Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Автоматизация анализа микроядер с помощью визуализационной проточной цитометрии и искусственного интеллекта

Published: January 27, 2023 doi: 10.3791/64549
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Amnis Flow Cytometry, Luminex Corporation

Summary

Анализ микроядра (MN) является хорошо зарекомендовавшим себя тестом для количественной оценки повреждения ДНК. Однако оценка анализа с использованием традиционных методов, таких как ручная микроскопия или анализ изображений на основе признаков, является трудоемкой и сложной. В этой статье описывается методология разработки модели искусственного интеллекта для оценки анализа MN с использованием данных проточной цитометрии визуализации.

Abstract

Анализ микроядра (MN) используется регулирующими органами во всем мире для оценки химических веществ на предмет генетической токсичности. Анализ может быть выполнен двумя способами: путем оценки MN в однажды разделенных, заблокированных цитокинезом бинуклеированных клетках или полностью разделенных моноядерных клетках. Исторически сложилось так, что световая микроскопия была золотым стандартом для оценки анализа, но она трудоемка и субъективна. Проточная цитометрия использовалась в последние годы для оценки анализа, но ограничена неспособностью визуально подтвердить ключевые аспекты клеточных изображений. Визуализирующая проточная цитометрия (IFC) сочетает в себе высокопроизводительный захват изображений и автоматический анализ изображений и успешно применяется для быстрого получения изображений и оценки всех ключевых событий в анализе MN. Недавно было продемонстрировано, что методы искусственного интеллекта (ИИ), основанные на сверточных нейронных сетях, могут быть использованы для оценки данных анализа MN, полученных IFC. В этом документе описываются все шаги по использованию программного обеспечения ИИ для создания модели глубокого обучения для оценки всех ключевых событий и применения этой модели для автоматической оценки дополнительных данных. Результаты модели глубокого обучения ИИ хорошо сравниваются с ручной микроскопией, что позволяет полностью автоматизировать оценку анализа MN путем объединения IFC и AI.

Introduction

Анализ микроядра (MN) имеет основополагающее значение в генетической токсикологии для оценки повреждения ДНК при разработке косметики, фармацевтических препаратов и химических веществ для использования человеком 1,2,3,4. Микроядра образуются из целых хромосом или фрагментов хромосом, которые не включаются в ядро после деления и конденсируются в небольшие круглые тела, отделенные от ядра. Таким образом, MN можно использовать в качестве конечной точки для количественной оценки повреждения ДНК при тестировании на генотоксичность1.

Предпочтительный метод количественной оценки MN заключается в некогда разделенных бинуклеированных клетках (BNC) путем блокирования деления с использованием цитохалазина-B (Cyt-B). В этой версии анализа цитотоксичность также оценивается путем оценки моноядерных (MONO) и полиядерных (POLY) клеток. Анализ также может быть выполнен путем оценки MN в незаблокированных клетках MONO, что быстрее и легче набрать, при этом цитотоксичность оценивается с использованием количества клеток до и после воздействия для оценки пролиферации 5,6.

Физический подсчет результатов анализа исторически проводился с помощью ручной микроскопии, поскольку это позволяет визуально подтверждать все ключевые события. Однако ручная микроскопия сложна и субъективна1. Таким образом, были разработаны автоматизированные методы, в том числе сканирование предметных стекол микроскопа и проточная цитометрия, каждая из которых имеет свои преимущества и ограничения. В то время как методы сканирования слайдов позволяют визуализировать ключевые события, слайды должны создаваться с оптимальной плотностью ячеек, чего может быть трудно достичь. Кроме того, в этом методе часто отсутствует цитоплазматическая визуализация, что может поставить под угрозу оценку клеток MONO и POLY 7,8. В то время как проточная цитометрия обеспечивает высокопроизводительный сбор данных, клетки должны быть лизированы, что не позволяет использовать форму анализа Cyt-B. Кроме того, традиционная проточная цитометрия, не являющаяся методом визуализации, не обеспечивает визуальной проверки ключевых событий 9,10.

Поэтому для проведения анализа MN была исследована визуализирующая проточная цитометрия (IFC). ImageStreamX Mk II сочетает в себе скорость и статистическую надежность обычной проточной цитометрии с возможностями визуализации с высоким разрешением микроскопии в одной системе11. Было показано, что с помощью IFC можно захватывать и автоматически оценивать изображения всех ключевых событий с высоким разрешением с использованием методов 12,13 на основе функций 12,13 или искусственного интеллекта (ИИ) 14,15. Используя IFC для проведения анализа MN, можно получить автоматическую оценку гораздо большего количества клеток по сравнению с микроскопией за более короткий промежуток времени.

Эта работа отличается от ранее описанного рабочего процессаанализа изображений 16 и обсуждает все шаги, необходимые для разработки и обучения модели случайного леса (RF) и/или сверточной нейронной сети (CNN) с использованием программного обеспечения Amnis AI (далее именуемого «программное обеспечение AI»). Описаны все необходимые шаги, включая заполнение наземных достоверных данных с помощью инструментов маркировки с помощью ИИ, интерпретацию результатов обучения модели и применение модели для классификации дополнительных данных, что позволяет рассчитать генотоксичность и цитотоксичность15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Сбор данных с помощью визуализирующей проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Rodrigues et al.16 со следующими изменениями, отмечая, что для оптимального захвата изображения, возможно, потребуется модифицировать области сбора данных с использованием IFC:

  1. Для метода, отличного от Cyt-B, выполните подсчет клеток с использованием коммерчески доступного счетчика клеток, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов) на каждой культуре непосредственно перед культурой и сразу после периода восстановления.
  2. При запуске образцов на проточном цитометре с одной камерой поместите Brightfield (BF) в канал 4. Замените M01 на M04, а M07 на M01.
    ПРИМЕЧАНИЕ: «M» относится к каналу камеры на IFC.
  3. Используйте 40-кратное увеличение во время съемки.
  4. На графике соотношения сторон области BF и BF во время съемки используйте следующие координаты региона:
    X-координаты: 100 и 900; Y-координаты: 0.7 и 1 (метод Cyt-B)
    X-координаты: 100 и 600; Y-координаты: 0.7 и 1
  5. На графике интенсивности Хёхста используйте следующие координаты региона:
    X-координаты: 55 и 75; Y-координаты: 9.5 и 15 (метод Cyt-B)
    X-координаты: 55 и 75; Y-координаты: 13 и 21 (метод без Cyt-B)
  6. Чтобы удалить из данных изображения апоптотических и некротических объектов, запустите программный пакет IDEAS 6.3 (далее именуемый «программное обеспечение для анализа изображений»; см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение AI было разработано для работы с файлами .daf, которые были обработаны с использованием последней версии программного обеспечения для анализа изображений. Убедитесь, что программное обеспечение для анализа изображений обновлено.
  7. Сохраните эту работу в виде файла шаблона (.ast).

2. Создание DAF-файлов для всех файлов .rif

  1. Программное обеспечение искусственного интеллекта позволяет импортировать только файлы .daf. Создайте DAF-файлы для всех RIF-файлов в эксперименте с помощью пакетной обработки.
  2. В меню «Инструменты» нажмите «Пакетные файлы данных», а затем нажмите «Добавить пакет».
  3. В новом окне выберите «Добавить файлы» и выберите файлы .rif для добавления в пакет. В разделе Выберите шаблон или файл анализа данных (.ast, .daf) выберите AST-файл , созданный ранее.
  4. При необходимости назначьте имя пакета и нажмите OK, чтобы создать файлы .daf для всех загруженных файлов .rif.

3. Создание эксперимента в программном обеспечении ИИ

  1. На рисунке 1 показана блок-схема, описывающая процесс создания модели глубокого обучения с помощью программного обеспечения ИИ.
  2. Запустите программное обеспечение AI и убедитесь, что установлена самая последняя версия, нажав « О программе » в левом нижнем углу окна. Если последняя версия не установлена, свяжитесь с support@luminexcorp.com, чтобы получить ее.
  3. Экран по умолчанию в программном обеспечении — экран «Новый эксперимент ». С помощью значка «Папка» выберите место для сохранения эксперимента и введите имя эксперимента (например, « Модель MN»).
  4. В разделе " Тип эксперимента" щелкните переключатель рядом с "Обучить ", чтобы начать обучающий эксперимент и начать построение модели CNN. Нажмите « Далее».
    1. Необязательно: если модель была ранее обучена, ее можно использовать в качестве шаблона для новой модели ИИ, а также выбрать в качестве шаблона для создания новой модели на экране Выбор модели шаблона . Если шаблонная модель не существует, просто пропустите этот шаг, нажав кнопку Далее.
  5. Следующий экран — экран «Определить новую модель ». В разделе Модель будет автоматически заполнено имя, присвоенное модели на шаге 3.3.
    1. В разделе «Описание» введите описание модели (необязательно) и оставьте максимальный размер изображения 150 пикселов.
    2. В разделе « Каналы» нажмите « Добавить BF», чтобы добавить канал яркого поля в список. В разделе « Имя» дважды щелкните Brightfield и переименуйте этот канал в BF. Нажмите « Добавить FL », чтобы добавить флуоресцентный канал в список. В разделе « Имя» дважды щелкните « Флуоресцентный » и переименуйте этот канал в ДНК.
    3. В разделе «Имена классов» нажмите « Добавить». Во всплывающем окне введите Mononucleated и нажмите OK. При этом одноядерный класс добавляется в список имен классов. Повторите этот процесс, чтобы убедиться, что в списке определены следующие шесть классов:
      Одноядерный
      Моноядерный с MN
      Двуядерный
      Двуядерный с MN
      Полиядерный
      Нерегулярная морфология
      Нажмите « Далее».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шесть классов наземных моделей истинности будут представлять ключевые события, подлежащие оценке, а также изображения с морфологией, отличающейся от принятых критериев оценки5.
      1. Дополнительно: При желании можно включить шаблон анализа из версии 1.7 для использования функций программного обеспечения для анализа изображений. Если вы хотите включить эти функции в модель ИИ, найдите AST-файл, а затем в раскрывающихся списках для конкретных каналов выберите подмножества функций, которые вы хотите включить.
    4. В разделе «Выбрать файлы» нажмите «Добавить файлы» и найдите нужные файлы , которые будут добавлены в программное обеспечение ИИ для создания наземных достоверных данных. Нажмите « Далее».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно добавить несколько файлов данных (например, положительные и отрицательные контрольные данные), которые содержат достаточное количество всех ключевых событий.
  6. Затем на экране Select Base Populations (Выбор базовых популяций) найдите неапоптотическую популяцию из иерархии популяций. Щелкните правой кнопкой мыши неапоптотическую популяцию и выберите « Выбрать все совпадающие популяции». Нажмите « Далее».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно исключить любые популяции, которые не должны быть классифицированы (например, бусины, мусор, дублеты и т. Д.)
  7. Этот экран является экраном "Выбор истинных популяций".
    1. Если помеченные истинные популяции ключевых событий не были созданы в программном обеспечении для анализа изображений, нажмите « Далее».
    2. Если в программном обеспечении для анализа изображений были созданы помеченные истинные популяции, назначьте их соответствующему классу модели.
    3. Чтобы назначить помеченную истинную популяцию клеток MONO с MN, щелкните класс Mononucleated with MN в разделе Model Classes (Классы моделей ) слева. Затем нажмите на соответствующую помеченную правду справа, которая содержит эти события.
    4. Если помеченные истинные популяции были созданы в нескольких файлах данных, щелкните правой кнопкой мыши одну из истинных популяций и выберите « Выбрать все совпадающие популяции », чтобы добавить помеченные популяции из нескольких файлов в соответствующий класс.
    5. После того, как все соответствующие группы истины будут назначены, нажмите « Далее».
  8. На экране Выбор каналов выберите соответствующие каналы для эксперимента. Здесь установите BF на канал 1, а Hoechst на канал 7. Щелкните правой кнопкой мыши канал и выберите «Применить ко всем». Нажмите «Далее».
  9. Наконец, на экране подтверждения нажмите « Создать эксперимент».
  10. Программное обеспечение ИИ загружает изображения из файлов данных и создает классы моделей, определенные на шаге 3.5.3, с наземными изображениями, которые были назначены на шаге 3.7. Нажмите «Готово».
  11. После создания эксперимента представляются пять вариантов:
    Эксперимент: предоставляет подробные сведения об эксперименте, включая загруженные файлы данных, выбранные каналы и определенные классы модели наземной истины.
    Тегирование: запускает инструмент тегов, с помощью которого пользователи могут заполнять наземные достоверные данные.
    Обучение: обучает модель на основе наземных достоверных данных.
    Классификация: использует обученные модели для классификации данных.
    Результаты: предоставляет результаты как обучающего эксперимента, так и классификационного эксперимента.

4. Заполнение наземных достоверных данных с помощью инструментов маркировки с помощью искусственного интеллекта

  1. Нажмите « Теги », чтобы запустить интерфейс инструмента тегов.
    1. Нажмите на инструменты масштабирования (значки увеличительного стекла), чтобы обрезать изображения для более удобного просмотра.
    2. Нажмите на ползунок, чтобы настроить размер изображения, чтобы изменить количество изображений, отображаемых в галерее.
    3. Нажмите на опцию « Настройка дисплея » и выберите «Мин-Макс», который обеспечивает наилучшее контрастное изображение для идентификации всех ключевых событий.
    4. Нажмите « Настроить отображение галереи », чтобы изменить цвет изображения ДНК на желтый или белый, что улучшит визуализацию небольших объектов (например, MN).
  2. Нажмите « Кластер », чтобы запустить алгоритм группировки объектов со схожей морфологией. После завершения кластеризации отдельные кластеры с количеством объектов в кластере отображаются в списке в разделе Неизвестные популяции. Выберите отдельные кластеры, чтобы просмотреть объекты в кластере, и назначьте эти объекты соответствующим классам моделей.
  3. После того, как каждому классу модели будет назначено не менее 25 объектов, алгоритм прогнозирования становится доступным. Нажмите « Предсказать».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объекты, которые плохо вписываются в какую-либо популяцию, остаются неизвестными. По мере того, как все больше объектов добавляется в популяции истины, точность предсказания улучшается.
  4. Продолжайте заполнять классы наземных моделей истинности соответствующими изображениями до тех пор, пока не будет достигнуто достаточное количество объектов в каждом классе.
  5. После того, как каждому классу моделей будет назначено не менее 100 объектов, нажмите на вкладку « Обучение » в верхней части экрана. Нажмите на кнопку «Обучить », чтобы создать модель с помощью алгоритмов Random Forest и CNN.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение ИИ создает модели, используя алгоритмы Random Forest и CNN, флажки позволяют создавать модели с использованием только алгоритмов Random Forest of CNN.

5. Оценка точности модели

  1. После завершения обучения модели нажмите « Просмотреть результаты».
  2. Используйте экран результатов для оценки точности модели. Используйте выпадающее меню для переключения между Random Forest и CNN.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Популяции истинности могут быть обновлены, а модель может быть переобучена или использована как есть для классификации дополнительных данных.
    1. Чтобы обновить популяции правды, нажмите « Теги » вверху и следуйте разделу 4.

6. Классификация данных с помощью модели

  1. Запустите программное обеспечение AI. По умолчанию используется экран «Новый эксперимент ». С помощью значка «Папка » выберите место для сохранения эксперимента и введите имя эксперимента.
  2. В разделе " Тип эксперимента" щелкните переключатель рядом с "Классифицировать ", чтобы начать эксперимент по классификации. Нажмите « Далее».
  3. Нажмите на модель, которая будет использоваться для классификации, затем нажмите « Далее».
  4. На экране «Выбор файлов » нажмите «Добавить файлы» и найдите файлы , которые будут классифицированы по модели CNN. Нажмите « Далее».
  5. Затем на экране Select Base Populations поставьте галочку напротив Non-Apoptotic population в одном из загруженных файлов. Щелкните правой кнопкой мыши неапоптотическую популяцию и выберите « Выбрать все совпадающие популяции », чтобы выбрать эту популяцию из всех загруженных файлов. Нажмите « Далее».
  6. Необязательно: если классифицируемые данные содержат популяции истинности, их можно назначить соответствующим классам моделей на экране Выбор популяций истинности. В противном случае нажмите кнопку Далее, чтобы пропустить этот шаг.
  7. На экране «Выбор каналов» выберите «Канал 1» для светлого поля и «Канал 7» для окрашивания ДНК. Щелкните правой кнопкой мыши канал и выберите «Применить ко всем». Затем нажмите «Далее».
  8. Наконец, на экране подтверждения нажмите «Создать эксперимент». Программное обеспечение AI загружает выбранную модель и все изображения из выбранных файлов данных. Нажмите «Готово».
  9. Нажмите « Классифицировать », чтобы запустить экран классификации. Нажмите на кнопку «Классифицировать ». Это запускает процесс использования модели RF и CNN для классификации дополнительных данных и идентификации всех объектов, принадлежащих к указанным классам моделей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флажки можно использовать для выбора модели RF и/или модели CNN.
  10. После завершения классификации нажмите « Просмотреть результаты».
  11. Нажмите кнопку «Обновить DAF », чтобы открыть окно « Обновить DAF с результатами классификации ». Нажмите OK , чтобы обновить файлы .daf.

7. Формирование отчета о результатах классификации

  1. На экране «Результаты» нажмите «Создать отчет». Установите флажок рядом с пунктом Создать отчет для каждого входного DAF, если требуется отдельный отчет для каждого входного DAF. Нажмите на кнопку ОК.
  2. После завершения откройте папку, в которой были сохранены файлы отчета. В папке есть отчет об эксперименте .pdf и папка ресурсов .
  3. Откройте .pdf, чтобы просмотреть отчет. Отчет содержит сведения о модели и эксперименте, список входных DAF-файлов, количество классов и процентное соотношение классов в табличном формате и формате гистограммы, а также матрицу путаницы, обобщающую среднюю вероятность предсказания для всех входных DAF-файлов.
  4. Откройте папку «Ресурсы », а затем папку CNN . В этой папке находятся .png файлы с гистограммами количества классов и процентами, а также матрица путаницы. Кроме того, существует .csv файлов, содержащих количество классов и проценты для каждого входного файла.

8. Определение частоты МН и цитотоксичности

  1. Расчет частоты МН
    1. Метод, отличный от Cyt-B: Чтобы определить частоту MN, откройте файл class_count.csv из шага 7.4. Для каждого входного файла разделите количество в популяции «Одноядерное с MN» на количество в популяции «Одноядерное» и умножьте на 100:
      Equation 1
    2. Метод Cyt-B: Чтобы определить частоту MN, откройте файл class_count.csv из шага 7.4. Для каждого входного файла разделите количество в «двуядерной» популяции на количество в «двуядерной» популяции и умножьте на 100:
      Equation 2
  2. Расчет цитотоксичности
    1. Метод Non Cyt-B:
      1. Используя начальное количество клеток и количество клеток после лечения, сначала рассчитайте удвоение популяции (PD) для каждой выборки2:
        Equation 3
      2. Затем вычисляем относительное удвоение численности населения2:
        Equation 4
      3. Наконец, рассчитайте цитотоксичность2 для каждого образца:
        Equation 5
    2. Метод Cyt-B:
      1. Чтобы рассчитать индекс пролиферации цитокинез-блоков (CBPI)2, используйте подсчет в моноядерных, бинуклеированных и полиядерных классах для каждого образца из файла class_count.csv :
        Equation 6
      2. Чтобы рассчитать цитотоксичность2, используйте CBPI из контрольных культур (C) и подвергшихся воздействию культур (T):
        Equation 7

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 показан рабочий процесс использования программного обеспечения ИИ для создания модели для анализа MN. Пользователь загружает нужные файлы .daf в программное обеспечение ИИ, а затем назначает объекты классам наземных моделей истинности с помощью кластера с помощью ИИ (рис. 2) и алгоритмов прогнозирования (рис. 3). После того, как все классы наземных моделей будут заполнены достаточным количеством объектов, модель может быть обучена с использованием алгоритмов RF или CNN. После обучения производительность модели можно оценить с помощью таких инструментов, как гистограммы распределения классов, статистику точности и интерактивную матрицу путаницы (рис. 4). С экрана результатов в программном обеспечении ИИ пользователь может либо вернуться к обучающей части рабочего процесса для улучшения наземных данных, либо, если была достигнута достаточная точность, пользователь может использовать модель для классификации дополнительных данных.

Используя как кластерный, так и прогнозный алгоритмы, 190 сегментов с общим количеством объектов 285 000 были отнесены к соответствующим классам наземной истины, пока все классы не были заполнены от 1 500 до 10 000 изображений. Всего при обучении этой модели было использовано 31 500 объектов (всего 10,5% от исходных загруженных объектов). Точность (процент ложных срабатываний), отзыв (процент ложноотрицательных результатов) и оценка F1 (баланс между точностью и отзывом) доступны в программном пакете глубокого обучения для количественной оценки точности модели. Здесь эта статистика варьировалась от 86,0% до 99,4%, что указывает на высокую точность модели (рис. 4).

При использовании Cyt-B фоновые частоты MN для всех контрольных образцов составляли от 0,43% до 1,69%, что хорошо сопоставимо с литературой17. Статистически значимое увеличение частоты МН, варьирующееся от 2,09% до 9,50% для ММК (митомицина С) и от 2,99% до 7,98% для этопозида, наблюдалось по сравнению с контролем растворителей и хорошо сравнивалось с оценкой ручной микроскопии. При исследовании отрицательного контроля маннита не наблюдалось значительного увеличения частоты МН. Кроме того, увеличение цитотоксичности с дозой наблюдалось как для этопозида, так и для MMC, причем как микроскопия, так и AI показали сходные тенденции в диапазоне доз. Для маннита не наблюдалось заметного увеличения цитотоксичности (рис. 5).

При отсутствии использования Cyt-B фоновые частоты MN для всех контрольных образцов составляли от 0,38% до 1,0%, что согласуется с результатами, опубликованными в литературе17. Статистически значимое увеличение частоты MN, варьирующееся от 2,55% до 7,89% для MMC и от 2,37% до 5,13% для этопозида, наблюдалось по сравнению с контролем растворителями и по сравнению с ручной микроскопией. При исследовании отрицательного контроля маннита не наблюдалось значительного увеличения частоты МН. Кроме того, увеличение цитотоксичности с дозой наблюдалось как для этопозида, так и для MMC, причем как микроскопия, так и AI показали сходные тенденции в диапазоне доз. Для маннита не наблюдалось заметного увеличения цитотоксичности (рис. 5).

При подсчете очков с помощью микроскопии из каждой культуры оценивали 1000 бинуклеированных клеток для оценки частоты MN, а еще 500 одноядерных, бинуклеированных или полиядерных клеток оценивали для определения цитотоксичности в версии анализа Cyt-B. В версии анализа, не относящейся к Cyt-B, 1000 моноядерных клеток были оценены для оценки частоты MN. С помощью IFC в среднем 7 733 бинуклеированных клеток, 6 493 моноядерных клеток и 2 649 полиядерных клеток были оценены на культуру для определения цитотоксичности. Частота MN определялась из популяции бинуклеированных клеток для версии анализа Cyt-B. Для версии анализа, не относящейся к Cyt-B, в среднем 27 866 моноядерных клеток были оценены на наличие MN (рис. 5).

Figure 1
Рисунок 1: Рабочий процесс программного обеспечения ИИ. Пользователь начинает с выбора файлов .daf для загрузки в программное обеспечение ИИ. После загрузки данных пользователь начинает присваивать объекты классам наземных моделей с помощью пользовательского интерфейса. Чтобы помочь в популяции наземной истины, алгоритмы кластера и прогнозирования могут быть использованы для идентификации изображений с похожей морфологией. После того, как в каждый класс модели будет добавлено достаточное количество объектов, модель можно обучить. После обучения пользователь может оценить производительность модели, используя предоставленные инструменты, включая интерактивную матрицу путаницы. Наконец, пользователь может либо вернуться к обучающей части рабочего процесса, чтобы улучшить наземные данные, либо, если была достигнута достаточная точность, пользователь может выйти из цикла рабочего процесса обучения/маркировки и использовать модель для классификации дополнительных данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Кластерный алгоритм. Кластерный алгоритм может быть запущен в любой момент времени на сегменте из 1 500 объектов, случайно выбранных из входных данных. Этот алгоритм группирует похожие объекты в сегменте вместе в соответствии с морфологией как неклассифицированных объектов, так и объектов, отнесенных к классам наземных моделей истинности. Примеры изображений показывают бинуклеированные, одноядерные и многоядерные клетки, а также клетки с нерегулярной морфологией. Кластеры, содержащие одноядерные клетки, находятся на одной стороне карты объектов, в то время как кластеры с многоядерными клетками находятся на противоположной стороне карты объектов. Двуядерные клеточные кластеры находятся где-то между моно- и многоядерными клеточными кластерами. Наконец, кластеры с нерегулярной морфологией попадают в совершенно другую область карты объектов. Пользовательский интерфейс позволяет добавлять целые кластеры или выбирать объекты внутри кластеров в классы наземных моделей истинности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Алгоритм прогнозирования. Алгоритм прогнозирования требует как минимум 25 объектов в каждом классе модели наземной истины и пытается предсказать наиболее подходящий класс модели для назначения неклассифицированных объектов в сегменте. Алгоритм прогнозирования более надежен по сравнению с кластерным алгоритмом в отношении идентификации тонких морфологий на изображениях (т. е. моноядерных клеток с MN [желтым] и моноядерных клеток без MN [красного]). Объекты с таким сходством размещаются в непосредственной близости на карте объектов; Тем не менее, пользователь может легко проверить изображения в каждом прогнозируемом классе и назначить объекты соответствующему классу модели. Объекты, для которых алгоритм не может предсказать класс, останутся неизвестными. Алгоритм прогнозирования позволяет пользователям быстро заполнять классы наземных моделей истинности, особенно в случае событий, которые считаются редкими и сложными для обнаружения во входных данных, таких как микроядерные клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Матрица путаницы с результатами модели. Экран результатов программного обеспечения искусственного интеллекта предоставляет пользователю три различных инструмента для оценки точности модели. (A) Гистограммы распределения классов позволяют пользователю щелкнуть ячейки гистограммы, чтобы оценить взаимосвязь между объектами в истинных популяциях и объектами, которые, как было предсказано, принадлежат к этому классу моделей. В целом, чем ближе процентные значения между истинной и прогнозируемой популяциями друг к другу для данного класса моделей, тем точнее модель. (B) Таблица статистики точности позволяет пользователю оценить три общие метрики машинного обучения для оценки точности модели: точность, отзыв и F1. Как правило, чем ближе эти метрики к 100%, тем точнее модель идентифицирует события в классах моделей. Наконец, (C) интерактивная матрица путаницы дает представление о том, где модель неправильно классифицирует события. Записи на оси (зеленые) обозначают объекты из наземных данных, которые были правильно классифицированы во время обучения. Внеосевые записи (заштрихованы оранжевым цветом) указывают на объекты из наземных данных, которые были неправильно классифицированы. Показаны различные примеры неправильно классифицированных объектов, в том числе (i) одноядерная клетка, классифицированная как одноядерная клетка с MN, (ii) бинуклеированная клетка, классифицированная как бинуклеированная клетка с MN, (iii) одноядерная клетка, классифицированная как клетка с нерегулярной морфологией, (iv) бинуклеированная клетка с MN, классифицированная как клетка с нерегулярной морфологией, и (v) бинуклеированная клетка с MN, классифицированная как бинуклеированная клетка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Результаты генотоксичности и цитотоксичности. Генотоксичность, измеряемая процентным содержанием MN с помощью микроскопии (прозрачные столбцы) и AI (точечные полосы) после 3-часового воздействия и 24-часового восстановления маннита, этопозида и MMC с использованием методов (A-C) Cyt-B и (D-F) без Cyt-B. Статистически значимое увеличение частоты МН по сравнению с контрольной группой обозначено звездочками (*p < 0,001, точный критерий Фишера). Столбцы погрешности представляют собой стандартное отклонение среднего значения от трех реплицированных культур в каждой точке дозы, за исключением MMC с помощью микроскопии, где оценивались только дублирующиеся культуры. Эта цифра была изменена по сравнению с Rodrigues et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В представленной здесь работе описывается использование алгоритмов глубокого обучения для автоматизации скоринга анализа MN. Несколько недавних публикаций показали, что интуитивно понятные интерактивные инструменты позволяют создавать модели глубокого обучения для анализа данных изображений без необходимости глубоких вычислительных знаний18,19. Протокол, описанный в этой работе с использованием программного пакета, управляемого пользовательским интерфейсом, был разработан для хорошей работы с очень большими файлами данных и позволяет легко создавать модели глубокого обучения. Обсуждаются все необходимые шаги по созданию и обучению моделей RF и CNN в программном пакете ИИ, что позволяет с высокой точностью идентифицировать и количественно оценивать все ключевые события как в версиях Cyt-B, так и в версиях анализа, не относящихся к Cyt-B. Наконец, описаны шаги по использованию этих моделей глубокого обучения для классификации дополнительных данных и оценки химической цитотоксичности и частоты MN.

Программное обеспечение ИИ, используемое в этой работе, было создано с удобным пользовательским интерфейсом и сконструировано для удобной работы с большими наборами данных, генерируемыми системами IFC. Обучение, оценка и совершенствование моделей глубокого обучения выполняются с помощью простого итеративного подхода (рис. 1), а применение обученных моделей для классификации дополнительных данных может быть выполнено всего за несколько шагов. Программное обеспечение содержит отличительные кластерные (рис. 2) и предсказательные (рис. 3) алгоритмы, которые позволяют быстро распределять объекты по соответствующим классам наземных моделей. Протокол в этой статье демонстрирует, как модель CNN, построенная и обученная с использованием программного обеспечения ИИ, способна надежно идентифицировать все ключевые события в анализе MN; Он дает результаты, которые хорошо сравниваются с традиционной микроскопией, тем самым устраняя необходимость в анализе изображений и опыте компьютерного кодирования. Кроме того, результаты интерактивной модели (рис. 4) позволяют исследовать конкретные события, которые модель неправильно классифицирует. Итеративный процесс позволяет назначать эти неправильно классифицированные события соответствующим классам модели, чтобы модель можно было снова обучить для повышения точности.

Результаты, представленные здесь (рис. 5), показывают оценку маннита, этопозида и MMC с использованием микроскопии и модели CNN, созданной в программном обеспечении ИИ. Используя обе версии анализа MN, оцененные с помощью одной модели ИИ, увеличение цитотоксичности согласуется с увеличением доз как для MMC, так и для этопозида, в то время как воздействие маннита не приводит к увеличению цитотоксичности, как ожидалось. Для оценки генотоксичности значительное (точный тест Фишера, одностороннее) увеличение частоты MN было продемонстрировано с использованием MMC и этопозида, но не с использованием маннита. Результаты как микроскопии, так и модели искусственного интеллекта хорошо сравнивались в диапазонах доз для каждого тестируемого химического вещества.

В нескольких предыдущих публикациях было показано, что анализ MN на основе IFC может быть выполнен с помощью простых и простых этапов пробоподготовки наряду с анализом на основе изображений с использованием масок (областей интереса, которые выделяют пиксели на изображении) и признаков, рассчитанных с использованием этих масок для автоматической оценки всех ключевых событий12,13,16 . Этот анализ на основе IFC использует преимущества IFC, включая высокопроизводительный захват изображений, упрощенную обработку образцов с помощью простых красителей ДНК и автоматическую дифференциацию клеточных изображений с морфологией, которая соответствует опубликованным критериям оценки анализа MN. Однако этот рабочий процесс также имел недостатки, такие как сложность методов анализа на основе признаков, которые часто являются жесткими и требуют глубоких знаний о программных пакетах для анализа изображений12. Использование глубокого обучения для анализа данных MN, полученных IFC, демонстрирует, что CNN можно использовать, чтобы избавиться от ограничений и трудностей анализа на основе признаков, давая результаты, которые являются высокоточными и хорошо сравниваются с оценкой микроскопии14,15. Хотя этот подход, основанный на искусственном интеллекте, является многообещающим, необходимо провести дальнейшие исследования с расширенным выбором хорошо описанных химических веществ для дальнейшего тестирования и подтверждения надежности метода. Эта работа еще раз демонстрирует преимущества IFC по сравнению с более традиционными методами, такими как микроскопия и традиционная проточная цитометрия, для повышения эффективности анализов со сложной морфологией и строгими требованиями к оценке.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы работают в Luminex Corporation, компании DiaSorin, производителе проточного цитометра ImageStream и программного обеспечения Amnis AI, используемого в этой работе.

Acknowledgments

Никакой.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tube Falcon 352096
Cleanser - Coulter Clenz  Beckman Coulter 8546931 Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/
1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine MilliporeSigma 64-86-8
Corning bottle-top vacuum filter  MilliporeSigma CLS430769 0.22 µm filter, 500 mL bottle
Cytochalasin B MilliporeSigma 14930-96-2 5 mg bottle
Debubbler - 70% Isopropanol MilliporeSigma 1.3704 Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) MilliporeSigma 67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X EMD Millipore BSS-1006-B PBS Ca++MG++ Free 
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences, Inc. 04018 This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Guava Muse Cell Analyzer Luminex 0500-3115 A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used.
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10 mg/mL solution
Mannitol MilliporeSigma 69-65-8
MEM Non-Essential Amino Acids 100X HyClone SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II Luminex, a DiaSorin company 100220 A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used.
MIFC analysis software - IDEAS Luminex, a DiaSorin company 100220 "Image analysis sofware"
The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC software - INSPIRE Luminex, a DiaSorin company 100220 "Image acquisition software"
This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)
Amnis AI software Luminex, a DiaSorin company 100221 "AI software"
This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data
Mitomycin C MilliporeSigma 50-07-7
NEAA Mixture 100x Lonza BioWhittaker 13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X Gibco 15070063
Potassium Chloride (KCl) MilliporeSigma P9541
Rinse - Ultrapure water or deionized water NA NA Use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RNase MilliporeSigma 9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1x HyClone SH30027.01
Sheath - PBS MilliporeSigma BSS-1006-B This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x  Ca++MG++ free.  Fill container with 900 mL of Sheath.
Sterile water HyClone SH30529.01
Sterilizer - 0.4%–0.7% Hypochlorite VWR JT9416-1 This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
T25 flask Falcon 353109
T75 flask Falcon 353136
TK6 cells MilliporeSigma 95111735

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
  2. OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , OECD Publishing. Paris. (2016).
  3. Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).
  4. Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
  5. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
  6. Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).
  7. Seager, A. L., et al. Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells. Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).
  8. Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
  9. Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).
  10. Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
  11. Basiji, D. A. Principles of Amnis imaging flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
  12. Rodrigues, M. A. Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer. Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).
  13. Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).
  14. Wills, J. W., et al. Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).
  15. Rodrigues, M. A., et al. The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).
  16. Rodrigues, M. A. An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).
  17. Lovell, D. P., et al. Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).
  18. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  19. Hennig, H., et al. An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning. Methods. 112, 201-210 (2017).

Tags

Биоинженерия выпуск 191 анализ микроядер генотоксичность цитотоксичность визуализационная проточная цитометрия анализ изображений машинное обучение искусственный интеллект
Автоматизация анализа микроядер с помощью визуализационной проточной цитометрии и искусственного интеллекта
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodrigues, M. A., Gracia García … More

Rodrigues, M. A., Gracia García Mendoza, M., Kong, R., Sutton, A., Pugsley, H. R., Li, Y., Hall, B. E., Fogg, D., Ohl, L., Venkatachalam, V. Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence. J. Vis. Exp. (191), e64549, doi:10.3791/64549 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter