Summary
Mikronukleusanalysen (MN) er en veletableret test til kvantificering af DNA-skader. Imidlertid er det besværligt og udfordrende at score analysen ved hjælp af konventionelle teknikker såsom manuel mikroskopi eller funktionsbaseret billedanalyse. Dette papir beskriver metoden til at udvikle en kunstig intelligensmodel til at score MN-analysen ved hjælp af billeddannelsesflowcytometridata.
Abstract
Mikrokerneanalysen (MN) anvendes over hele verden af regulerende organer til at evaluere kemikalier for genetisk toksicitet. Analysen kan udføres på to måder: ved at score MN i en gang opdelte, cytokinesisblokerede binucleerede celler eller fuldt opdelte mononukleerede celler. Historisk set har lysmikroskopi været guldstandardmetoden til at score analysen, men det er besværligt og subjektivt. Flowcytometri er blevet brugt i de senere år til at score analysen, men er begrænset af manglende evne til visuelt at bekræfte nøgleaspekter af cellulære billeder. Imaging flow cytometri (IFC) kombinerer high-throughput billedoptagelse og automatiseret billedanalyse, og er blevet anvendt med succes til hurtigt at erhverve billeder af og score alle vigtige begivenheder i MN assay. For nylig er det blevet demonstreret, at kunstig intelligens (AI) metoder baseret på convolutional neurale netværk kan bruges til at score MN assay data erhvervet af IFC. Dette dokument beskriver alle trin til at bruge AI-software til at oprette en dyb læringsmodel til at score alle vigtige hændelser og til at anvende denne model til automatisk at score yderligere data. Resultaterne fra AI deep learning-modellen kan sammenlignes godt med manuel mikroskopi, hvilket muliggør fuldautomatisk scoring af MN-analysen ved at kombinere IFC og AI.
Introduction
Mikrokerneanalysen (MN) er grundlæggende i genetisk toksikologi til evaluering af DNA-skader i udviklingen af kosmetik, lægemidler og kemikalier til human brug 1,2,3,4. Mikrokerner dannes af hele kromosomer eller kromosomfragmenter, der ikke inkorporeres i kernen efter opdeling og kondenseres til små, cirkulære legemer adskilt fra kernen. MN kan således anvendes som endepunkt til at kvantificere DNA-skader i genotoksicitetstest1.
Den foretrukne metode til kvantificering af MN er inden for en gang delte binucleated celler (BNC'er) ved at blokere division ved hjælp af cytochalasin-B (Cyt-B). I denne version af analysen vurderes cytotoksicitet også ved at score mononukleerede (MONO) og polynukleerede (POLY) celler. Analysen kan også udføres ved at score MN i ikke-blokerede MONO-celler, hvilket er hurtigere og lettere at score, idet cytotoksicitet vurderes ved hjælp af celletal før og efter eksponering for at vurdere proliferation 5,6.
Fysisk scoring af analysen er historisk set blevet udført gennem manuel mikroskopi, da dette muliggør visuel bekræftelse af alle nøglehændelser. Imidlertid er manuel mikroskopi udfordrende og subjektiv1. Således er automatiserede teknikker blevet udviklet, herunder mikroskopdiasscanning og flowcytometri, hver med deres egne fordele og begrænsninger. Mens diasscanningsmetoder gør det muligt at visualisere nøglehændelser, skal dias oprettes med optimal celletæthed, hvilket kan være vanskeligt at opnå. Derudover mangler denne teknik ofte cytoplasmatisk visualisering, hvilket kan kompromittere scoringen af MONO- og POLY-celler 7,8. Mens flowcytometri tilbyder datafangst med høj kapacitet, skal cellerne lyseres, hvilket ikke tillader anvendelse af Cyt-B-formen af assayet. Derudover giver konventionel flowcytometri som en ikke-billeddannelsesteknik ikke visuel validering af nøglehændelser 9,10.
Derfor er billeddannelsesflowcytometri (IFC) blevet undersøgt for at udføre MN-assayet. ImageStreamX Mk II kombinerer hastigheden og den statistiske robusthed af konventionel flowcytometri med mikroskopiens billeddannelsesfunktioner i høj opløsning i et enkelt system11. Det har vist sig, at ved hjælp af IFC kan billeder i høj opløsning af alle nøglebegivenheder optages og automatisk scores ved hjælp af funktionsbaserede 12,13 eller kunstig intelligens (AI) teknikker14,15. Ved at bruge IFC til at udføre MN-analysen kan den automatiske scoring af mange flere celler sammenlignet med mikroskopi på kortere tid opnås.
Dette arbejde afviger fra en tidligere beskrevet billedanalysearbejdsgang16 og diskuterer alle trin, der kræves for at udvikle og træne en Random Forest (RF) og / eller convolutional neural network (CNN) model ved hjælp af Amnis AI-softwaren (fremover benævnt "AI-software"). Alle nødvendige trin er beskrevet, herunder udfyldning af grundlæggende sandhedsdata ved hjælp af AI-assisterede mærkningsværktøjer, fortolkning af modeltræningsresultater og anvendelse af modellen til at klassificere yderligere data, hvilket muliggør beregning af genotoksicitet og cytotoksicitet15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dataindsamling ved hjælp af billeddannelsesflowcytometri
BEMÆRK: Se Rodrigues et al.16 med følgende ændringer, idet det bemærkes, at anskaffelsesregionerne, der bruger IFC, muligvis skal ændres for optimal billedoptagelse:
- For non-Cyt-B-metoden udføres en celletælling ved hjælp af en kommercielt tilgængelig celletæller efter producentens anvisninger (se materialetabellen) på hver kultur umiddelbart før dyrkning og umiddelbart efter restitutionsperioden.
- Hvis du kører prøver på et enkelt kamerabilledflowcytometer, skal du placere Brightfield (BF) i kanal 4. Udskift M01 med M04 og M07 med M01.
BEMÆRK: "M" henviser til kamerakanalen på IFC. - Brug 40x forstørrelse under anskaffelse.
- På BF-området versus BF-størrelsesforholdet under anskaffelsen skal du bruge følgende områdekoordinater:
X-koordinater: 100 og 900; Y-koordinater: 0,7 og 1 (Cyt-B-metoden)
X-koordinater: 100 og 600; Y-koordinater: 0,7 og 1 - Brug følgende områdekoordinater i Hoechst-intensitetsplottet:
X-koordinater: 55 og 75; Y-koordinater: 9,5 og 15 (Cyt-B-metoden)
X-koordinater: 55 og 75; Y-koordinater: 13 og 21 (ikke-Cyt-B-metoden) - For at fjerne billeder af apoptotiske og nekrotiske objekter fra dataene skal du starte IDEAS 6.3-softwarepakken (herefter benævnt "billedanalysesoftwaren"; se materialefortegnelsen).
BEMÆRK: AI-softwaren er designet til at arbejde med .daf-filer, der er blevet behandlet ved hjælp af den nyeste version af billedanalysesoftwaren. Sørg for, at billedanalysesoftwaren er opdateret. - Gem dette arbejde som en skabelonfil (.ast).
2. Oprettelse af .daf-filer til alle .rif-filer
- AI-softwaren tillader kun import af .daf-filer. Opret .daf-filer for alle .rif-filer i eksperimentet via batchbehandling.
- Under menuen Funktioner skal du klikke på Batchdatafiler og derefter klikke på Tilføj batch.
- I det nye vindue skal du vælge Tilføj filer og vælge de .rif-filer, der skal føjes til batchen. Under indstillingen Vælg en skabelon eller dataanalysefil ( .ast, .daf) skal du vælge den .ast-fil, der blev oprettet tidligere.
- Tildel om nødvendigt et batchnavn, og klik på OK for at oprette .daf-filer til alle indlæste .rif-filer.
3. Oprettelse af et eksperiment i AI-softwaren
- Se rutediagrammet i figur 1 , der beskriver processen med at oprette en dyb læringsmodel ved hjælp af AI-softwaren.
- Start AI-softwaren, og sørg for, at den nyeste version er installeret ved at klikke på Om i nederste venstre hjørne af vinduet. Hvis den nyeste version ikke er installeret, skal du kontakte support@luminexcorp.com for at få den.
- Standardskærmen i softwaren er skærmbilledet Nyt eksperiment . Brug mappeikonet til at vælge, hvor eksperimentet skal gemmes, og skriv et navn til eksperimentet (f.eks. "MN-model").
- Under Eksperimenttype skal du klikke på alternativknappen ud for Træning for at starte et træningseksperiment for at begynde at bygge CNN-modellen. Klik på Næste.
- Valgfrit: Hvis en model tidligere er blevet oplært, kan den bruges som skabelon for en ny AI-model og kan vælges som en skabelon til oprettelse af en ny model fra skærmbilledet Vælg skabelonmodel . Hvis der ikke findes en skabelonmodel, skal du blot springe dette trin over ved at klikke på Næste.
- Det næste skærmbillede er skærmen Definer ny model . Under Model udfyldes det navn, der blev givet til modellen i trin 3.3, automatisk.
- Skriv en beskrivelse af modellen (valgfrit) under Beskrivelse, og lad den maksimale billedstørrelse være 150 pixel.
- Under Kanaler skal du klikke på Tilføj BF for at tilføje en brightfield-kanal til listen. Under Navn skal du dobbeltklikke på Brightfield og omdøbe denne kanal til BF. Klik på Tilføj FL for at tilføje en fluorescerende kanal til listen. Under Navn skal du dobbeltklikke på Fluorescerende og omdøbe denne kanal til DNA.
- Under Klassenavne skal du klikke på Tilføj. Skriv Mononucleated i pop op-vinduet, og klik på OK. Dette føjer den mononucleerede klasse til listen over klassenavne. Gentag denne proces for at sikre, at følgende seks klasser er defineret på listen:
Enkernet
Mononukleeret med MN
Binucleated
Binucleated med MN
Polynucleated
Uregelmæssig morfologi
Klik på Næste.
BEMÆRK: Disse seks grundlæggende sandhedsmodelklasser repræsenterer de vigtigste begivenheder, der skal scores, samt billeder med morfologi, der adskiller sig fra de accepterede scoringskriterier5.- Valgfrit: Hvis det ønskes, kan analyseskabelonen fra 1.7 inkluderes for at bruge funktioner fra billedanalysesoftwaren. Hvis du vil medtage disse funktioner i AI-modellen, skal du søge efter .ast-filen og derefter vælge de funktionsundersæt, du vil medtage, på de kanalspecifikke rullelister.
- Under Vælg filer skal du klikke på Tilføj filer og søge efter de ønskede filer , der skal føjes til AI-softwaren for at opbygge de grundlæggende sandhedsdata. Klik på Næste.
BEMÆRK: Det er vigtigt at tilføje flere datafiler (f.eks. positive og negative kontroldata), der indeholder et tilstrækkeligt antal af alle nøglehændelser.
- Find derefter den ikke-apoptotiske population fra befolkningshierarkiet på skærmbilledet Vælg basispopulationer. Højreklik på den ikke-apoptotiske population, og vælg Vælg alle matchende populationer. Klik på Næste.
BEMÆRK: Det er vigtigt at udelukke populationer, der ikke bør klassificeres (f.eks. perler, affald, dubletter osv.) - Denne skærm er skærmen Vælg sandhedspopulationer .
- Hvis taggede sandhedspopulationer af nøglebegivenhederne ikke er oprettet i billedanalysesoftwaren, skal du klikke på Næste.
- Hvis der er oprettet mærkede sandhedspopulationer i billedanalysesoftwaren, skal du tildele dem til den relevante modelklasse.
- For at tildele en mærket sandhedspopulation af MONONO-celler med MN skal du klikke på klassen Mononucleated with MN under Model Classes til venstre. Klik derefter på den relevante taggede sandhedspopulation til højre, der indeholder disse begivenheder.
- Hvis de mærkede sandhedspopulationer er blevet oprettet i mere end én datafil, skal du højreklikke på en af sandhedspopulationerne og vælge Vælg alle matchende populationer for at tilføje kodede populationer fra flere filer til den relevante klasse.
- Når alle relevante sandhedspopulationer er blevet tildelt, skal du klikke på Næste.
- På skærmbilledet Vælg kanaler skal du vælge de relevante kanaler til eksperimentet. Her indstilles BF til kanal 1 og Hoechst til kanal 7. Højreklik på en kanal, og vælg Anvend på alle. Klik på Næste.
- Til sidst skal du klikke på Opret eksperiment på bekræftelsesskærmen.
- AI-softwaren indlæser billeder fra datafilerne og opretter de modelklasser, der er defineret i trin 3.5.3, med de grundlæggende sandhedsbilleder, der blev tildelt i trin 3.7. Klik på Udfør.
- Når eksperimentet er oprettet, præsenteres fem muligheder:
Eksperiment: indeholder oplysninger om eksperimentet, herunder indlæste datafiler, valgte kanaler og definerede sandhedsmodelklasser.
Tagging: lancerer taggingværktøjet, hvorigennem brugerne kan udfylde grundlæggende sandhedsdata.
Træning: træner en model baseret på de grundlæggende sandhedsdata.
Klassificer: bruger trænede modeller til at klassificere data.
Resultater: giver resultater fra både et træningseksperiment og et klassificeringseksperiment.
4. Udfyldning af de grundlæggende sandhedsdata ved hjælp af AI-assisterede mærkningsværktøjer
- Klik på Tagging for at starte taggingværktøjets grænseflade.
- Klik på zoomværktøjerne (forstørrelsesglasikoner) for at beskære billederne for lettere visning.
- Klik på skyderen for at justere billedstørrelsen for at ændre, hvor mange billeder der vises i galleriet.
- Klik på indstillingen Skærmindstilling , og vælg Min-Max, som giver det bedste kontrastbillede til identifikation af alle nøglehændelser.
- Klik på Setup Gallery Display for at ændre farven på DNA-billedet til gul eller hvid, hvilket vil forbedre visualiseringen af små objekter (f.eks. MN).
- Klik på Klynge for at køre algoritmen for at gruppere objekter med lignende morfologi sammen. Når klyngedannelsen er fuldført, vises de enkelte klynger med antallet af objekter pr. klynge på en liste under Ukendte populationer. Vælg de enkelte klynger for at få vist objekterne i klyngen, og tildel disse objekter til deres relevante modelklasser.
- Når der er tildelt mindst 25 objekter til hver modelklasse, bliver algoritmen Predict tilgængelig. Klik på Forudsig.
BEMÆRK: Objekter, der ikke passer godt ind i nogen population, forbliver klassificeret som ukendte. Efterhånden som flere objekter føjes til sandhedspopulationerne, forbedres forudsigelsesnøjagtigheden. - Fortsæt med at udfylde grundsandhedsmodelklasserne med passende billeder, indtil et tilstrækkeligt antal objekter i hver klasse er nået.
- Når mindst 100 objekter er tildelt hver modelklasse, skal du klikke på fanen Træning øverst på skærmen. Klik på knappen Train for at oprette en model ved hjælp af algoritmerne Random Forest og CNN.
BEMÆRK: AI-softwaren opretter modeller ved hjælp af både Random Forest- og CNN-algoritmerne, afkrydsningsfelterne tillader kun oprettelse af modeller ved hjælp af Random Forest of CNN-algoritmer.
5. Vurdering af modellens nøjagtighed
- Når modeltræningen er fuldført, skal du klikke på Vis resultater.
- Brug skærmbilledet med resultater til at vurdere modellens nøjagtighed. Brug rullemenuen til at skifte mellem Random Forest og CNN.
BEMÆRK: Sandhedspopulationerne kan opdateres, og modellen kan omskoles eller bruges, som den er, til at klassificere yderligere data.- For at opdatere sandhedspopulationerne skal du klikke på Tagging øverst og følge afsnit 4.
6. Klassificering af data ved hjælp af modellen
- Start AI-softwaren. Standardskærmen er skærmbilledet Nyt eksperiment . Brug mappeikonet til at vælge, hvor eksperimentet skal gemmes, og skriv et navn til eksperimentet.
- Klik på alternativknappen ud for Klassificer under Eksperimenttype for at starte et klassificeringseksperiment. Klik på Næste.
- Klik på den model, der skal bruges til klassificering, og klik derefter på Næste.
- På skærmen Vælg filer skal du klikke på Tilføj filer og søge efter de filer, der skal klassificeres efter CNN-modellen. Klik på Næste.
- Klik derefter på afkrydsningsfeltet ud for den ikke-apoptotiske population i en af de indlæste filer på skærmbilledet Vælg basispopulationer. Højreklik på den ikke-apoptotiske population, og klik på Vælg alle matchende populationer for at vælge denne population blandt alle indlæste filer. Klik på Næste.
- Valgfrit: Hvis de data, der skal klassificeres, indeholder sandhedspopulationer, kan de tildeles de relevante modelklasser på skærmen Vælg sandhedspopulationer. Ellers skal du klikke på Næste for at springe dette trin over.
- På skærmen Vælg kanaler skal du vælge Kanal 1 for brightfield og Kanal 7 for DNA-pletten. Højreklik på en kanal, og klik på Anvend på alle. Klik derefter på Næste.
- Til sidst skal du klikke på Opret eksperiment på bekræftelsesskærmen. AI-softwaren indlæser den valgte model og alle billeder fra de valgte datafiler. Klik på Udfør.
- Klik på Klassificer for at starte klassificeringsskærmen. Klik på knappen Klassificer . Dette starter processen med at bruge RF- og CNN-modellen til at klassificere yderligere data og identificere alle objekter, der hører til i de angivne modelklasser.
BEMÆRK: Afkrydsningsfelterne kan bruges til at vælge RF-modellen og/eller CNN-modellen. - Når klassificeringen er fuldført, skal du klikke på Vis resultater.
- Klik på knappen Opdater DAF'er for at åbne vinduet Opdater DAF'er med klassificeringsresultater. Klik på OK for at opdatere .daf-filerne.
7. Generering af en rapport over klassificeringsresultaterne
- På skærmbilledet Resultater skal du klikke på Generer rapport. Markér afkrydsningsfeltet ud for Opret rapport for hver input DAF, hvis der kræves en individuel rapport for hver input daf. Klik på OK.
- Når du er færdig, skal du åbne den mappe, hvor rapportfilerne er gemt. I mappen er der et eksperiment .pdf rapport og en ressourcemappe .
- Åbn .pdf for at få vist rapporten. Rapporten indeholder model- og eksperimentoplysninger, listen over input .daf-filer, klassetællinger og klasseprocenter i tabel- og histogramformat og en forvirringsmatrix, der opsummerer medianforudsigelsessandsynligheden på tværs af alle input .daf-filer.
- Åbn mappen Ressourcer og derefter mappen CNN . I denne mappe er .png filer med klassetælling og procentvise søjlediagrammer samt forvirringsmatrixen. Derudover er der .csv filer, der indeholder klassetællinger og procenter for hver inputfil.
8. Bestemmelse af MN-frekvens og cytotoksicitet
- Beregning af MN-frekvens
- Ikke-Cyt-B-metode: For at bestemme MN-frekvensen skal du åbne filen class_count.csv fra trin 7.4. For hver inputfil divideres tællingerne i populationen "Mononucleated with MN" med tællingerne i populationen "Mononucleated" og ganges med 100:
- Cyt-B-metode: For at bestemme MN-frekvensen skal du åbne filen class_count.csv fra trin 7.4. For hver inputfil divideres tællingerne i populationen "Binucleated with MN" med tællingerne i "Binucleated" populationen og ganges med 100:
- Ikke-Cyt-B-metode: For at bestemme MN-frekvensen skal du åbne filen class_count.csv fra trin 7.4. For hver inputfil divideres tællingerne i populationen "Mononucleated with MN" med tællingerne i populationen "Mononucleated" og ganges med 100:
- Beregning af cytotoksicitet
- Ikke-Cyt-B-metode:
- Ved hjælp af de indledende celletal og efterbehandlingscelletællingerne beregnes først populationsfordoblingen (PD) for hver prøve2:
- Beregn derefter den relative befolkningsfordobling2:
- Til sidst beregnes cytotoksiciteten2 for hver prøve:
- Ved hjælp af de indledende celletal og efterbehandlingscelletællingerne beregnes først populationsfordoblingen (PD) for hver prøve2:
- Cyt-B metode:
- For at beregne Cytokinesis-Block Proliferation Index (CBPI)2 skal du bruge tællingerne i de mononukleerede, binucleerede og polynucleated klasser for hver prøve fra class_count.csv-filen :
- For at beregne cytotoksicitet2 skal du bruge CBPI fra kontrolkulturerne (C) og eksponerede kulturer (T):
- For at beregne Cytokinesis-Block Proliferation Index (CBPI)2 skal du bruge tællingerne i de mononukleerede, binucleerede og polynucleated klasser for hver prøve fra class_count.csv-filen :
- Ikke-Cyt-B-metode:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser arbejdsprocessen for brug af AI-softwaren til at oprette en model til MN-analysen. Brugeren indlæser de ønskede .daf-filer i AI-softwaren og tildeler derefter objekter til jordsandhedsmodelklasserne ved hjælp af AI-assisterede klyngealgoritmer (figur 2) og forudsige (figur 3). Når alle grundlæggende sandhedsmodelklasser er blevet befolket med tilstrækkelige objekter, kan modellen trænes ved hjælp af RF- eller CNN-algoritmerne. Efter træning kan modellens ydeevne vurderes ved hjælp af værktøjer, herunder klassefordelingshistogrammer, nøjagtighedsstatistikker og en interaktiv forvirringsmatrix (figur 4). Fra resultatskærmen i AI-softwaren kan brugeren enten vende tilbage til træningsdelen af arbejdsgangen for at forbedre de grundlæggende sandhedsdata, eller hvis der er opnået tilstrækkelig nøjagtighed, kan brugeren bruge modellen til at klassificere yderligere data.
Ved hjælp af både klynge- og forudsigelsesalgoritmerne blev 190 segmenter med i alt 285.000 objekter tildelt de korrekte jordsandhedsklasser, indtil alle klasser var befolket med mellem 1.500 og 10.000 billeder. I alt blev 31.500 objekter (kun 10,5% af de oprindelige objekter, der blev indlæst) brugt til træning af denne model. Præcision (procentdel af falske positiver), tilbagekaldelse (procentdel af falske negativer) og F1-score (balance mellem præcision og tilbagekaldelse) er tilgængelige i softwarepakken til dyb læring for at kvantificere modelnøjagtighed. Her varierede disse statistikker fra 86,0% til 99,4%, hvilket indikerer høj modelnøjagtighed (figur 4).
Ved hjælp af Cyt-B var baggrunds-MN-frekvenserne for alle kontrolprøver mellem 0,43% og 1,69%, sammenlignet med litteratur17. Statistisk signifikante stigninger i MN-frekvensen, der spænder fra 2,09 % til 9,50 % for (Mitomycin C) MMC og fra 2,99 % til 7,98 % for etoposid, blev observeret sammenlignet med opløsningsmiddelkontroller og sammenlignet godt med manuel mikroskopi-scoring. Ved undersøgelse af den negative kontrol Mannitol blev der ikke observeret signifikante stigninger i MN-frekvensen. Derudover blev der observeret stigende cytotoksicitet med dosis for både etoposid og MMC, hvor både mikroskopi og AI viste lignende tendenser i hele dosisområdet. For Mannitol sås ingen observerbar stigning i cytotoksicitet (figur 5).
Når Cyt-B ikke blev brugt, var MN-baggrundsfrekvenserne for alle kontrolprøver mellem 0,38 % og 1,0 %, hvilket stemmer overens med resultaterne offentliggjort i litteraturen17. Statistisk signifikante stigninger i MN-frekvensen, der spænder fra 2,55% til 7,89% for MMC og fra 2,37% til 5,13% for etoposid, blev observeret sammenlignet med opløsningsmiddelkontroller og sammenlignet godt med manuel mikroskopi-scoring. Ved undersøgelse af den negative kontrol Mannitol blev der ikke observeret signifikante stigninger i MN-frekvensen. Endvidere blev der observeret stigende cytotoksicitet med dosis for både etoposid og MMC, hvor både mikroskopi og AI viste lignende tendenser i hele dosisområdet. For Mannitol sås ingen observerbar stigning i cytotoksicitet (figur 5).
Ved scoring ved mikroskopi blev der fra hver kultur scoret 1.000 binucleerede celler for at vurdere MN-frekvensen, og yderligere 500 mononukleerede, binucleerede eller polynucleerede celler blev scoret for at bestemme cytotoksicitet i Cyt-B-versionen af assayet. I den ikke-Cyt-B-version af analysen blev 1.000 mononukleerede celler scoret for at vurdere MN-frekvensen. Ved IFC blev i gennemsnit 7.733 binucleated celler, 6.493 mononucleated celler og 2.649 polynucleated celler scoret pr. Kultur for at bestemme cytotoksicitet. MN-frekvensen blev bestemt inden for den binucleerede cellepopulation for Cyt-B-versionen af assayet. For non-Cyt-B-versionen af analysen blev gennemsnitligt 27.866 mononukleerede celler vurderet for tilstedeværelsen af MN (figur 5).
Figur 1: Arbejdsproces for AI-software. Brugeren begynder med at vælge de .daf-filer, der skal indlæses i AI-softwaren. Når dataene er indlæst, begynder brugeren at tildele objekter til grundsandhedsmodelklasserne via brugergrænsefladen. For at hjælpe med at reducere jordsandhedspopulationen kan klynge- og forudsigelsesalgoritmerne bruges til at identificere billeder med lignende morfologi. Når der er tilføjet tilstrækkeligt mange objekter til hver modelklasse, kan modellen trænes. Efter træning kan brugeren vurdere modellens ydeevne ved hjælp af de medfølgende værktøjer, herunder en interaktiv forvirringsmatrix. Endelig kan brugeren enten vende tilbage til træningsdelen af arbejdsprocessen for at forbedre de grundlæggende sandhedsdata, eller hvis der er opnået tilstrækkelig nøjagtighed, kan brugeren træde ud af trænings-/tagging-arbejdsforløbsløjfen og bruge modellen til at klassificere yderligere data. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Klyngealgoritme. Klyngealgoritmen kan køres når som helst på et segment på 1.500 objekter, der er tilfældigt valgt blandt inputdataene. Denne algoritme grupperer lignende objekter inden for et segment sammen i henhold til morfologien for både uklassificerede objekter og objekter, der er tildelt grundsandhedsmodelklasserne. Eksempelbilleder viser binucleated, mononucleated og multinucleated celler og celler med uregelmæssig morfologi. Klynger, der indeholder mononukleerede celler, falder på den ene side af objektkortet, mens klynger med flerkernede celler er på den modsatte side af objektkortet. Binucleated celleklynger falder et sted mellem mono- og multinucleated celleklynger. Endelig falder klynger med uregelmæssig morfologi i et helt andet område af objektkortet. Brugergrænsefladen gør det muligt at tilføje hele klynger eller vælge objekter i klynger til grundsandhedsmodelklasserne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Forudsig algoritme. Forudsigelsesalgoritmen kræver mindst 25 objekter i hver grundlæggende sandhedsmodelklasse og forsøger at forudsige den mest passende modelklasse til at tildele uklassificerede objekter inden for et segment. Forudsigelsesalgoritmen er mere robust sammenlignet med klyngealgoritmen med hensyn til identifikation af subtile morfologier i billeder (dvs. mononukleerede celler med MN [gul] versus mononukleerede celler uden MN [rød]). Objekter med disse ligheder placeres tæt på objektkortet; Brugeren er dog let i stand til at inspicere billederne i hver forudsagt klasse og tildele objekter til den relevante modelklasse. Objekter, som algoritmen ikke kan forudsige en klasse for, forbliver som 'ukendte'. Forudsigelsesalgoritmen giver brugerne mulighed for hurtigt at udfylde de grundlæggende sandhedsmodelklasser, især i tilfælde af begivenheder, der betragtes som sjældne og udfordrende at finde inden for inputdataene, såsom mikronukleerede celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Forvekslingsmatrix med modelresultater. AI-softwarens resultatskærm præsenterer brugeren for tre forskellige værktøjer til at vurdere modelnøjagtigheden. (A) Klassefordelingshistogrammerne tillader brugeren at klikke på histogrammets skraldespande for at vurdere forholdet mellem objekter i sandhedspopulationerne og objekter, der blev forudsagt at tilhøre denne modelklasse. Generelt gælder det, at jo tættere procentværdierne mellem sandheden og de forudsagte populationer er på hinanden for en given modelklasse, jo mere nøjagtig er modellen. (B) Statistiktabellen for nøjagtighed giver brugeren mulighed for at vurdere tre almindelige målepunkter for maskinel indlæring for at vurdere modellens nøjagtighed: præcision, tilbagekaldelse og F1. Generelt gælder det, at jo tættere disse metrics er på 100 %, jo mere nøjagtig er modellen til at identificere hændelser i modelklasserne. Endelig (C) giver den interaktive forvirringsmatrix en indikation af, hvor modellen fejlklassificerer begivenheder. Posterne på aksen (grøn) angiver objekter fra de grundlæggende sandhedsdata, der blev klassificeret korrekt under træning. Poster uden for aksen (orangeskraveret) angiver objekter fra de grundlæggende sandhedsdata, der blev klassificeret forkert. Forskellige eksempler på fejlklassificerede objekter vises, herunder (i) en mononukleeret celle klassificeret som en mononukleeret celle med MN, (ii) en binucleated celle klassificeret som en binucleated celle med MN, (iii) en mononucleated celle klassificeret som en celle med uregelmæssig morfologi, (iv) en binucleated celle med MN klassificeret som en celle med uregelmæssig morfologi og (v) en binucleated celle med en MN klassificeret som en binucleated celle. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Genotoksicitet og cytotoksicitetsresultater. Genotoksicitet målt ved procentdelen af MN ved mikroskopi (klare søjler) og AI (stiplede søjler) efter en 3 timers eksponering og 24 timers restitution for Mannitol, Etoposid og MMC ved anvendelse af både (A-C) Cyt-B og (D-F) non-Cyt-B metoder. Statistisk signifikante stigninger i MN-frekvensen sammenlignet med kontroller er angivet med stjerner (*p < 0,001, Fisher's Exact Test). Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelsen for gennemsnittet fra tre replikate kulturer ved hvert dosispunkt undtagen MMC ved mikroskopi, hvor kun duplikatkulturer blev scoret. Dette tal er blevet ændret fra Rodrigues et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Arbejdet, der præsenteres her, beskriver brugen af deep learning-algoritmer til at automatisere scoringen af MN-analysen. Flere nylige publikationer har vist, at intuitive, interaktive værktøjer gør det muligt at oprette deep learning-modeller til at analysere billeddata uden behov for dybdegående beregningsviden18,19. Protokollen beskrevet i dette arbejde ved hjælp af en brugergrænsefladedrevet softwarepakke er designet til at fungere godt med meget store datafiler og muliggøre oprettelse af dyb læringsmodeller med lethed. Alle nødvendige trin til at oprette og træne RF- og CNN-modeller i AI-softwarepakken diskuteres, hvilket muliggør meget nøjagtig identifikation og kvantificering af alle nøglehændelser i både Cyt-B- og ikke-Cyt-B-versionerne af analysen. Endelig beskrives trinene til at bruge disse deep learning-modeller til at klassificere yderligere data og evaluere kemisk cytotoksicitet og MN-frekvens.
AI-softwaren, der bruges i dette arbejde, er skabt med en praktisk brugergrænseflade og konstrueret til let at arbejde med store datasæt genereret fra IFC-systemer. Træning, evaluering og forbedring af deep learning-modeller følger en ligetil iterativ tilgang (figur 1), og anvendelse af de trænede modeller til klassificering af yderligere data kan udføres i nogle få trin. Softwaren indeholder karakteristiske klyngealgoritmer (figur 2) og forudsige (figur 3), der muliggør hurtig tildeling af objekter i passende jordsandhedsmodelklasser. Protokollen i dette papir demonstrerer, hvordan en CNN-model, konstrueret og trænet ved hjælp af AI-software, er i stand til robust at identificere alle nøglehændelser i MN-assayet; Det giver resultater, der kan sammenlignes godt med traditionel mikroskopi, hvilket fjerner kravet om billedanalyse og computerkodningserfaring. Desuden gør de interaktive modelresultater (figur 4) det muligt at undersøge specifikke hændelser, som modellen fejlklassificerer. Den iterative proces gør det muligt at tildele disse fejlklassificerede hændelser til de relevante modelklasser, så modellen kan trænes igen for at forbedre nøjagtigheden.
Resultaterne præsenteret her (figur 5) viser evalueringen af Mannitol, Etoposid og MMC ved hjælp af mikroskopi og en CNN-model oprettet i AI-softwaren. Ved hjælp af begge versioner af MN-assayet, evalueret med en enkelt AI-model, er stigninger i cytotoksicitet i overensstemmelse med stigende doser for både MMC og Etoposid, mens eksponering for mannitol ikke giver nogen stigning i cytotoksicitet som forventet. Til genotoksicitetsevaluering blev signifikante (Fisher's Exact Test, ensidige) stigninger i MN-frekvensen påvist ved anvendelse af MMC og Etoposid, men ikke ved anvendelse af Mannitol. Resultaterne for både mikroskopi og AI-modellen sammenlignede godt på tværs af dosisintervallerne for hvert testet kemikalie.
I flere tidligere publikationer har det vist sig, at et IFC-baseret MN-assay kan udføres med enkle og enkle prøveforberedelsestrin sammen med en billedbaseret analyse ved hjælp af masker (interesseområder, der fremhæver pixels i et billede) og funktioner beregnet ved hjælp af disse masker for automatisk at score alle nøglehændelser12,13,16 . Dette IFC-baserede assay udnytter styrkerne ved IFC, herunder billedoptagelse med høj kapacitet, forenklet prøvebehandling med enkle DNA-farvestoffer og automatiseret differentiering af cellulære billeder med morfologi, der stemmer overens med offentliggjorte MN-assay-scoringskriterier. Denne arbejdsgang omfattede imidlertid også ulemper, såsom kompleksiteten af funktionsbaserede analyseteknikker, der ofte er stive og kræver avanceret viden om billedanalysesoftwarepakker12. Brugen af dyb læring til at analysere MN-data erhvervet af IFC viser, at CNN'er kan bruges til at bryde væk fra begrænsningerne og vanskelighederne ved funktionsbaserede analyser, hvilket giver resultater, der er meget nøjagtige og sammenligner godt med mikroskopi, der scorer14,15. Selv om denne AI-baserede tilgang er lovende, bør der udføres yderligere undersøgelser med et udvidet udvalg af velbeskrevne kemikalier for yderligere at teste og validere teknikkens robusthed. Dette arbejde demonstrerer yderligere fordelene ved IFC i forhold til mere traditionelle metoder, såsom mikroskopi og konventionel flowcytometri, for at forbedre ydeevnen af assays med udfordrende morfologier og strenge scoringskrav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne er ansat af Luminex Corporation, et DiaSorin Company, producenten af ImageStream imaging flow cytometer og Amnis AI-software, der anvendes i dette arbejde.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser - Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler - 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC - ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software - IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software - INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse - Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath - PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer - 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
References
- Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
- OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , OECD Publishing. Paris. (2016).
- Fenech, M.
- Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
- Fenech, M.
- Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).
- Seager, A. L., et al. Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells. Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).
- Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
- Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).
- Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
- Basiji, D. A. Principles of Amnis imaging flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
- Rodrigues, M. A. Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer. Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).
- Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).
- Wills, J. W., et al. Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).
- Rodrigues, M. A., et al. The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).
- Rodrigues, M. A. An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).
- Lovell, D. P., et al. Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hennig, H., et al. An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning. Methods. 112, 201-210 (2017).
