no início do colapso. O parâmetro adimensional γ está associado ao inverso da área de poros na rede de compactação de hemácias (expresso em múltiplos de raio de partícula), Δρ é a diferença de densidade entre o plasma e as hemácias do doador, a é o diâmetro característico das hemácias, η é a viscosidade do plasma à temperatura ambiente e Φ é o hematócrito do doador. O ajuste é realmente realizado fixando Δρ,a,η e Φ e, em seguida, determinando a melhor γ, Φm e t0. O hematócrito deve ser determinado independentemente por outro método padrão, enquanto o outro pode ser fixado em valores padrão (ΔρEquation 10080kg/m3 31,32, ηEquation 100 1,5 mPa s 33 e 4Equation 100μm). Qualquer desvio dos outros parâmetros simplesmente modificaria o valor determinado de γ por um fator correspondente, mas não alteraria a determinação final de Um, que é então um parâmetro robusto a esse respeito.

As coleções dos valores dos parâmetros coletados em estudos fundamentais anteriores, mostrando as tendências dos parâmetros em função dos níveis de hematócrito e fibrinogênio, são mostradas nas Figuras 3 e 4.

Figure 1
Figura 1: Processamento das imagens . (A) Visão ideal de várias amostras, com ROIs relevantes, destacadas para uma amostra. (B) Amplie o ROI selecionado. (C) Conversão do ROI colorido em nível de cinza. (D) Imagem binarizada obtida com o limiar de Otsu. (E) A intensidade média horizontal da imagem binária em função da altura (de acordo com a convenção usual no processamento de imagens, a origem é considerada no topo da imagem; ver também o passo 2.4 do protocolo). (F) Intensidade suavizada realizando uma média móvel em uma vizinhança vertical de 50 pixels (veja também a etapa 2.5 do protocolo). (G) Variações da intensidade suavizada ao longo da direção vertical. A posição do valor máximo absoluto é tomada como a posição da interface (ver também o passo 2.5 do protocolo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Ajustes característicos. (A) Curvas e ajustes obtidos para um doador saudável, com vários hematócritos ajustados. As curvas são adaptadas de estudo anterior17. (B) Curvas e ajustes obtidos para um doador saudável, com várias concentrações de fibrinogênio. Várias concentrações de fibrinogênio foram obtidas pela mistura de plasma autólogo e soro em várias proporções. As curvas e os dados são de um estudo anterior16. As barras de erro (obtidas a partir de estatísticas de ajuste ou resolução de pixels) são menores do que o tamanho do símbolo. As figuras foram reimpressas com permissão de Dasanna et al.16 (18 amostras de quatro coletas de sangue independentes) e Darras et al.17 (16 amostras de sete coletas de sangue independentes). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Valores característicos dos parâmetros extraídos para os diversos hematócritos. (A) Variação da velocidade máxima de sedimentação extraída Umem função do hematócrito Φ da amostra. Círculos são medidas individuais; Diferentes cores estão relacionadas a diferentes doadores saudáveis. A linha vermelha contínua é a tendência prevista pelo modelo, obtida com os valores médios de Φm e γ. O valor corrigido de Umpara um hematócrito de Φ = 0,45 também é mostrado, tanto como triângulos para valores individuais quanto como uma reta para a constante predita do modelo. Esse valor corrigido foi calculado de acordo com o modelo como Equation 10. (B) Valores obtidos para o parâmetro γ. (C) Valores obtidos para o parâmetro Φm. (D) Valores obtidos para o parâmetro t0. As barras de erro para dados individuais obtidos a partir de estatísticas de ajuste são menores do que o tamanho do símbolo. Esse valor foi adaptado com permissão de Darras et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Valores característicos dos parâmetros extraídos para várias concentrações de fibrinogênio. (A) Variação da velocidade máxima de sedimentação extraída Umem função da concentração de fibrinogênio da amostra. Cores diferentes estão relacionadas a diferentes doadores saudáveis. (B) Valores obtidos para o parâmetro γ. (C) Valores obtidos para o parâmetro Φm. (D) Valores obtidos para o parâmetro t0. As barras de erro para dados individuais obtidos a partir de estatísticas de ajuste são menores do que o tamanho do símbolo. Essa figura foi reimpressa com permissão de Dasanna et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme Suplementar 1: Exemplo de uma sequência de imagens devidamente adquirida. Vários tipos de amostra são mostrados nessas fotos de dois doadores diferentes (mesmo grupo sanguíneo). Da esquerda para a direita, todas as amostras com duplicatas: sangue total do doador 1, suspensão de hemácias do doador 1 em Dextran 70 kDa (55 mg/mL PBS) com hematócrito controlado a 45%, sangue pleno do doador 2, suspensão de hemácias do doador 2 em Dextran (hematócrito de 45%), suspensão de hemácias do doador 1 no plasma do doador 2 (hematócrito de 45%), e suspensão de hemácias do doador 2 no plasma do doador 1 (hematócrito de 45%). As amostras têm uma ampla faixa de velocidades de sedimentação, e as suspensões em Dextran também mostram alguma hemólise. No entanto, o código fornecido MatlabCodeImageAnalysisSampled.m analisa eficientemente todos eles. Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Arquivo suplementar 1: MatlabCodeImageAnalysisSampled.m. Código principal utilizado para a análise das imagens (etapa 2 do protocolo). Para executar o código em um dispositivo específico, a linha 8 deve ser modificada. Ele deve conter o caminho para a pasta que contém as fotos dos tubos Westergren para análise, terminando com o prefixo das imagens, se houver. Um conjunto de imagens compactadas está disponível para download de acesso aberto no Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). O código, e em particular as propriedades de cada amostra (definidas nas linhas 14-61), já foi adaptado para analisar essas figuras. Para este conjunto de imagens, o prefixo usado foi 'IMG_'. Portanto, a linha de cadeia de caracteres 8 deve terminar com '\IMG_' (ou '/IMG_' em sistemas Linux). A última parte do código (linhas 166-179) também plota automaticamente as curvas de sedimentação extraídas para cada amostra. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: ShapeAnalyzerIntegrated.m. Código principal utilizado para ajuste do modelo físico (etapa 3 do protocolo). Para executar esse código, basta copiá-lo e colá-lo na pasta que contém os arquivos de texto de saída de MatlabCodeImageAnalysisSampled.m, juntamente com SedimFit.m. Os nomes dos arquivos a serem analisados (sem a extensão .txt) devem ser listados na linha 9. O hematócrito inicial e a altura do tubo também devem estar contidos nas linhas 12 e 15, respectivamente. Este código já está preparado para analisar as curvas extraídas das imagens de acesso aberto no Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). Uma vez que os códigos de linha acima mencionados tenham sido modificados, basta clicar no botão 'Executar' na barra de ferramentas do Matlab Editor. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: SedimFit.m. Modelo físico ajustado pelo ShapeAnalyzerIntegrated.m. Este arquivo é uma função Matlab, definindo as funções que são ajustadas às curvas experimentais para extrair os parâmetros físicos. Ele deve estar na mesma pasta que ShapeAnalyzerIntegrated.m quando a análise é executada. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Para que o protocolo automatizado funcione de forma eficiente, é importante ter um fundo claro e iluminação adequada. Um fundo escuro pode impedir a existência de um limiar de binarização eficiente. Para amostras com alguma hemólise, que geralmente ocorre (aumenta) ao longo do tempo, é importante verificar primeiro se o limiar de binarização escolhido é relevante tanto para as imagens iniciais quanto para as finais.

Quando se trata do processo de binarização da imagem, a escolha do ROI e do limiar de binarização é a etapa mais sensível. Pode ser útil testar manualmente diferentes valores de limiar em três figuras diferentes (no início, meio e final do processo de sedimentação) para garantir que a escolha do limiar realmente forneça a binarização relevante para todo o processo. Se a amostra apresentar hemólise forte, pode ser necessário restringir a análise da amostra ao início do processo, quando uma interface clara ainda pode ser observada. Como para qualquer medida de VHS, também é essencial evitar a presença de bolhas no tubo. No entanto, se algumas pequenas bolhas forem observadas na parte superior do tubo, uma ROI começando abaixo das bolhas e bem em cima da interface inicial ainda pode fornecer a medida relevante. Neste caso, no entanto, é importante incluir algum espaço de fundo à direita e à esquerda do tubo para que o limite de Otsu possa ser determinado, sempre considerando uma quantidade significativa de pixels com o nível de cinza do fundo.

O método, como em todas as medidas de VHS, baseia-se na suposição de que uma interface clara entre eritrócitos concentrados e plasma livre de células pode ser vista. Se a amostra apresentar alguma quantidade significativa de hemólise, ou se o hematócrito da amostra estiver muito diluído (abaixo de 25%17), tal interface não será mais observada. Uma medição de VHS nessas condições é então impossível de ser realizada.

Como dito anteriormente, esse método garante proporcionar a velocidade relevante do colapso do gel Um, que pode ser corrigido de acordo com o hematócrito inicial do paciente17. A Figura 3A, juntamente com as medidas brutas de Um, também mostra os valores corrigidos para um hematócrito normalizado de Φ 0 = 0,45. Pode-se ver que a correção remove a dependência geral de Φ0, bem como a maior parte da dispersão de dados. A determinação de Umcom base diretamente no modelo físico relevante também implica que a técnica é mais objetiva do que uma suavização arbitrária de curvas, com escolhas arbitrárias de parâmetros de suavização. Entre outros, esse método tem se mostrado mais robusto em contextos médicos onde valores anormalmente baixos de VHS são observados19,20.

Outro interesse intrínseco dessa medição é que ela fornece dados mais robustos e fisicamente interpretáveis. Por exemplo, no caso de uma VHS rebaixada, ela permite distinguir se o tempo de atraso t0 do colapso é prolongado, se a rede de hemácias é incomumente desordenada através de γ, ou se a compactação final Φm das células é de alguma forma prejudicada16,19,20.

Curiosamente, a medida da velocidade máxima de sedimentação também é mais robusta e sensível aos níveis de fibrinogênio, como já destacado em estudos anteriores13,14,15. Essa é uma característica importante, pois a VHS é frequentemente usada para monitorar a inflamação, que está associada a níveis elevados de fibrinogênio. Essa sensibilidade decorre essencialmente do desacoplamento de Um do momento do colapso do gel, que sabidamente possui um importante componente aleatório34,35,36. Mais precisamente, como destacado na Figura 4D16, para concentrações mais elevadas de fibrinogênio, a variação aleatória intrínseca do tempo de atraso (em que medidas acima de 150 mg/mL estão entre 12 min e 30 min, mesmo em um único doador) tem a mesma ordem de grandeza que sua dependência subjacente desse parâmetro (entre 150 mg/dL e 300 mg/dL; a tendência média das medidas só diminui de 0,45 h para 0,4 h [ ou seja, 27 min a 24 min]). Uma vez que esse tempo de atraso é realmente incluído na medição tradicional da altura em 30 min ou 1 h (durações que esse tempo de atraso às vezes pode atingir ou exceder), extrair a velocidade máxima Um (apresentando uma tendência sistemática e significativa para cada doador) fornece então um parâmetro mais robusto e significativo 13,14,15,34,35, 36º.

Além disso, o parâmetro Um pode ser eficientemente corrigido para o hematócrito inicial, de acordo com o resultado Equation 11 prático descritoanteriormente17. Ao combinar os dados de todos os doadores saudáveis em estudo anterior17, obtêm-se valores de γ = 0,50 ± 0,06 e Φ m = 0,86 ± 0,04, que reproduzem bem a tendência de Um em função do hematócrito Φ  do doador, como mostra a Figura 3. No entanto, em casos práticos, a correção da VHS pode ser mais rigorosa com os valores de γ e Φmobtidos para um doador específico, uma vez que os níveis de fibrinogênio também podem se alterar significativamente entre os doadores e ter uma influência significativa sobre esses parâmetros (Figura 4).

Considerando os pontos discutidos e incluindo-os em procedimentos médicos de rotina, a acurácia e a versatilidade da VHS como ferramenta clínica in vitro melhorarão ainda mais.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar relevantes para o conteúdo deste artigo.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela unidade de pesquisa FOR 2688 - Wa1336/12 da Fundação Alemã de Pesquisa e pelo acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie No. 860436-EVIDENCE. T. J. e C. W. reconhecem o financiamento da Universidade Francesa Alemã (DFH/UFA). A. D. reconhece o financiamento da Young Investigator Grant da Universidade de Saarland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (for blood sample) SARSTEDT 267001 or 265 Anticoagulated blood sample to characterize
Camera EOS M50 Canon Kit EF-M18-150 IS STM Any camera should work, provided that sector alimentation, connection to computer for automated shooting and adapted objective are available
Centrifuge HERMLE 302.00 V03 - Z 36 HK Requirements: at least 3000 x g ofr 7 min.
Micro-centrifuge MLW TH21 or any other way to determine the hematocrit
Micro-hematocrit capilaries Fisher scientific 11884040 or other capillaries/containers for hematocrit determination
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher 10010023 1x PBS, pH 7.4, 298 Osm
Pipettes (e.g. positive displacement pipette) Gilson FD10006 Pipette required to manipulate blood and/or packed cells.Other models are of course suitable, but be careful to treat blood and pakced cells as highly viscous fluids.
Wax sealing plate Hirschmann 9120101 Sealing wax for the micro-hematocrit capillaries
Westergren tubes Praxindo A9244560 Any other standard Wetsergren tube should work too
White background with illumination / / White sheet(s) of paper behind the samples, with usual room light is perfcetly sufficient.

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References

  1. Bedell, S. E., Bush, B. T. Erythrocyte sedimentation rate. From folklore to facts. The American Journal of Medicine. 78, 1001-1009 (1985).
  2. Grzybowski, A., Sak, J. Edmund Biernacki (1866-1911): Discoverer of the erythrocyte sedimentation rate. On the 100th anniversary of his death. Clinics in Dermatology. 29 (6), 697-703 (2011).
  3. Kushner, I., Mackiewicz, A. The Acute Phase Response: An Overview. Acute Phase Proteins. , CRC Press. (1993).
  4. Tishkowski, K., Gupta, V. Erythrocyte Sedimentation Rate. StatPearls Publishing. , Treasure Island, FL. (2022).
  5. Menees, S. B., Powell, C., Kurlander, J., Goel, A., Chey, W. D. A meta-analysis of the utility of C-reactive protein, erythrocyte sedimentation rate, fecal calprotectin, and fecal lactoferrin to exclude inflammatory bowel disease in adults with IBS. The Americal Journal of Gastroenterology. 110 (3), 444-454 (2015).
  6. Brigden, M. L. Clinical utility of the erythrocyte sedimentation rate. Americal Family Physician. 60 (5), 1443-1450 (1999).
  7. Liu, S., et al. Preliminary case-control study to evaluate diagnostic values of C-reactive protein and erythrocyte sedimentation rate in differentiating active Crohn's disease from intestinal lymphoma, intestinal tuberculosis and Behcet's syndrome. The American Journal of the Medical Sciences. 346 (6), 467-472 (2013).
  8. Greidanus, N. V., et al. Use of erythrocyte sedimentation rate and C-reactive protein level to diagnose infection before revision total knee arthroplasty: A prospective evaluation. The Journal of Bone and Joint Surgery. 89 (7), 1409-1416 (2007).
  9. Flormann, D., Kuder, E., Lipp, P., Wagner, C., Kaestner, L. Is there a role of C-reactive protein in red blood cell aggregation. International Journal of Laboratory Hematology. 37 (4), 474-482 (2015).
  10. Brust, M., et al. The plasma protein fibrinogen stabilizes clusters of red blood cells in microcapillary flows. Scientific Reports. 4, 4348 (2014).
  11. Gray, S. J., Mitchell, E. B., Dick, G. F. Effect of purified protein fractions on sedimentation rate of erythrocytes. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 51 (3), 403-404 (1942).
  12. Kratz, A., et al. ICSH recommendations for modified and alternate methods measuring the erythrocyte sedimentation rate. International Journal of Laboratory Hematology. 39 (5), 448-457 (2017).
  13. Hung, W. T., Collings, A. F., Low, J. Erythrocyte sedimentation rate studies in whole human blood. Physics in Medicine and Biology. 39 (11), 1855-1873 (1994).
  14. Woodland, N. B., Cordatos, K., Hung, W. T., Reuben, A., Holley, L. Erythrocyte sedimentation in columns and the significance of ESR. Biorheology. 33 (6), 477-488 (1996).
  15. Holley, L., Woodland, N., Hung, W. T., Cordatos, K., Reuben, A. Influence of fibrinogen and haematocrit on erythrocyte sedimentation kinetics. Biorheology. 36 (4), 287-297 (1999).
  16. Dasanna, A. K., et al. Erythrocyte sedimentation: Effect of aggregation energy on gel structure during collapse. Physical Review. E. 105 (2-1), 024610 (2022).
  17. Darras, A., et al. Erythrocyte sedimentation: collapse of a high-volume-fraction soft-particle gel. Physical Review Letters. 128 (8), 088101 (2022).
  18. Darras, A., et al. Imaging erythrocyte sedimentation in whole blood. Frontiers in Physiology. 12, 729191 (2022).
  19. Darras, A., et al. Acanthocyte sedimentation rate as a diagnostic biomarker for neuroacanthocytosis syndromes: Experimental evidence and physical justification. Cells. 10 (4), 788 (2021).
  20. Rabe, A., et al. The erythrocyte sedimentation rate and its relation to cell shape and rigidity of red blood cells from chorea-acanthocytosis patients in an off-label treatment with dasatinib. Biomolecules. 11 (5), 727 (2021).
  21. Giavarina, D., Capuzzo, S., Pizzolato, U., Soffiati, G. Length of erythrocyte sedimentation rate (ESR) adjusted for the hematocrit: reference values for the TEST 1 method. Clinical Laboratory. 52 (5-6), 241-245 (2006).
  22. Bull, B. S. Is a standard ESR possible. Laboratory Medicine. 6 (11), 31-39 (1975).
  23. Bull, B. S., Brecher, G. An evaluation of the relative merits of the Wintrobe and Westergren sedimentation methods, including hematocrit correction. American Journal of Clinical Pathology. 62 (4), 502-510 (1974).
  24. Reinhart, W. H., Singh, A., Straub, P. W. Red blood cell aggregation and sedimentation: the role of the cell shape. British Journal of Haematology. 73 (4), 551-556 (1989).
  25. Jan, K., Usami, S., Smith, J. A. Influence of oxygen tension and hematocrit reading on ESRs of sickle cells: Role of RBC aggregation. Archives of Internal Medicine. 141 (13), 1815-1818 (1981).
  26. Issaq, H. J., Xiao, Z., Veenstra, T. D. Serum and plasma proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3601-3620 (2007).
  27. Yu, Z., et al. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One. 6 (7), 21230 (2011).
  28. Proper Pipetting Techniques - DE. , Available from: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/lab-plasticware-supplies/lab-plasticware-supplies-learning-center/lab-plasticware-supplies-resource-library/fundamentals-of-pipetting/proper-pipetting-techniques.html (2023).
  29. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transaction on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
  30. Solomon, C., et al. A comparison of fibrinogen measurement methods with fibrin clot elasticity assessed by thromboelastometry, before and after administration of fibrinogen concentrate in cardiac surgery patients. Transfusion. 51 (8), 1695-1706 (2011).
  31. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLoS One. 12 (7), 0180520 (2017).
  32. Trudnowski, R. J., Rico, R. C. Specific gravity of blood and plasma at 4 and 37 degrees C. Clinical Chemistry. 20 (5), 615-616 (1974).
  33. Késmárky, G., Kenyeres, P., Rábai, M., Tóth, K. Plasma viscosity: A forgotten variable. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 39 (1-4), 243-246 (2008).
  34. Teece, L. J., et al. Gels under stress: The origins of delayed collapse. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 458, 126-133 (2014).
  35. Lindström, S. B., Kodger, T. E., Sprakel, J., Weitz, D. A. Structures, stresses, and fluctuations in the delayed failure of colloidal gels. Soft Matter. 8 (13), 3657-3664 (2012).
  36. Bartlett, P., Teece, L. J., Faers, M. A. Sudden collapse of a colloidal gel. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 85, 021404 (2012).

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Medicina Edição 193
Velocidade de Hemossedimentação: Uma Caracterização Física em um Contexto Médico
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Darras, A., John, T., Wagner, C., Kaestner, L. Erythrocyte Sedimentation Rate: A Physics-Driven Characterization in a Medical Context. J. Vis. Exp. (193), e64502, doi:10.3791/64502 (2023).

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