Summary
Mikronukleusanalysen (MN) er en veletablert test for å kvantifisere DNA-skade. Å score analysen ved hjelp av konvensjonelle teknikker som manuell mikroskopi eller funksjonsbasert bildeanalyse er imidlertid arbeidskrevende og utfordrende. Denne artikkelen beskriver metodikken for å utvikle en kunstig intelligensmodell for å skåre MN-analysen ved hjelp av avbildningsflowcytometridata.
Abstract
Mikronukleusanalysen (MN) brukes over hele verden av reguleringsorganer for å evaluere kjemikalier for genetisk toksisitet. Analysen kan utføres på to måter: ved å score MN i en gang delt, cytokinesisblokkerte binukleerte celler eller fullt delte mononukleerte celler. Historisk sett har lysmikroskopi vært gullstandardmetoden for å score analysen, men den er arbeidskrevende og subjektiv. Flowcytometri har blitt brukt de siste årene for å skåre analysen, men er begrenset av manglende evne til visuelt å bekrefte viktige aspekter ved cellulære bilder. Imaging flow cytometry (IFC) kombinerer bildeopptak med høy gjennomstrømning og automatisert bildeanalyse, og har blitt brukt til raskt å skaffe bilder av og score alle viktige hendelser i MN-analysen. Nylig har det blitt demonstrert at kunstig intelligens (AI) metoder basert på konvolusjonelle nevrale nettverk kan brukes til å score MN-analysedata innhentet av IFC. Denne rapporten beskriver alle trinnene for å bruke AI-programvare til å opprette en dyplæringsmodell for å score alle viktige hendelser og bruke denne modellen til å automatisk score tilleggsdata. Resultatene fra AI-dyplæringsmodellen kan sammenlignes godt med manuell mikroskopi, og muliggjør derfor helautomatisk skåring av MN-analysen ved å kombinere IFC og AI.
Introduction
Mikronukleusanalysen (MN) er grunnleggende i genetisk toksikologi for å evaluere DNA-skade i utviklingen av kosmetikk, legemidler og kjemikalier til menneskelig bruk 1,2,3,4. Mikrokjerner er dannet av hele kromosomer eller kromosomfragmenter som ikke innlemmes i kjernen etter deling og kondenserer til små, sirkulære legemer atskilt fra kjernen. Dermed kan MN brukes som et endepunkt for å kvantifisere DNA-skade i gentoksisitetstesting1.
Den foretrukne metoden for å kvantifisere MN er innenfor en gang delte binucleated celler (BNCs) ved å blokkere deling ved hjelp av Cytochalasin-B (Cyt-B). I denne versjonen av analysen vurderes cytotoksisitet også ved å skåre mononukleerte (MONO) og polynukleerte (POLY) celler. Analysen kan også utføres ved å score MN i ikke-blokkerte MONO-celler, som er raskere og lettere å score, med cytotoksisitet som vurderes ved bruk av celletall før og etter eksponering for å vurdere spredning 5,6.
Fysisk skåring av analysen har historisk blitt utført ved manuell mikroskopi, da dette muliggjør visuell bekreftelse av alle viktige hendelser. Manuell mikroskopi er imidlertid utfordrende og subjektivt1. Dermed har automatiserte teknikker blitt utviklet, inkludert mikroskoplysbildeskanning og flowcytometri, hver med sine egne fordeler og begrensninger. Mens lysbildeskanningsmetoder gjør det mulig å visualisere viktige hendelser, må lysbilder opprettes med optimal celletetthet, noe som kan være vanskelig å oppnå. I tillegg mangler denne teknikken ofte cytoplasmatisk visualisering, noe som kan kompromittere poengsummen til MONO- og POLY-celler 7,8. Mens flowcytometri gir høy gjennomstrømningsdatafangst, må cellene lyseres, og dermed ikke tillate bruk av Cyt-B-formen av analysen. I tillegg, som en ikke-avbildningsteknikk, gir konvensjonell flowcytometri ikke visuell validering av viktige hendelser 9,10.
Derfor har bildeblødningscytometri (IFC) blitt undersøkt for å utføre MN-analysen. ImageStreamX Mk II kombinerer hastigheten og den statistiske robustheten til konvensjonell flowcytometri med de høyoppløselige bildeegenskapene til mikroskopi i ett enkelt system11. Det har vist seg at ved å bruke IFC kan høyoppløselige bilder av alle viktige hendelser tas og automatisk scores ved hjelp av funksjonsbaserte12,13 eller kunstig intelligens (AI) teknikker14,15. Ved å bruke IFC til å utføre MN-analysen, er automatisk scoring av mange flere celler sammenlignet med mikroskopi på kortere tid oppnåelig.
Dette arbeidet avviker fra en tidligere beskrevet arbeidsflyt for bildeanalyse16 og diskuterer alle trinnene som kreves for å utvikle og trene en Random Forest (RF) og/eller konvolusjonell nevral nettverksmodell (CNN) ved hjelp av Amnis AI-programvaren (heretter referert til som "AI-programvare"). Alle nødvendige trinn er beskrevet, inkludert utfylling av sannhetsdata ved hjelp av AI-assisterte merkingsverktøy, tolkning av modellopplæringsresultater og anvendelse av modellen for å klassifisere tilleggsdata, som tillater beregning av gentoksisitet og cytotoksisitet15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Datainnsamling ved hjelp av avbildningsflowcytometri
MERK: Se Rodrigues et al.16 med følgende modifikasjoner, og merk at oppkjøpsregionene som bruker IFC kanskje må endres for optimal bildeopptak:
- For ikke-Cyt-B-metoden, utfør en celletelling ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig celleteller i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse) på hver kultur umiddelbart før dyrkning og umiddelbart etter restitusjonsperioden.
- Hvis du kjører prøver på et enkelt bildebehandlingscytometer for bildebehandling, plasserer du Brightfield (BF) i kanal 4. Erstatt M01 med M04 og M07 med M01.
MERK: "M" refererer til kamerakanalen på IFC. - Bruk 40x forstørrelse under anskaffelsen.
- På plottet BF-området kontra BF-størrelsesforholdet under anskaffelsen bruker du følgende områdekoordinater:
X-koordinater: 100 og 900; Y-koordinater: 0,7 og 1 (Cyt-B-metoden)
X-koordinater: 100 og 600; Y-koordinater: 0,7 og 1 - På Hoechst-intensitetsplottet bruker du følgende områdekoordinater:
X-koordinater: 55 og 75; Y-koordinater: 9,5 og 15 (Cyt-B-metoden)
X-koordinater: 55 og 75; Y-koordinater: 13 og 21 (ikke-Cyt-B-metode) - Hvis du vil fjerne bilder av apoptotiske og nekrotiske objekter fra dataene, starter du programvarepakken IDEAS 6.3 (heretter kalt "bildeanalyseprogramvaren"; se Materialfortegnelse).
MERK: AI-programvaren er designet for å fungere med .daf-filer som er behandlet ved hjelp av den nyeste versjonen av bildeanalyseprogramvaren. Forsikre deg om at bildeanalyseprogramvaren er oppdatert. - Lagre dette arbeidet som en malfil (AST).
2. Opprette .daf-filer for alle .rif-filer
- AI-programvaren tillater bare import av .daf-filer. Opprett DAF-filer for alle RIF-filer i eksperimentet ved hjelp av gruppebehandling.
- Under Verktøy-menyen klikker du på Batch Data Files og klikker deretter på Add Batch.
- I det nye vinduet velger du Legg til filer og velger .rif-filene som skal legges til i batchen. Under alternativet Velg en mal eller dataanalysefil (ASST, DAF) velger du AST-filen som ble opprettet tidligere.
- Tilordne et batchnavn om nødvendig, og klikk på OK for å opprette .daf-filer for alle lastede .rif-filer.
3. Opprette et eksperiment i AI-programvaren
- Se flytskjemaet i figur 1 som beskriver prosessen med å lage en dyplæringsmodell ved hjelp av AI-programvaren.
- Start AI-programvaren og sørg for at den nyeste versjonen er installert ved å klikke på Om nederst til venstre i vinduet. Hvis den nyeste versjonen ikke er installert, kontakter du support@luminexcorp.com for å få den.
- Standardskjermbildet i programvaren er skjermbildet Nytt eksperiment . Bruk mappeikonet til å velge hvor eksperimentet skal lagres, og skriv inn et navn på eksperimentet (f.eks.
- Under Eksperimenttype klikker du alternativknappen ved siden av Tren for å starte et opplæringseksperiment for å begynne å bygge CNN-modellen. Klikk på Neste.
- Valgfritt: Hvis en modell har blitt opplært tidligere, kan den brukes som en mal for en ny AI-modell, og kan velges som en mal for oppretting av en ny modell fra skjermbildet Velg malmodell . Hvis det ikke finnes noen malmodell, hopper du over dette trinnet ved å klikke Neste.
- Det neste skjermbildet er skjermbildet Definer ny modell . Under Modell fylles navnet som ble gitt til modellen i trinn 3.3 automatisk ut.
- Skriv inn en beskrivelse for modellen (valgfritt) under Beskrivelse, og la den maksimale bildestørrelsen være 150 bildepunkter.
- Under Kanaler klikker du på Legg til BF for å legge til en lysfeltkanal i listen. Under Navn, dobbeltklikk på Brightfield og gi nytt navn til denne kanalen til BF. Klikk på Legg til FL for å legge til en fluorescerende kanal i listen. Under Navn, dobbeltklikk på Fluorescerende og gi nytt navn til denne kanalen til DNA.
- Under Klassenavn klikker du på Legg til. I popup-vinduet skriver du inn Mononucleated og klikker på OK. Dette legger til den mononukleerte klassen i listen over klassenavn. Gjenta denne prosessen for å sikre at følgende seks klasser er definert i listen:
Enkjernet
Mononukleert med MN
Binucleated
Binucleated med MN
Polynukleert
Uregelmessig morfologi
Klikk på Neste.
MERK: Disse seks grunnsannhetsmodellklassene vil representere de viktigste hendelsene som skal scores, samt bilder med morfologi som avviker fra de aksepterte poengkriteriene5.- Valgfritt: Om ønskelig kan analysemalen fra 1.7 inkluderes for å bruke funksjoner fra bildeanalyseprogramvaren. Hvis du vil inkludere disse funksjonene i AI-modellen, blar du etter AST-filen, og deretter velger du funksjonsdelsettene du vil inkludere, fra de kanalspesifikke rullegardinlistene.
- Under Velg filer klikker du på Legg til filer og blar etter de ønskede filene som skal legges til AI-programvaren for å bygge grunnsannhetsdataene. Klikk på Neste.
MERK: Det er viktig å legge til flere datafiler (f.eks. positive og negative kontrolldata) som inneholder et tilstrekkelig antall av alle viktige hendelser.
- Deretter, på skjermbildet Velg basispopulasjoner , finner du den ikke-apoptotiske populasjonen fra populasjonshierarkiet. Høyreklikk på den ikke-apoptotiske populasjonen og velg Velg alle samsvarende populasjoner. Klikk på Neste.
MERK: Det er viktig å ekskludere populasjoner som ikke skal klassifiseres (f.eks. perler, rusk, dubletter osv.) - Dette skjermbildet er skjermbildet Select Truth Populations .
- Hvis taggede sannhetspopulasjoner av nøkkelhendelsene ikke er opprettet i bildeanalyseprogramvaren, klikker du på Neste.
- Hvis taggede sannhetspopulasjoner er opprettet i bildeanalyseprogramvaren, tilordner du dem til riktig modellklasse.
- For å tilordne en merket sannhetspopulasjon av MONO-celler med MN, klikk på klassen Mononukleert med MN under Modellklasser til venstre. Klikk deretter på den aktuelle merkede sannhetspopulasjonen til høyre som inneholder disse hendelsene.
- Hvis de merkede sannhetspopulasjonene er opprettet i mer enn én datafil, høyreklikker du på en av sannhetspopulasjonene og velger Velg alle samsvarende populasjoner for å legge til merkede populasjoner fra flere filer i riktig klasse.
- Når alle passende sannhetspopulasjoner er tildelt, klikker du på Neste.
- På Velg kanaler-skjermen velger du de aktuelle kanalene for eksperimentet. Her setter du BF til kanal 1 og Hoechst til kanal 7. Høyreklikk på en kanal og velg Bruk på alle. Klikk på Neste.
- Til slutt, på bekreftelsesskjermen , klikker du på Opprett eksperiment.
- AI-programvaren laster bilder fra datafilene og oppretter modellklassene definert i trinn 3.5.3 med grunnsannhetsbildene som ble tildelt i trinn 3.7. Klikk på Fullfør.
- Når eksperimentet er opprettet, presenteres fem alternativer:
Eksperiment: gir detaljer om eksperimentet, inkludert datafiler som er lastet inn, valgte kanaler og definerte grunnsannhetsmodellklasser.
Tagging: starter merkingsverktøyet der brukere kan fylle ut sannhetsdata fra bakken.
Opplæring: trener en modell basert på sannhetsdata fra bakken.
Klassifisere: bruker trente modeller for å klassifisere data.
Resultater: gir resultater fra både et treningseksperiment og et klassifiseringseksperiment.
4. Fylle ut sannhetsdataene på bakken ved hjelp av AI-assisterte taggingsverktøy
- Klikk på Tagging for å starte grensesnittet for merkingsverktøyet.
- Klikk på zoomverktøyene (forstørrelsesglassikoner) for å beskjære bildene for enklere visning.
- Klikk på glidebryteren for å justere bildestørrelsen for å endre hvor mange bilder som vises i galleriet.
- Klikk på alternativet Skjerminnstilling , og velg Min-Max, som gir det beste kontrastbildet for å identifisere alle viktige hendelser.
- Klikk på Setup Gallery Display for å endre fargen på DNA-bildet til gult eller hvitt, noe som vil forbedre visualiseringen av små objekter (f.eks. MN).
- Klikk på Cluster for å kjøre algoritmen for å gruppere objekter med lignende morfologi sammen. Når klyngingen er fullført, vises de individuelle klyngene med antall objekter per klynge i en liste under Ukjente populasjoner. Velg de individuelle klyngene for å vise objektene i klyngen og tilordne disse objektene til de aktuelle modellklassene.
- Når minst 25 objekter er tilordnet hver modellklasse, blir Predict-algoritmen tilgjengelig. Klikk på Forutsi.
MERK: Objekter som ikke passer godt inn i en populasjon, forblir klassifisert som Ukjent. Etter hvert som flere objekter legges til sannhetspopulasjonene, forbedres prediksjonsnøyaktigheten. - Fortsett å fylle klassene for grunnsannhetsmodeller med passende bilder til et tilstrekkelig antall objekter i hver klasse er nådd.
- Når minst 100 objekter er tildelt hver modellklasse, klikker du på kategorien Opplæring øverst på skjermen. Klikk på Train-knappen for å lage en modell ved hjelp av algoritmene Random Forest og CNN.
MERK: AI-programvaren lager modeller ved hjelp av både Random Forest- og CNN-algoritmer, avmerkingsboksene tillater kun opprettelse av modeller ved hjelp av Random Forest of CNN-algoritmer.
5. Vurdering av modellens nøyaktighet
- Når modellopplæringen er fullført, klikker du på Vis resultater.
- Bruk resultatskjermen til å vurdere modellens nøyaktighet. Bruk rullegardinmenyen til å bytte mellom Random Forest og CNN.
MERK: Sannhetspopulasjonene kan oppdateres, og modellen kan omskoleres eller brukes som den er for å klassifisere tilleggsdata.- For å oppdatere sannhetspopulasjonene, klikk på Tagging øverst og følg seksjon 4.
6. Klassifisering av data ved hjelp av modellen
- Start AI-programvaren. Standardskjermen er skjermbildet Nytt eksperiment . Bruk mappeikonet til å velge hvor eksperimentet skal lagres, og skriv inn et navn på eksperimentet.
- Under Eksperimenttype klikker du alternativknappen ved siden av Klassifiser for å starte et klassifiseringseksperiment. Klikk på Neste.
- Klikk på modellen som skal brukes til klassifisering, og klikk deretter på Neste.
- På skjermbildet Velg filer klikker du på Legg til filer og blar etter filene som skal klassifiseres av CNN-modellen. Klikk på Neste.
- Deretter, på skjermbildet Velg basispopulasjoner , klikker du på avkrysningsruten ved siden av den ikke-apoptotiske populasjonen i en av de lastede filene. Høyreklikk på den ikke-apoptotiske populasjonen og klikk på Velg alle samsvarende populasjoner for å velge denne populasjonen fra alle lastede filer. Klikk på Neste.
- Valgfritt: Hvis dataene som skal klassifiseres inneholder sannhetspopulasjoner, kan de tilordnes de aktuelle modellklassene på skjermbildet Velg sannhetspopulasjoner. Ellers klikker du Neste for å hoppe over dette trinnet.
- På Select Channels-skjermen velger du Channel 1 for brightfield og Channel 7 for DNA-flekken. Høyreklikk på en kanal og klikk på Bruk på alle. Klikk deretter på Neste.
- Til slutt, på bekreftelsesskjermen , klikker du på Opprett eksperiment. AI-programvaren laster den valgte modellen og alle bilder fra de valgte datafilene. Klikk på Fullfør.
- Klikk på Klassifiser for å starte klassifiseringsskjermen. Klikk på Klassifisere-knappen . Dette begynner prosessen med å bruke RF- og CNN-modellen til å klassifisere tilleggsdata og identifisere alle objekter som hører til i de angitte modellklassene.
MERK: Avmerkingsboksene kan brukes til å velge RF-modell og / eller CNN-modellen. - Når klassifiseringen er fullført, klikker du på Vis resultater.
- Klikk på Oppdater DAF-er for å vise vinduet Oppdater DAF-er med klassifiseringsresultater. Klikk på OK for å oppdatere .daf-filene.
7. Generere en rapport om klassifiseringsresultatene
- På skjermbildet Resultater klikker du på Generer rapport. Merk av i avmerkingsboksen ved siden av Opprett rapport for hver inndata-DAF hvis det kreves en individuell rapport for hver inndata-daf. Klikk på OK.
- Når du er ferdig, åpner du mappen der rapportfilene er lagret. I mappen er det et eksperiment .pdf rapport og en ressursmappe .
- Åpne .pdf for å vise rapporten. Rapporten inneholder modell- og eksperimentinformasjon, listen over inndata-DAF-filer, klasseantall og klasseprosenter i tabell- og histogramformat, og en forvirringsmatrise som oppsummerer median prediksjonssannsynlighet på tvers av alle inndata-DAF-filer.
- Åpne Ressurser-mappen og deretter CNN-mappen . Innenfor denne mappen er .png filer av klassen teller og prosentandel søylediagrammer, samt forvirring matrise. I tillegg er det .csv filer som inneholder klasseantall og prosenter for hver inndatafil.
8. Bestemmelse av MN-frekvens og cytotoksisitet
- Beregning av MN-frekvens
- Ikke-Cyt-B-metode: For å bestemme MN-frekvens, åpne class_count.csv-filen fra trinn 7.4. For hver inndatafil, del tellingene i populasjonen "Mononukleert med MN" med tellingene i populasjonen "Mononukleert" og multipliser med 100:
- Cyt-B-metode: For å bestemme MN-frekvens, åpne class_count.csv-filen fra trinn 7.4. For hver inndatafil, del tellingene i populasjonen "Binucleated with MN" med tellingene i "Binucleated" populasjonen og multipliser med 100:
- Ikke-Cyt-B-metode: For å bestemme MN-frekvens, åpne class_count.csv-filen fra trinn 7.4. For hver inndatafil, del tellingene i populasjonen "Mononukleert med MN" med tellingene i populasjonen "Mononukleert" og multipliser med 100:
- Beregning av cytotoksisitet
- Ikke Cyt-B-metoden:
- Ved å bruke de første celletellingene og celleantallet etter behandling, beregner du først populasjonsdoblingen (PD) for hver prøve2:
- Deretter beregner du den relative befolkningsdoblingen2:
- Til slutt beregner du cytotoksisiteten2 for hver prøve:
- Ved å bruke de første celletellingene og celleantallet etter behandling, beregner du først populasjonsdoblingen (PD) for hver prøve2:
- Cyt-B-metoden:
- For å beregne Cytokinesis-Block Proliferation Index (CBPI)2, bruk tellingene i mononukleerte, binukleerte og polynukleerte klasser for hver prøve fra class_count.csv-filen :
- For å beregne cytotoksisitet2, bruk CBPI fra kontrollkulturer (C) og eksponerte kulturer (T):
- For å beregne Cytokinesis-Block Proliferation Index (CBPI)2, bruk tellingene i mononukleerte, binukleerte og polynukleerte klasser for hver prøve fra class_count.csv-filen :
- Ikke Cyt-B-metoden:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser arbeidsflyten for bruk av AI-programvaren til å lage en modell for MN-analysen. Brukeren laster de ønskede .daf-filene inn i AI-programvaren, og tilordner deretter objekter til enhetssannhetsmodellklassene ved hjelp av AI-assistert klynge (figur 2) og forutsi (figur 3) merkingsalgoritmer. Når alle bakkesannhetsmodellklasser er fylt med tilstrekkelige objekter, kan modellen trenes ved hjelp av RF- eller CNN-algoritmer. Etter opplæring kan modellens ytelse vurderes ved hjelp av verktøy som klassefordelingshistogrammer, nøyaktighetsstatistikk og en interaktiv forvirringsmatrise (figur 4). Fra resultatskjermen i AI-programvaren kan brukeren enten gå tilbake til opplæringsdelen av arbeidsflyten for å forbedre bakkesannhetsdataene, eller hvis tilstrekkelig nøyaktighet er oppnådd, kan brukeren bruke modellen til å klassifisere tilleggsdata.
Ved hjelp av både klynge- og prediksjonsalgoritmer ble 190 segmenter med totalt 285 000 objekter tildelt de riktige grunnsannhetsklassene til alle klasser var befolket med mellom 1 500 og 10 000 bilder. Totalt ble 31 500 objekter (kun 10, 5% av de opprinnelige objektene lastet) brukt i opplæringen av denne modellen. Presisjon (prosentandel falske positiver), tilbakekalling (prosentandel falske negativer) og F1-poengsum (balanse mellom presisjon og tilbakekalling) er tilgjengelig i dyplæringsprogramvarepakken for å kvantifisere modellens nøyaktighet. Her varierte denne statistikken fra 86,0 % til 99,4 %, noe som indikerer høy modellnøyaktighet (figur 4).
Ved bruk av Cyt-B var bakgrunns MN-frekvenser for alle kontrollprøver mellom 0,43 % og 1,69 %, sammenlignet godt med litteratur17. Statistisk signifikante økninger i MN-frekvens, varierende fra 2,09 % til 9,50 % for (Mitomycin C) MMC og fra 2,99 % til 7,98 % for Etoposid, ble observert sammenlignet med løsemiddelkontroller og sammenlignet godt med manuell mikroskopiskåring. Ved undersøkelse av den negative kontrollen mannitol ble det ikke observert noen signifikant økning i MN-frekvens. I tillegg ble det observert økende cytotoksisitet med dosen for både etoposid og MMC, med både mikroskopi og AI som viste lignende trender over doseområdet. For mannitol ble det ikke sett noen observerbar økning i cytotoksisitet (figur 5).
Ved ikke bruk av Cyt-B var bakgrunns MN-frekvenser for alle kontrollprøver mellom 0,38 % og 1,0 %, i samsvar med resultater publisert i litteraturen17. Statistisk signifikante økninger i MN-frekvens, fra 2,55 % til 7,89 % for MMC og fra 2,37 % til 5,13 % for etoposid, ble observert sammenlignet med løsemiddelkontroller og sammenlignet godt med manuell mikroskopiskåring. Ved undersøkelse av den negative kontrollen mannitol ble det ikke observert noen signifikant økning i MN-frekvens. Videre ble det observert økende cytotoksisitet med dosen for både etoposid og MMC, med både mikroskopi og AI som viste lignende trender over hele doseområdet. For mannitol ble det ikke sett noen observerbar økning i cytotoksisitet (figur 5).
Ved scoring ved mikroskopi, fra hver kultur, ble 1000 binucleated celler scoret for å vurdere MN-frekvens og ytterligere 500 mononukleerte, binukleerte eller polynukleerte celler ble scoret for å bestemme cytotoksisitet i Cyt-B-versjonen av analysen. I ikke-Cyt-B-versjonen av analysen ble 1000 mononukleerte celler skåret for å vurdere MN-frekvensen. Ved IFC ble gjennomsnittlig 7 733 binukleerte celler, 6 493 mononukleerte celler og 2 649 polynukleerte celler skåret per kultur for å bestemme cytotoksisitet. MN-frekvens ble bestemt fra den binukleerte cellepopulasjonen for Cyt-B-versjonen av analysen. For ikke-Cyt-B-versjonen av analysen ble gjennomsnittlig 27 866 mononukleerte celler vurdert for tilstedeværelse av MN (figur 5).
Figur 1: arbeidsflyt for AI-programvare. Brukeren begynner med å velge .daf-filene som skal lastes inn i AI-programvaren. Når dataene er lastet inn, begynner brukeren å tilordne objekter til bakkens sannhetsmodellklasser gjennom brukergrensesnittet. For å hjelpe til med bakkesannhetspopulasjonen kan klyngen og forutsi algoritmer brukes til å identifisere bilder med lignende morfologi. Når tilstrekkelige objekter er lagt til hver modellklasse, kan modellen trenes. Etter opplæring kan brukeren vurdere ytelsen til modellen ved hjelp av verktøyene som tilbys, inkludert en interaktiv forvirringsmatrise. Til slutt kan brukeren enten gå tilbake til opplæringsdelen av arbeidsflyten for å forbedre bakkesannhetsdataene, eller, hvis tilstrekkelig nøyaktighet er oppnådd, kan brukeren gå ut av arbeidsflytsløyfen for opplæring/merking og bruke modellen til å klassifisere tilleggsdata. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Klyngealgoritme. Klyngealgoritmen kan kjøres når som helst på et segment på 1 500 objekter som er tilfeldig valgt fra inndataene. Denne algoritmen grupperer lignende objekter i et segment sammen i henhold til morfologien til både uklassifiserte objekter og objekter som har blitt tildelt grunnsannhetsmodellklassene. Eksempelbilder viser binucleated, mononucleated og multinucleated celler, og celler med uregelmessig morfologi. Klynger som inneholder mononukleerte celler faller på den ene siden av objektkartet, mens klynger med flerkjernede celler er på motsatt side av objektkartet. Binucleated celleklynger faller et sted mellom mono- og multinukleerte celleklynger. Til slutt faller klynger med uregelmessig morfologi helt i et annet område av objektkartet. Brukergrensesnittet tillater å legge til hele klynger, eller velge objekter i klynger, til bakken sannhet modell klasser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Forutsi algoritme. Prediksjonsalgoritmen krever minst 25 objekter i hver grunnsannhetsmodellklasse og forsøker å forutsi den mest passende modellklassen for å tilordne uklassifiserte objekter i et segment. Prediksjonsalgoritmen er mer robust i forhold til klyngealgoritmen med hensyn til identifisering av subtile morfologier i bilder (dvs. mononukleerte celler med MN [gul] versus mononukleerte celler uten MN [rød]). Objekter med disse likhetene er plassert i umiddelbar nærhet på objektkartet; Imidlertid er brukeren lett i stand til å inspisere bildene i hver forutsagt klasse og tilordne objekter til riktig modellklasse. Objekter som algoritmen ikke klarer å forutsi en klasse for, vil forbli som "ukjente". Forutsigelsesalgoritmen tillater brukere å raskt fylle grunnsannhetsmodellklassene, spesielt når det gjelder hendelser som anses som sjeldne og utfordrende å finne i inngangsdataene, for eksempel mikronukleerte celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Forvirringsmatrise med modellresultater. Resultatskjermen til AI-programvaren gir brukeren tre forskjellige verktøy for å vurdere modellens nøyaktighet. (A) Klassefordelingshistogrammene tillater brukeren å klikke på hyllene i histogrammet for å vurdere forholdet mellom objekter i sannhetspopulasjonene og objekter som ble spådd å tilhøre den modellklassen. Generelt, jo nærmere prosentverdiene mellom sannheten og predikerte populasjoner er til hverandre for en gitt modellklasse, desto mer nøyaktig er modellen. (B) Statistikktabellen for nøyaktighet lar brukeren vurdere tre vanlige måledata for maskinlæring for å vurdere modellens nøyaktighet: presisjon, tilbakekalling og F1. Generelt, jo nærmere disse beregningene er 100 %, desto mer nøyaktig er modellen til å identifisere hendelser i modellklassene. Til slutt, (C) den interaktive forvirringsmatrisen gir en indikasjon på hvor modellen feilklassifiserer hendelser. Oppføringene på aksen (grønn) indikerer objekter fra bakken sannhetsdata som ble klassifisert riktig under trening. Off-axis-oppføringer (skyggelagt oransje) indikerer objekter fra bakken sannhetsdata som ble feilklassifisert. Ulike eksempler på feilklassifiserte objekter vises, inkludert (i) en mononukleert celle klassifisert som en mononukleert celle med MN, (ii) en binucleated celle klassifisert som en binucleated celle med MN, (iii) en mononucleated celle klassifisert som en celle som har uregelmessig morfologi, (iv) en binucleated celle med MN klassifisert som en celle som har uregelmessig morfologi, og (v) en binucleated celle med en MN klassifisert som en binucleated celle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Gentoksisitet og cytotoksisitetsresultater. Gentoksisitet målt ved prosentandel av MN ved mikroskopi (klare søyler) og AI (stiplede søyler) etter 3 timers eksponering og 24 timers restitusjon for mannitol, etoposid og MMC ved bruk av både (A-C) Cyt-B og (D-F) ikke-Cyt-B metoder. Statistisk signifikante økninger i MN-frekvens sammenlignet med kontroller er indikert med stjerner (*p < 0,001, Fishers eksakte test). Feilfelt representerer standardavviket til gjennomsnittet fra tre replikerte kulturer ved hvert dosepunkt, bortsett fra MMC ved mikroskopi, hvor bare dupliserte kulturer ble skåret. Denne figuren er modifisert fra Rodrigues et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Arbeidet som presenteres her beskriver bruken av dype læringsalgoritmer for å automatisere scoringen av MN-analysen. Flere nyere publikasjoner har vist at intuitive, interaktive verktøy gjør det mulig å lage dype læringsmodeller for å analysere bildedata uten behov for dyptgående beregningskunnskap18,19. Protokollen beskrevet i dette arbeidet ved hjelp av en brukergrensesnittdrevet programvarepakke er designet for å fungere godt med svært store datafiler og tillate opprettelse av dype læringsmodeller med letthet. Alle nødvendige trinn for å lage og trene RF- og CNN-modeller i AI-programvarepakken diskuteres, noe som tillater svært nøyaktig identifisering og kvantifisering av alle viktige hendelser i både Cyt-B- og ikke-Cyt-B-versjonene av analysen. Til slutt beskrives trinnene for å bruke disse dype læringsmodellene for å klassifisere tilleggsdata og evaluere kjemisk cytotoksisitet og MN-frekvens.
AI-programvaren som brukes i dette arbeidet er laget med et praktisk brukergrensesnitt og konstruert for å fungere enkelt med store datasett generert fra IFC-systemer. Opplæring, evaluering og forbedring av dype læringsmodeller følger en enkel iterativ tilnærming (figur 1), og anvendelse av de trente modellene for å klassifisere tilleggsdata kan oppnås i bare noen få trinn. Programvaren inneholder særegne cluster (figur 2) og predikere (figur 3) algoritmer som tillater rask tildeling av objekter i passende bakken sannhet modell klasser. Protokollen i denne artikkelen demonstrerer hvordan en CNN-modell, konstruert og trent ved hjelp av AI-programvare, er i stand til å identifisere alle viktige hendelser i MN-analysen robust; Det gir resultater som kan sammenlignes godt med tradisjonell mikroskopi, og fjerner dermed kravet om bildeanalyse og datakodingserfaring. Videre tillater resultatene fra den interaktive modellen (figur 4) å undersøke spesifikke hendelser som modellen feilklassifiserer. Den iterative prosessen gjør det mulig å tilordne disse feilklassifiserte hendelsene til de aktuelle modellklassene, slik at modellen kan læres opp igjen for å forbedre nøyaktigheten.
Resultatene som presenteres her (figur 5) viser evalueringen av mannitol, etoposid og MMC ved hjelp av mikroskopi og en CNN-modell opprettet i AI-programvaren. Ved bruk av begge versjoner av MN-analysen, evaluert med en enkelt AI-modell, er økninger i cytotoksisitet konsistente med økende doser for både MMC og etoposid, mens eksponering for mannitol ikke gir noen økning i cytotoksisitet, som forventet. For gentoksisitetsevaluering ble signifikante (Fishers eksakte test, ensidig) økning i MN-frekvens vist ved bruk av MMC og etoposid, men ikke ved bruk av mannitol. Resultatene for både mikroskopi og AI-modellen sammenlignet godt på tvers av doseområdene for hvert kjemikalie som ble testet.
I flere tidligere publikasjoner har det blitt vist at en IFC-basert MN-analyse kan utføres med enkle og enkle prøveprepareringstrinn sammen med en bildebasert analyse ved hjelp av masker (interesseområder som fremhever piksler i et bilde) og funksjoner beregnet ved hjelp av disse maskene for automatisk å score alle viktige hendelser12,13,16 . Denne IFC-baserte analysen utnytter styrken til IFC, inkludert bildeopptak med høy gjennomstrømning, forenklet prøvebehandling med enkle DNA-fargestoffer og automatisert differensiering av cellulære bilder med morfologi som samsvarer med publiserte MN-analysekriterier. Denne arbeidsflyten inkluderte imidlertid også ulemper, for eksempel kompleksiteten til funksjonsbaserte analyseteknikker som ofte er stive og krever avansert kunnskap om programvarepakker for bildeanalyse12. Bruken av dyp læring for å analysere MN-data innhentet av IFC demonstrerer at CNN-er kan brukes til å bryte seg bort fra begrensningene og vanskelighetene med funksjonsbaserte analyser, noe som gir resultater som er svært nøyaktige og sammenligner godt med mikroskopiskåring14,15. Selv om denne AI-baserte tilnærmingen er lovende, bør videre studier med et utvidet utvalg av velbeskrevne kjemikalier utføres for ytterligere å teste og validere robustheten til teknikken. Dette arbeidet demonstrerer videre fordelene med IFC over mer tradisjonelle metoder, som mikroskopi og konvensjonell flowcytometri, for å forbedre ytelsen til analyser med utfordrende morfologier og strenge scoringskrav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne er ansatt i Luminex Corporation, et DiaSorin Company, produsenten av ImageStream imaging flow cytometer og Amnis AI-programvaren som brukes i dette arbeidet.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser - Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler - 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC - ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software - IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software - INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse - Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath - PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer - 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
References
- Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
- OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , OECD Publishing. Paris. (2016).
- Fenech, M.
- Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
- Fenech, M.
- Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).
- Seager, A. L., et al. Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells. Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).
- Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
- Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).
- Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
- Basiji, D. A. Principles of Amnis imaging flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
- Rodrigues, M. A. Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer. Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).
- Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).
- Wills, J. W., et al. Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).
- Rodrigues, M. A., et al. The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).
- Rodrigues, M. A. An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).
- Lovell, D. P., et al. Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hennig, H., et al. An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning. Methods. 112, 201-210 (2017).
