Summary
Mikrokärnanalysen (MN) är ett väletablerat test för kvantifiering av DNA-skador. Att göra analysen med konventionella tekniker som manuell mikroskopi eller funktionsbaserad bildanalys är dock mödosamt och utmanande. Detta dokument beskriver metoden för att utveckla en artificiell intelligensmodell för att poängsätta MN-analysen med hjälp av bildflödescytometridata.
Abstract
Mikrokärnanalysen (MN) används över hela världen av tillsynsorgan för att utvärdera kemikalier för genetisk toxicitet. Analysen kan utföras på två sätt: genom att poängsätta MN i en gång uppdelade, cytokineseblockerade binukleerade celler eller helt uppdelade mononukleerade celler. Historiskt sett har ljusmikroskopi varit guldstandardmetoden för att göra analysen, men det är mödosamt och subjektivt. Flödescytometri har använts under de senaste åren för att poängsätta analysen, men begränsas av oförmågan att visuellt bekräfta viktiga aspekter av cellulära bilder. Imaging flow cytometry (IFC) kombinerar bildtagning med hög genomströmning och automatiserad bildanalys och har framgångsrikt tillämpats för att snabbt få bilder av och poängsätta alla viktiga händelser i MN-analysen. Nyligen har det visats att metoder för artificiell intelligens (AI) baserade på konvolutionella neurala nätverk kan användas för att poängsätta MN-analysdata som förvärvats av IFC. I det här dokumentet beskrivs alla steg för att använda AI-programvara för att skapa en djupinlärningsmodell för att poängsätta alla viktiga händelser och tillämpa den här modellen för att automatiskt poängsätta ytterligare data. Resultat från AI-djupinlärningsmodellen jämförs väl med manuell mikroskopi, vilket möjliggör helt automatiserad poängsättning av MN-analysen genom att kombinera IFC och AI.
Introduction
Mikrokärnanalysen (MN) är grundläggande inom genetisk toxikologi för att utvärdera DNA-skador vid utveckling av kosmetika, läkemedel och kemikalier för humant bruk 1,2,3,4. Mikrokärnor bildas av hela kromosomer eller kromosomfragment som inte införlivas i kärnan efter delning och kondenseras till små, cirkulära kroppar separerade från kärnan. Således kan MN användas som slutpunkt för att kvantifiera DNA-skador vid genotoxicitetstestning1.
Den föredragna metoden för kvantifiering av MN är inom en gång uppdelade binucleated cells (BNC) genom att blockera delning med cytochalasin-B (Cyt-B). I denna version av analysen bedöms cytotoxicitet också genom att poängsätta mononukleerade (MONO) och polynukleerade (POLY) celler. Analysen kan också utföras genom att poängsätta MN i oblockerade MONO-celler, vilket är snabbare och lättare att poängsätta, med cytotoxicitet som bedöms med hjälp av celltal före och efter exponering för att bedöma proliferation 5,6.
Fysisk poängsättning av analysen har historiskt utförts genom manuell mikroskopi, eftersom detta möjliggör visuell bekräftelse av alla viktiga händelser. Manuell mikroskopi är dock utmanande och subjektiv1. Således har automatiserade tekniker utvecklats, inklusive mikroskopskanning och flödescytometri, var och en med sina egna fördelar och begränsningar. Medan diaskanningsmetoder gör det möjligt att visualisera viktiga händelser, måste bilder skapas med optimal celldensitet, vilket kan vara svårt att uppnå. Dessutom saknar denna teknik ofta cytoplasmatisk visualisering, vilket kan äventyra poängsättningen av MONO och POLY celler 7,8. Medan flödescytometri erbjuder datainsamling med hög genomströmning måste cellerna lyseras, vilket inte tillåter användning av Cyt-B-formen av analysen. Dessutom, som en icke-avbildningsteknik, ger konventionell flödescytometri inte visuell validering av nyckelhändelser 9,10.
Därför har avbildningsflödescytometri (IFC) undersökts för att utföra MN-analysen. ImageStreamX Mk II kombinerar hastigheten och den statistiska robustheten hos konventionell flödescytometri med de högupplösta avbildningsfunktionerna hos mikroskopi i ett enda system11. Det har visats att genom att använda IFC kan högupplösta bilder av alla viktiga händelser fångas och automatiskt poängsättas med hjälp av funktionsbaserade 12,13 eller artificiell intelligens (AI) tekniker 14,15. Genom att använda IFC för att utföra MN-analysen kan automatisk poängsättning av många fler celler jämfört med mikroskopi på kortare tid uppnås.
Detta arbete avviker från ett tidigare beskrivet arbetsflöde för bildanalys16 och diskuterar alla steg som krävs för att utveckla och träna en Random Forest (RF) och/eller CNN-modell (Convolutional Neural Network) med hjälp av Amnis AI-programvara (hädanefter kallad "AI-programvara"). Alla nödvändiga steg beskrivs, inklusive att fylla i marksanningsdata med hjälp av AI-assisterade taggningsverktyg, tolkning av modellträningsresultat och tillämpning av modellen för att klassificera ytterligare data, vilket möjliggör beräkning av genotoxicitet och cytotoxicitet15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Datainsamling med hjälp av bildflödescytometri
Se Rodrigues et al.16 med följande ändringar, notera att förvärvsregionerna som använder IFC kan behöva modifieras för optimal bildtagning:
- För icke-Cyt-B-metoden, utför ett celltal med hjälp av en kommersiellt tillgänglig cellräknare enligt tillverkarens anvisningar (se materialförteckning) för varje odling omedelbart före odling och omedelbart efter återhämtningsperioden.
- Om du kör prover på en enda kameraflödescytometer placerar du Brightfield (BF) i kanal 4. Ersätt M01 med M04 och M07 med M01.
OBS: "M" avser kamerakanalen på IFC. - Använd 40x förstoring under förvärvet.
- I BF-området jämfört med BF-bildförhållandediagrammet under anskaffningen använder du följande regionkoordinater:
X-koordinater: 100 och 900; Y-koordinater: 0,7 och 1 (Cyt-B-metoden)
X-koordinater: 100 och 600; Y-koordinater: 0,7 och 1 - I Hoechst-intensitetsdiagrammet använder du följande regionkoordinater:
X-koordinater: 55 och 75; Y-koordinater: 9,5 och 15 (Cyt-B-metoden)
X-koordinater: 55 och 75; Y-koordinater: 13 och 21 (icke-Cyt-B-metod) - För att ta bort bilder av apoptotiska och nekrotiska objekt från data, starta programvarupaketet IDEAS 6.3 (hädanefter kallat "bildanalysprogramvaran"; se Materialförteckning).
AI-programvaran har utformats för att fungera med .daf-filer som har bearbetats med den senaste versionen av bildanalysprogramvaran. Se till att bildanalysprogrammet är uppdaterat. - Spara det här arbetet som en mallfil (.ast).
2. Skapa .daf-filer för alla .rif-filer
- AI-programvaran tillåter endast import av .daf-filer. Skapa .daf-filer för alla .rif-filer i experimentet genom batchbearbetning.
- Under menyn Verktyg klickar du på Batchdatafiler och klickar sedan på Lägg till batch.
- I det nya fönstret väljer du Lägg till filer och väljer de .rif-filer som ska läggas till i bunten. Under alternativet Välj en mall eller dataanalysfil (.ast, .daf) väljer du den AST-fil som skapades tidigare.
- Tilldela ett batchnamn om det behövs och klicka på OK för att skapa .daf-filer för alla laddade .rif-filer.
3. Skapa ett experiment i AI-programvaran
- Se flödesschemat i figur 1 som beskriver processen för att skapa en djupinlärningsmodell med hjälp av AI-programvaran.
- Starta AI-programvaran och se till att den senaste versionen är installerad genom att klicka på Om i det nedre vänstra hörnet av fönstret. Om den senaste versionen inte är installerad, kontakta support@luminexcorp.com för att få den.
- Standardskärmen i programvaran är skärmen Nytt experiment . Använd mappikonen för att välja var experimentet ska sparas och ange ett namn för experimentet (t.ex. "MN-modell").
- Under Experimenttyp klickar du på alternativknappen bredvid Träna för att starta ett träningsexperiment för att börja skapa CNN-modellen. Klicka på Nästa.
- Valfritt: om en modell har tränats tidigare kan den användas som mall för en ny AI-modell och kan väljas som mall för att skapa en ny modell från skärmen Välj mallmodell . Om det inte finns någon mallmodell hoppar du bara över det här steget genom att klicka på Nästa.
- Nästa skärm är skärmen Definiera ny modell . Under Modell fylls namnet som gavs till modellen i steg 3.3 i automatiskt.
- Under Beskrivning anger du en beskrivning av modellen (valfritt) och lämnar den maximala bildstorleken på 150 bildpunkter.
- Under Kanaler klickar du på Lägg till BF för att lägga till en brightfield-kanal i listan. Under Namn dubbelklickar du på Brightfield och byter namn på den här kanalen till BF. Klicka på Lägg till FL för att lägga till en fluorescerande kanal i listan. Under Namn dubbelklickar du på Fluorescerande och byter namn på den här kanalen till DNA.
- Under Klassnamn klickar du på Lägg till. I popup-fönstret skriver du Mononucleated och klickar på OK. Då läggs den mononukleerade klassen till i listan över klassnamn. Upprepa den här processen för att säkerställa att följande sex klasser definieras i listan:
Mononukleerad
Mononukleerad med MN
Binucleated
Binucleated med MN
Polynukleerade
Oregelbunden morfologi
Klicka på Nästa.
OBS: Dessa sex grundsanningsmodellklasser representerar de viktigaste händelserna som ska poängsättas, liksom bilder med morfologi som skiljer sig från de accepterade poängkriterierna5.- Valfritt: Om så önskas kan analysmallen från 1.7 inkluderas för att använda funktioner från bildanalysprogrammet. Om du vill inkludera dessa funktioner i AI-modellen bläddrar du till .ast-filen och väljer sedan de funktionsdelmängder som du vill inkludera i de kanalspecifika listrutorna.
- Under Välj filer klickar du på Lägg till filer och bläddrar efter önskade filer som ska läggas till i AI-programvaran för att bygga grundsanningsdata. Klicka på Nästa.
Det är viktigt att lägga till flera datafiler (t.ex. positiva och negativa kontrolldata) som innehåller ett tillräckligt antal av alla viktiga händelser.
- På skärmen Välj baspopulationer letar du sedan upp den icke-apoptotiska populationen från befolkningshierarkin. Högerklicka på den icke-apoptotiska populationen och välj Välj alla matchande populationer. Klicka på Nästa.
OBS: Det är viktigt att utesluta alla populationer som inte bör klassificeras (t.ex. pärlor, skräp, dubbletter etc.) - Den här skärmen är skärmen Välj sanningspopulationer .
- Om taggade sanningspopulationer av nyckelhändelserna inte har skapats i bildanalysprogramvaran, klicka sedan på Nästa.
- Om taggade sanningspopulationer har skapats i bildanalysprogrammet tilldelar du dem till lämplig modellklass.
- Om du vill tilldela en taggad sanningspopulation av MONO-celler med MN klickar du på klassen Mononucleated with MN under Model Classes till vänster. Klicka sedan på lämplig taggad sanningspopulation till höger som innehåller dessa händelser.
- Om de taggade sanningspopulationerna har skapats i mer än en datafil högerklickar du på en av sanningspopulationerna och väljer Välj alla matchande populationer för att lägga till taggade populationer från flera filer i lämplig klass.
- När alla lämpliga sanningspopulationer har tilldelats klickar du på Nästa.
- På skärmen Välj kanaler väljer du lämpliga kanaler för experimentet. Ställ här in BF på kanal 1 och Hoechst på kanal 7. Högerklicka på en kanal och välj Använd för alla. Klicka på Nästa.
- Slutligen, på bekräftelseskärmen , klicka på Skapa experiment.
- AI-programvaran läser in bilder från datafilerna och skapar modellklasserna som definierades i steg 3.5.3 med de grundläggande sanningsbilder som tilldelades i steg 3.7. Klicka på Slutför.
- När experimentet har skapats presenteras fem alternativ:
Experiment: innehåller information om experimentet, inklusive inlästa datafiler, valda kanaler och definierade modellklasser för marksanning.
Taggning: startar taggningsverktyget genom vilket användare kan fylla i marksanningsdata.
Träning: tränar en modell baserad på marksanningsdata.
Klassificera: använder tränade modeller för att klassificera data.
Resultat: ger resultat från både ett träningsexperiment och ett klassificera experiment.
4. Fyll i marksanningsdata med hjälp av AI-assisterade taggningsverktyg
- Klicka på Taggning för att starta taggningsverktygets gränssnitt.
- Klicka på zoomverktygen (förstoringsglasikoner) för att beskära bilderna för enklare visning.
- Klicka på skjutreglaget för att justera bildstorleken för att ändra hur många bilder som visas i galleriet.
- Klicka på alternativet Skärminställning och välj Min-Max, vilket ger den bästa kontrastbilden för att identifiera alla viktiga händelser.
- Klicka på Setup Gallery Display för att ändra färgen på DNA-bilden till gul eller vit, vilket förbättrar visualiseringen av små objekt (t.ex. MN).
- Klicka på Kluster för att köra algoritmen för att gruppera objekt med liknande morfologi tillsammans. När klustringen är klar visas de enskilda klustren med antalet objekt per kluster i en lista under Okända populationer. Välj de enskilda klustren för att visa objekten i klustret och tilldela dessa objekt till lämpliga modellklasser.
- När minst 25 objekt har tilldelats till varje modellklass blir algoritmen Predict tillgänglig. Klicka på Förutsäg.
OBS: Objekt som inte passar bra in i någon population förblir klassificerade som okända. När fler objekt läggs till i sanningspopulationerna förbättras förutsägelsenoggrannheten. - Fortsätt att fylla i modellklasserna för marksanning med lämpliga bilder tills ett tillräckligt antal objekt i varje klass har nåtts.
- När minst 100 objekt har tilldelats varje modellklass klickar du på fliken Träning högst upp på skärmen. Klicka på knappen Träna för att skapa en modell med hjälp av algoritmerna Random Forest och CNN.
AI-programvaran skapar modeller med både Random Forest och CNN-algoritmerna, kryssrutorna tillåter endast skapande av modeller med Random Forest of CNN-algoritmer.
5. Bedömning av modellens noggrannhet
- När modellträningen är klar klickar du på Visa resultat.
- Använd resultatskärmen för att utvärdera modellens noggrannhet. Använd rullgardinsmenyn för att växla mellan Random Forest och CNN.
Sanningspopulationerna kan uppdateras och modellen kan tränas om eller användas som den är för att klassificera ytterligare data.- För att uppdatera sanningspopulationerna, klicka på Taggning högst upp och följ avsnitt 4.
6. Klassificera data med hjälp av modellen
- Starta AI-programvaran. Standardskärmen är skärmen Nytt experiment . Använd mappikonen för att välja var experimentet ska sparas och ange ett namn för experimentet.
- Under Experimenttyp klickar du på alternativknappen bredvid Klassificera för att starta ett klassificeringsexperiment. Klicka på Nästa.
- Klicka på modellen som ska användas för klassificering och klicka sedan på Nästa.
- På skärmen Välj filer klickar du på Lägg till filer och bläddrar efter filerna som ska klassificeras av CNN-modellen. Klicka på Nästa.
- På skärmen Välj baspopulationer klickar du sedan på kryssrutan bredvid den icke-apoptotiska populationen i en av de inlästa filerna. Högerklicka på den icke-apoptotiska populationen och klicka på Välj alla matchande populationer för att välja denna population från alla laddade filer. Klicka på Nästa.
- Valfritt: om data som ska klassificeras innehåller sanningspopulationer kan de tilldelas till lämpliga modellklasser på skärmen Välj sanningspopulationer. Annars klickar du på Nästa för att hoppa över det här steget.
- På skärmen Välj kanaler väljer du Kanal 1 för ljusfält och Kanal 7 för DNA-fläcken. Högerklicka på en kanal och klicka på Apply to All. Klicka sedan på Nästa.
- Slutligen, på bekräftelseskärmen , klicka på Skapa experiment. AI-programvaran laddar den valda modellen och alla bilder från de valda datafilerna. Klicka på Slutför.
- Klicka på Klassificera för att starta klassificeringsskärmen. Klicka på knappen Klassificera . Detta inleder processen med att använda RF- och CNN-modellen för att klassificera ytterligare data och identifiera alla objekt som hör hemma i de angivna modellklasserna.
OBS: Kryssrutorna kan användas för att välja RF-modell och / eller CNN-modell. - När klassificeringen är klar klickar du på Visa resultat.
- Klicka på knappen Uppdatera DAF för att öppna fönstret Uppdatera DAF med klassificeringsresultat. Klicka på OK för att uppdatera .daf-filerna.
7. Generera en rapport om klassificeringsresultaten
- På skärmen Resultat klickar du på Generera rapport. Markera kryssrutan bredvid Skapa rapport för varje indata-DAF om en enskild rapport för varje indata-DAF krävs. Klicka på OK.
- När du är klar öppnar du mappen där rapportfilerna har sparats. I mappen finns ett experiment .pdf rapporten och en resursmapp .
- Öppna .pdf för att visa rapporten. Rapporten innehåller modell- och experimentinformation, listan över indata-.daf-filer, klassantal och klassprocent i tabell- och histogramformat samt en förvirringsmatris som sammanfattar mediansannolikheten för förutsägelse för alla .daf-indatafiler.
- Öppna mappen Resources och sedan CNN-mappen . I den här mappen finns .png filer med klassräknings- och procentstapeldiagrammen samt förvirringsmatrisen. Dessutom finns det .csv filer som innehåller klassantal och procentsatser för varje indatafil.
8. Bestämning av MN-frekvens och cytotoxicitet
- Beräkning av MN-frekvens
- Icke-Cyt-B-metod: För att bestämma MN-frekvensen, öppna filen class_count.csv från steg 7.4. För varje indatafil dividerar du antalet i populationen "Mononucleated with MN" med antalet i populationen "Mononucleated" och multiplicerar med 100:
- Cyt-B-metod: För att bestämma MN-frekvensen, öppna filen class_count.csv från steg 7.4. För varje indatafil dividerar du antalet i populationen "Binucleated with MN" med räkningarna i populationen "Binucleated" och multiplicerar med 100:
- Icke-Cyt-B-metod: För att bestämma MN-frekvensen, öppna filen class_count.csv från steg 7.4. För varje indatafil dividerar du antalet i populationen "Mononucleated with MN" med antalet i populationen "Mononucleated" och multiplicerar med 100:
- Beräkning av cytotoxicitet
- Icke-Cyt-B-metod:
- Med hjälp av de initiala cellräkningarna och cellräkningarna efter behandling beräknar du först populationsfördubblingen (PD) för varje prov2:
- Beräkna sedan den relativa befolkningsfördubblingen2:
- Slutligen beräkna cytotoxicitet2 för varje prov:
- Med hjälp av de initiala cellräkningarna och cellräkningarna efter behandling beräknar du först populationsfördubblingen (PD) för varje prov2:
- Cyt-B-metod:
- För att beräkna cytokinesis-block proliferation index (CBPI)2, använd räkningarna i de mononukleerade, binucleated och polynucleated klasserna för varje prov från class_count.csv filen:
- För att beräkna cytotoxicitet2, använd CBPI från kontrollkulturerna (C) och exponerade kulturer (T):
- För att beräkna cytokinesis-block proliferation index (CBPI)2, använd räkningarna i de mononukleerade, binucleated och polynucleated klasserna för varje prov från class_count.csv filen:
- Icke-Cyt-B-metod:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bild 1 visar arbetsflödet för att använda AI-programvaran för att skapa en modell för MN-analysen. Användaren läser in önskade .daf-filer i AI-programvaran och tilldelar sedan objekt till marksanningsmodellklasserna med hjälp av AI-assisterade kluster- (figur 2) och förutsägningsalgoritmer (figur 3). När alla marksanningsmodellklasser har fyllts med tillräckligt många objekt kan modellen tränas med RF- eller CNN-algoritmerna. Efter träning kan modellens prestanda bedömas med hjälp av verktyg inklusive histogram för klassfördelning, noggrannhetsstatistik och en interaktiv förvirringsmatris (figur 4). Från resultatskärmen i AI-programvaran kan användaren antingen återgå till träningsdelen av arbetsflödet för att förbättra grundsanningsdata eller, om tillräcklig noggrannhet har uppnåtts, kan användaren använda modellen för att klassificera ytterligare data.
Med hjälp av både kluster- och förutsägalgoritmerna tilldelades 190 segment med totalt 285 000 objekt till rätt marksanningsklasser tills alla klasser fylldes med mellan 1 500 och 10 000 bilder. Totalt användes 31 500 objekt (endast 10,5% av de ursprungliga objekten laddade) vid träningen av denna modell. Precision (procentandel falska positiva resultat), återkallande (procentandel falska negativa) och F1-poäng (balans mellan precision och återkallelse) är tillgängliga i programvarupaketet för djupinlärning för att kvantifiera modellens noggrannhet. Här varierade denna statistik från 86,0% till 99,4%, vilket indikerar hög modellnoggrannhet (figur 4).
Med Cyt-B var bakgrunds-MN-frekvenserna för alla kontrollprover mellan 0,43% och 1,69%, vilket jämförde väl med litteratur17. Statistiskt signifikanta ökningar av MN-frekvensen, från 2,09% till 9,50% för (Mitomycin C) MMC och från 2,99% till 7,98% för etoposid, observerades jämfört med lösningsmedelskontroller och jämfördes väl med manuell mikroskopipoängning. Vid undersökning av den negativa kontrollen Mannitol observerades inga signifikanta ökningar av MN-frekvensen. Dessutom observerades ökande cytotoxicitet med dosen för både etoposid och MMC, med både mikroskopi och AI som visar liknande trender över dosintervallet. För mannitol sågs ingen observerbar ökning av cytotoxicitet (figur 5).
När Cyt-B inte användes var bakgrunds-MN-frekvenserna för alla kontrollprover mellan 0,38 % och 1,0 %, vilket överensstämde med resultaten publicerade i litteraturen17. Statistiskt signifikanta ökningar av MN-frekvensen, från 2,55% till 7,89% för MMC och från 2,37% till 5,13% för etoposid, observerades jämfört med lösningsmedelskontroller och jämfördes väl med manuell mikroskopipoäng. Vid undersökning av den negativa kontrollen Mannitol observerades inga signifikanta ökningar av MN-frekvensen. Vidare observerades ökande cytotoxicitet med dosen för både etoposid och MMC, med både mikroskopi och AI som visar liknande trender över dosintervallet. För mannitol sågs ingen observerbar ökning av cytotoxicitet (figur 5).
Vid poängsättning genom mikroskopi, från varje kultur, poängsattes 1 000 binucleated celler för att bedöma MN-frekvensen och ytterligare 500 mononucleated, binucleated eller polynucleated celler poängsattes för att bestämma cytotoxicitet i Cyt-B-versionen av analysen. I icke-Cyt-B-versionen av analysen poängsattes 1 000 mononukleerade celler för att bedöma MN-frekvensen. Vid IFC poängsattes i genomsnitt 7 733 binukleerade celler, 6 493 mononukleerade celler och 2 649 polynukleerade celler per kultur för att bestämma cytotoxicitet. MN-frekvensen bestämdes inifrån den binucleerade cellpopulationen för Cyt-B-versionen av analysen. För icke-Cyt-B-versionen av testet bedömdes i genomsnitt 27 866 mononukleerade celler för förekomst av MN (figur 5).
Bild 1: Arbetsflöde för AI-programvara. Användaren börjar med att välja de .daf-filer som ska laddas in i AI-programvaran. När data har lästs in börjar användaren tilldela objekt till marksanningsmodellklasserna via användargränssnittet. För att underlätta marksanningspopulationen kan kluster- och förutsägalgoritmerna användas för att identifiera bilder med liknande morfologi. När tillräckligt många objekt har lagts till i varje modellklass kan modellen tränas. Efter träningen kan användaren bedöma modellens prestanda med hjälp av de verktyg som tillhandahålls, inklusive en interaktiv förvirringsmatris. Slutligen kan användaren antingen återgå till utbildningsdelen av arbetsflödet för att förbättra grundläggande sanningsdata eller, om tillräcklig noggrannhet har uppnåtts, kan användaren gå ut ur arbetsflödesloopen för träning/taggning och använda modellen för att klassificera ytterligare data. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Klusteralgoritm. Klusteralgoritmen kan köras när som helst på ett segment med 1 500 objekt som väljs slumpmässigt från indata. Denna algoritm grupperar liknande objekt inom ett segment tillsammans enligt morfologin för både oklassificerade objekt och objekt som har tilldelats marksanningsmodellklasserna. Exempelbilder visar binukleerade, mononukleerade och flerkärniga celler och celler med oregelbunden morfologi. Kluster som innehåller enkärniga celler faller på ena sidan av objektkartan, medan kluster med flerkärniga celler är på motsatt sida av objektkartan. Binucleated cellkluster faller någonstans mellan mono- och flerkärniga cellkluster. Slutligen faller kluster med oregelbunden morfologi helt i ett annat område av objektkartan. Användargränssnittet tillåter att hela kluster läggs till, eller utvalda objekt i kluster, till de grundläggande sanningsmodellklasserna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 3: Förutsäg algoritm. Predict-algoritmen kräver minst 25 objekt i varje ground truth-modellklass och försöker förutsäga den lämpligaste modellklassen för att tilldela oklassificerade objekt inom ett segment. Prediktionsalgoritmen är mer robust jämfört med klusteralgoritmen med avseende på identifiering av subtila morfologier i bilder (dvs. mononukleerade celler med MN [gul] kontra mononukleerade celler utan MN [röd]). Objekt med dessa likheter placeras i närheten på objektkartan; Användaren kan dock enkelt inspektera bilderna i varje förutsagd klass och tilldela objekt till lämplig modellklass. Objekt som algoritmen inte kan förutsäga en klass för förblir "okända". Predict-algoritmen tillåter användare att snabbt fylla i grundsanningsmodellklasserna, särskilt när det gäller händelser som anses vara sällsynta och utmanande att hitta inom indata, såsom mikrokärnceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Förväxlingsmatris med modellresultat. Resultatskärmen för AI-programvaran ger användaren tre olika verktyg för att bedöma modellens noggrannhet. (A) Histogrammen för klassfördelning tillåter användaren att klicka på histogrammets fack för att bedöma förhållandet mellan objekt i sanningspopulationerna och objekt som förutspåddes tillhöra den modellklassen. I allmänhet, ju närmare procentvärdena mellan sanningen och förutsagda populationer är varandra för en given modellklass, desto mer exakt är modellen. (B) Noggrannhetsstatistiktabellen gör det möjligt för användaren att bedöma tre vanliga maskininlärningsmått för att bedöma modellens noggrannhet: precision, återkallande och F1. I allmänhet gäller att ju närmare dessa mått är 100 %, desto mer exakt är modellen när det gäller att identifiera händelser i modellklasserna. Slutligen (C) ger den interaktiva förvirringsmatrisen en indikation på var modellen felklassificerar händelser. Posterna på axeln (gröna) indikerar objekt från marksanningsdata som klassificerades korrekt under träningen. Poster utanför axeln (skuggad orange) anger objekt från markens sanningsdata som klassificerats felaktigt. Olika exempel på felklassificerade objekt visas, inklusive (i) en mononukleerad cell klassificerad som en mononukleerad cell med MN, (ii) en binucleated cell klassificerad som en binucleated cell med MN, (iii) en mononucleated cell klassificerad som en cell med oregelbunden morfologi, (iv) en binucleated cell med MN klassificerad som en cell med oregelbunden morfologi, och (v) en binucleated cell med en MN klassificerad som en binucleated cell. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Resultat av genotoxicitet och cytotoxicitet. Genotoxicitet mätt som procentandelen MN genom mikroskopi (klara staplar) och AI (prickade staplar) efter 3 timmars exponering och 24 timmars återhämtning för Mannitol, Etoposid och MMC med både (A-C) Cyt-B och (D-F) icke-Cyt-B-metoderna. Statistiskt signifikanta ökningar av MN-frekvensen jämfört med kontroller indikeras av asterisker (*p < 0,001, Fisher's Exact Test). Felstaplar representerar standardavvikelsen för medelvärdet från tre replikatkulturer vid varje dospunkt utom för MMC genom mikroskopi, där endast duplikatkulturer poängsattes. Denna siffra har modifierats från Rodrigues et al.15. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Arbetet som presenteras här beskriver användningen av djupinlärningsalgoritmer för att automatisera poängsättningen av MN-analysen. Flera nya publikationer har visat att intuitiva, interaktiva verktyg gör det möjligt att skapa djupinlärningsmodeller för att analysera bilddata utan behov av djupgående beräkningskunskap18,19. Protokollet som beskrivs i detta arbete med hjälp av ett användargränssnittsdrivet mjukvarupaket har utformats för att fungera bra med mycket stora datafiler och möjliggöra skapandet av djupinlärningsmodeller med lätthet. Alla nödvändiga steg för att skapa och träna RF- och CNN-modeller i AI-programvarupaketet diskuteras, vilket möjliggör mycket noggrann identifiering och kvantifiering av alla viktiga händelser i både Cyt-B- och icke-Cyt-B-versionerna av analysen. Slutligen beskrivs stegen för att använda dessa djupinlärningsmodeller för att klassificera ytterligare data och utvärdera kemisk cytotoxicitet och MN-frekvens.
AI-programvaran som används i detta arbete har skapats med ett bekvämt användargränssnitt och konstruerats för att fungera enkelt med stora dataset genererade från IFC-system. Träning, utvärdering och förbättring av djupinlärningsmodeller följer en enkel iterativ metod (figur 1), och tillämpning av de tränade modellerna för att klassificera ytterligare data kan åstadkommas i bara några steg. Programvaran innehåller distinkta kluster (figur 2) och förutsäga (figur 3) algoritmer som möjliggör snabb tilldelning av objekt till lämpliga marksanningsmodellklasser. Protokollet i detta dokument visar hur en CNN-modell, konstruerad och tränad med AI-programvara, kan robust identifiera alla viktiga händelser i MN-analysen; Det ger resultat som jämför väl med traditionell mikroskopi, vilket tar bort kravet på bildanalys och datorkodningserfarenhet. Dessutom tillåter de interaktiva modellresultaten (figur 4) undersökning av specifika händelser som modellen felklassificerar. Den iterativa processen gör det möjligt att tilldela dessa felklassificerade händelser till lämpliga modellklasser så att modellen kan tränas igen för att förbättra noggrannheten.
Resultaten som presenteras här (figur 5) visar utvärderingen av Mannitol, Etoposid och MMC med hjälp av mikroskopi och en CNN-modell skapad i AI-programvaran. Med båda versionerna av MN-analysen, utvärderad med en enda AI-modell, är ökningar av cytotoxicitet förenliga med ökande doser för både MMC och Etoposid, medan exponering för Mannitol inte ger någon ökning av cytotoxicitet, som förväntat. För utvärdering av genotoxicitet visades signifikanta (Fisher's Exact Test, ensidiga) ökningar av MN-frekvensen med användning av MMC och Etoposid men inte med Mannitol. Resultaten för både mikroskopi och AI-modellen jämfördes väl över dosintervallen för varje testad kemikalie.
I flera tidigare publikationer har det visats att en IFC-baserad MN-analys kan utföras med enkla och enkla provberedningssteg tillsammans med en bildbaserad analys med masker (intressanta regioner som markerar pixlar i en bild) och funktioner beräknade med dessa masker för att automatiskt poängsätta alla viktiga händelser12,13,16 . Denna IFC-baserade analys drar nytta av IFC: s styrkor, inklusive bildtagning med hög genomströmning, förenklad provbearbetning med enkla DNA-färgämnen och automatiserad differentiering av cellulära bilder med morfologi som överensstämmer med publicerade MN-analyskriterier. Detta arbetsflöde inkluderade emellertid också nackdelar, såsom komplexiteten hos funktionsbaserade analystekniker som ofta är stela och kräver avancerad kunskap om programvarupaket för bildanalys12. Användningen av djupinlärning för att analysera MN-data som förvärvats av IFC visar att CNN kan användas för att bryta sig bort från begränsningarna och svårigheterna med funktionsbaserade analyser, vilket ger resultat som är mycket exakta och jämför bra med mikroskopipoäng14,15. Även om detta AI-baserade tillvägagångssätt är lovande, bör ytterligare studier med ett utökat urval av välbeskrivna kemikalier utföras för att ytterligare testa och validera teknikens robusthet. Detta arbete visar vidare fördelarna med IFC jämfört med mer traditionella metoder, såsom mikroskopi och konventionell flödescytometri, för att förbättra analysernas prestanda med utmanande morfologier och stränga poängkrav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna är anställda av Luminex Corporation, ett DiaSorin-företag, tillverkaren av ImageStream-bildflödescytometern och Amnis AI-programvaran som används i detta arbete.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser - Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler - 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC - ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software - IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software - INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse - Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath - PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer - 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
References
- Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
- OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , OECD Publishing. Paris. (2016).
- Fenech, M.
- Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
- Fenech, M.
- Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).
- Seager, A. L., et al. Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells. Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).
- Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
- Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).
- Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
- Basiji, D. A. Principles of Amnis imaging flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
- Rodrigues, M. A. Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer. Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).
- Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).
- Wills, J. W., et al. Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).
- Rodrigues, M. A., et al. The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).
- Rodrigues, M. A. An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).
- Lovell, D. P., et al. Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hennig, H., et al. An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning. Methods. 112, 201-210 (2017).
