Summary
小核(MN)アッセイは、DNA損傷を定量化するための確立されたテストです。ただし、手動顕微鏡や特徴ベースの画像分析などの従来の手法を使用してアッセイをスコアリングすることは、面倒で困難です。この論文では、イメージングフローサイトメトリーデータを使用してMNアッセイをスコアリングするための人工知能モデルを開発する方法論について説明します。
Abstract
小核(MN)アッセイは、化学物質の遺伝毒性を評価するために世界中の規制機関によって使用されています。アッセイは2つの方法で実施することができる:一度分裂した、細胞質分裂がブロックされた二核細胞または完全に分裂した単核細胞におけるMNをスコアリングすることによって。歴史的に、光学顕微鏡はアッセイをスコアリングするためのゴールドスタンダードの方法でしたが、それは面倒で主観的です。フローサイトメトリーは、近年、アッセイのスコアリングに使用されていますが、細胞画像の重要な側面を視覚的に確認できないため、制限されています。イメージングフローサイトメトリー(IFC)は、ハイスループット画像キャプチャと自動画像解析を組み合わせたもので、MNアッセイのすべての重要なイベントの画像を迅速に取得し、スコアリングするために成功裏に適用されています。最近、畳み込みニューラルネットワークに基づく人工知能(AI)手法を使用して、IFCが取得したMNアッセイデータをスコアリングできることが実証されました。このホワイトペーパーでは、AIソフトウェアを使用してディープラーニングモデルを作成し、すべての主要なイベントをスコアリングし、このモデルを適用して追加データを自動的にスコアリングするためのすべての手順について説明します。AIディープラーニングモデルの結果は、手動顕微鏡と比較して優れているため、IFCとAIを組み合わせることでMNアッセイの完全に自動化されたスコアリングが可能になります。
Introduction
小核(MN)アッセイは、ヒト用の化粧品、医薬品、および化学物質の開発におけるDNA損傷を評価するための遺伝毒物学の基本です1,2,3,4。小核は、分裂後に核に取り込まれず、核とは別の小さな円形体に凝縮する染色体全体または染色体断片から形成されます。したがって、MNは、遺伝毒性試験1におけるDNA損傷を定量するためのエンドポイントとして使用できます。
MNを定量するための好ましい方法は、サイトカラシン-B(Cyt-B)を用いて分裂をブロックすることによって一回分裂した二核細胞(BNC)内である。このバージョンのアッセイでは、細胞毒性は、単核(MONO)および多核(POLY)細胞のスコアリングによっても評価されます。このアッセイは、ブロックされていないMONO細胞におけるMNをスコアリングすることによっても実行することができ、これはより速く、より簡単にスコアリングすることができ、増殖を評価するために曝露前および曝露後の細胞カウントを使用して細胞毒性を評価する5,6。
アッセイの物理的スコアリングは、すべての重要なイベントを視覚的に確認できるため、歴史的に手動顕微鏡によって行われてきました。しかし、手動顕微鏡は困難で主観的です1。そのため、顕微鏡スライドスキャンやフローサイトメトリーなどの自動化技術が開発されていますが、それぞれに独自の利点と制限があります。スライドスキャン法では重要なイベントを視覚化できますが、スライドは最適なセル密度で作成する必要があり、達成が困難な場合があります。さらに、この手法は細胞質の可視化を欠いていることが多く、MONO細胞とPOLY細胞のスコアリングを損なう可能性があります7,8。フローサイトメトリーはハイスループットなデータキャプチャを提供しますが、細胞を溶解する必要があるため、Cyt-B型のアッセイを使用することはできません。さらに、非イメージング技術として、従来のフローサイトメトリーは重要な事象の視覚的検証を提供しない9、10。
そのため、MNアッセイを行うためにイメージングフローサイトメトリー(IFC)が検討されている。ImageStreamX Mk IIは、従来のフローサイトメトリーの速度と統計的堅牢性を、顕微鏡の高解像度イメージング機能を単一のシステムで組み合わせた11。IFCを使用することにより、すべての主要なイベントの高解像度画像をキャプチャし、特徴ベースの12,13または人工知能(AI)技術14,15を使用して自動的にスコアリングできることが示されています。IFCを使用してMNアッセイを行うことにより、顕微鏡検査と比較して、より短時間でより多くの細胞を自動的にスコアリングすることができます。
この作業は、前述の画像分析ワークフロー16 から逸脱し、Amnis AIソフトウェア(以下「AIソフトウェア」と呼ぶ)を使用してランダムフォレスト(RF)および/または畳み込みニューラルネットワーク(CNN)モデルを開発およびトレーニングするために必要なすべてのステップについて説明します。AI支援タグ付けツールを使用したグラウンドトゥルースデータの入力、モデルトレーニング結果の解釈、追加データを分類するためのモデルの適用など、必要なすべてのステップが説明されており、遺伝毒性と細胞毒性の計算が可能になります15。
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Protocol
1. イメージングフローサイトメトリーを用いたデータ取得
注:Rodrigues et al.16 を参照し、次の変更を加えて、IFCを使用する取得領域を最適な画像キャプチャのために変更する必要があるかもしれないことに注意してください。
- Non-Cyt-B法の場合は、培養直前および回収期間直後の各培養液について、製造元の説明書( 材料表参照)に従って市販のセルカウンターを用いて細胞カウントを行います。
- シングルカメライメージングフローサイトメーターでサンプルを実行する場合は、明視野(BF)をチャンネル4に配置します。M01 を M04 に、M07 を M01 に置き換えます。
注意: 「M」はIFCのカメラチャンネルを指します。 - 集録時には40倍の倍率を使用してください。
- 集録時のBF面積対BFアスペクト比プロットで、次の領域座標を使用します。
X座標:100と900。Y 座標: 0.7 および 1 (Cyt-B 法)
X座標:100と600。Y 座標: 0.7 および 1 - ヘキスト強度プロットで、次の領域座標を使用します。
X座標:55と75。Y 座標: 9.5 および 15 (Cyt-B 法)
X座標:55と75。Y 座標: 13 および 21 (非 Cyt-B 法) - アポトーシスおよび壊死物体の画像をデータから削除するには、IDEAS 6.3ソフトウェアパッケージを起動します(以下、「画像解析ソフトウェア」と呼びます。
注:AIソフトウェアは、最新バージョンの画像解析ソフトウェアを使用して処理された.dafファイルで動作するように設計されています。画像解析ソフトウェアが最新であることを確認します。 - この作業をテンプレート (.ast) ファイルとして保存します。
2. すべての .rif ファイルに対して .daf ファイルを作成する
- AIソフトウェアは.dafファイルのインポートのみを許可します。バッチ処理を使用して、実験内のすべての .rif ファイルの .daf ファイルを作成します。
- [ ツール ] メニューで、[バッチ データ ファイル ] をクリックし、[ バッチの追加] をクリックします。
- 新しいウィンドウで、[ ファイルの追加 ] を選択し、バッチに追加する .rif ファイルを選択します。[ テンプレートまたはデータ分析ファイル (.ast、.daf) の選択] オプションで、前に作成した .ast ファイル を選択します。
- 必要に応じてバッチ名を割り当て、[ OK ]をクリックして、ロードされたすべての.rifファイルの.dafファイルを作成します。
3. AIソフトウェアで実験を作成する
- AIソフトウェアを使用してディープラーニングモデルを作成するプロセスを説明する 図1 のフローチャートを参照してください。
- AIソフトウェアを起動し、ウィンドウの左下隅にある[ バージョン情報 ]をクリックして、最新バージョンがインストールされていることを確認します。最新バージョンがインストールされていない場合は、support@luminexcorp.com に連絡して入手してください。
- ソフトウェアの既定の画面は [新しい実験 ] 画面です。 [フォルダー ] アイコンを使用して実験を保存する場所を選択し、実験の名前を入力します (例: "MN モデル")。
- [実験の種類] で、[トレーニング] の横にあるラジオ ボタンをクリックしてトレーニング実験を開始し、CNN モデルの構築を開始します。[次へ]をクリックします。
- オプション:モデルが以前にトレーニングされている場合は、新しいAIモデルのテンプレートとして使用でき、[テンプレートモデルの選択]画面から新しい モデルを作成するためのテンプレート として選択できます。テンプレート モデルが存在しない場合は、[ 次へ] をクリックしてこの手順をスキップします。
- 次の画面は、[ 新しいモデルの定義 ]画面です。[ モデル] で、手順 3.3 でモデルに付けられた名前が自動的に入力されます。
- [ 説明] にモデルの説明を入力し (オプション)、最大画像サイズは 150 ピクセルのままにします。
- [チャネル]で、[BFの追加]をクリックして、明視野チャネルをリストに追加します。[名前]で[ブライトフィールド]をダブルクリックし、このチャンネルの名前をBFに変更します。[FLの追加]をクリックして、蛍光チャンネルをリストに追加します。[名前]で[蛍光]をダブルクリックし、このチャネルの名前をDNAに変更します。
- [クラス名] で [追加] をクリックします。ポップアップウィンドウで、単核文字を入力し、[OK]をクリックします。これにより、単核クラスがクラス名のリストに追加されます。このプロセスを繰り返して、次の 6 つのクラスがリストに定義されていることを確認します。
単核
MNによる単核化
二核
MNで二核化
多核
不規則な形態
[ 次へ]をクリックします。
注:これらの6つのグラウンドトゥルースモデルクラスは、スコアリングされる主要なイベントと、受け入れられているスコアリング基準5とは異なる形態の画像を表します。- オプション: 必要に応じて、1.7 の解析テンプレートを組み込んで、画像解析ソフトウェアの機能を使用できます。これらの機能を AI モデルに含める場合は、.ast ファイルを参照し、チャネル固有のドロップダウンから、含める機能のサブセットを選択します。
- [ファイルの選択]で、[ファイルの追加]をクリックし、AIソフトウェアに追加してグラウンドトゥルースデータを構築する目的のファイルを参照します。[次へ]をクリックします。
注:十分な数のすべてのキーイベントを含む複数のデータファイル(ポジティブコントロールデータとネガティブコントロールデータなど)を追加することが重要です。
- 次に、[ ベース集団の選択 ] 画面で、母集団階層から 非アポトーシス 集団を見つけます。 非アポトーシス 集団を右クリックし、 一致するすべての集団を選択を選択します。[ 次へ]をクリックします。
注:分類すべきではない集団(ビーズ、破片、ダブレットなど)を除外することが重要です。 - この画面は、 真理母集団の選択 画面です。
- 主要なイベントのタグ付けされた真理値母集団が画像解析ソフトウェアで作成されていない場合は、[ 次へ]をクリックします。
- タグ付き真理値母集団が画像解析ソフトウェアで作成されている場合は、適切なモデルクラスに割り当てます。
- MNを持つMONO細胞のタグ付けされた真理値集団を割り当てるには、左側のモデルクラスの下にある単核MNクラスをクリックします。次に、これらのイベントを含む右側の適切なタグ付けされた真理値母集団をクリックします。
- タグ付けされた真理値母集団が複数のデータ・ファイルに作成されている場合は、真理値母集団の1つを右クリックし、 一致する母 集団をすべて選択を選択して、複数のファイルから適切なクラスにタグ付けされた母集団を追加します。
- すべての適切な真理値母集団が割り当てられたら、 次へをクリックします。
- [ チャネルの選択] 画面で、実験に適したチャネルを選択します。ここでは、BFをチャンネル1に、ヘキストをチャンネル7に設定します。チャネルを右クリックし、[ すべてに適用] を選択します。[ 次へ]をクリックします。
- 最後に、[ 確認 ] 画面で [ 実験の作成] をクリックします。
- AI ソフトウェアはデータ ファイルから画像を読み込み、手順 3.7 で割り当てられたグラウンド トゥルース画像を使用して、手順 3.5.3 で定義されたモデル クラスを作成します。[ 完了]をクリックします。
- 実験が作成されると、次の 5 つのオプションが表示されます。
実験: 読み込まれたデータファイル、選択されたチャネル、定義されたグラウンドトゥルースモデルクラスなど、実験の詳細を提供します。
タグ付け: ユーザーがグラウンドトゥルースデータを入力できるタグ付けツールを起動します。
トレーニング: グラウンドトゥルースデータに基づいてモデルをトレーニングします。
分類: トレーニング済みのモデルを使用してデータを分類します。
結果: トレーニング実験と分類実験の両方の結果を提供します。
4. AI支援タグ付けツールを使用したグラウンドトゥルースデータの入力
- [タグ付け]をクリックして、 タグ付け ツールのインターフェイスを起動します。
- ズームツール(虫眼鏡アイコン)をクリックして、見やすくするために画像をトリミングします。
- スライダーバーをクリックして画像サイズを調整し、ギャラリーに表示される画像の数を変更します。
- [ 表示設定 ]オプションをクリックし、すべての主要なイベントを識別するのに最適なコントラスト画像を提供する [最小-最大]を選択します。
- [ギャラリーディスプレイのセットアップ]をクリックして、DNA画像の色を黄色または白に変更すると、小さなオブジェクト(MNなど)の視覚化が向上します。
- [ クラスター ]をクリックしてアルゴリズムを実行し、類似した形態を持つオブジェクトをグループ化します。クラスタリングが完了すると、クラスタあたりのオブジェクト数を持つ個々のクラスタが [不明な母集団] の下のリストに表示されます。個々のクラスターを選択してクラスター内のオブジェクトを表示し、これらのオブジェクトを適切なモデル クラスに割り当てます。
- 各モデル クラスに少なくとも 25 個のオブジェクトが割り当てられると、 Predict アルゴリズムが使用可能になります。[ 予測] をクリックします。
注: どの母集団にもうまく適合しないオブジェクトは、 不明として分類されたままになります。より多くのオブジェクトが真理値母集団に追加されるにつれて、予測精度が向上します。 - 各クラスのオブジェクト数が十分に達するまで、グラウンドトゥルース モデル クラスに適切な画像を設定し続けます。
- 各モデルクラスに最低100個のオブジェクトが割り当てられたら、画面上部の[ トレーニング ]タブをクリックします。 [トレーニング ] ボタンをクリックして、ランダム フォレストと CNN アルゴリズムを使用してモデルを作成します。
注:AIソフトウェアはランダムフォレストとCNNアルゴリズムの両方を使用してモデルを作成し、チェックボックスはCNNアルゴリズムのランダムフォレストのみを使用してモデルを作成できます。
5. モデルの精度の評価
- モデルのトレーニングが完了したら、[ 結果の表示] をクリックします。
- 結果画面を使用して、モデルの精度を評価します。プルダウン メニューを使用して、ランダム フォレストと CNN を切り替えます。
注: 真理母集団を更新したり、モデルを再トレーニングしたり、そのまま使用して追加のデータを分類したりできます。- 真理の母集団を更新するには、上部の タグ付け をクリックし、セクション4に従います。
6. モデルを使用したデータの分類
- AIソフトウェアを起動します。既定の画面は [新しい実験 ] 画面です。 [フォルダー ] アイコンを使用して、実験を保存する場所を選択し、実験の名前を入力します。
- [実験タイプ] で、[分類] の横にあるラジオ ボタンをクリックして、分類実験を開始します。[次へ]をクリックします。
- 分類に使用するモデルをクリックし、[ 次へ] をクリックします。
- [ ファイルの選択 ] 画面で、[ファイルの追加] をクリックし、CNN モデルで分類する ファイル を参照します。[ 次へ]をクリックします。
- 次に、[ベースポピュレーションの選択]画面で、ロードされたファイルの1つで非アポトーシスポピュレーションの横にあるチェックボックスをクリックします。非アポトーシス集団を右クリックし、一致するすべての集団を選択をクリックして、ロードされたすべてのファイルからこの母集団を選択します。[次へ]をクリックします。
- オプション: 分類するデータに真理値の母集団が含まれている場合は、「真理値母集団の選択」画面で適切なモデル・クラスに割り当てることができます。それ以外の場合は、[次へ] をクリックしてこの手順をスキップします。
- チャンネル選択画面で、明視野にはチャンネル1、DNA染色にはチャンネル7を選択します。チャンネルを右クリックし、[すべてに適用]をクリックします。次に、[次へ]をクリックします。
- 最後に、[ 確認 ] 画面で [ 実験の作成] をクリックします。AIソフトウェアは、選択したデータファイルから選択したモデルとすべての画像をロードします。[ 完了]をクリックします。
- [分類] をクリックして、分類画面を起動します。[分類]ボタンをクリックします。これにより、RF および CNN モデルを使用して追加データを分類し、指定されたモデル クラスに属するすべてのオブジェクトを識別するプロセスが開始されます。
注:チェックボックスを使用して、RFモデルやCNNモデルを選択できます。 - 分類が完了したら、[ 結果の表示] をクリックします。
- [DAF の更新] ボタンをクリックして、[分類結果で DAF を更新] ウィンドウを表示します。[OK] をクリックして .daf ファイルを更新します。
7. 分類結果のレポートの生成
- [結果] 画面で、[レポートの生成] をクリックします。入力 DAF ごとに個別のレポートが必要な場合は、[入力 DAF ごとにレポートを作成] の横にあるチェックボックスをオンにします。OKをクリックします。
- 完了したら、レポートファイルが保存されているフォルダを開きます。フォルダー内には、実験.pdfレポートと リソース フォルダーがあります。
- .pdfを開いてレポートを表示します。レポートには、モデルと実験の情報、入力 .daf ファイルの一覧、表形式とヒストグラム形式のクラス数とクラスの割合、およびすべての入力 .daf ファイルの予測確率の中央値を要約した混同行列が含まれています。
- [リソース] フォルダーを開き、[CNN] フォルダーを開きます。このフォルダ内には、クラス数とパーセンテージ棒グラフの.pngファイル、および混同行列があります。さらに、各入力ファイルのクラス数とパーセンテージを含む.csvファイルがあります。
8.MN頻度と細胞毒性の決定
- MN 周波数の計算
- 非 Cyt-B 法: MN 頻度を決定するには、ステップ 7.4 の class_count.csv ファイルを開きます。各入力ファイルについて、「MNで単核」母集団のカウントを「単核」母集団のカウントで割り、100を掛けます。
- Cyt-B 法: MN 頻度を決定するには、ステップ 7.4 の class_count.csv ファイルを開きます。各入力ファイルについて、"MNで二核化" 母集団のカウントを "二核" 母集団のカウントで割り、100 を掛けます。
- 非 Cyt-B 法: MN 頻度を決定するには、ステップ 7.4 の class_count.csv ファイルを開きます。各入力ファイルについて、「MNで単核」母集団のカウントを「単核」母集団のカウントで割り、100を掛けます。
- 細胞毒性の計算
- 非サイトB法:
- 初期細胞数と処理後の細胞数を使用して、最初に各サンプルの母集団倍増(PD)を計算します2:
- 次に、相対人口倍増2を計算します。
- 最後に、各サンプルの細胞毒性2 を計算します。
- 初期細胞数と処理後の細胞数を使用して、最初に各サンプルの母集団倍増(PD)を計算します2:
- サイトBメソッド:
- 細胞質分裂ブロック増殖指数(CBPI)2を計算するには、 class_count.csv ファイルの各サンプルの単核、二核、および多核クラスのカウントを使用します。
- 細胞毒性2を計算するには、対照培養物(C)および暴露培養物(T)からのCBPIを使用します。
- 細胞質分裂ブロック増殖指数(CBPI)2を計算するには、 class_count.csv ファイルの各サンプルの単核、二核、および多核クラスのカウントを使用します。
- 非サイトB法:
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Representative Results
図1は、AIソフトウェアを使用してMNアッセイのモデルを作成するためのワークフローを示しています。ユーザーは、目的の.dafファイルをAIソフトウェアにロードし、AI支援クラスター(図2)と予測(図3)タグ付けアルゴリズムを使用して、オブジェクトをグラウンドトゥルースモデルクラスに割り当てます。すべてのグラウンドトゥルースモデルクラスに十分なオブジェクトが入力されたら、RFまたはCNNアルゴリズムを使用してモデルをトレーニングできます。トレーニング後、クラス分布ヒストグラム、精度統計、対話型の混同行列などのツールを使用してモデルのパフォーマンスを評価できます(図4)。AIソフトウェアの結果画面から、ユーザーはワークフローのトレーニング部分に戻ってグラウンドトゥルースデータを強化するか、十分な精度が達成された場合、ユーザーはモデルを使用して追加のデータを分類できます。
クラスターアルゴリズムと予測アルゴリズムの両方を使用して、合計 285,000 個のオブジェクトを含む 190 個のセグメントが適切なグラウンドトゥルース クラスに割り当てられ、すべてのクラスに 1,500 から 10,000 個の画像が入力されました。合計で31,500個のオブジェクト(最初にロードされたオブジェクトの10.5%のみ)がこのモデルのトレーニングで使用されました。精度 (偽陽性の割合)、再現率 (偽陰性の割合)、および F1 スコア (精度と再現率のバランス) は、モデルの精度を定量化するためにディープ ラーニング ソフトウェア パッケージで使用できます。ここでは、これらの統計は86.0%から99.4%の範囲であり、モデルの精度が高いことを示しています(図4)。
Cyt-Bを使用すると、すべての対照サンプルのバックグラウンドMN頻度は0.43%から1.69%の間であり、文献17とよく比較されました。溶媒対照と比較し、手動顕微鏡スコアと比較した場合、(マイトマイシンC)MMCで2.09%から9.50%、エトポシドで2.99%から7.98%の範囲のMN頻度の統計的に有意な増加が観察されました。.陰性対照マンニトールを調べた場合、MN頻度の有意な増加は観察されなかった。さらに、エトポシドとMMCの両方で用量による細胞毒性の増加が観察され、顕微鏡とAIの両方が用量範囲全体で同様の傾向を示しました。マンニトールについては、細胞毒性の観察可能な増加は見られませんでした(図5)。
Cyt−Bを使用しない場合、全ての対照試料のバックグラウンドMN頻度は0.38%から1.0%の間であり、文献17で発表された結果と一致した。MN頻度の統計的に有意な増加は、溶媒対照と比較し、手動顕微鏡スコアと比較した場合、MMCで2.55%から7.89%、エトポシドで2.37%から5.13%の範囲で観察されました。.陰性対照マンニトールを調べた場合、MN頻度の有意な増加は観察されなかった。さらに、エトポシドとMMCの両方で用量による細胞毒性の増加が観察され、顕微鏡とAIの両方が用量範囲全体で同様の傾向を示しました。マンニトールについては、細胞毒性の観察可能な増加は見られませんでした(図5)。
顕微鏡によるスコアリングの場合、各培養物から、MN頻度を評価するために1,000個の二核細胞をスコアリングし、さらに500個の単核、二核、または多核細胞をスコアリングして、Cyt-Bバージョンのアッセイにおける細胞毒性を決定しました。アッセイの非Cyt-Bバージョンでは、MN頻度を評価するために1,000個の単核細胞をスコアリングしました。IFCにより、培養ごとに平均7,733個の二核細胞、6,493個の単核細胞、および2,649個の多核細胞をスコアリングし、細胞毒性を決定しました。MN頻度は、アッセイのCyt−Bバージョンについて二核細胞集団内から決定した。アッセイの非Cyt-Bバージョンでは、平均27,866個の単核細胞がMNの存在について評価されました(図5)。
図1:AIソフトウェアのワークフロー。 ユーザーは、AIソフトウェアにロードする.dafファイルを選択することから始めます。データがロードされると、ユーザーはユーザーインターフェイスを介してグラウンドトゥルースモデルクラスにオブジェクトを割り当て始めます。グラウンド トゥルースの母集団を支援するために、クラスター アルゴリズムと予測アルゴリズムを使用して、類似した形態を持つ画像を特定できます。各モデル クラスに十分なオブジェクトが追加されたら、モデルをトレーニングできます。トレーニング後、ユーザーは、対話型の混同行列を含む、提供されているツールを使用してモデルのパフォーマンスを評価できます。最後に、ユーザーはワークフローのトレーニング部分に戻ってグラウンドトゥルースデータを強化するか、十分な精度が達成された場合、ユーザーはトレーニング/タグ付けワークフローループから抜け出し、モデルを使用して追加のデータを分類できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:クラスタアルゴリズム。 クラスター アルゴリズムは、入力データからランダムに選択された 1,500 個のオブジェクトのセグメントに対していつでも実行できます。このアルゴリズムは、セグメント内の類似したオブジェクトを、未分類のオブジェクトとグラウンドトゥルースモデルクラスに割り当てられたオブジェクトの両方の形態に従ってグループ化します。画像の例は、二核細胞、単核細胞、多核細胞、および不規則な形態の細胞を示しています。単核細胞を含むクラスターはオブジェクト マップの片側にあり、多核細胞を含むクラスターはオブジェクト マップの反対側にあります。二核細胞クラスターは、単核細胞クラスターと多核細胞クラスターの間のどこかにあります。最後に、不規則な形態を持つクラスターは、オブジェクトマップのまったく異なる領域に分類されます。ユーザーインターフェイスでは、クラスター全体、またはクラスター内の選択したオブジェクトをグラウンドトゥルースモデルクラスに追加できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:予測アルゴリズム。 予測アルゴリズムは、各グラウンドトゥルースモデルクラスに少なくとも25個のオブジェクトを必要とし、セグメント内に未分類のオブジェクトを割り当てるために最も適切なモデルクラスを予測しようとします。予測アルゴリズムは、画像内の微妙な形態(すなわち、MN[黄色]を有する単核細胞対MN[赤]を有する単核細胞)の同定に関して、クラスタアルゴリズムと比較してより堅牢である。これらの類似性を持つオブジェクトは、オブジェクト マップのすぐ近くに配置されます。ただし、ユーザーは、予測された各クラスの画像を簡単に調べて、オブジェクトを適切なモデル クラスに割り当てることができます。アルゴリズムがクラスを予測できないオブジェクトは、「不明」のままになります。predict アルゴリズムを使用すると、ユーザーは、特に小核細胞など、入力データ内で見つけることがまれで難しいと考えられるイベントの場合に、グラウンドトゥルースモデルクラスを迅速に入力できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:モデル結果を含む混同行列。 AIソフトウェアの結果画面には、モデルの精度を評価するための3つの異なるツールが表示されます。(A)クラス分布ヒストグラムを使用すると、ユーザーはヒストグラムのビンをクリックして、真理母集団内のオブジェクトとそのモデルクラスに属すると予測されたオブジェクトとの関係を評価できます。一般に、特定のモデル クラスで真理値と予測母集団の間のパーセンテージ値が互いに近いほど、モデルの精度が高くなります。(B) 精度統計テーブルを使用すると、ユーザーはモデルの精度を評価するための 3 つの一般的な機械学習メトリック (精度、再現率、F1) を評価できます。一般に、これらのメトリックが 100% に近いほど、モデルはモデル クラス内のイベントをより正確に識別できます。最後に、(C)対話型混同行列は、モデルがイベントを誤って分類している場所を示します。軸上のエントリ (緑色) は、トレーニング中に正しく分類されたグラウンドトゥルース データのオブジェクトを示します。軸外のエントリ(オレンジ色の影付き)は、誤って分類されたグラウンドトゥルースデータのオブジェクトを示します。誤分類対象物の様々な例が示され、(i)MNを有する単核細胞に分類される単核細胞、(ii)MNを有する二核細胞に分類される二核細胞、(iii)不規則形態を有する細胞に分類される単核細胞、(iv)不規則形態を有する細胞として分類されるMNを有する二核細胞、および(v)二核細胞として分類されるMNを有する二核細胞が含まれる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:遺伝毒性と細胞毒性の結果。(A-C)Cyt-B法と(D-F)非Cyt-B法の両方を使用したマンニトール、エトポシド、およびMMCの3時間の曝露と24時間の回収後の顕微鏡(透明なバー)およびAI(点線のバー)によるMNの割合で測定された遺伝毒性。対照と比較したMN頻度の統計的に有意な増加は、アスタリスク(*p < 0.001、フィッシャーの正確確率検定)で示されています。エラーバーは、顕微鏡によるMMCを除き、各用量ポイントでの3つの反復培養からの平均の標準偏差を表し、重複培養のみがスコアリングされました。この図はRodrigues et al.15から修正されている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで紹介する研究では、MNアッセイのスコアリングを自動化するためのディープラーニングアルゴリズムの使用について説明しています。最近のいくつかの出版物は、直感的でインタラクティブなツールが、深い計算知識を必要とせずに画像データを分析するための深層学習モデルの作成を可能にすることを示しています18,19。ユーザーインターフェイス駆動型ソフトウェアパッケージを使用してこの作業で説明されているプロトコルは、非常に大きなデータファイルでうまく機能し、ディープラーニングモデルを簡単に作成できるように設計されています。AIソフトウェアパッケージでRFおよびCNNモデルを作成およびトレーニングするために必要なすべてのステップについて説明し、アッセイのCyt-Bバージョンと非Cyt-Bバージョンの両方ですべての重要なイベントの高精度な識別と定量化を可能にします。最後に、これらのディープラーニングモデルを使用して追加データを分類し、化学的細胞毒性とMN頻度を評価する手順について説明します。
本研究で使用しているAIソフトウェアは、便利なユーザーインターフェースで作成され、IFCシステムから生成された大規模なデータセットで簡単に動作するように構成されています。ディープラーニングモデルのトレーニング、評価、および強化は、単純な反復アプローチに従い(図1)、トレーニング済みモデルを適用して追加のデータを分類することは、わずか数ステップで実行できます。このソフトウェアには、特徴的なクラスタ(図2)および予測(図3)アルゴリズムが含まれており、オブジェクトを適切なグラウンドトゥルースモデルクラスに迅速に割り当てることができます。この論文のプロトコルは、AIソフトウェアを使用して構築およびトレーニングされたCNNモデルが、MNアッセイのすべての重要なイベントを確実に識別できる方法を示しています。従来の顕微鏡と比較できる結果が得られるため、画像分析やコンピューターコーディングの経験が不要になります。さらに、対話型モデルの結果(図4)により、モデルが誤って分類している特定のイベントを調査できます。反復プロセスでは、これらの誤分類されたイベントを適切なモデル クラスに割り当てることで、モデルを再度トレーニングして精度を高めることができます。
ここに示す結果(図5)は、顕微鏡とAIソフトウェアで作成されたCNNモデルを使用したマンニトール、エトポシド、およびMMCの評価を示しています。単一のAIモデルで評価されたMNアッセイの両方のバージョンを使用すると、細胞毒性の増加はMMCとエトポシドの両方の用量の増加と一致しますが、マンニトールへの曝露は予想通り細胞毒性の増加をもたらさなかった。遺伝毒性評価のために、MN頻度の有意な(フィッシャーの正確確率検定、片側)増加がMMCおよびエトポシドを使用して実証されましたが、マンニトールは使用しませんでした。.顕微鏡とAIモデルの両方の結果は、テストされた各化学物質の用量範囲全体でよく比較されました。
以前のいくつかの出版物では、IFCベースのMNアッセイは、マスク(画像内のピクセルを強調する関心領域)およびこれらのマスクを使用して計算された特徴を使用してすべての主要なイベントを自動的にスコアリングする特徴を使用した画像ベースの分析とともに、簡単で簡単なサンプル調製ステップで実行できることが示されています12,13,16.このIFCベースのアッセイは、ハイスループット画像キャプチャ、単純なDNA色素によるサンプル処理の簡素化、公開されているMNアッセイスコアリング基準に沿った形態による細胞画像の自動識別など、IFCの強みを活用しています。しかしながら、このワークフローには、しばしば厳格であり、画像解析ソフトウェアパッケージ12の高度な知識を必要とする特徴ベースの解析技術の複雑さなどの欠点も含まれていた。IFCが取得した多国籍企業データを分析するためのディープラーニングの使用は、CNNを使用して特徴ベースの分析の制限と困難から脱却し、非常に正確で顕微鏡のスコア14,15によく匹敵する結果をもたらすことを示しています。このAIベースのアプローチは有望ですが、技術の堅牢性をさらにテストおよび検証するために、よく説明された化学物質の選択を拡大したさらなる研究を実行する必要があります。この研究はさらに、顕微鏡検査や従来のフローサイトメトリーなどの従来の方法に対するIFCの利点を実証し、困難な形態と厳しいスコアリング要件を持つアッセイの性能を向上させます。
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Disclosures
著者らは、ImageStreamイメージングフローサイトメーターと本研究で使用したAmnis AIソフトウェアのメーカーであるDiaSorin CompanyであるLuminex Corporationに雇用されています。
Acknowledgments
何一つ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser - Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler - 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC - ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software - IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software - INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse - Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath - PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer - 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
References
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