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Medicine

Velocità di eritrosedimentazione: una caratterizzazione guidata dalla fisica in un contesto medico

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64502
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3
1Experimental Physics, Saarland University, 2Department of Physics and Materials Science, University of Luxembourg, 3Theoretical Medicine and Biosciences, Saarland University

Summary

La velocità di eritrosedimentazione (VES) è un parametro fisico, spesso utilizzato nei controlli sanitari di routine e nella diagnosi medica. Recentemente è stato sviluppato un modello teorico che consente di estrarre parametri fisicamente significativi dall'intera curva di sedimentazione, basato sulle moderne conoscenze colloidali. Qui, presentiamo un protocollo per raccogliere automaticamente la VES nel tempo ed estrarre i parametri di questo modello recente da questa raccolta automatica dei dati. Questi parametri raffinati sono anche suscettibili di migliorare la testimonianza medica.

Abstract

La velocità di sedimentazione degli eritrociti (o globuli rossi) (ESR) è un parametro fisico derivato del sangue che viene spesso utilizzato nei controlli sanitari di routine e nella diagnosi medica. Ad esempio, nel caso dell'infiammazione, si osserva una VES più elevata a causa dell'aumento associato del fibrinogeno e di altre proteine plasmatiche. Si riteneva che questo aumento fosse dovuto alla formazione di aggregati più grandi di globuli rossi (RBC) causati dall'aumento del fibrinogeno. In effetti, il fibrinogeno è un'aggregazione di globuli rossi che favorisce l'agente e nel regime di Stokes si presume che venga osservato nei sedimenti di aggregati più grandi del sangue più velocemente. Tuttavia, tutti i modelli di misurazione ESR basati su questa ipotesi richiedono ulteriori assunzioni fisiche specifiche, non richieste in nessun altro sistema. Inoltre, studi moderni nel campo delle sospensioni colloidali hanno stabilito che particelle attrattive formano aggregati percolanti (cioè aggregati larghi quanto il contenitore). La sedimentazione di questi colloidi segue poi un cosiddetto "collasso del gel colloidale". Recentemente, è stato dimostrato che i globuli rossi seguono effettivamente lo stesso comportamento. Questa ipotesi permette anche di modellare in modo efficiente e analitico la curva di sedimentazione dei globuli rossi, da cui possono essere estratti descrittori robusti e fisicamente significativi. Questo manoscritto descrive come eseguire tale analisi e discute i vantaggi di questo approccio.

Introduction

La velocità di eritrosedimentazione (VES) è uno strumento clinico medico in vitro, formalmente introdotto nella medicina basata sull'evidenza nel corso del XX secolo 1,2,3,4. Attualmente è utilizzato in tutto il mondo come test infiammatorio aspecifico, o per monitorare l'evoluzione di alcune condizioni specifiche 5,6,7,8. Ciò è dovuto principalmente ad un aumento della concentrazione di fibrinogeno, ma anche in altri componenti plasmatici come IgM 1,9,10,11. Secondo l'attuale protocollo standard Westergren, i valori ESR sono riportati come la misurazione dello strato di plasma privo di cellule in un dato punto temporale (30 minuti o 1 ora) dopo aver lasciato un tubo verticale di una dimensione tipica di 20 cm verticalmente a riposo12. Tuttavia, questo metodo di misurazione è stato criticato poiché sono stati riportati stadi qualitativamente diversi nel processo di sedimentazione, incluso un ritardo prima di raggiungere la velocità massima di sedimentazione13. Questo ritardo dura più di 1 ora in circa la metà dei campioni sani14. La velocità durante questa fase obbedisce a una scala diversa rispetto alla seconda fase, più veloce della sedimentazione15. Limitare la lettura alla velocità media di assestamento durante la prima ora, quindi confrontare un diverso mix di varie proprietà del sangue tra individui diversi.

Inoltre, è stato recentemente dimostrato che le solite considerazioni teoriche alla base di questo protocollo erano errate16,17,18. All'ematocrito fisiologico (superiore a circa il 25%), i globuli rossi (RBC) non sedimentano come aggregati separati, ma piuttosto come una rete continua, cosiddetta percolante, di globuli rossi 17,18, obbedendo a un diverso insieme di equazioni fisiche rispetto alla sedimentazione di Stokes 16,17 solitamente menzionata. È stato dimostrato che considerare una descrizione fisica basata sulle misure risolte nel tempo della sedimentazione (intera curva) era più robusto in alcuni nuovi contesti medici19,20. Inoltre, queste misurazioni potrebbero essere utilizzate per far luce sui meccanismi fisici che alterano la VES in patologie in cui le forme cellulari sono alterate19,20. Inoltre, una VES lenta può avere un'utile interpretazione medica, come indicato nelle misurazioni di una coorte di pazienti con sindrome da neuroacantocitosi19,20. Questo articolo esamina come implementare praticamente la misurazione di parametri fisicamente significativi, in base all'intera cinetica ESR. Più precisamente, il metodo qui presentato estrae la velocità massima di sedimentazione Um, il cui valore può essere corretto per considerare l'effetto dell'ematocrito del donatore16,17. Questo parametro è più preciso e quindi più affidabile della misura tradizionale16,17,19,20.

Inoltre, in alcune ricerche fondamentali, invece di monitorare lo stato infiammatorio di un determinato paziente, è interessante escludere l'effetto dell'ematocrito sulla VES 21,22,23, o indagare il ruolo dei globuli rossi in una VES modificata 19,20,24,25 tra diversi donatori. Potrebbe essere utile confrontare campioni che non sono direttamente campioni di sangue completi di pazienti. Pertanto, la sospensione dei globuli rossi con un ematocrito controllato nel plasma autologo, o in un sostituente del plasma, potrebbe essere utilizzata come primo passo della misurazione della VES. Ad esempio, soluzioni di destrano 70 kDa con una concentrazione di 55 mg/ml in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) producono un intervallo di sedimentazione all'interno dell'intervallo di controllo per le cellule sane19. Questo manoscritto mostra anche come tali passi dovrebbero essere condotti, e che l'analisi presentata è rilevante anche in questi casi.

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Protocol

La raccolta di campioni di sangue e gli esperimenti sono stati approvati dalla "Ärztekammer des Saarlandes", ethics votum 51/18, ed eseguiti dopo aver ottenuto il consenso informato secondo la Dichiarazione di Helsinki. Le misurazioni standard devono essere eseguite con sangue anticoagulato con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (concentrazione standard di EDTA di 1,6 mg/ml di sangue, norma europea NF EN ISO 6710), in provette di Westergren. Il volume richiesto per riempire il tubo Westergren dipende dal produttore (poiché le parti inferiori a volte contengono un serbatoio più largo); Il volume deve essere di circa 1 ml di sangue pieno e 800 μL per le provette indicate nella tabella dei materiali. Il metodo descritto di seguito è comunque valido indipendentemente dalla specifica forma della sospensione e del contenitore, purché l'ematocrito dei campioni sondati sia superiore al 25%16. Volumi, contenitori, mezzi di sospensione e additivi dovrebbero quindi essere selezionati in base agli obiettivi specifici della ricerca eseguita.

1. Esperimenti e misurazioni

NOTA: Registrare la velocità di sedimentazione del campione ogni minuto.

  1. Preparazione del campione (se necessario): se è necessario un ematocrito di controllo o un liquido sospensivo, iniziare lavando le cellule e preparando i campioni (ad esempio, mostriamo come preparare campioni con vari livelli di fibrinogeno, mescolando siero e plasma autologhi). Il siero può infatti essere approssimato come plasma libero da fibrinogeno26,27, e può essere utilizzato per diminuire l'aggregazione dei globuli rossi, in condizioni altrimenti fisiologiche. Per preparare diversi campioni, raccogliere il sangue in provette EDTA standard da 9 ml e il siero in provette di siero standard (con perle di silice come attivatori della coagulazione) di 9 ml.
    1. Centrifugare i campioni di sangue (cioè 9 ml di EDTA standard e provette di siero nell'esempio scelto) a 3.000 x g per almeno 7 minuti, per una compattazione ottimale degli eritrociti imballati. Sostituire il surnatante con PBS o il liquido di sospensione desiderato, se è disponibile una quantità sufficiente. Se è semplicemente necessario controllare l'ematocrito nel plasma autologo, procedere direttamente al punto 1.1.3. Altrimenti, mescolare delicatamente dopo l'inclusione del surnatante per il lavaggio.
    2. Ripeti tre volte. Eseguire l'ultimo lavaggio con il liquido di sospensione desiderato in ogni caso.
      1. Nell'esempio scelto, preparare miscele di plasma autologo e siero con proporzioni determinate (ad esempio, 25%/75%, 50%/50% o 75%/25% della frazione volumetrica plasma-siero). Ad esempio, quando si preparano 2,5 ml della miscela plasma-siero al 25%/75%, aggiungere 0,625 ml di plasma a 1,875 ml di siero.
    3. Estrarre il volume richiesto di celle imballate e sospenderlo nel liquido desiderato. Trattare le celle imballate come un liquido altamente viscoso (utilizzando il pre-pipettaggio standard e/o il reverse pipetting o una pipetta a spostamento positivo28). Nell'esempio scelto, per un campione di 4 ml con un ematocrito del 45%, sospendere 1,8 ml di cellule imballate entro 2,2 ml dalla miscela plasma-siero.
  2. Se l'ematocrito del campione non è controllato, determinarlo mediante microcentrifugazione ad alta velocità (sono adatti anche altri metodi standard).
    1. Estrarre la quantità necessaria di campione per la determinazione dell'ematocrito: riempire i capillari del microematocrito immergendo la punta inferiore nel liquido. Fermarlo coprendo l'apertura superiore quando la quantità richiesta di campione sale nel tubo mediante aspirazione capillare.
    2. Sigillare i capillari con ceralacca. Metterli nella centrifuga micro-ematocrito e farlo funzionare a 15.000 x g (12.000 giri / min) per 5 minuti o secondo le istruzioni del produttore.
    3. Leggere il livello di ematocrito sul capillare e scriverlo per riferimento.
  3. Impostare una telecamera per registrare la sedimentazione dei campioni. Per evitare di sovraccaricare la memoria o scaricare la batteria, alimentare il dispositivo dalla rete elettrica e salvare le immagini direttamente su un computer o un disco rigido esterno.
    1. Posizionare una telecamera fissa davanti al supporto in cui i tubi ESR verranno lasciati a riposo. Usa uno sfondo bianco illuminato (i fogli di carta bianchi sullo sfondo funzionano perfettamente).
    2. Utilizzando tubi Westergren vuoti, preferibilmente senza marcature, impostare la messa a fuoco e il campo visivo della telecamera per ottenere la massima risoluzione in cui verranno posizionati i campioni. Preferibilmente, assicurarsi che i bordi delle immagini siano allineati nella direzione verticale e orizzontale.
    3. Scatta una foto di un tubo in scala per estrarre la risoluzione in pixel. Si consiglia l'uso di immagini RGB.
    4. Impostare la luce e il tempo di esposizione della fotocamera in modo che abbia uno sfondo bianco, ma senza saturazione. L'esempio in Figura 1 è stato ottenuto utilizzando una Canon EOS M50, con un tempo di esposizione di 1/15s, un'apertura di F8.0, bilanciamento del bianco al tungsteno, in modalità scatto singolo con messa a fuoco manuale e una velocità ISO di 1.000.
  4. Preparare e posizionare i tubi ESR.
    1. Riempire il contenitore inferiore del tubo Westergren con il volume corrispondente alle istruzioni del produttore. Inserire il tubo Westergren nel contenitore inferiore come indicato dal produttore.
    2. Non appena il primo tubo è pronto, posizionarlo nel supporto e avviare la registrazione della fotocamera. La registrazione di un'immagine ogni minuto di solito fornisce una buona risoluzione della curva cinetica ESR.
    3. Preparare e posizionare i campioni successivi. Assicurati di non stare di fronte a nessun campione quando viene scattata una foto.
    4. Lasciare che le misurazioni vengano eseguite per almeno 2 ore, al fine di confrontare con le misurazioni standard a 30 min, 1 h e 2 h. Tuttavia, è anche meglio vedere la saturazione e l'arresto della sedimentazione. Per campioni sani, o in caso di infiammazione, la registrazione dei campioni durante la notte, tra 12 h e 24 h, è più che sufficiente poiché la curvatura dei campioni più veloci è visibile entro 3 h13,19. Tuttavia, se una condizione diminuisce la velocità di sedimentazione, come fa una diminuzione della concentrazione di fibrinogeno (cioè, nell'esempio scelto, alta frazione di volume sierico), potrebbero essere necessarie registrazioni di 50 ore o più per ottenere le informazioni più accurate16,19.

2. Analisi delle immagini

NOTA: una volta registrate le immagini, estrarre la curva ESR. Un esempio di codice Matlab viene fornito come file supplementare 1 (MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).

  1. Selezionare o identificare una regione di interesse (ROI) in cui è visibile un solo tubo, il cui bordo inferiore si trova sotto la posizione più bassa dell'interfaccia del plasma privo di cellule eritrocitarie ma all'interno del campione (vedere Figura 1A, B). Se necessario, ruotare l'immagine in modo che la direzione verticale sia allineata lungo il primo componente dell'immagine.
  2. Converti il ROI dell'immagine RGB in un'immagine in scala di grigi o matrice Gr. Di solito, combinando i canali a tre colori (rosso [R], verde [G] e blu [B]) come Gr = 2 * R - B - G è molto efficiente con uno sfondo chiaro (vedere Figura 1C e MatlabCodeImageAnalysisSampled.m righe 121-128).
  3. Binarizzare l'immagine. Per un campione integro, l'utilizzo della soglia Otsu29 in genere fornisce un risultato coerente (vedere la Figura 1D e la riga 133 di MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Per i campioni con un ematocrito alto o con qualche emolisi, potrebbe essere meglio regolarlo manualmente o utilizzare un altro metodo automatico (come fatto nelle righe 129-131 di MatlabCodeImageAnalysisSampled.m), a seconda dell'esatto contrasto ottenuto tra le varie fasi all'interno del tubo.
  4. Ottenere la media dei valori di pixel (o elementi) di Gr lungo la direzione orizzontale. Questo passaggio riduce al minimo il rumore e calcola in modo efficiente la media delle possibili irregolarità dell'interfaccia (vedere la Figura 1E e MatlabCodeImageAnalysisSampled.m riga 137).
  5. Prima di calcolare le variazioni, smussare la curva con una media mobile, soprattutto se i tubi contengono alcuni segni orizzontali (vedi Figura 1F). Per gli esempi forniti, per questo processo è stata utilizzata una finestra mobile di ~2,5 mm (50 pixel) (vedere la riga 138 di MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Quindi, identificare la posizione dell'interfaccia come il punto con la variazione di intensità più elevata (vedere la Figura 1G).
  6. Ripetere l'operazione per ogni immagine e ogni campione. Per ogni campione, salvare le posizioni dell'interfaccia nel tempo in un formato appropriato per adattare il modello fisico a qualsiasi software adatto.

3. Adattamento del modello fisico

  1. Utilizzando qualsiasi software opportunamente adatto, conoscendo l'ematocrito e l'altezza iniziale della colonna sanguigna h 0, trovare i valori del tempo di ritardo t0, il tempo adimensionale γ e la frazione di volume finale impacchettata Φmdegli eritrociti che minimizza la somma delle deviazioni residue al quadrato per il modello fisico17. Un codice Matlab (ShapeAnalyzerIntegrated.m) viene fornito come file supplementare 2 come esempio di come eseguire tale adattamento. Vedere il file supplementare 2 per ulteriori istruzioni. Come descritto altrove16,17, eritrociti a sedimento ematocrito fisiologico come gel di particelle molli, dove i parametri fisici importanti sono la differenza di densità tra il plasma e i globuli rossi del donatore Δρ, il diametro caratteristico dei globuli rossi rRBC, la viscosità plasmatica a temperatura ambiente η e l'ematocrito del donatore Φ . Usando questi parametri, e supponendo che lo stress gravitazionale sia il principale processo trainante per il plasma a fluire verso l'alto attraverso la rete porosa formata dagli eritrociti dopo un tempo di ritardo t0, si ottiene l'evoluzione temporale16,17:
    Equation 1
    con Equation 2, Equation 3, e Equation 4 essendo il raggio medio del disco di un eritrocita. Un esempio di codice Matlab che esegue questa operazione viene fornito come allegato (ShapeAnalyzerIntegrated.m si adatta alla funzione definita in SedimFit.m [File supplementare 3]). In alternativa, G/γ può anche essere utilizzato direttamente come parametro di adattamento con unità di 1/t.
  2. Una volta estratta la curva quantitativa dall'immagine, salvare i parametri fisici del campione. I valori ESR tradizionali a 30 min, 1 h o 2 h possono ancora essere estratti dalla curva come riferimento (vedere ShapeAnalyzerIntegrated.m righe 123-132).

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Representative Results

Un esempio di sequenza di immagini correttamente acquisita è fornito come filmato supplementare 1 (MovieS1.avi). Una serie di adattamenti caratteristici del modello è mostrata per varie condizioni nella Figura 2. La concentrazione di fibrinogeno è stata determinata dalla concentrazione di fibrinogeno nel plasma Fib0, supponendo che il siero non abbia alcun fibrinogeno. Quindi, Fib = C Fib0, dove C è la frazione di volume plasmatico nella miscela plasma-siero. Negli studi precedenti16, Fib0 è stato determinato con metodi standard nel laboratorio di chimica clinica dell'ospedale universitario del Saarland (Homburg, Germania). Se è necessario misurare tale quantità in modo indipendente, un metodo conveniente per determinare la concentrazione di fibrinogeno include coagulometri a sfera (semi) automatici, che potrebbero anche richiedere l'ottenimento di un campione di sangue citrato anticoagulato dal donatore30. Le curve ESR degli studi che hanno generato queste curve potrebbero essere dotate di un coefficiente di Pearson R 2 [0,974, 0,9996], con una media di 0,996 e una deviazione standard di 0,004 (solo una curva su 35 ha dato un R2Equation 11 < 0,99). I parametri eventualmente estratti sono l'ematocrito finale nella fase RBC Φm, il tempo di ritardo t0 - necessario affinché il gel si frattura e inizi a collassare - e la massima velocità Equation 6istantanea, raggiunta all'inizio del collasso. Il parametro adimensionale γ è associato all'inverso dell'area dei pori nella rete di compattazione dei globuli rossi (espressa in multipli del raggio delle particelle), Δρ è la differenza di densità tra il plasma e i globuli rossi del donatore, a è il diametro caratteristico dei globuli rossi, η è la viscosità del plasma a temperatura ambiente e Φ è l'ematocrito del donatore. L'adattamento viene effettivamente eseguito fissando Δρ,a,η e Φ e quindi determinando il γ migliore, Φm e t0. L'ematocrito deve essere determinato indipendentemente tramite un altro metodo standard, mentre l'altro può essere fissato a valori standard (ΔρEquation 10080kg/m3 31,32, ηEquation 100 1,5 mPa s 33 e 4 Equation 100μm). Qualsiasi deviazione degli altri parametri modificherebbe semplicemente il valore determinato di γ di un fattore corrispondente, ma non modificherebbe la determinazione finale di Um, che è quindi un parametro robusto a tale riguardo.

Le raccolte di valori dei parametri raccolti in precedenti studi fondamentali, che mostrano le tendenze dei parametri in funzione dei livelli di ematocrito e fibrinogeno, sono mostrate nella Figura 3 e nella Figura 4.

Figure 1
Figura 1: Elaborazione delle immagini . (A) Visualizzazione ideale di diversi campioni, con ROI rilevanti, evidenziati per un campione. (B) Ingrandire il ROI selezionato. (C) Conversione del ROI colorato in livello di grigio. (D) Immagine binarizzata ottenuta con la soglia Otsu. (E) L'intensità media orizzontale dell'immagine binaria in funzione dell'altezza (secondo la consueta convenzione nell'elaborazione delle immagini, l'origine è considerata nella parte superiore dell'immagine; vedi anche il punto 2.4 del protocollo.) (F) Intensità attenuata eseguendo una media mobile su un quartiere verticale di 50 pixel (vedere anche il passaggio 2.5 del protocollo). (G) Variazioni dell'intensità attenuata lungo la direzione verticale. La posizione del valore massimo assoluto è considerata come posizione dell'interfaccia (vedere anche il punto 2.5 del protocollo). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Adattamenti caratteristici. (A) Curve e attacchi ottenuti per un donatore sano, con vari ematocriti aggiustati. Le curve sono adattate da uno studio precedente17. (B) Curve e adattamenti ottenuti per un donatore sano, con varie concentrazioni di fibrinogeno. Varie concentrazioni di fibrinogeno sono state ottenute mescolando plasma autologo e siero in varie proporzioni. Le curve e i dati provengono da uno studio precedente16. Le barre di errore (ottenute dalla risoluzione dei pixel o dalle statistiche di adattamento) sono più piccole della dimensione del simbolo. Le figure sono state ristampate con il permesso di Dasanna et al.16 (18 campioni da quattro disegni di sangue indipendenti) e Darras et al.17 (16 campioni da sette prelievi di sangue indipendenti). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Valori caratteristici dei parametri estratti per vari ematocriti . (A) Variazione della velocità massima di sedimentazione Umestratta in funzione dell'ematocrito campione Φ. I cerchi sono misure individuali; Colori diversi sono legati a diversi donatori sani. La linea rossa continua è l'andamento previsto dal modello, ottenuto con i valori medi di Φm e γ. Viene anche mostrato il valore corretto di Umper un ematocrito di Φ = 0,45, sia come triangoli per i singoli valori che come linea retta per la costante prevista del modello. Questo valore corretto è stato calcolato secondo il modello come Equation 10. (B) Valori ottenuti per il parametro γ. (C) Valori ottenuti per il parametro Φm. (D) Valori ottenuti per il parametro t0. Le barre di errore per i singoli dati ottenuti dalle statistiche di adattamento sono inferiori alla dimensione del simbolo. Questa cifra è stata adattata con il permesso di Darras et al.17. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Valori caratteristici dei parametri estratti per varie concentrazioni di fibrinogeno . (A) Variazione della velocità massima di sedimentazione Umestratta in funzione della concentrazione di fibrinogeno del campione. Colori diversi sono legati a diversi donatori sani. (B) Valori ottenuti per il parametro γ. (C) Valori ottenuti per il parametro Φm. (D) Valori ottenuti per il parametro t0. Le barre di errore per i singoli dati ottenuti dalle statistiche di adattamento sono inferiori alla dimensione del simbolo. Questa figura è stata ristampata con il permesso di Dasanna et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Filmato supplementare 1: Esempio di una sequenza di immagini acquisita correttamente. In queste immagini sono mostrati vari tipi di campioni da due diversi donatori (stesso gruppo sanguigno). Da sinistra a destra, tutti i campioni con duplicati: sangue pieno dal donatore 1, sospensione dei globuli rossi dal donatore 1 nel destrano 70 kDa (55 mg/mL PBS) con ematocrito controllato al 45%, sangue intero dal donatore 2, sospensione dei globuli rossi dal donatore 2 nel destrano (ematocrito al 45%), sospensione dei globuli rossi dal donatore 1 nel plasma del donatore 2 (ematocrito al 45%), e sospensione dei globuli rossi dal donatore 2 nel plasma del donatore 1 (45% ematocrito). I campioni hanno una vasta gamma di velocità di sedimentazione e le sospensioni in destrano mostrano anche una certa emolisi. Tuttavia, il codice fornito MatlabCodeImageAnalysisSampled.m li analizza in modo efficiente tutti. Clicca qui per scaricare questo film.

File supplementare 1: MatlabCodeImageAnalysisSampled.m. Codice principale utilizzato per l'analisi delle immagini (passo 2 del protocollo). Per eseguire il codice su un dispositivo specifico, è necessario modificare la riga 8. Dovrebbe contenere il percorso della cartella contenente le immagini dei tubi di Westergren da analizzare, terminando con il prefisso delle immagini, se presenti. Una serie di immagini compresse è disponibile per il download ad accesso libero su Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). Il codice, e in particolare le proprietà di ciascun campione (definite nelle righe 14-61), è già stato adattato per analizzare queste immagini. Per questo set di immagini, il prefisso utilizzato era 'IMG_'. Pertanto, la riga di stringa 8 dovrebbe terminare con '\IMG_' (o '/IMG_' sui sistemi Linux). Anche l'ultima parte del codice (righe 166-179) traccia automaticamente le curve di sedimentazione estratte per ciascun campione. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: ShapeAnalyzerIntegrated.m. Codice principale utilizzato per adattarsi al modello fisico (passaggio 3 del protocollo). Per eseguire questo codice, è sufficiente copiarlo e incollarlo nella cartella contenente i file di testo di output da MatlabCodeImageAnalysisSampled.m, insieme a SedimFit.m. I nomi dei file da analizzare (senza l'estensione .txt) dovrebbero essere elencati nella riga 9. L'ematocrito iniziale e l'altezza del tubo dovrebbero anche essere contenuti nelle righe 12 e 15, rispettivamente. Questo codice è già pronto per analizzare le curve estratte dalle immagini open-access su Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). Una volta modificati i codici di linea di cui sopra, è sufficiente fare clic sul pulsante "Esegui" nella barra degli strumenti di Matlab Editor. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: SedimFit.m. Modello fisico regolato da ShapeAnalyzerIntegrated.m. Questo file è una funzione Matlab, che definisce le funzioni che vengono adattate alle curve sperimentali per estrarre i parametri fisici. Deve trovarsi nella stessa cartella di ShapeAnalyzerIntegrated.m quando viene eseguita l'analisi. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Affinché il protocollo automatizzato funzioni in modo efficiente, è importante avere uno sfondo chiaro e un'illuminazione adeguata. Uno sfondo scuro potrebbe impedire l'esistenza di una soglia di binarizzazione efficiente. Per i campioni con una certa emolisi, che di solito si verifica (aumenta) nel tempo, è importante verificare prima che la soglia di binarizzazione scelta sia rilevante sia per le immagini iniziali che per quelle finali.

Quando si tratta del processo di binarizzazione dell'immagine, la scelta del ROI e della soglia di binarizzazione è il passaggio più delicato. Potrebbe essere utile testare manualmente diversi valori di soglia su tre diverse immagini (all'inizio, a metà e alla fine del processo di sedimentazione) per garantire che la scelta della soglia fornisca effettivamente la binarizzazione pertinente per l'intero processo. Se il campione subisce una forte emolisi, potrebbe essere necessario limitare l'analisi del campione all'inizio del processo, quando è ancora possibile osservare un'interfaccia chiara. Come per qualsiasi misurazione ESR, è anche essenziale evitare la presenza di eventuali bolle nel tubo. Tuttavia, se si osservano alcune piccole bolle nella parte superiore del tubo, un ROI che inizia sotto le bolle e proprio sopra l'interfaccia iniziale potrebbe comunque fornire la misurazione pertinente. In questo caso, tuttavia, è importante includere un po 'di spazio di sfondo a destra e a sinistra del tubo in modo che la soglia Otsu possa essere determinata considerando sempre una quantità significativa di pixel con il livello di grigio dello sfondo.

Il metodo, come per tutte le misurazioni ESR, si basa sul presupposto che si possa vedere una chiara interfaccia tra eritrociti impacchettati e plasma privo di cellule. Se il campione sperimenta una quantità significativa di emolisi, o se l'ematocrito del campione è troppo diluito (inferiore al 25%17), tale interfaccia non sarà più osservata. Una misurazione ESR in queste condizioni è quindi impossibile da eseguire.

Come affermato in precedenza, questo metodo garantisce di fornire la velocità rilevante del collasso del gel Um, che può essere corretta in base all'ematocrito iniziale del paziente17. La figura 3A, insieme alle misurazioni grezze di Um, mostra anche i valori corretti per un ematocrito normalizzato di Φ 0 = 0,45. Si può vedere che la correzione rimuove la dipendenza complessiva da Φ0, così come la maggior parte della dispersione dei dati. La determinazione di Umbasata direttamente sul modello fisico pertinente implica anche che la tecnica è più oggettiva di un arrotondamento arbitrario della curva, con scelte arbitrarie di parametri di livellamento. Tra gli altri, questo metodo ha dimostrato di essere più robusto in contesti medici in cui si osservano valori di ESR anormalmente bassi19,20.

Un altro interesse intrinseco di questa misurazione è che fornisce dati più robusti e fisicamente interpretabili. Ad esempio, nel caso di una VES abbassata, permette di distinguere se il tempo di ritardo t0 del collasso è prolungato, se la rete di RBC è insolitamente disordinata attraverso γ, o se la compattazione finale Φm delle celle è in qualche modo ostacolata16,19,20.

È interessante notare che la misura della velocità massima di sedimentazione è anche più robusta e sensibile ai livelli di fibrinogeno, come già evidenziato in studi precedenti13,14,15. Questa è una caratteristica importante, poiché la VES viene spesso utilizzata per monitorare l'infiammazione, che è associata a livelli elevati di fibrinogeno. Questa sensibilità deriva essenzialmente dal disaccoppiamento di Um dal momento del collasso del gel, che è noto per avere un'importante componente casuale34,35,36. Più precisamente, come evidenziato nella figura 4D16, per concentrazioni più elevate di fibrinogeno, la variazione casuale intrinseca del tempo di ritardo (in cui le misurazioni superiori a 150 mg/ml sono comprese tra 12 minuti e 30 minuti, anche tra un singolo donatore) ha lo stesso ordine di grandezza della sua dipendenza sottostante da questo parametro (tra 150 mg/dL e 300 mg/dL; la tendenza media delle misurazioni diminuisce solo da 0,45 h a 0,4 h [ cioè, da 27 minuti a 24 minuti]). Poiché questo tempo di ritardo è effettivamente incluso nella misurazione tradizionale dell'altezza a 30 minuti o 1 ora (durate che questo tempo di ritardo può talvolta raggiungere o superare), l'estrazione della velocità massima Um (che presenta una tendenza sistematica e significativa per ciascun donatore) fornisce quindi un parametro più robusto e significativo 13,14,15,34,35, 36.

Inoltre, il parametro Um può essere efficacemente corretto per l'ematocrito iniziale, secondo il risultato Equation 11 pratico descritto in precedenza17. Combinando i dati per tutti i donatori sani in uno studio precedente17, si ottengono valori di γ = 0,50 ± 0,06 e Φ m = 0,86 ± 0,04, che riproducono bene l'andamento di Um in funzione dell'ematocrito del donatore Φ , come mostrato nella Figura 3. Tuttavia, in casi pratici, potrebbe essere più rigoroso correggere la VES con i valori di γ e Φmottenuti per un donatore specifico, poiché i livelli di fibrinogeno possono anche cambiare significativamente tra i donatori e avere un'influenza significativa su questi parametri (Figura 4).

Considerando i punti discussi e includendoli nelle procedure mediche di routine, l'accuratezza e la versatilità della VES come strumento clinico in vitro miglioreranno ulteriormente.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare rilevanti per il contenuto di questo articolo.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dall'unità di ricerca FOR 2688 - Wa1336/12 della Fondazione tedesca per la ricerca e dalla convenzione di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 860436-EVIDENCE. T. J. e C. W. riconoscono il finanziamento dell'Università franco-tedesca (DFH / UFA). A. D. riconosce il finanziamento da parte del Young Investigator Grant dell'Università del Saarland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (for blood sample) SARSTEDT 267001 or 265 Anticoagulated blood sample to characterize
Camera EOS M50 Canon Kit EF-M18-150 IS STM Any camera should work, provided that sector alimentation, connection to computer for automated shooting and adapted objective are available
Centrifuge HERMLE 302.00 V03 - Z 36 HK Requirements: at least 3000 x g ofr 7 min.
Micro-centrifuge MLW TH21 or any other way to determine the hematocrit
Micro-hematocrit capilaries Fisher scientific 11884040 or other capillaries/containers for hematocrit determination
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher 10010023 1x PBS, pH 7.4, 298 Osm
Pipettes (e.g. positive displacement pipette) Gilson FD10006 Pipette required to manipulate blood and/or packed cells.Other models are of course suitable, but be careful to treat blood and pakced cells as highly viscous fluids.
Wax sealing plate Hirschmann 9120101 Sealing wax for the micro-hematocrit capillaries
Westergren tubes Praxindo A9244560 Any other standard Wetsergren tube should work too
White background with illumination / / White sheet(s) of paper behind the samples, with usual room light is perfcetly sufficient.

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References

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Medicina Numero 193
Velocità di eritrosedimentazione: una caratterizzazione guidata dalla fisica in un contesto medico
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Darras, A., John, T., Wagner, C.,… More

Darras, A., John, T., Wagner, C., Kaestner, L. Erythrocyte Sedimentation Rate: A Physics-Driven Characterization in a Medical Context. J. Vis. Exp. (193), e64502, doi:10.3791/64502 (2023).

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