Summary
Den metaboliske status af humane retinale pigmentepitelceller (H-RPE) afspejler deres sundhed og funktion. Her præsenteres en optimeret protokol til undersøgelse af den metaboliske flux i realtid af H-RPE ved hjælp af respirometri med høj opløsning.
Abstract
Metabolisk dysfunktion af retinale pigmentepitelceller (RPE) er en vigtig patogen drivkraft for retinale sygdomme såsom aldersrelateret makuladegeneration (AMD) og proliferativ vitreoretinopati (PVR). Da RPE er stærkt metabolisk aktive celler, afspejler ændringer i deres metaboliske status ændringer i deres sundhed og funktion. Respirometri med høj opløsning muliggør kinetisk analyse i realtid af de to store bioenergetiske veje, glykolyse og mitokondriel oxidativ phosphorylering (OXPHOS), gennem kvantificering af henholdsvis den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) og iltforbrugshastigheden (OCR). Følgende er en optimeret protokol til udførelse af respirometri med høj opløsning på primære humane retinale pigmentepitelceller (H-RPE). Denne protokol giver en detaljeret beskrivelse af de trin, der er involveret i fremstilling af bioenergetiske profiler af RPE for at definere deres basale og maksimale OXPHOS og glykolytiske kapacitet. At udsætte H-RPE for forskellige lægemiddelinjektioner rettet mod mitokondrie- og glykolytmaskineriet resulterer i definerede bioenergetiske profiler, hvorfra vigtige metaboliske parametre kan beregnes. Denne protokol fremhæver BAM15's forbedrede respons som afkoblingsmiddel sammenlignet med carbonylcyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP) for at inducere den maksimale respirationskapacitet i RPE. Denne protokol kan bruges til at studere RPE's bioenergetiske status under forskellige sygdomstilstande og teste effekten af nye lægemidler til at genoprette RPE's basale metaboliske status.
Introduction
Retinale pigmentepitelceller (RPE) eksisterer som et monolag af pigmenterede epitelceller, der er strategisk placeret mellem fotoreceptorerne og det fenestrerede endotel i choriocapillaris. RPE er meget metabolisk aktive med adskillige funktioner, herunder (1) fagocytose af skurfotoreceptorskiver, (2) genbrug af visuelt pigment for at opretholde den visuelle cyklus, (3) transport af næringsstoffer, metabolitter, ioner og vand, (4) absorption af lys, (5) beskyttelse mod fotooxidation, (6) sekretion af væsentlige faktorer til støtte for retinal integritet og (7) dannelse af den ydre blod-retinale barriere1 . Degeneration af RPE er forbundet med metabolisk dysfunktion og mitokondriedefekter, hvilket fører til blændende øjensygdomme såsom aldersrelateret makuladegeneration (AMD) og proliferativ vitreoretinopati (PVR)2.
To vigtige bioenergetiske veje omfatter glykolyse, som forekommer i cytoplasmaet, og oxidativ phosphorylering (OXPHOS), som forekommer i mitokondrier. Under glykolyse omdannes et molekyle glucose til to molekyler pyruvat og en nettoproduktion af to molekyler adenosintrifosfat (ATP). I modsætning til glykolyse producerer OXPHOS langt højere niveauer af ATP (~ 32-38 molekyler ATP pr. Glukosemolekyle). Især forbruger OXPHOS ilt og kræver, at funktionelle mitokondrier forekommer, mens glykolyse forekommer i cytoplasmaet og ikke kræver ilt.
Før introduktionen af fluorescens- eller phosphorescensbaserede teknikker til undersøgelse af mitokondriel respiration blev iltniveauerne målt i permeabiliserede cellesuspensioner i kamre udstyret med en iltelektrode af Clark-typen3. Mens Clark-elektroden er meget billigere end fluorescensbaseret respirometri og fungerer i ikke-klæbende celler, er den relativt lav gennemstrømning, hvor hver åndedrætskørsel varer omkring 15-20 minutter og kræver langt større mængder celler til hver prøve3. Således har den fluorescensbaserede respirometriteknik stort set erstattet Clark-elektroden og er blevet en populær teknik inden for metabolisme og mitokondrieforskning.
Denne protokol beskriver en høj kapacitet, høj opløsning, fluorescensbaseret respirometri teknik, der kinetisk måler OXPHOS og glykolytiske bioenergetiske profiler af levende celler. Da processen med OXPHOS forbruger ilt, produceres den bioenergetiske profil for OXPHOS ved at kortlægge ændringer i iltforbrugshastigheden (OCR) over tid4. I denne teknik er to fluoroforer indlejret i sensorpatronhylsteret, der er forbundet med fiberoptiske bundter, der udsender lys og spænder fluoroforerne. Ændringer i fluoroforemission måles af meget følsomme fluorescenssensorer og overføres gennem det fiberoptiske bundt, der skal konverteres til en OCR-aflæsning5. Fluoroforen slukkes af ilt, hvilket muliggør bestemmelse af ekstracellulære iltniveauer i analysemediet, kendt som oxygenflux eller OCR. Den anden fluorofor er en pH-sensorsonde, der er følsom over for ændringer i protonefflux, som omdannes til et mål for ekstracellulær forsuringshastighed (ECAR). Under målinger sænkes de fiberoptiske bundter med indlejrede fluoroforer til 200 μm over cellemonolaget, hvilket skaber et forbigående mikrokammer, der muliggør hurtige aflæsninger i realtid. Når en 10% ændring i ilt- eller protonniveauer er detekteret, løftes sensorerne opad, hvilket tillader en større mængde medier at blande sig med de forbigående mikrokammermedier, hvilket gendanner OCR- og ECAR-værdier tilbage til baseline. Hver sensorpatron er udstyret med fire porte for at muliggøre sekventiel administration af op til fire forbindelser pr. brønd under analysen. Målinger kan indsamles før og efter injektion af forbindelserne i hver port, hvilket afslører nøgleoplysninger om cellernes metaboliske status.
Undersøgelse af disse to forskellige metaboliske veje kan give vigtige opdagelser vedrørende RPE's metaboliske status efter eksponering for forskellige patogene stimuli og kan således bruges til at teste effektiviteten af lægemidler til at genoprette den metaboliske integritet af RPE 6,7,8. Fremkomsten af respirometri med høj kapacitet og tilgængeligheden af specifikke mitokondriehæmmere har stimuleret mere forskning i at definere de bioenergetiske profiler af RPE og identificere defekter i metabolisme og mitokondrier under sygdomstilstande 6,7,8,9,10,11,12,13 . Respirometri med høj opløsning har fremhævet nøglerollen som metabolisk omprogrammering af RPE i retinale patologier som AMD og PVR. To vigtige cytokiner involveret i patogenesen af AMD og PVR transformerer vækstfaktor-beta 2 (TGFβ2) og tumornekrosefaktor-alfa (TNFα). Induktionen af epitel-mesenkymal overgang (EMT) af TGFβ2 ledsages af mitokondriel dysfunktion, OXPHOS-undertrykkelse og en kompenserende stigning i glycolytisk kapacitet i RPE6. For nylig har det proinflammatoriske cytokin, TNFα, vist sig at inducere en signifikant opregulering af basal OXPHOS og reduceret glykolyse i H-RPE7. Administration af dimethylfumarat undertrykte signifikant TNFα-induceret inflammation i H-RPE og genoprettede mitokondriemorfologi og basale bioenergetiske profiler7. De divergerende metaboliske profiler induceret af disse to vækstfaktorer stimulerer spændende mekanistiske spørgsmål vedrørende involvering af metabolisk omprogrammering i retinale sygdomme. Følgende protokol beskriver trinene til vurdering af OXPHOS og glykolytiske bioenergetiske profiler i H-RPE ved hjælp af respirometri med høj opløsning.
Protocol
1. Plating H-RPE i cellekulturpladen
- Optø H-RPE i en T25-kolbe i humant RPE-medium suppleret med RPE-vækstmediumtilskud (4 mM L-glutamin, 25 ng/ml FGF-2, 2% FBS, 30 mg/ml gentamicin og 15 μg/ml amphotericin).
- Cellerne inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i en befugtet inkubator. Opdater mediet næste dag, og vent på, at cellerne når mindst 80% sammenløb, før de passerer i forholdet 1:3 i en T75-kolbe.
- Når de er sammenflydende, skal du passere cellerne ved hjælp af subkulturreagenssættet, der består af trypsin / EDTA 0,025% opløsning, trypsinneutraliserende opløsning og HEPES-bufret saltvand (pH 7,0-7,6).
- Skyl H-RPE forsigtigt med 3 ml HEPES bufret saltvand. Derefter tilsættes 3 ml trypsin/EDTA og inkuberes (37 °C og 5% CO2) i 5 minutter (eller indtil cellerne har løftet bunden af kolben, som observeret under mikroskopet). Neutralisere trypsin / EDTA med 3 ml trypsin neutraliserende opløsning.
- Centrifuger cellerne ved 200 x g i 3,5 min for at danne cellepellet. Supernatanten suges forsigtigt og kasseres.
- Resuspender cellerne i humant RPE-medium til en slutkoncentration på 20.000 celler pr. 100 μL pr. hul.
- Pipetten pipetteres op og ned flere gange for at sikre, at cellesuspensionen er homogen, ved hjælp af en multikanalpipette for at lette og ensartetisere pipettering i mikropladen med 96 brønde cellekulturer. Hvil pipettespidsen lige under den cirkulære kant øverst i brønden for at få et jævnt, homogent cellelag.
BEMÆRK: Der kræves ingen belægning, da cellerne klæber godt til mikropladen. - Sørg for at lade de fire hjørnebrønde være tomme for celler (kun 100 μL medier) for at fungere som baggrundskorrektionsbrønde (figur 1A).
BEMÆRK: Mikropladen er formateret i et typisk 96-brønds pladedesign; Imidlertid er overfladearealet af hver brønd 0,106 cm2, hvilket er 40% mindre end en standard 96-brøndplade. Ved denne celletæthed skal cellerne være 100% sammenflydende den næste dag. Det anbefales at udføre et celletæthedsoptimeringseksperiment først, før du tester behandlinger for at sikre, at basale OCR- og ECAR-aflæsninger er henholdsvis omkring 50-100 pmol / min og 10-20 mpH / min.
- Pipetten pipetteres op og ned flere gange for at sikre, at cellesuspensionen er homogen, ved hjælp af en multikanalpipette for at lette og ensartetisere pipettering i mikropladen med 96 brønde cellekulturer. Hvil pipettespidsen lige under den cirkulære kant øverst i brønden for at få et jævnt, homogent cellelag.
- Lad cellekulturpladen stå ved stuetemperatur (RT) i 1 time, før den sættes tilbage i inkubatoren (5% CO2, 37 ° C, befugtet) for at minimere kanteffekter. Kanteffekter er ændringer i medievolumen i brøndene i de perifere grænser af 96-brøndpladen på grund af fordampning14.
BEMÆRK: Cellerne klæber natten over og danner et sammenflydende monolag den næste dag. H-RPE modnes i pladen i mindst 1 måned ved at opdatere halvdelen af vækstmediet hver 2-3 dage. - Undersøg cellerne under mikroskopet, før du skifter medie for at kontrollere deres morfologi og pigmenteringsniveau. Sørg for, at cellerne flyder sammen med en karakteristisk brostenslignende morfologi og erhverver pigmentering over tid, som det ses i morfologibillederne i Shu et al.7.
2. Dagen før analysen køres
- Sørg for, at sensorpatronen er hydreret dagen før analysen ved at fylde hvert hul på brugspladen med 200 μL deioniseret vand.
BEMÆRK: Låget på værktøjspladen indeholder fluorescerende biosensorer til måling af ilt- og pH-niveauer for hver brønd. Sensorerne er koblet til fiberoptiske bølgeledere, der leverer lys ved forskellige excitationsbølgelængder og transmitterer et fluorescerende signal gennem optiske filtre til fotodetektorer. - Anbring sensorpatronen nedsænket i vand i brugspladen sammen med ~20 ml kalibrant (for at varme op til brug næste dag) i en 37 °C befugtet ovn (uden CO2) natten over.
BEMÆRK: Kalibreringen er en proprietær løsning designet til kalibrering af sensorpatroner og har sandsynligvis samme sammensætning som fosfatbufret saltvand (PBS). Minimumstiden for patronhydrering er 4 timer, men de bedste resultater opnås med hydrering natten over. - Sørg for, at instrumentet er tændt, og start softwaren, så instrumentet stabiliseres til 37 °C natten over (figur 2). Generelt kan instrumentet efterlades tændt, selv når det ikke er i brug.
3. Mito-stresstest i realtid ved hjælp af den ekstracellulære fluxanalysator
- På analysedagen udskiftes vandet i brugspladen med en tilsvarende mængde opvarmet kalibrant mindst 45 minutter, før analysen køres.
- Foretag Mito-stresstestens analysemedier ved hjælp af basismediet uden phenolrød ved at tilføje kosttilskud, som vist i tabel 1. Mediet opvarmes til 37 °C, pH-værdien indstilles til 7,4, og mediet vakuumfiltreres ved hjælp af en rørfilterenhed. For at køre en fuld plade skal du lave ~ 25 ml analysemedier.
- Det humane RPE-medie fjernes, og det erstattes med 180 μL frisklavet analysemedie (trin 3.2). Cellekulturpladen anbringes i en befugtet 37 °C ovn (uden CO2) i 1 time, inden analysen påbegyndes.
BEMÆRK: Dette er vigtigt for afgasning af cellepladen, hvilket muliggør CO2 -diffusion. Da cellerne ikke længere er i deres vækstmedier og ikke længere i en inkubator med CO2, vil deres levedygtighed forringes over tid, derfor skal man sørge for at udføre analysen så effektivt som muligt. Der skal også udvises forsigtighed for at sikre, at der ikke er bobler i cellekulturpladen; Hvis nogen er til stede, skal du poppe dem med en pipette eller nål. - Hver sensorpatron har fire reagenstilførselsporte pr. brønd til injektion af testforbindelser i hullerne på cellekulturpladen under analysen (figur 1C, D). Forbered ~ 3 ml af de 10x lægemiddelopløsninger ved at fortynde lægemiddellagrene i de respektive analysemedier i henhold til tabel 2. For eksempel indlæses Port A med 25 μM oligomycin opløst i Mito-stresstestens analysemedier, således at når lægemiddelvolumenet injiceres i brønden af instrumentet, er den endelige koncentration, som hver celle udsættes for, 2,5 μM. Pipette 20 μL af 10x lægemiddelbestanden i Port A, 22 μL i Port B, og 25 μL i Port C for at opnå den specificerede endelige lægemiddelkoncentration i hvert hul. For protokoller, der kræver alle fire lægemiddelporte, pipetteres 28 μL ind i port D.
BEMÆRK: Se figur 1B , når lægemidlerne pipetteres ind i lægemiddelportene for korrekt orientering af port A/B/C/D. Hakket på kanten af patronen skal være placeret i nederste venstre hjørne, når lægemiddelportene indlæses. Ved at pipettere skråt ind i hver lægemiddelport kan bobler minimeres. Hvis der er bobler til stede, skal man sørge for at poppe dem med en pipette eller nål. - Åbn fanen Skabeloner i analysesoftwaren, vælg Mito-stresstest, og udfyld gruppedefinitionerne.
- Input detaljer om injektionsstrategien (i dette tilfælde er det forudindtastet som Mito Stress Test-lægemidler). Inputoplysninger om de forskellige eksperimentelle grupper i analysen (f.eks. Kontrol eller behandling). Indtast detaljer om analysemediet (tilsætning af forskellige kosttilskud og deres specifikke koncentrationer til basisanalysemediet ) og tilføj til sidst celletypen.
- Klik på den næste fane, Pladekort, hvor de forskellige grupper, der undersøges, vil blive tildelt deres specifikke placering på 96-brønds pladekortet. Når dette er gjort, skal du klikke på fanen Protokol for at gennemgå instrumentprotokollen for standard Mito-stresstestprotokollen .
BEMÆRK: Standard Mito Stress Test-skabelonen er klar til brug, men kan ændres på enhver måde, så den passer til det eksperimentelle design. For eksempel er standardmåletiden 3 min, men denne kan ændres til 5 min, hvis det ønskes.
- Klik på Kør assayet , og indsæt sensorpatronen, der er nedsænket i kalibreringsopløsningen, i værktøjspladen. Denne proces tager ca. 25 min. I dette trin kalibreres hver biosensor uafhængigt baseret på sensoroutputtet målt i kalibreringsopløsningen med kendt pH- og iltkoncentration.
- Når dette er kalibreret, fjernes hjælpepladen, og cellekulturpladen indsættes.
BEMÆRK: Cellekulturpladen ekvilibreres først, hvorefter instrumentet begynder at blande analysemediet og måle OCR- og ECAR-værdierne. Dette trin tager ca. 1,5 time og udføres inde i instrumentet uden nogen indgriben fra brugeren. En baselineaflæsning af OCR og ECAR etableres først ved at blande analysemediet i 3 minutter og derefter måle OCR og ECAR i 3 minutter. Instrumentet udfører tre sløjfer af blanding og måling. - Efter baselinemålingen injicerer instrumentet automatisk Port A-lægemiddelopløsningen i hver brønd. Dette efterfølges af tre sløjfer med blanding og måling (3 min hver). Det samme mønster forekommer efter hver efterfølgende lægemiddelinjektion (porte B og C).
- Når dette er kalibreret, fjernes hjælpepladen, og cellekulturpladen indsættes.
- Når kørslen er fuldført, skal du fjerne cellekulturpladen og sensorpatronen. Af hensyn til kvalitetskontrol skal du sikre dig, at alle lægemiddelporte i sensorcylinderampullen er blevet injiceret ved at undersøge portene for at kontrollere, at der ikke er nogen resterende medicin tilbage. Kassér sensorpatronen og brugspladen, da de er engangsprodukter.
- Undersøg cellerne i cellekulturmikropladen under mikroskopet for at sikre, at der stadig er et sammenflydende monolag af celler. Kassér analysemediet, og erstat det med 60 μL 1x lysisbuffer i hvert hul.
BEMÆRK: Lysisbufferen fremstilles af 10x lysisbuffer fortyndet til 1x i deioniseret vand med tilsætning af 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). - Pladens kanter pakkes ind i parafilm for at forhindre fordampning, og læg den i en fryser på -80 °C for at hjælpe med cellelyse natten over, før proteinindholdet kvantificeres ved hjælp af BCA-assayet.
- Til dataanalyse normaliseres alle data ved at dividere OCR- og ECAR-værdierne med mikrogrammet protein i hver brønd. Eksportér Mito-stresstestrapportgeneratoren, som bruger Excel-makroer til automatisk at beregne Mito-stresstestparametrene ved hjælp af dataanalysesoftwaren.
BEMÆRK: Dette kan bruges til at bestemme basal respiration, maksimal respiration, ekstra åndedrætskapacitet, protonlækage, ATP-produktion og ikke-mitokondriel respiration. Definitionerne af disse beregninger er anført i tabel 3.
4. Glykolytisk stresstest i realtid ved hjælp af den ekstracellulære fluxanalysator
- Udfør den glykolytiske stresstest ved at følge de samme trin som Mito-stresstesten, undtagen ved hjælp af de forskellige analysemedietilskud og lægemiddelinjektioner, der er vist i tabel 1 og tabel 2.
- Til dataanalyse skal du eksportere rapportgeneratoren til glykolytisk stresstest, som bruger Excel-makroer til automatisk at beregne parametrene for glykolytisk stresstest fra dataanalysesoftwaren.
BEMÆRK: Dette kan bruges til at bestemme ikke-glykolytisk forsuring, glykolyse, glykolytisk kapacitet og glykolytisk reserve. Definitionerne af disse beregninger er anført i tabel 3.
5. BCA-proteinkvantificeringsassay
BEMÆRK: Bicinchonic acid (BCA) proteinkvantificeringsassay (også kendt som Smith assay15) er et kobberbaseret kolorimetrisk assay, der anvendes til at bestemme det samlede proteinindhold i en prøve. Normalisering af OCR- og ECAR-data til mikrogrammet protein i hver brønd sikrer, at forskellige mængder celler / protein i hver brønd ikke skævvrider aflæsningerne. Mekanismen for BCA-analysen er baseret på to kemiske reaktioner. For det første reducerer peptidbindingerne i proteiner kobberioner (Cu2+) til kobberioner (Cu +), som er en temperaturafhængig reaktion assisteret af højere temperaturer (37 til 60 ° C). Hvis der er flere peptidbindinger, gør mængden af Cu2+ proportional med proteinindholdet i opløsningen16. Denne reaktion resulterer i en farveændring fra grøn til en intens lilla opløsning med en maksimal absorbans ved 562 nm16. Jo højere proteinindholdet i prøven er, desto højere er absorbansen ved denne bølgelængde. Arbejdsområdet for dette sæt er 20-2.000 μg/ml.
- BCA-analysesættet indeholder 1 ml alikvoter bovin serumalbumin (BSA) ved 2 mg / ml, der tjener som referencestandard for proteinkoncentration. Der fremstilles en seriel fortynding i en klar, fladbundet plade med 96 huller ved at starte fra den ufortyndede 2 mg/ml BSA og derefter halvere koncentrationen ved fortynding i deioniseret vand (f.eks. 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 mg/ml osv.). Ved hjælp af en kendt proteinkoncentration er det muligt at beregne en standardkurve, som bruges til at beregne proteinindholdet i forsøgsprøverne. For at forbedre nøjagtigheden af de beregnede målinger af proteinindhold måles absorbansaflæsningerne i referencestandarderne for proteinkoncentration sammen med forsøgsprøverne for hvert assay.
- Der pipetteres 25 μL af hver BSA-seriel fortynding i to eksemplarer i 96-brøndspladen.
- 25 μL af 1x lysisbufferen pipetteres i to eksemplarer ind i 96-brøndspladen for at tjene som blindprøve.
- Optø cellekulturpladen til stuetemperatur, og pipetter 25 μL af hvert cellelysat i to eksemplarer i 96-brøndpladen.
- Arbejdsreagenset fremstilles i forholdet 50:1 BCA-kitreagenser A:B. Bland grundigt ved hvirvelstrøm for at fjerne enhver turbiditet i arbejdsreagenset, så det er en homogen grøn opløsning. Der tilsættes 200 μL af arbejdsreagenset til hvert hul.
- Beskyt pladen mod lys ved at dække pladen med folie og inkuber den i en 37 °C ovn i 20 min.
- Absorbansen måles ved 562 nm i en pladelæser med 96 huller.
- Til dataanalyse skal du beregne gennemsnittet af alle duplikatværdierne. De blindabsorbansniveauer, der bestemmes fra hullerne med 1x lysisbuffer, trækkes fra målingerne af alle prøverne. Standardkurven bestemmes ved at plotte absorbansen af hver BSA-standard til dens kendte koncentration i μg/ml. Brug den lineære ligning afledt af standardkurven til at bestemme proteinkoncentrationen af de eksperimentelle prøver.
Representative Results
Instrumentet måler samtidig både OCR og ECAR for hver kørsel. For Mito-stresstesten er parameterberegninger baseret på OCR-aflæsninger (figur 3A), mens parameterberegninger for den glykolytiske stresstest er baseret på ECAR-aflæsninger (figur 3B). Figur 3 viser repræsentative grafer for Mito-stresstestens OCR-kurve over tid (figur 3C) og parameterberegninger i form af søjlediagrammer for H-RPE (figur 3D). Den glykolytiske stresstest er repræsenteret som en ECAR-kurve over tid (figur 3E), og parameterberegninger vises i søjlediagrammer for H-RPE (figur 3F).
Basal respiration giver en forståelse af cellernes energiske krav under basale forhold17. Den første lægemiddelinjektion, oligomycin (Oligo), er en ATP-syntasehæmmer, og derfor er enhver reduktion af OCR efter den første lægemiddelinjektion et mål for ATP-bundet respiration18. Enhver resterende basal respiration efter efterfølgende lægemiddelinjektioner betragtes som en protonlækage, da den ikke er koblet til ATP-syntese. Øget protonlækage kan indikere øget mitokondriel afkobling, som reguleres ved afkobling af proteiner, der er fysiologisk til stede, men som også har været forbundet med patologier som fedme, kræft, type 2-diabetes og hjerte-kar-sygdomme19. Den anden injektion er af et afkoblingsmiddel, såsom BAM15 eller FCCP, for at bestemme mitokondriernes maksimale respirationspotentiale. Afkoblingsmidler kollapser protongradienten og reducerer protonens bevægelseskraft over mitokondriets indre membran. Resultatet er en uhæmmet strøm af elektroner gennem elektrontransportkæden (ETC), hvilket hæver iltforbruget og får mitokondriel respiration til at nå sin maksimale kapacitet20. Ekstra åndedrætskapacitet (SRC) er forskellen mellem maksimal og basal respiration, hvilket indikerer cellernes evne til at reagere på ændringer i energiske krav, når de udfordres, hvilket indikerer cellekondition. Det er vigtigt, at BAM15 for Mito-stresstesten i H-RPE er bedre end FCCP med hensyn til at forbedre mitokondriel respirationskapacitet (figur 4A, B), da maksimal respiration og ekstra respirationskapacitet er signifikant højere med 10 μM BAM15 sammenlignet med 500 nM eller 1 μM FCCP. Der blev ikke observeret signifikante forskelle mellem nogen af FCCP-doserne. Den tredje og sidste injektion af rotenon og antimycin A (Rot / AA) hæmmer mitokondriekomplekser I og III henholdsvis af ETC, som lukker mitokondriel respiration; enhver resterende OCR skyldes ikke-mitokondrie kilder21.
Under glykolyse omdannes et molekyle glucose til to molekyler lactat i fravær af ilt. Ekstruderingen af lactat fra cellen ledsages af udstrømningen af en proton pr. Lactatmolekyle, hvilket forårsager forsuring af det ekstracellulære rum. Strømmen af protonproduktion i medierne måles ved ændringer i ECAR. Basalglykolyseniveauerne fastlægges først, hvorefter glucose injiceres i analysemediet, som er blottet for glucose, for at inducere glykolyse og dermed øge ECAR-niveauerne22. Oligomycin injiceres for at inducere den "højeste" ECAR, da det stopper mitokondriel ATP-produktion, hvilket tvinger cellen til at udlede sin ATP gennem glykolyse. Endelig lukkes glykolyse ned ved tilsætning af 2DG, som hæmmer hexokinase, det første enzym i glykolyse23. Eventuel resterende ECAR skyldes sandsynligvis andre kilder til forsuring, såsom CO2 -produktion ved TCA-cyklussen under OXPHOS, og betegnes som ikke-glykolytisk ECAR. Den glykolytiske reserve beregnes som forskellen mellem den "højeste" ECAR og ECAR i nærvær af glucose. Den glykolytiske kapacitet er summen af glykolyse og den glykolytiske reserve.
Figur 1: Komponenter i plade- og sensorpatronen . (A) Instrumentet, dataanalysesoftwaren og protokolopsætningsgrænsefladen vises. I 96-brønds kulturpladelayoutet er cellerne belagt i de blåfarvede brønde, og de fire hjørnebrønde er markeret med sort, da de fungerer som rygkorrektionsbrønde, der kun indeholder medier (og ingen celler). (B) Der er fire lægemiddelporte til hver brønd i sensorpatronen, hvor lægemiddel A, B, C og D kan isættes. De mængder, der skal pipetteres i hver port, er angivet baseret på beregningerne for 10x lægemiddellagerpræparater. (C) Sensorpatronen består af sensorsonder, som er placeret direkte i den kalibrantfyldte brugsplade. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Tidslinje for analysen. Cellerne podes i cellekulturpladen. Når analysen er klar, involverer den en 2-dages procedure efterfulgt af kvantificering af proteinindholdet ved hjælp af BCA-analysen og efterfølgende dataanalyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative grafer for Mito-stresstesten og den glykolytiske stresstest. Beregninger af (A) Mito Stress Test og (B) Glycolytic Stress Test parametre er afbildet i skemaet. (C) Repræsentativ iltforbrugskurve (OCR) og (D) Mito-stresstestparametre for H-RPE vises. (E) Repræsentativ kurve for ekstracellulær forsuringshastighed (ECAR) og (F) glykolytiske stresstestparametre for H-RPE vises. Fejlbjælker er midler ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Sammenligning af BAM15 versus FCCP som afkoblingsmiddel. Mito-stresstest på H-RPE, der sammenligner effekten af at inducere maksimal respiration ved hjælp af 10 μM BAM15, 500 nM FCCP eller 1 μM FCCP, der viser (A) iltforbrugshastighedskurven (OCR) og (B) Mito-stresstestparametrene. Fejlbjælker er midler ± SEM. **** p ≤ 0,0001; ns, ikke signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Test | Glukose (mM) | GlutaMax (mM) | Natriumpyruvat (mM) | HEPES (mM) |
| Mito stresstest | 25 | 2 | 1 | 1 |
| Glykolytisk stresstest | Ingen | 0.5 | Ingen | 1 |
Tabel 1: Koncentration af kosttilskud tilsat analysemedierne til Mito- og glykolytiske stresstest.
| Test | Havn A | Havn B | Port C |
| Mito stresstest | Oligomycin 2,5 μM | FCCP 500 nM ELLER BAM15 10 μM | Rotenone 2 μM OG Antimycin A 2 μM |
| Glykolytisk stresstest | Glukose 10 mM | Oligomycin 2 μM | 2-Deoxyglucose 50 mM |
Tabel 2: Koncentrationer af lægemiddelportinjektioner til Mito- og glykolytiske stresstest. Det er vigtigt at bemærke, at disse er de endelige koncentrationer, som cellerne udsættes for efter injektion af lægemidlerne i hver brønd. Lægemidlerne bør fremstilles 10x stærkere, når lægemiddelportene indlæses.
| Udtryk | Definition | |||
| Kalibrering | Kalibraren er en løsning, der bruges til kalibrering af sensorpatronen. Dens formulering er proprietær og har en lignende sammensætning som PBS. | |||
| Sensor patron | Sensorpatronen indeholder to fluoroforer indlejret i sensorpatronhylsteret, som er forbundet til fiberoptiske bundter, der udsender lys, spændende fluoroforerne. Den ene fluorofor måler iltflux, og den anden måler protonflux. Hver sensorpatron er også udstyret med 4 porte for at muliggøre sekventiel administration af op til 4 forbindelser pr. brønd under analysen. | |||
| Utility plade | Hjælpepladen (også kendt som kalibrantpladen) bruges til kalibrering af sensorerne. Calibrant-opløsningen anbringes i brugspladen. | |||
| Mito stresstest | Mito-stresstesten er navnet på analysen, der giver mitokondriel respirationsbioenergetisk profil ved at plotte ændringer i OCR over tid. | |||
| Glykolytisk stresstest | Den glykolytiske stresstest er navnet på det assay, der giver den glykolytiske bioenergetiske profil ved at plotte ændringer i ECAR over tid. | |||
| Iltforbrug (OCR) | Oxygenforbrugshastighed er et mål for iltflux (pmol / min) og angiver mitokondriets metaboliske status. | |||
| Ekstracellulær forsuringshastighed (ECAR) | Ekstracellulær forsuringshastighed er et mål for protonefflux (mpH / min) og angiver den glykolytiske metaboliske status. | |||
| Wave Software | Wave-softwaren bruges til programmering af analysen og efterfølgende dataanalyse | |||
| Ikke-mitokondrie iltforbrug | Minimumsmåling efter Rotenone/antimycin A-injektion | |||
| Basal Respiration | (Sidste hastighedsmåling før første injektion) – (ikke-mitokondriel respirationshastighed) | |||
| Maksimal åndedræt | (Måling af maksimal hastighed efter FCCP-injektion) – (ikke-mitokondriel respiration) | |||
| H+ (proton) lækage | (Minimumshastighedsmåling efter oligomycininjektion) – (ikke-mitokondriel respiration | |||
| ATP Produktion | (Sidste sats måling før oligomycin injektion) – (Mindste sats måling efter oligomycin injektion) | |||
| Ekstra åndedrætskapacitet | (Maksimal respiration) – (Basal respiration) | |||
| Ekstra åndedrætskapacitet i % | (Maksimal respiration) / (Basal respiration) × 100 | |||
| Kobling effektivitet | ATP-produktionshastighed) / (basal respirationshastighed) × 100 | |||
| Glykolyse | (Maksimal hastighedsmåling før oligomycininjektion) – (Sidste hastighedsmåling før glukoseinjektion) | |||
| Glykolytisk kapacitet | (Maksimal hastighedsmåling efter oligomycininjektion) – (Sidste hastighedsmåling før glukoseinjektion) | |||
| Glykolytisk reserve | (Glykolytisk kapacitet) – (Glykolyse) | |||
| Glykolytisk reserve i % | (Glykolytisk kapacitetshastighed) /(Glykolyse) × 100 | |||
| Ikke-glykolytisk forsuring | Sidste hastighedsmåling før glukoseinjektion | |||
Tabel 3: Liste over definitioner af analysens nøglekomponenter.
Discussion
Denne optimerede protokol til højopløsningsrespirometri af H-RPE involverer brugen af BAM15 som afkobler i stedet for den almindeligt anvendte FCCP. Mens tidligere undersøgelser af høj opløsning respirometri af RPE anvendte FCCP 9,24, synes BAM15 at inducere en mere robust induktion af maksimale respirationsniveauer i H-RPE sammenlignet med FCCP. Mens både FCCP og BAM15 er sikre at bruge i celler, rapporteres BAM15 at have færre bivirkninger i normale celler sammenlignet med FCCP eller carbonylcyanid-3-chlorphenylhydrazon (CCCP)25. Kenwood et al. viste, at BAM15 depolariserer mitokondrier uden at påvirke plasmamembranpotentialet og dermed inducerer en vedvarende maksimal mitokondriel respirationshastighed ved lav cytotoksicitet26. FCCP depolariserer derimod både mitokondrier og plasmamembranen og viser højere cytotoksicitet26.
Der er flere kritiske trin i protokollen, herunder at sikre, at cellerne er korrekt belagt i et sammenflydende, jævnt og homogent monolag af RPE i alle eksperimentelle brønde i mikropladen. Ældre RPE er stærkt afhængige af OXPHOS til energiproduktion, og cellerne skal derfor have lov til at modnes i mindst 1 måned for at sikre, at RPE genererer korrekte basale og maksimale OCR-aflæsninger under analysen. Afgasning af cellekulturpladen i 1 time ved 37 °C i en befugtet ovn (uden CO 2), inden den placeres i instrumentet, er afgørende for nøjagtige ECAR-aflæsninger, da CO2 kan påvirke analysemediets pH. Det er vigtigt at huske at hydrere sensorpatronen dagen før analysen for at sikre, at den giver pålidelige OCR- og ECAR-aflæsninger på analysedagen. Der skal udvises omhu for korrekt rekonstitution af de lægemidler, der skal injiceres, og alikvote de rekonstituerede lægemiddellagre i mindre mængder til langtidsopbevaring for at minimere fryse-/optøningscyklusser. Det er afgørende at forberede 10x lægemiddelopløsninger, der fortyndes i de respektive analysemedier (f.eks. Fortynd i Mito-stresstestanalysemedier til Mito-stresstesten) for at indregne fortyndingen fra injektion af lægemidlet i hver brønd fyldt med analysemedier. Ved hver efterfølgende lægemiddelinjektion er der flere medier i hver brønd, og derfor øges mængderne af lægemiddel, der fyldes med hver injektion, og man skal sørge for at følge de mængder, der er angivet i protokollen. Det er vigtigt at udføre kvalitetskontrol efter afslutningen af eksperimentet ved at undersøge sensorpatronen for at sikre, at der ikke er noget resterende lægemiddel tydeligt og observere cellekulturpladen under et mikroskop for at sikre, at det sammenflydende og homogene cellemonolag forbliver.
Ændringer af denne protokol inkluderer injektion af forskellige lægemidler i havnene og bestemmelse af, hvordan disse lægemidler påvirker OCR- og ECAR-aflæsninger. En populær ændring er at injicere et eksperimentelt lægemiddel efter eget valg som Port A, før du injicerer de sædvanlige Mito- eller glykolytiske stresstestlægemidler. Denne type protokol giver indsigt i, hvordan en akut injektion af det valgte lægemiddel påvirker de efterfølgende OXPHOS og glykolytiske parametre. Andre ændringer omfatter undersøgelse af forskellige celletyper; dette kræver indledende fejlfinding af den optimale såcelletæthed og optimering af analysemediet ved at sikre, at basale aflæsninger spænder fra 50-100 pmol / min for OCR og 10-20 mpH / min for ECAR. De optimale koncentrationer af de injicerede lægemidler skal bestemmes for hver ny celletype, der undersøges, ved at observere OCR- og ECAR-responserne på en seriel fortynding af lægemidlerne.
En vigtig begrænsning af protokollen er, at cellelevedygtigheden falder over tid, da cellerne ikke er i en CO2 -inkubator i deres normale vækstmedier, og analysen skal derfor afsluttes inden for 3-4 timer for at sikre maksimal cellelevedygtighed. Desuden kan eksponering for mitokondrietoksiner, der injiceres i hver brønd, yderligere mindske cellelevedygtigheden over tid. Når analysen er afsluttet, skal cellerne lyseres til evaluering af proteinindholdet for at normalisere OCR- og ECAR-aflæsninger, og derfor kan de samme celler ikke høstes til efterfølgende molekylærbiologiske assays.
Alternativer til Seahorse til bioenergetisk profilering inkluderer Oroboros Oxygraph 2k (O2k)27, BaroFuse28,29 og Resipher (Lucid Scientific)7. Oroboros O2k er et lukket to-kammer respirometer, der bruger S1 Clark-type polarografiske iltelektroder. Mens Oroboros O2k producerer meget følsomme målinger af metabolisk flux i realtid, er enheden arbejdskrævende, da operatøren skal injicere hvert lægemiddelmanuelt 30. BaroFuse er et nyt multikanals mikrofluidisk perfusionssystem, der bruger gastryk til at muliggøre flere parallelle perfusionseksperimenter og er knyttet til et iltdetekteringssystem til måling af OCR. Fordelen ved dette flowkultursystem er, at vævsfunktion og levedygtighed opretholdes i modsætning til Seahorse, hvor cellelevedygtigheden mindskes over længere assays. Resipher bruger meget følsomme optiske iltsensorer til at måle OCR, mens cellerne er i en 96-brønds plade i inkubatoren, hvilket muliggør kontinuerlige OCR-målinger over flere uger til måneder. Især måler disse instrumenter ikke ECAR, og derfor har Seahorse fordelen ved samtidig udforskning af både OXPHOS og glykolyse.
Forhør af bioenergetiske profiler i realtid af OXPHOS og glykolyse fremstår som en nøglefaktor i karakteriseringen af RPE's sundhed og funktion. Respirometri med høj opløsning muliggør et effektivt middel til at sammenligne metabolisk status for normal og syg RPE og åbner dermed nye muligheder for screening af lægemiddeleffektivitet for nethindesygdomme som AMD og PVR. Fremtidige retninger for respirometri med høj opløsning på RPE inkluderer optimering af en protokol til undersøgelse af bioenergetiske profiler for stærkt polariserede RPE-monolag dyrket på transwellfiltre. Calton et al. (2016) opnåede dette med succes ved at skære en trekantet sektion af det polariserede RPE-monolag dyrket på transwellfiltre31. Yderligere udvidelse af metoden omfatter undersøgelse af de bioenergetiske profiler af induceret pluripotent stamcelleafledt RPE (iPSC-RPE), isoleret fra patienter med forskellige retinale degenerative tilstande32. Udforskning af, hvordan patogene cytokiner involveret i AMD og PVR påvirker den dynamiske karakter af RPE-metabolisme, kan afsløre metaboliske sårbarheder, der kan informere identifikationen af nye lægemiddelbare mål.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev delvist støttet af tilskud fra: Fight for Sight Leonard & Robert Weintraub Postdoctoral Fellowship (D.Y.S.); BrightFocus Foundation Postdoc-stipendieprogram i makuladegenerationsforskning (M2021010F, D.Y.S.); Department of Defense, Spinal Vision Research Program under Award nr. VR180132 (M.S.-G. og L.A.K.); National Eye Institute of the National Institutes of Health under pris nr. R01EY027739 (L.A.K.). Der gives anerkendelse til donorerne af Macular Degeneration Research M2021010F, et program fra BrightFocus Foundation, til støtte for denne forskning. Skemaer blev oprettet med Biorender.com
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375-5G | Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection) |
| 96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile | VWR | 229597 | BCA Assay 96-well plate |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma | A8674-25MG | Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone) |
| BAM15 | Sigma | SML1760-5MG | Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection) |
| BCA Assay | ThermoFisher | 23225 | To determine total protein content in each well |
| Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge |
| Cell Lysis buffer 10x | Cell Signaling Technologies | 9803S | Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection) |
| DMSO, Cell culture grade | Sigma-aldrich | D4540-100ML | For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG |
| FCCP | Sigma | C2920-10MG | Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests |
| HEPES solution | Sigma | H0887-100ML | Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests |
| H-RPE – Human Retinal Pigment Epithelial Cells | Lonza | 194987 | Primary human fetal RPE cells |
| Oligomycin - CAS 1404-19-9 - Calbiochem | Sigma | 495455-10MG | ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection) |
| Parafilm | Bemis | PM996 | To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor | Gold Biotechnology Inc | 50-153-2823 | Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution |
| ReagentPack Subculture Reagents, 100 mL | Lonza | CC-5034 | Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline |
| Rotenone | Sigma | R8875-1G | Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A) |
| RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit - RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407) | Lonza | 195409 | Media for primary human fetal RPE cells |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | High-Resolution Respirometry Instrument | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution |
| Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636-100ML | Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 µm pore size | Millipore-Sigma | SCGP00525 | Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media |
| Synergy H1 Plate Reader | BioTek | Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay | |
| XF base medium without phenol red | Agilent | 103335-100 | Base media for running the Seahorse assay |
References
- He, Y., et al. Mitochondria impairment correlates with increased sensitivity of aging RPE cells to oxidative stress. Journal of Ocular Biology Diseases and Informatics. 3 (3), 92-108 (2010).
- Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: Emerging roles in age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4271 (2020).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 2-16 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protocol. 8 (10), 2850 (2018).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFbeta2-induced EMT of retinal pigment epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4701 (2021).
- Shu, D. Y., et al. Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium. Frontiers in Molecular Neuroscience. 15, 896786 (2022).
- Satish, S., Philipose, H., Rosales, M. A. B., Saint-Geniez, M. Pharmaceutical induction of PGC-1α promotes retinal pigment epithelial cell metabolism and protects against oxidative damage. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 9248640 (2018).
- Ferrington, D. A., et al. Altered bioenergetics and enhanced resistance to oxidative stress in human retinal pigment epithelial cells from donors with age-related macular degeneration. Redox Biology. 13, 255-265 (2017).
- Cai, H., et al. High-throughput screening identifies compounds that protect RPE cells from physiological stressors present in AMD. Experimental Eye Research. 185, 107641 (2019).
- Kurihara, T., et al. Hypoxia-induced metabolic stress in retinal pigment epithelial cells is sufficient to induce photoreceptor degeneration. Elife. 5, 14319 (2016).
- Ishii, M., Beeson, G., Beeson, C., Rohrer, B. Mitochondrial C3a receptor activation in oxidatively stressed epithelial cells reduces mitochondrial respiration and metabolism. Frontiers in Immunology. 12, 628062 (2021).
- Rosales, M. A. B., Shu, D. Y., Iacovelli, J., Saint-Geniez, M. Loss of PGC-1α in RPE induces mesenchymal transition and promotes retinal degeneration. Life Science Alliance. 2 (3), 201800212 (2019).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Smith, P. K., et al.
- Huang, T., Long, M., Huo, B. Competitive binding to cuprous ions of protein and BCA in the bicinchoninic acid protein assay. Open Biomedical Engineering Journal. 4, 271-278 (2010).
- Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).
- Symersky, J., Osowski, D., Walters, D. E., Mueller, D. M. Oligomycin frames a common drug-binding site in the ATP synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13961-13965 (2012).
- Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26 (3), 192-205 (2011).
- Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
- Herst, P. M., Tan, A. S., Scarlett, D. J., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption by mitochondrial gene knockout cells. Biochimica Biophysica Acta. 1656 (2-3), 79-87 (2004).
- Pike Winer, L. S., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PLoS One. 9 (10), 109916 (2014).
- Laussel, C., Leon, S. Cellular toxicity of the metabolic inhibitor 2-deoxyglucose and associated resistance mechanisms. Biochemical Pharmacology. 182, 114213 (2020).
- Miyagishima, K. J., et al. AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration. Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).
- Gao, Z. X., et al. The new mitochondrial uncoupler BAM15 induces ROS production for treatment of acute myeloid leukemia. Biochemical Pharmacology. 198, 114948 (2022).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
- Ye, F., Hoppel, C. L. Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts. Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).
- Rountree, A., et al. Barofuse a novel pressure-driven, adjustable-throughput perfusion system for tissue maintenance and assessment. Heliyon. 2 (12), 00210 (2016).
- Kamat, V., et al. Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism. Elife. 10, 66716 (2021).
- Mas-Bargues, C., Garcia-Dominguez, E., Borras, C. Recent approaches to determine static and dynamic redox state-related parameters. Antioxidants. 11 (5), 864 (2022).
- Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).
- Chichagova, V., et al. Human iPSC disease modelling reveals functional and structural defects in retinal pigment epithelial cells harbouring the m.3243A > G mitochondrial DNA mutation. Scientific Reports. 7 (1), 12320 (2017).
