Summary
O ensaio de micronúcleo (MN) é um teste bem estabelecido para quantificar danos ao DNA. No entanto, pontuar o ensaio usando técnicas convencionais, como microscopia manual ou análise de imagem baseada em recursos, é trabalhoso e desafiador. Este artigo descreve a metodologia para desenvolver um modelo de inteligência artificial para pontuar o ensaio de MN usando dados de citometria de fluxo de imagem.
Abstract
O ensaio de micronúcleo (MN) é usado mundialmente por órgãos reguladores para avaliar produtos químicos quanto à toxicidade genética. O ensaio pode ser realizado de duas maneiras: pontuando MN em células binucleadas bloqueadas por citocinese ou células mononucleadas totalmente divididas. Historicamente, a microscopia óptica tem sido o método padrão-ouro para pontuar o ensaio, mas é trabalhosa e subjetiva. A citometria de fluxo tem sido usada nos últimos anos para pontuar o ensaio, mas é limitada pela incapacidade de confirmar visualmente aspectos-chave da imagética celular. A citometria de fluxo por imagem (IFC) combina captura de imagem de alto rendimento e análise automatizada de imagens, e tem sido aplicada com sucesso para adquirir rapidamente imagens e pontuar todos os eventos-chave no ensaio de MN. Recentemente, foi demonstrado que métodos de inteligência artificial (IA) baseados em redes neurais convolucionais podem ser usados para pontuar dados de ensaios de MN adquiridos por IFC. Este documento descreve todas as etapas para usar o software de IA para criar um modelo de aprendizado profundo para pontuar todos os eventos-chave e aplicar esse modelo para pontuar automaticamente dados adicionais. Os resultados do modelo de aprendizagem profunda de IA se comparam bem à microscopia manual, permitindo assim a pontuação totalmente automatizada do ensaio MN combinando IFC e IA.
Introduction
O ensaio de micronúcleos (NM) é fundamental na toxicologia genética para avaliar danos ao DNA no desenvolvimento de cosméticos, fármacos e produtos químicos para uso humano 1,2,3,4. Os micronúcleos são formados a partir de cromossomos inteiros ou fragmentos cromossômicos que não se incorporam ao núcleo após a divisão e se condensam em pequenos corpos circulares separados do núcleo. Assim, o NM pode ser usado como um desfecho para quantificar danos ao DNA em testes de genotoxicidade1.
O método preferido para quantificar MN é dentro de células binucleadas (BNCs) divididas uma vez por bloqueio de divisão usando Citocalasina-B (Cyt-B). Nesta versão do ensaio, a citotoxicidade também é avaliada por meio da pontuação de células mononucleadas (MONO) e polinucleadas (POLY). O ensaio também pode ser realizado por meio da pontuação de MN em células MONO desbloqueadas, o que é mais rápido e fácil de pontuar, com a citotoxicidade sendo avaliada usando contagens de células pré e pós-exposição para avaliar a proliferação 5,6.
A pontuação física do ensaio tem sido historicamente realizada por microscopia manual, uma vez que permite a confirmação visual de todos os eventos-chave. Entretanto, a microscopia manual é desafiadora esubjetiva1. Assim, técnicas automatizadas têm sido desenvolvidas, incluindo varredura de lâminas ao microscópio e citometria de fluxo, cada uma com suas vantagens e limitações. Embora os métodos de varredura de slides permitam que eventos-chave sejam visualizados, os slides devem ser criados na densidade de célula ideal, o que pode ser difícil de alcançar. Além disso, essa técnica muitas vezes não tem visualização citoplasmática, o que pode comprometer a pontuação das células MONO e POLY 7,8. Embora a citometria de fluxo ofereça captura de dados de alto rendimento, as células devem ser lisadas, não permitindo o uso da forma Cyt-B do ensaio. Além disso, por ser uma técnica não imaginológica, a citometria de fluxo convencional não fornece validação visual de eventos-chave 9,10.
Portanto, a citometria de fluxo por imagem (CIF) tem sido investigada para realizar o ensaio de NM. O ImageStreamX Mk II combina a velocidade e a robustez estatística da citometria de fluxo convencional com os recursos de imagem de alta resolução da microscopia em um único sistema11. Foi demonstrado que, usando IFC, imagens de alta resolução de todos os eventos-chave podem ser capturadas e pontuadas automaticamente usando técnicas baseadas em recursos 12,13 ou inteligência artificial (IA) 14,15. Usando IFC para realizar o ensaio de MN, a pontuação automática de muito mais células em comparação com a microscopia em um período mais curto de tempo é alcançável.
Este trabalho se desvia de um fluxo de trabalho de análise de imagens descrito anteriormente16 e discute todas as etapas necessárias para desenvolver e treinar um modelo de Floresta Aleatória (RF) e/ou rede neural convolucional (CNN) usando o software Amnis AI (doravante referido como "software de IA"). Todas as etapas necessárias são descritas, incluindo o preenchimento de dados de verdade terrestres usando ferramentas de marcação assistidas por IA, interpretação dos resultados do treinamento do modelo e aplicação do modelo para classificar dados adicionais, permitindo o cálculo de genotoxicidade e citotoxicidade15.
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Protocol
1. Aquisição de dados por citometria de fluxo por imagem
NOTA: Consulte Rodrigues et al.16 com as seguintes modificações, observando que as regiões de aquisição usando IFC podem precisar ser modificadas para a captura ideal da imagem:
- Para o método não-Cyt-B, realizar uma contagem de células usando um contador de células disponível comercialmente seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais) em cada cultura imediatamente antes da cultura e imediatamente após o período de recuperação.
- Se estiver executando amostras em um citômetro de fluxo de imagem de câmera única, coloque o Brightfield (BF) no Canal 4. Substitua M01 por M04 e M07 por M01.
NOTA: "M" refere-se ao canal da câmera no IFC. - Use a ampliação de 40x durante a aquisição.
- No gráfico de proporção área BF versus BF durante a aquisição, use as seguintes coordenadas de região:
Coordenadas X: 100 e 900; Coordenadas Y: 0,7 e 1 (método Cyt-B)
Coordenadas X: 100 e 600; Coordenadas Y: 0,7 e 1 - No gráfico de intensidade Hoechst, use as seguintes coordenadas de região:
Coordenadas X: 55 e 75; Coordenadas Y: 9,5 e 15 (método Cyt-B)
Coordenadas X: 55 e 75; Coordenadas Y: 13 e 21 (método não-Cyt-B) - Para remover imagens de objetos apoptóticos e necróticos dos dados, inicie o pacote de software IDEAS 6.3 (doravante denominado "software de análise de imagens"; ver Tabela de Materiais).
NOTA: O software AI foi projetado para trabalhar com arquivos .daf que foram processados usando a versão mais recente do software de análise de imagem. Certifique-se de que o software de análise de imagens esteja atualizado. - Salve este trabalho como um arquivo de modelo (.ast).
2. Criando arquivos .daf para todos os arquivos .rif
- O software de IA só permite importar arquivos .daf. Crie arquivos .daf para todos os arquivos .rif no experimento por meio do processamento em lote.
- No menu Ferramentas , clique em Arquivos de dados em lote e, em seguida, clique em Adicionar lote.
- Na nova janela, selecione Adicionar arquivos e selecione os arquivos .rif a serem adicionados ao lote. Na opção Selecionar um modelo ou arquivo de análise de dados (.ast, .daf), selecione o arquivo .ast criado anteriormente.
- Atribua um nome de lote, se necessário, e clique em OK para criar arquivos .daf para todos os arquivos .rif carregados.
3. Criando um experimento no software de IA
- Consulte o fluxograma na Figura 1 que descreve o processo de criação de um modelo de aprendizado profundo usando o software de IA.
- Inicie o software de IA e certifique-se de que a versão mais recente está instalada clicando em Sobre no canto inferior esquerdo da janela. Se a versão mais recente não estiver instalada, entre em contato com support@luminexcorp.com para obtê-la.
- A tela padrão no software é a tela Novo Experimento . Use o ícone Pasta para escolher onde salvar o experimento e digite um nome para o experimento (por exemplo, "modelo MN").
- Em Tipo de experimento, clique no botão de opção ao lado de Treinar para iniciar um experimento de treinamento para começar a criar o modelo da CNN. Clique em Avançar.
- Opcional: se um modelo tiver sido treinado anteriormente, ele poderá ser usado como um modelo para um novo modelo de IA e poderá ser selecionado como um modelo para a criação de um novo modelo na tela Selecionar modelo de modelo. Se nenhum modelo de modelo existir, simplesmente ignore esta etapa clicando em Avançar.
- A próxima tela é a tela Definir Novo Modelo . Em Modelo, o nome que foi dado ao modelo na etapa 3.3 será preenchido automaticamente.
- Em Descrição, digite uma descrição para o modelo (opcional) e deixe o tamanho máximo da imagem em 150 pixels.
- Em Canais, clique em Adicionar BF para adicionar um canal de campo brilhante à lista. Em Nome, clique duas vezes em Brightfield e renomeie este canal para BF. Clique em Adicionar FL para adicionar um canal fluorescente à lista. Em Nome, clique duas vezes em Fluorescente e renomeie esse canal para DNA.
- Em Nomes de classe, clique em Adicionar. Na janela pop-up, digite Mononucleado e clique em OK. Isso adiciona a classe mononucleada à lista de nomes de classe. Repita esse processo para garantir que as seis classes a seguir sejam definidas na lista:
Mononucleado
Mononucleado com MN
Binucleado
Binucleado com MN
Polinucleado
Morfologia irregular
Clique em Avançar.
NOTA: Essas seis classes do modelo verdade fundamental representarão os eventos-chave a serem pontuados, bem como imagens com morfologia diferente dos critérios de pontuação aceitos5.- Opcional: Se desejar, o modelo de análise da versão 1.7 pode ser incluído para usar recursos do software de análise de imagem. Se você quiser incluir esses recursos no modelo de IA, procure o arquivo .ast e, em seguida, nas listas suspensas específicas do canal, escolha os subconjuntos de recursos que deseja incluir.
- Em Selecionar arquivos, clique em Adicionar arquivos e procure os arquivos desejados a serem adicionados ao software de IA para construir os dados de verdade de base. Clique em Avançar.
Observação : é importante adicionar vários arquivos de dados (por exemplo, dados de controle positivo e negativo) que contêm um número suficiente de todos os eventos chave.
- Em seguida, na tela Selecionar Populações Base , localize a população Não-Apoptótica da hierarquia populacional. Clique com o botão direito do mouse na população não-apoptótica e selecione Selecionar todas as populações correspondentes. Clique em Avançar.
NOTA: É importante excluir quaisquer populações que não devam ser classificadas (por exemplo, contas, detritos, duplos, etc.) - Esta tela é a tela Selecionar Populações da Verdade .
- Se as populações de verdade marcadas dos eventos-chave não tiverem sido criadas no software de análise de imagem, clique em Avançar.
- Se as populações de verdade marcadas tiverem sido criadas no software de análise de imagens, atribua-as à classe de modelo apropriada.
- Para atribuir uma população verdade marcada de células MONO com MN, clique na classe Mononucleada com MN em Classes de Modelo à esquerda. Em seguida, clique na população de verdade marcada apropriada à direita que contém esses eventos.
- Se as populações de verdade marcadas tiverem sido criadas em mais de um arquivo de dados, clique com o botão direito do mouse em uma das populações de verdade e selecione Selecionar todas as populações correspondentes para adicionar populações marcadas de vários arquivos à classe apropriada.
- Depois que todas as populações de verdade apropriadas tiverem sido atribuídas, clique em Avançar.
- Na tela Selecionar canais, escolha os canais apropriados para o experimento. Aqui, defina BF para o canal 1 e Hoechst para o canal 7. Clique com o botão direito do mouse em um canal e selecione Aplicar a Todos. Clique em Avançar.
- Por fim, na tela de confirmação , clique em Criar experimento.
- O software de IA carrega imagens dos arquivos de dados e cria as classes de modelo definidas na etapa 3.5.3 com as imagens de verdade básicas que foram atribuídas na etapa 3.7. Clique em Concluir.
- Uma vez criado o experimento, cinco opções são apresentadas:
Experimento: fornece detalhes do experimento, incluindo arquivos de dados carregados, canais escolhidos e classes de modelo verdade terrestres definidas.
Marcação: inicia a ferramenta de marcação por meio da qual os usuários podem preencher dados de verdade terrestres.
Treinamento: treina um modelo baseado nos dados da verdade terrestre.
Classificar: usa modelos treinados para classificar dados.
Resultados: fornece resultados de um experimento de treinamento e um experimento de classificação.
4. Preenchendo os dados de verdade terrestre usando ferramentas de marcação assistidas por IA
- Clique em Marcação para iniciar a interface da ferramenta de marcação.
- Clique nas ferramentas de zoom (ícones de lupa) para cortar as imagens para facilitar a visualização.
- Clique na barra deslizante para ajustar o tamanho da imagem para alterar quantas imagens são mostradas na galeria.
- Clique na opção Configuração de vídeo e escolha Min-Max, que fornece a melhor imagem de contraste para identificar todos os eventos-chave.
- Clique em Setup Gallery Display para alterar a cor da imagem de DNA para amarelo ou branco, o que melhorará a visualização de pequenos objetos (por exemplo, MN).
- Clique em Cluster para executar o algoritmo para agrupar objetos com morfologia semelhante. Quando o clustering estiver concluído, os clusters individuais com o número de objetos por cluster serão mostrados em uma lista em Populações desconhecidas. Selecione os clusters individuais para exibir os objetos dentro do cluster e atribua esses objetos às classes de modelo apropriadas.
- Depois que um mínimo de 25 objetos tiverem sido atribuídos a cada classe de modelo, o algoritmo Predict ficará disponível. Clique em Prever.
NOTA: Os objetos que não se encaixam bem em nenhuma população permanecem classificados como Desconhecidos. À medida que mais objetos são adicionados às populações de verdade, a precisão da previsão melhora. - Continue a preencher as classes de modelo verdade básicas com imagens apropriadas até que um número suficiente de objetos em cada classe seja alcançado.
- Depois que um mínimo de 100 objetos tiverem sido atribuídos a cada classe de modelo, clique na guia Treinamento na parte superior da tela. Clique no botão Treinar para criar um modelo usando os algoritmos Random Forest e CNN.
NOTA: O software de IA cria modelos usando os algoritmos Random Forest e CNN, as caixas de seleção permitem a criação de modelos usando apenas algoritmos Random Forest of CNN.
5. Avaliação da acurácia do modelo
- Quando o treinamento do modelo estiver concluído, clique em Exibir resultados.
- Use a tela de resultados para avaliar a precisão do modelo. Use o menu suspenso para alternar entre Random Forest e CNN.
NOTA: As populações de verdade podem ser atualizadas e o modelo pode ser retreinado ou usado como está para classificar dados adicionais.- Para atualizar as populações de verdade, clique em Marcação na parte superior e siga a seção 4.
6. Classificando os dados usando o modelo
- Inicie o software de IA. A tela padrão é a tela Novo Experimento . Use o ícone Pasta para escolher onde salvar o experimento e digite um nome para o experimento.
- Em Tipo de Experimento, clique no botão de opção ao lado de Classificar para iniciar um experimento de classificação. Clique em Avançar.
- Clique no modelo a ser usado para a classificação e, em seguida, clique em Avançar.
- Na tela Selecionar arquivos, clique em Adicionar arquivos e procure os arquivos a serem classificados pelo modelo CNN. Clique em Avançar.
- Em seguida, na tela Selecionar Populações Base , clique na caixa de seleção ao lado da população Não-Apoptótica em um dos arquivos carregados. Clique com o botão direito do mouse na população não-apoptótica e clique em Selecionar todas as populações correspondentes para selecionar essa população de todos os arquivos carregados. Clique em Avançar.
- Opcional: se os dados a serem classificados contiverem populações de verdade, eles poderão ser atribuídos às classes de modelo apropriadas na tela Selecionar Populações de Verdade. Caso contrário, clique em Avançar para ignorar esta etapa.
- Na tela Selecionar canais , escolha Canal 1 para campo brilhante e Canal 7 para a coloração de DNA. Clique com o botão direito do mouse em um canal e clique em Aplicar a Todos. Em seguida, clique em Avançar.
- Por fim, na tela de confirmação , clique em Criar experimento. O software de IA carrega o modelo selecionado e todas as imagens dos arquivos de dados escolhidos. Clique em Concluir.
- Clique em Classificar para iniciar a tela de classificação. Clique no botão Classificar . Isso inicia o processo de usar o modelo RF e CNN para classificar dados adicionais e identificar todos os objetos que pertencem às classes de modelo especificadas.
NOTA: As caixas de seleção podem ser usadas para selecionar o modelo de RF e/ou o modelo CNN. - Quando a classificação estiver concluída, clique em Exibir Resultados.
- Clique no botão Atualizar DAFs para abrir a janela Atualizar DAFs com Resultados da Classificação. Clique em OK para atualizar os arquivos .daf.
7. Geração de um relatório dos resultados da classificação
- Na tela Resultados, clique em Gerar Relatório. Marque a caixa de seleção ao lado de Criar relatório para cada DAF de entrada se um relatório individual para cada daf de entrada for necessário. Clique em OK.
- Depois de concluído, abra a pasta onde os arquivos de relatório foram salvos. Dentro da pasta, há um relatório de .pdf de experimento e uma pasta Recursos .
- Abra o .pdf para exibir o relatório. O relatório contém informações de modelo e experimento, a lista de arquivos .daf de entrada, as contagens de classe e porcentagens de classe em formato tabular e histograma e uma matriz de confusão resumindo a probabilidade de previsão mediana em todos os arquivos .daf de entrada.
- Abra a pasta Recursos e, em seguida, a pasta CNN . Dentro dessa pasta estão .png arquivos dos gráficos de contagem de classes e barras de porcentagem, bem como a matriz de confusão. Além disso, há .csv arquivos contendo as contagens de classe e porcentagens para cada arquivo de entrada.
8. Determinação da frequência e citotoxicidade de MN
- Calculando a frequência MN
- Método não Cyt-B: Para determinar a frequência MN, abra o arquivo class_count.csv da etapa 7.4. Para cada arquivo de entrada, divida as contagens na população "Mononucleada com MN" pelas contagens na população "Mononucleada" e multiplique por 100:
- Método Cyt-B: Para determinar a frequência MN, abra o arquivo class_count.csv da etapa 7.4. Para cada arquivo de entrada, divida as contagens na população "Binucleada com MN" pelas contagens na população "Binucleada" e multiplique por 100:
- Método não Cyt-B: Para determinar a frequência MN, abra o arquivo class_count.csv da etapa 7.4. Para cada arquivo de entrada, divida as contagens na população "Mononucleada com MN" pelas contagens na população "Mononucleada" e multiplique por 100:
- Cálculo da citotoxicidade
- Método não Cyt-B:
- Usando as contagens celulares iniciais e as contagens de células pós-tratamento, primeiro calcule a duplicação populacional (DP) para cada amostra2:
- Em seguida, calcule a duplicação relativa da população2:
- Finalmente, calcule a citotoxicidade2 para cada amostra:
- Usando as contagens celulares iniciais e as contagens de células pós-tratamento, primeiro calcule a duplicação populacional (DP) para cada amostra2:
- Método Cyt-B:
- Para calcular o Índice de Proliferação em Bloco de Citocinese (IPCB)2, use as contagens nas classes mononucleada, binucleada e polinucleada para cada amostra do arquivo class_count.csv :
- Para calcular a citotoxicidade2, utilizar o CBPI das culturas controle (C) e expostas (T):
- Para calcular o Índice de Proliferação em Bloco de Citocinese (IPCB)2, use as contagens nas classes mononucleada, binucleada e polinucleada para cada amostra do arquivo class_count.csv :
- Método não Cyt-B:
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Representative Results
A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para usar o software de IA para criar um modelo para o ensaio MN. O usuário carrega os arquivos .daf desejados no software de IA e, em seguida, atribui objetos às classes de modelo verdade terrestre usando os algoritmos de marcação de cluster assistido por IA (Figura 2) e de previsão (Figura 3). Uma vez que todas as classes de modelo verdade terrestre tenham sido preenchidas com objetos suficientes, o modelo pode ser treinado usando os algoritmos RF ou CNN. Após o treinamento, o desempenho do modelo pode ser avaliado usando ferramentas que incluem histogramas de distribuição de classes, estatísticas de acurácia e uma matriz de confusão interativa (Figura 4). A partir da tela de resultados no software de IA, o usuário pode retornar à parte de treinamento do fluxo de trabalho para aprimorar os dados de verdade terrestres ou, se a precisão suficiente tiver sido alcançada, o usuário pode usar o modelo para classificar dados adicionais.
Usando os algoritmos de cluster e de previsão, 190 segmentos com um total de 285.000 objetos foram atribuídos às classes de verdade básicas apropriadas até que todas as classes fossem preenchidas com entre 1.500 e 10.000 imagens. No total, 31.500 objetos (apenas 10,5% dos objetos iniciais carregados) foram utilizados no treinamento desse modelo. Precisão (porcentagem de falsos positivos), evocação (porcentagem de falsos negativos) e escore F1 (equilíbrio entre precisão e recordação) estão disponíveis no pacote de software de aprendizado profundo para quantificar a precisão do modelo. Aqui, essas estatísticas variaram de 86,0% a 99,4%, indicando alta acurácia do modelo (Figura 4).
Usando Cyt-B, as frequências de MN de fundo para todas as amostras controle ficaram entre 0,43% e 1,69%, comparando bem com aliteratura17. Aumentos estatisticamente significativos na frequência de NM, variando de 2,09% a 9,50% para MMC (Mitomicina C) e de 2,99% a 7,98% para Etoposídeo, foram observados quando comparados aos controles com solvente e bem comparados com a pontuação de microscopia manual. Ao examinar o controle negativo Mannitol, não foram observados aumentos significativos na frequência de NM. Além disso, foi observado aumento da citotoxicidade com a dose tanto para Etoposide quanto para MMC, com microscopia e IA mostrando tendências semelhantes em toda a faixa de dose. Para o Mannitol, não foi observado aumento observável da citotoxicidade (Figura 5).
Quando não se utilizou Cyt-B, as frequências de MN de fundo para todas as amostras controle ficaram entre 0,38% e 1,0%, concordando com resultados publicados na literatura17. Aumentos estatisticamente significativos na frequência de NM, variando de 2,55% a 7,89% para MMC e de 2,37% a 5,13% para Etoposide, foram observados quando comparados aos controles com solvente e bem comparados com a pontuação de microscopia manual. Ao examinar o controle negativo Mannitol, não foram observados aumentos significativos na frequência de NM. Além disso, o aumento da citotoxicidade com a dose foi observado tanto para Etoposide quanto para MMC, com a microscopia e o IA mostrando tendências semelhantes em todo o intervalo de doses. Para o Mannitol, não foi observado aumento observável da citotoxicidade (Figura 5).
Ao pontuar por microscopia, de cada cultura, 1.000 células binucleadas foram pontuadas para avaliar a frequência de MN e outras 500 células mononucleadas, binucleadas ou polinucleadas foram pontuadas para determinar a citotoxicidade na versão Cyt-B do ensaio. Na versão não-Cyt-B do ensaio, 1.000 células mononucleadas foram pontuadas para avaliar a frequência de MN. Por IFC, uma média de 7.733 células binucleadas, 6.493 células mononucleadas e 2.649 células polinucleadas foram pontuadas por cultura para determinar a citotoxicidade. A frequência de MN foi determinada a partir da população de células binucleadas para a versão Cyt-B do ensaio. Para a versão não-Cyt-B do ensaio, uma média de 27.866 células mononucleadas foi avaliada para a presença de MN (Figura 5).
Figura 1: Fluxo de trabalho do software de IA. O usuário começa selecionando os arquivos .daf a serem carregados no software de IA. Depois que os dados são carregados, o usuário começa a atribuir objetos às classes de modelo verdade de terra por meio da interface do usuário. Para ajudar na população de verdade terrestre, os algoritmos de agrupamento e previsão podem ser usados para identificar imagens com morfologia semelhante. Depois que objetos suficientes tiverem sido adicionados a cada classe de modelo, o modelo poderá ser treinado. Após o treinamento, o usuário pode avaliar o desempenho do modelo usando as ferramentas fornecidas, incluindo uma matriz de confusão interativa. Finalmente, o usuário pode retornar à parte de treinamento do fluxo de trabalho para aprimorar os dados de verdade de base ou, se a precisão suficiente tiver sido alcançada, o usuário pode sair do loop do fluxo de trabalho de treinamento/marcação e usar o modelo para classificar dados adicionais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Algoritmo de cluster. O algoritmo de cluster pode ser executado a qualquer momento em um segmento de 1.500 objetos selecionados aleatoriamente a partir dos dados de entrada. Esse algoritmo agrupa objetos semelhantes dentro de um segmento de acordo com a morfologia de objetos não classificados e objetos que foram atribuídos às classes de modelo verdade básicas. Imagens de exemplo mostram células binucleadas, mononucleadas e multinucleadas, e células com morfologia irregular. Aglomerados contendo células mononucleadas caem em um lado do mapa de objetos, enquanto aglomerados com células multinucleadas estão no lado oposto do mapa de objetos. Aglomerados de células binucleadas situam-se em algum lugar entre aglomerados de células mono e multinucleadas. Finalmente, aglomerados com morfologia irregular caem em uma área diferente do mapa de objetos. A interface do usuário permite adicionar clusters inteiros, ou selecionar objetos dentro de clusters, às classes de modelo verdade de base. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Algoritmo de previsão. O algoritmo de previsão requer um mínimo de 25 objetos em cada classe de modelo verdade fundamental e tenta prever a classe de modelo mais apropriada para atribuir objetos não classificados dentro de um segmento. O algoritmo de predição é mais robusto em comparação ao algoritmo de agrupamento no que diz respeito à identificação de morfologias sutis em imagens (i.e., células mononucleadas com MN [amarelo] versus células mononucleadas sem MN [vermelho]). Objetos com essas semelhanças são colocados próximos no mapa de objetos; no entanto, o usuário é facilmente capaz de inspecionar as imagens em cada classe prevista e atribuir objetos à classe de modelo apropriada. Os objetos para os quais o algoritmo não consegue prever uma classe permanecerão como 'desconhecidos'. O algoritmo de previsão permite que os usuários preencham rapidamente as classes do modelo de verdade terrestre, particularmente no caso de eventos considerados raros e difíceis de encontrar nos dados de entrada, como células micronucleadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Matriz de confusão com resultados do modelo. A tela de resultados do software de IA apresenta ao usuário três ferramentas diferentes para avaliar a precisão do modelo. (A) Os histogramas de distribuição de classes permitem que o usuário clique nos compartimentos do histograma para avaliar a relação entre objetos nas populações verdade e objetos que foram previstos para pertencer àquela classe modelo. Em geral, quanto mais próximos os valores percentuais entre as populações verdade e predita estiverem um do outro para uma determinada classe de modelo, mais preciso será o modelo. (B) A tabela de estatísticas de precisão permite que o usuário avalie três métricas comuns de aprendizado de máquina para avaliar a precisão do modelo: precisão, recall e F1. Em geral, quanto mais próximas essas métricas estiverem de 100%, mais preciso será o modelo na identificação de eventos nas classes de modelo. Finalmente, (C) a matriz de confusão interativa fornece uma indicação de onde o modelo está classificando erroneamente os eventos. As entradas no eixo (verde) indicam objetos dos dados de verdade do solo que foram classificados corretamente durante o treinamento. Entradas fora do eixo (laranja sombreado) indicam objetos dos dados de verdade do solo que foram classificados incorretamente. Vários exemplos de objetos mal classificados são mostrados, incluindo (i) uma célula mononucleada classificada como uma célula mononucleada com MN, (ii) uma célula binucleada classificada como uma célula binucleada com MN, (iii) uma célula mononucleada classificada como uma célula com morfologia irregular, (iv) uma célula binucleada com MN classificada como uma célula com morfologia irregular, e (v) uma célula binucleada com um MN classificado como uma célula binucleada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados de genotoxicidade e citotoxicidade. Genotoxicidade medida pela porcentagem de MN por microscopia (barras transparentes) e AI (barras pontilhadas) após uma exposição de 3 h e recuperação de 24 h para Mannitol, Etoposide e MMC usando os métodos (A-C) Cyt-B e (D-F) não-Cyt-B. Aumentos estatisticamente significativos na frequência de NM em relação aos controles são indicados por asteriscos (*p < 0,001, Teste Exato de Fisher). As barras de erro representam o desvio padrão da média de três culturas replicadas em cada ponto de dose, exceto para MMC por microscopia, onde apenas culturas duplicadas foram pontuadas. Esse valor foi modificado de Rodrigues et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O trabalho aqui apresentado descreve o uso de algoritmos de aprendizagem profunda para automatizar a pontuação do ensaio MN. Diversas publicações recentes têm demonstrado que ferramentas intuitivas e interativas permitem a criação de modelos de deep learning para analisar dados de imagens sem a necessidade de conhecimento computacional aprofundado18,19. O protocolo descrito neste trabalho usando um pacote de software orientado por interface de usuário foi projetado para funcionar bem com arquivos de dados muito grandes e permitir a criação de modelos de aprendizagem profunda com facilidade. Todas as etapas necessárias para criar e treinar modelos de RF e CNN no pacote de software de IA são discutidas, permitindo a identificação e quantificação altamente precisas de todos os eventos-chave nas versões Cyt-B e não-Cyt-B do ensaio. Finalmente, os passos para usar esses modelos de aprendizagem profunda para classificar dados adicionais e avaliar a citotoxicidade química e a frequência de MN são descritos.
O software de IA usado neste trabalho foi criado com uma interface de usuário conveniente e construído para trabalhar facilmente com grandes conjuntos de dados gerados a partir de sistemas IFC. O treinamento, a avaliação e o aprimoramento de modelos de aprendizagem profunda seguem uma abordagem iterativa direta (Figura 1), e a aplicação dos modelos treinados para classificar dados adicionais pode ser realizada em apenas algumas etapas. O software contém algoritmos distintos de cluster (Figura 2) e de previsão (Figura 3) que permitem a rápida atribuição de objetos em classes de modelo verdade de solo apropriadas. O protocolo neste artigo demonstra como um modelo CNN, construído e treinado usando software de IA, é capaz de identificar robustamente todos os eventos-chave no ensaio MN; Ele produz resultados que se comparam bem com a microscopia tradicional, eliminando assim a exigência de análise de imagem e experiência em codificação computacional. Além disso, os resultados do modelo interativo (Figura 4) permitem a investigação de eventos específicos que o modelo está classificando erroneamente. O processo iterativo permite atribuir esses eventos classificados incorretamente às classes de modelo apropriadas para que o modelo possa ser treinado novamente para melhorar a precisão.
Os resultados aqui apresentados (Figura 5) mostram a avaliação do manitol, etoposídeo e MMC utilizando microscopia e um modelo CNN criado no software AI. Usando ambas as versões do ensaio de MN, avaliadas com um único modelo de IA, aumentos na citotoxicidade são consistentes com doses crescentes para MMC e Etoposide, enquanto a exposição ao manitol não produz aumento na citotoxicidade, como esperado. Para a avaliação da genotoxicidade, aumentos significativos (Teste Exato de Fisher, unilateral) na frequência de MN foram demonstrados usando MMC e Etoposide, mas não usando Mannitol. Os resultados para a microscopia e o modelo de IA compararam-se bem entre os intervalos de dose para cada produto químico testado.
Em várias publicações anteriores, foi demonstrado que um ensaio de MN baseado em IFC pode ser realizado com etapas simples e simples de preparação da amostra, juntamente com uma análise baseada em imagem usando máscaras (regiões de interesse que destacam pixels em uma imagem) e recursos calculados usando essas máscaras para pontuar automaticamente todos os eventos-chave12,13,16 . Este ensaio baseado em IFC aproveita os pontos fortes do IFC, incluindo captura de imagem de alto rendimento, processamento simplificado de amostras com corantes de DNA simples e diferenciação automatizada de imagens celulares com morfologia que se alinha com os critérios de pontuação de ensaio de MN publicados. No entanto, esse fluxo de trabalho também incluiu desvantagens, como a complexidade das técnicas de análise baseadas em recursos, que muitas vezes são rígidas e requerem conhecimento avançado de pacotes de software de análise de imagem12. O uso de deep learning para analisar dados de NM adquiridos pela IFC demonstra que as CNNs podem ser usadas para romper com as restrições e dificuldades das análises baseadas em recursos, produzindo resultados altamente precisos e que se comparam bem com a pontuação da microscopia14,15. Embora essa abordagem baseada em IA seja promissora, novos estudos com uma seleção expandida de produtos químicos bem descritos devem ser realizados para testar e validar ainda mais a robustez da técnica. Este trabalho demonstra ainda mais as vantagens da IFC sobre métodos mais tradicionais, como microscopia e citometria de fluxo convencional, para melhorar o desempenho de ensaios com morfologias desafiadoras e requisitos rigorosos de pontuação.
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Disclosures
Os autores são empregados pela Luminex Corporation, uma empresa DiaSorin, fabricante do citômetro de fluxo de imagem ImageStream e do software Amnis AI usado neste trabalho.
Acknowledgments
Nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser - Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler - 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC - ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software - IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software - INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse - Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath - PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer - 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
References
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