Summary
De micronucleus (MN) assay is een gevestigde test voor het kwantificeren van DNA-schade. Het scoren van de test met behulp van conventionele technieken zoals handmatige microscopie of op functies gebaseerde beeldanalyse is echter bewerkelijk en uitdagend. Dit artikel beschrijft de methodologie om een kunstmatig intelligentiemodel te ontwikkelen om de MN-test te scoren met behulp van imaging flow cytometriegegevens.
Abstract
De micronucleus (MN) assay wordt wereldwijd gebruikt door regelgevende instanties om chemicaliën te evalueren op genetische toxiciteit. De test kan op twee manieren worden uitgevoerd: door MN te scoren in eenmaal verdeelde, cytokinese-geblokkeerde binucleated cellen of volledig gedeelde mononucleated cellen. Historisch gezien is lichtmicroscopie de gouden standaardmethode geweest om de test te scoren, maar het is bewerkelijk en subjectief. Flowcytometrie is de afgelopen jaren gebruikt om de test te scoren, maar wordt beperkt door het onvermogen om belangrijke aspecten van cellulaire beelden visueel te bevestigen. Imaging flow cytometry (IFC) combineert high-throughput beeldopname en geautomatiseerde beeldanalyse en is met succes toegepast om snel beelden te verzamelen van en alle belangrijke gebeurtenissen in de MN-test te scoren. Onlangs is aangetoond dat kunstmatige intelligentie (AI) -methoden op basis van convolutionele neurale netwerken kunnen worden gebruikt om MN-testgegevens te scoren die door IFC zijn verkregen. Dit artikel beschrijft alle stappen om AI-software te gebruiken om een deep learning-model te maken om alle belangrijke gebeurtenissen te scoren en om dit model toe te passen om automatisch aanvullende gegevens te scoren. De resultaten van het AI deep learning-model zijn goed te vergelijken met handmatige microscopie, waardoor een volledig geautomatiseerde score van de MN-test mogelijk is door IFC en AI te combineren.
Introduction
De micronucleus (MN) assay is fundamenteel in de genetische toxicologie om DNA-schade te evalueren bij de ontwikkeling van cosmetica, farmaceutische producten en chemicaliën voor menselijk gebruik 1,2,3,4. Micronuclei worden gevormd uit hele chromosomen of chromosoomfragmenten die na deling niet in de kern worden opgenomen en condenseren in kleine, cirkelvormige lichamen die gescheiden zijn van de kern. MN kan dus worden gebruikt als een eindpunt om DNA-schade te kwantificeren in genotoxiciteitstests1.
De voorkeursmethode voor het kwantificeren van MN is binnen eenmaal verdeelde binucleated cellen (BNC's) door de deling te blokkeren met behulp van Cytochalasine-B (Cyt-B). In deze versie van de test wordt de cytotoxiciteit ook beoordeeld door mononucleated (MONO) en polynucleated (POLY) cellen te scoren. De test kan ook worden uitgevoerd door MN te scoren in niet-geblokkeerde MONO-cellen, wat sneller en gemakkelijker te scoren is, waarbij cytotoxiciteit wordt beoordeeld met behulp van celtellingen vóór en na blootstelling om proliferatie 5,6 te beoordelen.
Fysieke scoring van de test is historisch uitgevoerd door middel van handmatige microscopie, omdat dit visuele bevestiging van alle belangrijke gebeurtenissen mogelijk maakt. Handmatige microscopie is echter uitdagend en subjectief1. Zo zijn geautomatiseerde technieken ontwikkeld, waaronder microscoopglaasscanning en flowcytometrie, elk met hun eigen voordelen en beperkingen. Terwijl diascanmethoden het mogelijk maken om belangrijke gebeurtenissen te visualiseren, moeten dia's worden gemaakt met een optimale celdichtheid, wat moeilijk te bereiken kan zijn. Bovendien ontbreekt het deze techniek vaak aan cytoplasmatische visualisatie, wat de score van MONO- en POLO-cellen 7,8 in gevaar kan brengen. Hoewel flowcytometrie gegevensverzameling met een hoge doorvoer biedt, moeten de cellen worden gelyseerd, waardoor het gebruik van de Cyt-B-vorm van de test niet mogelijk is. Bovendien biedt conventionele flowcytometrie, als een niet-beeldvormende techniek, geen visuele validatie van belangrijke gebeurtenissen 9,10.
Daarom is imaging flow cytometrie (IFC) onderzocht om de MN-test uit te voeren. De ImageStreamX Mk II combineert de snelheid en statistische robuustheid van conventionele flowcytometrie met de hoge resolutie beeldvormingsmogelijkheden van microscopie in één systeem11. Het is aangetoond dat door gebruik te maken van IFC, beelden met hoge resolutie van alle belangrijke gebeurtenissen kunnen worden vastgelegd en automatisch kunnen worden gescoord met behulp van feature-based 12,13 of kunstmatige intelligentie (AI) technieken 14,15. Door IFC te gebruiken om de MN-test uit te voeren, is het automatisch scoren van veel meer cellen in vergelijking met microscopie in een kortere tijd haalbaar.
Dit werk wijkt af van een eerder beschreven beeldanalyseworkflow16 en bespreekt alle stappen die nodig zijn om een Random Forest (RF) en/of convolutioneel neuraal netwerk (CNN) model te ontwikkelen en te trainen met behulp van de Amnis AI-software (hierna "AI-software" genoemd). Alle noodzakelijke stappen worden beschreven, inclusief het invullen van ground truth-gegevens met behulp van AI-ondersteunde tagging-tools, interpretatie van modeltrainingsresultaten en toepassing van het model om aanvullende gegevens te classificeren, waardoor berekening van genotoxiciteit en cytotoxiciteit15 mogelijk is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Data-acquisitie met behulp van imaging flow cytometrie
OPMERKING: Raadpleeg Rodrigues et al.16 met de volgende wijzigingen, waarbij wordt opgemerkt dat de acquisitieregio's die IFC gebruiken mogelijk moeten worden gewijzigd voor optimale beeldvastlegging:
- Voor de niet-Cyt-B-methode voert u een celtelling uit met behulp van een in de handel verkrijgbare cellenteller volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel) op elke cultuur onmiddellijk vóór de kweek en onmiddellijk na de herstelperiode.
- Als u monsters uitvoert op een flowcytometer met één camerabeeld, plaatst u de Brightfield (BF) in kanaal 4. Vervang M01 door M04 en M07 door M01.
OPMERKING: "M" verwijst naar het camerakanaal op de IFC. - Gebruik de 40x vergroting tijdens de acquisitie.
- Gebruik op de grafiek BF-gebied versus BF-hoogte-breedteverhouding tijdens de acquisitie de volgende regiocoördinaten:
X-coördinaten: 100 en 900; Y-coördinaten: 0,7 en 1 (Cyt-B methode)
X-coördinaten: 100 en 600; Y-coördinaten: 0.7 en 1 - Gebruik op het intensiteitsdiagram Hoechst de volgende regiocoördinaten:
X-coördinaten: 55 en 75; Y-coördinaten: 9.5 en 15 (Cyt-B methode)
X-coördinaten: 55 en 75; Y-coördinaten: 13 en 21 (niet-Cyt-B methode) - Om afbeeldingen van apoptotische en necrotische objecten uit de gegevens te verwijderen, start u het IDEAS 6.3-softwarepakket (hierna de "beeldanalysesoftware" genoemd; zie Materiaaltabel).
OPMERKING: De AI-software is ontworpen om te werken met .daf-bestanden die zijn verwerkt met behulp van de nieuwste versie van de beeldanalysesoftware. Zorg ervoor dat de beeldanalysesoftware up-to-date is. - Sla dit werk op als een sjabloonbestand (.ast).
2. .daf-bestanden maken voor alle .rif-bestanden
- De AI-software staat alleen het importeren van .daf-bestanden toe. Maak .daf-bestanden voor alle RIF-bestanden in het experiment via batchverwerking.
- Klik in het menu Extra op Batchgegevensbestanden en klik vervolgens op Batch toevoegen.
- Selecteer in het nieuwe venster Bestanden toevoegen en selecteer de RIF-bestanden die aan de batch moeten worden toegevoegd. Selecteer onder de optie Selecteer een sjabloon of gegevensanalysebestand (.ast, .daf) het AST-bestand dat eerder is gemaakt.
- Wijs indien nodig een batchnaam toe en klik op OK om .daf-bestanden te maken voor alle geladen .rif-bestanden.
3. Een experiment maken in de AI-software
- Raadpleeg het stroomdiagram in figuur 1 dat het proces beschrijft van het maken van een deep learning-model met behulp van de AI-software.
- Start de AI-software en zorg ervoor dat de meest recente versie is geïnstalleerd door op Info in de linkerbenedenhoek van het venster te klikken. Als de meest recente versie niet is geïnstalleerd, neemt u contact met support@luminexcorp.com op om deze te verkrijgen.
- Het standaardscherm in de software is het scherm Nieuw experiment . Gebruik het mappictogram om te kiezen waar u het experiment wilt opslaan en typ een naam voor het experiment (bijvoorbeeld 'MN-model').
- Klik onder Experimenttype op het keuzerondje naast Trein om een trainingsexperiment te starten om te beginnen met het bouwen van het CNN-model. Klik op Volgende.
- Optioneel: als een model eerder is getraind, kan het worden gebruikt als sjabloon voor een nieuw AI-model en kan het worden geselecteerd als sjabloon voor het maken van een nieuw model in het scherm Sjabloonmodel selecteren . Als er geen sjabloonmodel bestaat, slaat u deze stap over door op Volgende te klikken.
- Het volgende scherm is het scherm Nieuw model definiëren . Onder Model wordt de naam die in stap 3.3 aan het model is gegeven, automatisch ingevuld.
- Typ onder Beschrijving een beschrijving voor het model (optioneel) en laat de maximale afbeeldingsgrootte op 150 pixels staan.
- Klik onder Kanalen op BF toevoegen om een brightfield-kanaal aan de lijst toe te voegen. Dubbelklik onder Naam op Brightfield en hernoem dit kanaal naar BF. Klik op FL toevoegen om een fluorescerend kanaal aan de lijst toe te voegen. Dubbelklik onder Naam op Fluorescerend en hernoem dit kanaal naar DNA.
- Klik onder Klassenamen op Toevoegen. Typ in het pop-upvenster Mononucleated en klik op OK. Hiermee wordt de klasse mononucleated toegevoegd aan de lijst met klassenamen. Herhaal dit proces om ervoor te zorgen dat de volgende zes klassen in de lijst worden gedefinieerd:
Mononucleated
Mononucleated met MN
Binucleated
Binucleated met MN
Polynucleaat
Onregelmatige morfologie
Klik op Volgende.
OPMERKING: Deze zes ground truth-modelklassen vertegenwoordigen de belangrijkste gebeurtenissen die moeten worden gescoord, evenals afbeeldingen met een morfologie die afwijkt van de geaccepteerde scorecriteria5.- Optioneel: Indien gewenst kan de analysesjabloon uit 1.7 worden opgenomen om functies uit de beeldanalysesoftware te gebruiken. Als u deze functies in het AI-model wilt opnemen, bladert u naar het AST-bestand en kiest u vervolgens in de kanaalspecifieke vervolgkeuzelijsten de functiesubsets die u wilt opnemen.
- Klik onder Bestanden selecteren op Bestanden toevoegen en blader naar de gewenste bestanden die aan de AI-software moeten worden toegevoegd om de grondwaarheidsgegevens te bouwen. Klik op Volgende.
OPMERKING: Het is belangrijk om meerdere gegevensbestanden toe te voegen (bijv. positieve en negatieve controlegegevens) die een voldoende aantal van alle belangrijke gebeurtenissen bevatten.
- Zoek vervolgens op het scherm Basispopulaties selecteren de niet-apoptotische populatie uit de populatiehiërarchie. Klik met de rechtermuisknop op de niet-apoptotische populatie en selecteer Alle overeenkomende populaties selecteren. Klik op Volgende.
OPMERKING: Het is belangrijk om populaties uit te sluiten die niet geclassificeerd mogen worden (bijv. Kralen, puin, doubletten, enz.) - Dit scherm is het scherm Waarheidspopulaties selecteren .
- Als getagde waarheidspopulaties van de belangrijkste gebeurtenissen niet zijn gemaakt in de beeldanalysesoftware, klik dan op Volgende.
- Als getagde waarheidspopulaties zijn gemaakt in de beeldanalysesoftware, wijst u deze toe aan de juiste modelklasse.
- Om een gelabelde waarheidspopulatie van MONO-cellen met MN toe te wijzen, klikt u op de klasse Mononucleated with MN onder Model Classes aan de linkerkant. Klik vervolgens op de juiste getagde waarheidspopulatie aan de rechterkant die deze gebeurtenissen bevat.
- Als de gelabelde waarheidspopulaties in meer dan één gegevensbestand zijn gemaakt, klikt u met de rechtermuisknop op een van de waarheidspopulaties en selecteert u Alle overeenkomende populaties selecteren om gelabelde populaties uit meerdere bestanden aan de juiste klasse toe te voegen.
- Zodra alle geschikte waarheidspopulaties zijn toegewezen, klikt u op Volgende.
- Kies op het scherm Kanalen selecteren de juiste kanalen voor het experiment. Stel hier BF in op kanaal 1 en Hoechst op kanaal 7. Klik met de rechtermuisknop op een kanaal en selecteer Toepassen op alles. Klik op Volgende.
- Klik ten slotte in het bevestigingsscherm op Experiment maken.
- De AI-software laadt afbeeldingen uit de gegevensbestanden en maakt de modelklassen die zijn gedefinieerd in stap 3.5.3 met de grondwaarheidsbeelden die zijn toegewezen in stap 3.7. Klik op Voltooien.
- Zodra het experiment is gemaakt, worden vijf opties weergegeven:
Experiment: biedt details van het experiment, waaronder geladen gegevensbestanden, gekozen kanalen en gedefinieerde ground truth-modelklassen.
Tagging: lanceert de tagging-tool waarmee gebruikers ground truth-gegevens kunnen invullen.
Training: traint een model op basis van de ground truth data.
Classificeren: maakt gebruik van getrainde modellen om gegevens te classificeren.
Resultaten: geeft resultaten van zowel een trainingsexperiment als een classificatie-experiment.
4. De ground truth-gegevens invullen met behulp van AI-ondersteunde tagging-tools
- Klik op Tagging om de interface van de tagging-tool te starten.
- Klik op de zoomgereedschappen (vergrootglaspictogrammen) om de afbeeldingen bij te snijden voor een eenvoudigere weergave.
- Klik op de schuifbalk om de afbeeldingsgrootte aan te passen om te wijzigen hoeveel afbeeldingen in de galerij worden weergegeven.
- Klik op de optie Weergave-instelling en kies Min-Max, wat het beste contrastbeeld biedt voor het identificeren van alle belangrijke gebeurtenissen.
- Klik op Setup Gallery Display om de kleur van het DNA-beeld te wijzigen in geel of wit, wat de visualisatie van kleine objecten (bijv. MN) zal verbeteren.
- Klik op Cluster om het algoritme uit te voeren om objecten met een vergelijkbare morfologie samen te groeperen. Zodra het clusteren is voltooid, worden de afzonderlijke clusters met het aantal objecten per cluster weergegeven in een lijst onder Onbekende populaties. Selecteer de afzonderlijke clusters om de objecten binnen het cluster weer te geven en wijs deze objecten toe aan de juiste modelklassen.
- Nadat aan elke modelklasse minimaal 25 objecten zijn toegewezen, komt het Predict-algoritme beschikbaar. Klik op Voorspellen.
OPMERKING: Objecten die niet goed in een populatie passen, blijven geclassificeerd als Onbekend. Naarmate er meer objecten aan de waarheidspopulaties worden toegevoegd, verbetert de nauwkeurigheid van de voorspelling. - Ga door met het vullen van de ground truth-modelklassen met de juiste afbeeldingen totdat een voldoende aantal objecten in elke klasse is bereikt.
- Zodra er minimaal 100 objecten aan elke modelklasse zijn toegewezen, klikt u op het tabblad Training boven aan het scherm. Klik op de knop Trein om een model te maken met behulp van de Random Forest- en CNN-algoritmen.
OPMERKING: De AI-software maakt modellen met behulp van zowel de Random Forest- als CNN-algoritmen, de selectievakjes maken het mogelijk om modellen te maken met alleen Random Forest of CNN-algoritmen.
5. Beoordeling van de nauwkeurigheid van het model
- Zodra de modeltraining is voltooid, klikt u op Resultaten bekijken.
- Gebruik het resultatenscherm om de nauwkeurigheid van het model te beoordelen. Gebruik het vervolgkeuzemenu om te schakelen tussen Random Forest en CNN.
OPMERKING: De waarheidspopulaties kunnen worden bijgewerkt en het model kan opnieuw worden getraind of worden gebruikt zoals het is om aanvullende gegevens te classificeren.- Om de waarheidspopulaties bij te werken, klikt u bovenaan op Tagging en volgt u sectie 4.
6. Gegevens classificeren met behulp van het model
- Start de AI-software. Het standaardscherm is het scherm Nieuw experiment . Gebruik het mappictogram om te kiezen waar u het experiment wilt opslaan en typ een naam voor het experiment .
- Klik onder Experimenttype op het keuzerondje naast Classificeren om een classificatie-experiment te starten. Klik op Volgende.
- Klik op het model dat u wilt gebruiken voor classificatie en klik vervolgens op Volgende.
- Klik in het scherm Bestanden selecteren op Bestanden toevoegen en blader naar de bestanden die moeten worden geclassificeerd volgens het CNN-model. Klik op Volgende.
- Klik vervolgens op het scherm Basispopulaties selecteren op het selectievakje naast de niet-apoptotische populatie in een van de geladen bestanden. Klik met de rechtermuisknop op de niet-apoptotische populatie en klik op Selecteer alle overeenkomende populaties om deze populatie te selecteren uit alle geladen bestanden. Klik op Volgende.
- Optioneel: als de te classificeren gegevens waarheidspopulaties bevatten, kunnen ze worden toegewezen aan de juiste modelklassen op het scherm Waarheidspopulaties selecteren. Klik anders op Volgende om deze stap over te slaan.
- Kies in het scherm Kanalen selecteren de optie Kanaal 1 voor brightfield en Kanaal 7 voor de DNA-kleuring. Klik met de rechtermuisknop op een kanaal en klik op Toepassen op iedereen. Klik vervolgens op Volgende.
- Klik ten slotte in het bevestigingsscherm op Experiment maken. De AI-software laadt het geselecteerde model en alle afbeeldingen uit de gekozen gegevensbestanden. Klik op Voltooien.
- Klik op Classificeren om het classificatiescherm te starten. Klik op de knop Classificeren . Hiermee begint het proces van het gebruik van het RF- en CNN-model om aanvullende gegevens te classificeren en alle objecten te identificeren die in de opgegeven modelklassen thuishoren.
OPMERKING: De selectievakjes kunnen worden gebruikt om het RF-model en/of het CNN-model te selecteren. - Zodra de classificatie is voltooid, klikt u op Resultaten bekijken.
- Klik op de knop DAF's bijwerken om het venster DAF's bijwerken met classificatieresultaten weer te geven. Klik op OK om de .daf-bestanden bij te werken.
7. Het genereren van een rapport van de classificatieresultaten
- Klik in het scherm Resultaten op Rapport genereren. Schakel het selectievakje naast Rapport maken voor elke invoer-DAF in als een afzonderlijk rapport voor elke invoer-DAF vereist is. Klik op OK.
- Als u klaar bent, opent u de map waarin de rapportbestanden zijn opgeslagen. In de map bevindt zich een experiment .pdf rapport en een map Resources .
- Open de .pdf om het rapport weer te geven. Het rapport bevat model- en experimentinformatie, de lijst met daf-invoerbestanden, de klassentellingen en klassepercentages in tabel- en histogramindeling en een verwarringsmatrix die de mediane voorspellingskans voor alle daf-invoerbestanden samenvat.
- Open de map Resources en vervolgens de map CNN . In deze map bevinden zich .png bestanden van de klassentelling en percentagebalkdiagrammen, evenals de verwarringsmatrix. Bovendien zijn er .csv bestanden met de klassentellingen en percentages voor elk invoerbestand.
8. Bepaling van MN-frequentie en cytotoxiciteit
- MN-frequentie berekenen
- Niet-Cyt-B-methode: Om de MN-frequentie te bepalen, opent u het class_count.csv bestand uit stap 7.4. Deel voor elk invoerbestand de tellingen in de populatie "Mononucleated with MN" door de tellingen in de "Mononucleated" populatie en vermenigvuldig met 100:
- Cyt-B-methode: Om de MN-frequentie te bepalen, opent u het class_count.csv bestand uit stap 7.4. Deel voor elk invoerbestand de tellingen in de populatie "Binucleated with MN" door de tellingen in de "Binucleated" populatie en vermenigvuldig met 100:
- Niet-Cyt-B-methode: Om de MN-frequentie te bepalen, opent u het class_count.csv bestand uit stap 7.4. Deel voor elk invoerbestand de tellingen in de populatie "Mononucleated with MN" door de tellingen in de "Mononucleated" populatie en vermenigvuldig met 100:
- Cytotoxiciteit berekenen
- Niet Cyt-B methode:
- Bereken met behulp van de initiële celtellingen en de celtellingen na de behandeling eerst de populatieverdubbeling (PD) voor elk monster2:
- Bereken vervolgens de relatieve bevolkingsverdubbeling2:
- Bereken ten slotte de cytotoxiciteit2 voor elk monster:
- Bereken met behulp van de initiële celtellingen en de celtellingen na de behandeling eerst de populatieverdubbeling (PD) voor elk monster2:
- Cyt-B methode:
- Om de Cytokinesis-Block Proliferation Index (CBPI)2 te berekenen, gebruikt u de tellingen in de klassen mononucleated, binucleated en polynucleated voor elk monster uit het class_count.csv bestand:
- Om cytotoxiciteit2 te berekenen, gebruikt u de CBPI uit de controleculturen (C) en blootgestelde culturen (T):
- Om de Cytokinesis-Block Proliferation Index (CBPI)2 te berekenen, gebruikt u de tellingen in de klassen mononucleated, binucleated en polynucleated voor elk monster uit het class_count.csv bestand:
- Niet Cyt-B methode:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de workflow voor het gebruik van de AI-software om een model te maken voor de MN-test. De gebruiker laadt de gewenste .daf-bestanden in de AI-software en wijst vervolgens objecten toe aan de ground truth-modelklassen met behulp van de AI-ondersteunde cluster (figuur 2) en predict (figuur 3) tagging-algoritmen. Zodra alle ground truth-modelklassen zijn gevuld met voldoende objecten, kan het model worden getraind met behulp van de RF- of CNN-algoritmen. Na de training kunnen de prestaties van het model worden beoordeeld met behulp van hulpmiddelen zoals histogrammen voor klassenverdeling, nauwkeurigheidsstatistieken en een interactieve verwarringsmatrix (figuur 4). Vanuit het resultatenscherm in de AI-software kan de gebruiker terugkeren naar het trainingsgedeelte van de workflow om de ground truth-gegevens te verbeteren of, als er voldoende nauwkeurigheid is bereikt, kan de gebruiker het model gebruiken om aanvullende gegevens te classificeren.
Met behulp van zowel de cluster- als de voorspellingsalgoritmen werden 190 segmenten met in totaal 285.000 objecten toegewezen aan de juiste grondwaarheidsklassen totdat alle klassen waren gevuld met tussen de 1.500 en 10.000 afbeeldingen. In totaal werden 31.500 objecten (slechts 10,5% van de initiële geladen objecten) gebruikt bij de training van dit model. Precisie (percentage fout-positieven), recall (percentage fout-negatieven) en F1-score (balans tussen precisie en recall) zijn beschikbaar in het deep learning-softwarepakket om de nauwkeurigheid van het model te kwantificeren. Hier varieerden deze statistieken van 86,0% tot 99,4%, wat wijst op een hoge modelnauwkeurigheid (figuur 4).
Met behulp van Cyt-B lagen de MN-achtergrondfrequenties voor alle controlemonsters tussen 0,43% en 1,69%, in vergelijking met literatuur17. Statistisch significante stijgingen in MN-frequentie, variërend van 2,09% tot 9,50% voor (Mitomycine C) MMC en van 2,99% tot 7,98% voor Etoposide, werden waargenomen in vergelijking met oplosmiddelcontroles en goed vergeleken met handmatige microscopiescores. Bij het onderzoeken van de negatieve controle Mannitol werden geen significante toenames in MN-frequentie waargenomen. Bovendien werd toenemende cytotoxiciteit met de dosis waargenomen voor zowel Etoposide als MMC, waarbij zowel microscopie als AI vergelijkbare trends vertoonden in het dosisbereik. Voor Mannitol werd geen waarneembare toename van cytotoxiciteit gezien (figuur 5).
Bij het niet gebruiken van Cyt-B lagen de MN-achtergrondfrequenties voor alle controlemonsters tussen 0,38% en 1,0%, in overeenstemming met de resultaten gepubliceerd in de literatuur17. Statistisch significante stijgingen in MN-frequentie, variërend van 2,55% tot 7,89% voor MMC en van 2,37% tot 5,13% voor Etoposide, werden waargenomen in vergelijking met oplosmiddelcontroles en goed vergeleken met handmatige microscopiescores. Bij het onderzoeken van de negatieve controle Mannitol werden geen significante toenames in MN-frequentie waargenomen. Verder werd toenemende cytotoxiciteit met de dosis waargenomen voor zowel Etoposide als MMC, waarbij zowel microscopie als AI vergelijkbare trends vertoonden in het dosisbereik. Voor Mannitol werd geen waarneembare toename van cytotoxiciteit gezien (figuur 5).
Bij het scoren door microscopie, van elke cultuur, werden 1.000 binucleated cellen gescoord om MN-frequentie te beoordelen en nog eens 500 mononucleated, binucleated of polynucleated cellen werden gescoord om cytotoxiciteit te bepalen in de Cyt-B-versie van de assay. In de niet-Cyt-B-versie van de test werden 1.000 mononucleaire cellen gescoord om de MN-frequentie te beoordelen. Door IFC werden gemiddeld 7.733 binucleated cellen, 6.493 mononucleated cellen en 2.649 polynucleated cellen per cultuur gescoord om cytotoxiciteit te bepalen. MN-frequentie werd bepaald vanuit de binucleated celpopulatie voor de Cyt-B-versie van de assay. Voor de niet-Cyt-B-versie van de test werden gemiddeld 27.866 mononucleaire cellen beoordeeld op de aanwezigheid van MN (figuur 5).
Figuur 1: AI-softwareworkflow. De gebruiker begint met het selecteren van de .daf-bestanden die in de AI-software moeten worden geladen. Zodra de gegevens zijn geladen, begint de gebruiker objecten toe te wijzen aan de ground truth-modelklassen via de gebruikersinterface. Om te helpen bij de grondwaarheidspopulatie, kunnen de cluster- en voorspellingsalgoritmen worden gebruikt om beelden met een vergelijkbare morfologie te identificeren. Zodra er voldoende objecten aan elke modelklasse zijn toegevoegd, kan het model worden getraind. Na de training kan de gebruiker de prestaties van het model beoordelen met behulp van de meegeleverde tools, waaronder een interactieve verwarringsmatrix. Ten slotte kan de gebruiker terugkeren naar het trainingsgedeelte van de workflow om de ground truth-gegevens te verbeteren of, als er voldoende nauwkeurigheid is bereikt, kan de gebruiker uit de workflowlus voor training / tagging stappen en het model gebruiken om aanvullende gegevens te classificeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Clusteralgoritme. Het clusteralgoritme kan op elk gewenst moment worden uitgevoerd op een segment van 1.500 objecten die willekeurig zijn geselecteerd uit de invoergegevens. Dit algoritme groepeert vergelijkbare objecten binnen een segment volgens de morfologie van zowel niet-geclassificeerde objecten als objecten die zijn toegewezen aan de ground truth-modelklassen. Voorbeeldafbeeldingen tonen binucleated, mononucleated en multinucleated cellen, en cellen met onregelmatige morfologie. Clusters met mononucleated cellen vallen aan de ene kant van de objectkaart, terwijl clusters met multinucleated cellen zich aan de andere kant van de objectmap bevinden. Binucleated celclusters vallen ergens tussen mono- en multinucleated celclusters. Ten slotte vallen clusters met onregelmatige morfologie in een heel ander gebied van de objectkaart. De gebruikersinterface maakt het mogelijk om hele clusters toe te voegen, of objecten binnen clusters te selecteren, aan de ground truth-modelklassen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorspel algoritme. Het voorspellingsalgoritme vereist minimaal 25 objecten in elke ground truth-modelklasse en probeert de meest geschikte modelklasse te voorspellen om niet-geclassificeerde objecten binnen een segment toe te wijzen. Het voorspellingsalgoritme is robuuster in vergelijking met het clusteralgoritme met betrekking tot de identificatie van subtiele morfologieën in afbeeldingen (d.w.z. mononucleaire cellen met MN [geel] versus mononucleaire cellen zonder MN [rood]). Objecten met deze overeenkomsten worden dicht bij elkaar op de objectkaart geplaatst; De gebruiker kan echter eenvoudig de afbeeldingen in elke voorspelde klasse inspecteren en objecten toewijzen aan de juiste modelklasse. Objecten waarvoor het algoritme geen klasse kan voorspellen, blijven als 'onbekend'. Het voorspellingsalgoritme stelt gebruikers in staat om snel de ground truth-modelklassen te vullen, vooral in het geval van gebeurtenissen die als zeldzaam en uitdagend worden beschouwd om te vinden in de invoergegevens, zoals micronucleaire cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Verwarringsmatrix met modelresultaten. Het resultatenscherm van de AI-software biedt de gebruiker drie verschillende tools om de nauwkeurigheid van het model te beoordelen. (A) Met de histogrammen van de klassenverdeling kan de gebruiker op de bakken van het histogram klikken om de relatie te beoordelen tussen objecten in de waarheidspopulaties en objecten waarvan werd voorspeld dat ze tot die modelklasse behoorden. Over het algemeen geldt dat hoe dichter de procentuele waarden tussen de waarheid en voorspelde populaties bij elkaar liggen voor een bepaalde modelklasse, hoe nauwkeuriger het model. (B) Met de tabel met nauwkeurigheidsstatistieken kan de gebruiker drie veelgebruikte machine learning-statistieken beoordelen om de nauwkeurigheid van het model te beoordelen: precisie, recall en F1. Over het algemeen geldt dat hoe dichter deze statistieken bij 100% liggen, hoe nauwkeuriger het model is bij het identificeren van gebeurtenissen in de modelklassen. Ten slotte geeft (C) de interactieve verwarringsmatrix een indicatie van waar het model gebeurtenissen verkeerd classificeert. De on-axis entries (groen) geven objecten uit de ground truth-gegevens aan die tijdens de training correct zijn geclassificeerd. Off-axis vermeldingen (oranje gearceerd) geven objecten uit de ground truth-gegevens aan die onjuist zijn geclassificeerd. Verschillende voorbeelden van verkeerd geclassificeerde objecten worden getoond, waaronder (i) een mononucleaire cel geclassificeerd als een mononucleaire cel met MN, (ii) een binucleated cel geclassificeerd als een binucleated cel met MN, (iii) een mononucleated cel geclassificeerd als een cel met onregelmatige morfologie, (iv) een binucleated cel met MN geclassificeerd als een cel met onregelmatige morfologie, en (v) een binucleated cel met een MN geclassificeerd als een binucleated cel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Genotoxiciteit en cytotoxiciteit resultaten. Genotoxiciteit gemeten door het percentage MN door microscopie (clear bars) en AI (gestippelde staven) na een blootstelling van 3 uur en 24 h herstel voor Mannitol, Etoposide en MMC met behulp van zowel de (A-C) Cyt-B als (D-F) niet-Cyt-B methoden. Statistisch significante toenames in MN-frequentie in vergelijking met controles worden aangegeven met sterretjes (*p < 0,001, Fisher's Exact Test). Foutbalken vertegenwoordigen de standaardafwijking van het gemiddelde van drie replicaatculturen op elk dosispunt, behalve voor MMC door microscopie, waar alleen dubbele culturen werden gescoord. Dit cijfer is aangepast van Rodrigues et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier gepresenteerde werk beschrijft het gebruik van deep learning-algoritmen om de scoring van de MN-test te automatiseren. Verschillende recente publicaties hebben aangetoond dat intuïtieve, interactieve tools het mogelijk maken om deep learning-modellen te maken om beeldgegevens te analyseren zonder de noodzaak van diepgaande computationele kennis18,19. Het protocol dat in dit werk wordt beschreven met behulp van een softwarepakket met gebruikersinterface, is ontworpen om goed te werken met zeer grote gegevensbestanden en het gemakkelijk maken van deep learning-modellen mogelijk te maken. Alle noodzakelijke stappen voor het maken en trainen van RF- en CNN-modellen in het AI-softwarepakket worden besproken, waardoor zeer nauwkeurige identificatie en kwantificering van alle belangrijke gebeurtenissen in zowel de Cyt-B- als niet-Cyt-B-versies van de test mogelijk is. Ten slotte worden de stappen beschreven om deze deep learning-modellen te gebruiken om aanvullende gegevens te classificeren en chemische cytotoxiciteit en MN-frequentie te evalueren.
De AI-software die in dit werk wordt gebruikt, is gemaakt met een handige gebruikersinterface en gebouwd om gemakkelijk te werken met grote datasets die zijn gegenereerd uit IFC-systemen. Training, evaluatie en verbetering van deep learning-modellen volgen een eenvoudige iteratieve aanpak (figuur 1) en de toepassing van de getrainde modellen om aanvullende gegevens te classificeren kan in slechts een paar stappen worden bereikt. De software bevat onderscheidende cluster (Figuur 2) en predict (Figuur 3) algoritmen die een snelle toewijzing van objecten in geschikte ground truth modelklassen mogelijk maken. Het protocol in dit artikel laat zien hoe een CNN-model, geconstrueerd en getraind met behulp van AI-software, in staat is om alle belangrijke gebeurtenissen in de MN-test robuust te identificeren; Het levert resultaten op die goed te vergelijken zijn met traditionele microscopie, waardoor de vereiste voor beeldanalyse en computercoderingservaring wordt geëlimineerd. Bovendien maken de interactieve modelresultaten (figuur 4) het mogelijk om specifieke gebeurtenissen te onderzoeken die het model verkeerd classificeert. Het iteratieve proces maakt het mogelijk om deze verkeerd geclassificeerde gebeurtenissen toe te wijzen aan de juiste modelklassen, zodat het model opnieuw kan worden getraind om de nauwkeurigheid te verbeteren.
De hier gepresenteerde resultaten (figuur 5) tonen de evaluatie van Mannitol, Etoposide en MMC met behulp van microscopie en een CNN-model gemaakt in de AI-software. Met behulp van beide versies van de MN-test, geëvalueerd met een enkel AI-model, zijn toenames in cytotoxiciteit consistent met toenemende doses voor zowel MMC als Etoposide, terwijl blootstelling aan Mannitol geen toename van cytotoxiciteit oplevert, zoals verwacht. Voor genotoxiciteitsevaluatie werden significante (Fisher's Exact Test, eenzijdige) verhogingen van de MN-frequentie aangetoond met MMC en Etoposide, maar niet met Mannitol. De resultaten voor zowel microscopie als het AI-model vergeleken goed over de dosisbereiken voor elke geteste chemische stof.
In verschillende eerdere publicaties is aangetoond dat een op IFC gebaseerde MN-test kan worden uitgevoerd met eenvoudige en eenvoudige monstervoorbereidingsstappen, samen met een op afbeeldingen gebaseerde analyse met behulp van maskers (interessegebieden die pixels in een afbeelding markeren) en functies die met behulp van deze maskers zijn berekend om automatisch alle belangrijke gebeurtenissen te scoren12,13,16 . Deze op IFC gebaseerde test maakt gebruik van de sterke punten van IFC, waaronder high-throughput beeldvastlegging, vereenvoudigde monsterverwerking met eenvoudige DNA-kleurstoffen en geautomatiseerde differentiatie van cellulaire beelden met morfologie die overeenkomt met gepubliceerde MN-assayscorecriteria. Deze workflow bevatte echter ook nadelen, zoals de complexiteit van op functies gebaseerde analysetechnieken die vaak rigide zijn en geavanceerde kennis van beeldanalysesoftwarepakketten vereisen12. Het gebruik van deep learning om MN-gegevens te analyseren die door IFC zijn verkregen, toont aan dat CNN's kunnen worden gebruikt om de beperkingen en moeilijkheden van op functies gebaseerde analyses te doorbreken, wat resultaten oplevert die zeer nauwkeurig zijn en goed te vergelijken zijn met microscopiescoresvan 14,15. Hoewel deze op AI gebaseerde aanpak veelbelovend is, moeten verdere studies met een uitgebreide selectie van goed beschreven chemicaliën worden uitgevoerd om de robuustheid van de techniek verder te testen en te valideren. Dit werk toont verder de voordelen van IFC ten opzichte van meer traditionele methoden, zoals microscopie en conventionele flowcytometrie, om de prestaties van assays te verbeteren met uitdagende morfologieën en strenge scoringsvereisten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs zijn in dienst van Luminex Corporation, een DiaSorin Company, de fabrikant van de ImageStream imaging flow cytometer en de Amnis AI-software die in dit werk wordt gebruikt.
Acknowledgments
Geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser - Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler - 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC - ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software - IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software - INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse - Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath - PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer - 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
References
- Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
- OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , OECD Publishing. Paris. (2016).
- Fenech, M.
- Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
- Fenech, M.
- Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).
- Seager, A. L., et al. Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells. Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).
- Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
- Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).
- Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
- Basiji, D. A. Principles of Amnis imaging flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
- Rodrigues, M. A. Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer. Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).
- Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).
- Wills, J. W., et al. Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).
- Rodrigues, M. A., et al. The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).
- Rodrigues, M. A. An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).
- Lovell, D. P., et al. Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hennig, H., et al. An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning. Methods. 112, 201-210 (2017).
