Summary
המצב המטבולי של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית האנושית (H-RPE) משקף את בריאותם ותפקודם. מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לבחינת שטף מטבולי בזמן אמת של H-RPE באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.
Abstract
תפקוד מטבולי לקוי של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) הוא גורם פתוגני מרכזי למחלות רשתית כגון ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) וזגוגית שגשוגית (PVR). מכיוון ש-RPE הם תאים פעילים מאוד מבחינה מטבולית, שינויים במצב המטבולי שלהם משקפים שינויים בבריאותם ובתפקודם. רספירומטריה ברזולוציה גבוהה מאפשרת ניתוח קינטי בזמן אמת של שני המסלולים הביו-אנרגטיים העיקריים, גליקוליזה וזרחן חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS), באמצעות כימות קצב החמצה חוץ-תאי (ECAR) וקצב צריכת החמצן (OCR), בהתאמה. להלן פרוטוקול אופטימלי לביצוע רספירומטריה ברזולוציה גבוהה על תאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים בבני אדם (H-RPE). פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של השלבים הכרוכים בייצור פרופילים ביו-אנרגטיים של RPE כדי להגדיר את ה-OXPHOS והיכולות הגליקוליטיות הבסיסיות והמקסימליות שלהם. חשיפת H-RPE לזריקות תרופות שונות המכוונות למנגנון המיטוכונדריאלי והגליקוליטי יוצרת פרופילים ביו-אנרגטיים מוגדרים, שמהם ניתן לחשב פרמטרים מטבוליים מרכזיים. פרוטוקול זה מדגיש את התגובה המשופרת של BAM15 כסוכן uncoupling בהשוואה לקרבוניל ציאניד p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) כדי לגרום ליכולת הנשימה המרבית ב- RPE. פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר המצב הביואנרגטי של RPE בתנאי מחלה שונים ולבחון את יעילותן של תרופות חדשות בשחזור המצב המטבולי הבסיסי של RPE.
Introduction
תאי אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) קיימים כשכבה אחת של תאי אפיתל פיגמנטיים הממוקמים אסטרטגית בין הפוטורצפטורים לבין אנדותל fenestrated של choriocapillaris. RPE פעילים מאוד מבחינה מטבולית עם פונקציות רבות, כולל (1) פגוציטוזה של דיסקים פוטורצפטורים שנשפכו, (2) מחזור פיגמנט חזותי כדי לשמור על מחזור הראייה, (3) הובלה של חומרים מזינים, מטבוליטים, יונים ומים, (4) בליעת אור, (5) הגנה מפני פוטואוקסידציה, (6) הפרשת גורמים חיוניים לתמיכה בשלמות הרשתית, ו-(7) היווצרות מחסום הדם-רשתית החיצוני1 . ניוון RPE קשור לתפקוד מטבולי לקוי ולפגמים מיטוכונדריאליים, מה שמוביל למחלות עיניים מסנוורות כגון ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) וזגוגית שגשוגית (PVR)2.
שני מסלולים ביו-אנרגטיים עיקריים כוללים גליקוליזה, המתרחשת בציטופלסמה, וזרחן חמצוני (OXPHOS), המתרחש במיטוכונדריה. במהלך גליקוליזה, מולקולה אחת של גלוקוז מומרת לשתי מולקולות של פירובט וייצור נטו של שתי מולקולות של אדנוזין טריפוספט (ATP). בניגוד לגליקוליזה, OXPHOS מייצר רמות גבוהות בהרבה של ATP (~ 32-38 מולקולות ATP למולקולת גלוקוז). יש לציין כי OXPHOS צורכת חמצן ודורשת תפקוד מיטוכונדריה, בעוד שגליקוליזה מתרחשת בציטופלסמה ואינה דורשת חמצן.
לפני הצגת טכניקות מבוססות פלואורסצנטיות או זרחן לבחינת נשימה מיטוכונדריאלית, רמות החמצן נמדדו בתרחיפים של תאים חדירים בתאים המצוידים באלקטרודת חמצן מסוג קלארק3. בעוד שהאלקטרודה של קלארק זולה בהרבה מרספירומטריה מבוססת פלואורסצנטיות ועובדת בתאים שאינם דבקים, היא בעלת תפוקה נמוכה יחסית, כאשר כל ריצה נשימתית נמשכת כ-15-20 דקות ודורשת כמויות גדולות בהרבה של תאים עבור כל דגימה3. לפיכך, טכניקת הרספירומטריה המבוססת על פלואורסצנטיות החליפה במידה רבה את אלקטרודת קלארק והפכה לטכניקה פופולרית בתחומי חילוף החומרים ומחקר המיטוכונדריה.
פרוטוקול זה מתאר טכניקת רספירומטריה מבוססת פלואורסצנטיות בעלת תפוקה גבוהה, ברזולוציה גבוהה, המודדת באופן קינטי את ה-OXPHOS ואת הפרופילים הביו-אנרגטיים הגליקוליטיים של תאים חיים. מכיוון שתהליך OXPHOS צורך חמצן, הפרופיל הביו-אנרגטי של OXPHOS מיוצר על ידי מיפוי שינויים בקצב צריכת החמצן (OCR) לאורך זמן4. בטכניקה זו, שני פלואורופורים מוטמעים בשרוול מחסנית החיישן המחובר לצרורות סיבים אופטיים הפולטים אור, ומרגשים את הפלואורופורים. שינויים בפליטת פלואורופור נמדדים על ידי חיישני פלואורסצנטיות רגישים במיוחד ומועברים דרך חבילת הסיב האופטי כדי לעבור המרה לקריאת OCR5. הפלואורופור מרוה על ידי חמצן, ובכך מאפשר לקבוע את רמות החמצן החוץ תאי במדיית הבדיקה, המכונה שטף חמצן או OCR. הפלואורופור השני הוא חיישן pH הרגיש לשינויים באפלוקס פרוטונים, המומר למדד של קצב החמצה חוץ-תאי (ECAR). במהלך המדידות, חבילות הסיבים האופטיים עם פלואורופורים מוטבעים מונמכים לגובה של 200 מיקרומטר מעל חד-שכבת התא, ויוצרים מיקרו-תא ארעי המאפשר קריאות מהירות בזמן אמת. ברגע שמתגלה שינוי של 10% ברמות החמצן או הפרוטונים, החיישנים מורמים כלפי מעלה, מה שמאפשר לנפח גדול יותר של מדיה להתערבב עם המדיה המיקרו-תאית הארעית, ולשחזר את ערכי OCR ו-ECAR בחזרה לנקודת ההתחלה. כל מחסנית חיישן מצוידת בארבע יציאות כדי לאפשר ניהול רציף של עד ארבע תרכובות לכל באר במהלך הבדיקה. ניתן לאסוף מדידות לפני ואחרי הזרקת התרכובות בכל יציאה, ולחשוף מידע מרכזי על המצב המטבולי של התאים.
חקירת שני מסלולים מטבוליים שונים אלה יכולה להניב תגליות חשובות לגבי המצב המטבולי של RPE בעקבות חשיפה לגירויים פתוגניים שונים, ולכן ניתן להשתמש בה כדי לבחון את יעילותן של תרופות בשיקום השלמות המטבולית של RPE 6,7,8. הופעתה של רספירומטריה בעלת תפוקה גבוהה והזמינות של מעכבי מיטוכונדריה ספציפיים עוררו מחקר נוסף בהגדרת הפרופילים הביו-אנרגטיים של RPE ובזיהוי פגמים בחילוף החומרים ובמיטוכונדריה במהלך מצבי מחלה 6,7,8,9,10,11,12,13 . רספירומטריה ברזולוציה גבוהה הדגישה את תפקיד המפתח של תכנות מחדש מטבולי של RPE בפתולוגיות רשתית כגון AMD ו- PVR. שני ציטוקינים מרכזיים המעורבים בפתוגנזה של AMD ו-PVR הם טרנספורמציה של גורם גדילה-בטא 2 (TGFβ2) וגורם נמק גידולי-אלפא (TNFα). השראת מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) על ידי TGFβ2 מלווה בתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, דיכוי OXPHOS ועלייה מפצה ביכולת הגליקוליטית ב-RPE6. לאחרונה, הוכח כי הציטוקין מעודד הדלקת, TNFα, גורם לעלייה משמעותית בוויסות של OXPHOS בסיסי ולהפחתת גליקוליזה ב-H-RPE7. מתן דימתיל פומרט דיכא באופן משמעותי דלקת הנגרמת על ידי TNFα ב-H-RPE ושחזר את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית ואת הפרופיל הביו-אנרגטי הבסיסי7. הפרופילים המטבוליים השונים הנגרמים על ידי שני גורמי גדילה אלה מעוררים שאלות מכניסטיות מסקרנות לגבי מעורבותו של תכנות מחדש מטבולי במחלות רשתית. הפרוטוקול הבא מתאר את השלבים להערכת OXPHOS ופרופילים ביו-אנרגטיים גליקוליטיים ב-H-RPE באמצעות ספירומטריה ברזולוציה גבוהה.
Protocol
1. ציפוי H-RPE בצלחת תרבית התא
- הפשירו H-RPE בבקבוק T25 במדיום RPE אנושי בתוספת תוספי RPE בינוניים (4 מ"מ L-גלוטמין, 25 נ"ג/מ"ל FGF-2, 2% FBS, 30 מ"ג/מ"ל גנטמיצין ו-15 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין).
- לדגור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO2 באינקובטור לח. רעננו את המדיה למחרת והמתינו עד שהתאים יגיעו למפגש של 80% לפחות לפני המעבר ביחס של 1:3 לצלוחית T75.
- לאחר המפגש, עברו את התאים באמצעות ערכת ריאגנטים תת-תרבית המורכבת מתמיסת טריפסין/EDTA 0.025%, תמיסת נטרול טריפסין ותמיסת מלח חוצצת HEPES (pH 7.0-7.6).
- יש לשטוף את H-RPE בעדינות עם 3 מ"ל של מלח חוצץ HEPES. לאחר מכן יש להוסיף 3 מ"ל טריפסין/EDTA ולדגור (37°C ו-5% CO2) למשך 5 דקות (או עד שהתאים התרוממו מבסיס הצלוחית, כפי שנצפה במיקרוסקופ). נטרול טריפסין/EDTA עם 3 מ"ל של תמיסת נטרול טריפסין.
- צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 3.5 דקות כדי ליצור את גלולת התא. בזהירות לשאוף ולהשליך את supernatant.
- להשהות מחדש את התאים בתווך RPE אנושי לריכוז סופי של 20,000 תאים לכל 100 מיקרוליטר לבאר.
- פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי להבטיח שתרחיף התא הומוגני, תוך שימוש בפיפטה רב-ערוצית לקלות ועקביות של פיפטינג לתוך מיקרו-צלחת תרבית תאים בת 96 בארות. הניחו את קצה הפיפטה ממש מתחת לשפה העגולה בחלק העליון של הבאר לקבלת שכבת תאים אחידה והומוגנית.
הערה: אין צורך בציפוי מכיוון שהתאים נצמדים היטב למיקרו-לוחית. - הקפידו להשאיר את ארבע הבארות הפינתיות ריקות מתאים (100 מיקרוליטר של מדיה בלבד) כדי שישמשו כבארות תיקון רקע (איור 1A).
הערה: צלחת המיקרו מעוצבת בעיצוב לוח טיפוסי של 96 בארות; עם זאת, שטח הפנים של כל באר הוא 0.106 ס"מ2, שהוא 40% קטן יותר מאשר צלחת סטנדרטית 96 בארות. בצפיפות תאים זו, התאים צריכים להיות 100% במפגש למחרת. מומלץ לבצע ניסוי אופטימיזציה של צפיפות התאים תחילה לפני בדיקת טיפולים כדי להבטיח שקריאות OCR ו- ECAR בסיסיות הן סביב 50-100 pmol / min ו- 10-20 mpH / min, בהתאמה.
- פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי להבטיח שתרחיף התא הומוגני, תוך שימוש בפיפטה רב-ערוצית לקלות ועקביות של פיפטינג לתוך מיקרו-צלחת תרבית תאים בת 96 בארות. הניחו את קצה הפיפטה ממש מתחת לשפה העגולה בחלק העליון של הבאר לקבלת שכבת תאים אחידה והומוגנית.
- השאירו את צלחת תרבית התאים בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה אחת לפני שתחזירו אותה לאינקובטור (5% CO2, 37°C, לח) כדי לסייע במזעור השפעות הקצה. השפעות קצה הן שינויים בנפח המדיה בבארות של הגבולות ההיקפיים של צלחת 96 בארות עקב אידוי14.
הערה: התאים ידבקו במהלך הלילה וייצרו חד-שכבה מתלכדת למחרת. H-RPE מבשילים בצלחת לפחות חודש אחד על ידי רענון מחצית ממצע הגידול כל 2-3 ימים. - בחנו את התאים מתחת למיקרוסקופ לפני שינוי המדיה כדי לבדוק את המורפולוגיה ואת רמת הפיגמנטציה שלהם. ודא שהתאים נמצאים במפגש עם מורפולוגיה אופיינית דמוית אבן מרוצפת ורוכשים פיגמנטציה לאורך זמן, כפי שניתן לראות בתמונות המורפולוגיה ב- Shu et al.7.
2. יום לפני ביצוע הבדיקה
- ודא כי מחסנית החיישן הוא hydrated יום לפני הבדיקה על ידי מילוי כל באר של צלחת השירות עם 200 μL של מים deionized.
הערה: מכסה צלחת השירות מכיל ביו-חיישנים פלואורסצנטיים למדידת רמות חמצן ו- pH עבור כל באר. החיישנים מחוברים למדריכי גל סיבים אופטיים המעבירים אור באורכי גל עירור שונים ומעבירים אות פלואורסצנטי דרך מסננים אופטיים לגלאי אור. - הניחו את מחסנית החיישן השקועה במים בלוח השירות יחד עם ~20 מ"ל של הכיול (כדי להתחמם לשימוש למחרת) בתנור לחות של 37°C (ללא CO2) למשך הלילה.
הערה: הכיול הוא פתרון קנייני המיועד לכיול מחסניות חיישנים וככל הנראה דומה בהרכבו למלח חוצץ פוספט (PBS). הזמן המינימלי להידרציה של מחסנית הוא 4 שעות, אך התוצאות הטובות ביותר מתקבלות עם הידרציה בלילה. - ודא שהמכשיר מופעל והפעל את התוכנה כדי לאפשר למכשיר להתייצב ל-37°C במהלך הלילה (איור 2). בדרך כלל, ניתן להשאיר את המכשיר דולק גם כאשר אינו בשימוש.
3. מבחן מאמץ מיטו בזמן אמת באמצעות מנתח שטף חוץ תאי
- ביום הבדיקה, החלף את המים בלוחית השירות בנפח שווה של קליבר מחומם לפחות 45 דקות לפני הפעלת הבדיקה.
- הפוך את מדיית בדיקת המאמץ של מיטו באמצעות מדיום הבסיס ללא פנול אדום על ידי הוספת תוספים, כפי שמוצג בטבלה 1. חממו את המדיה ל-37°C, התאימו את ה-pH ל-7.4 וסננו את המדיה באמצעות יחידת סינון עליונה של הצינור. עבור הפעלת צלחת מלאה, לעשות ~ 25 מ"ל של מדיה assay.
- הסר את מדיית RPE האנושית והחלף אותה ב- 180 μL של מדיית בדיקה טרייה שהוכנה (שלב 3.2). מניחים את צלחת תרבית התאים בתנור לחות 37 מעלות צלזיוס (ללא CO2) למשך שעה אחת לפני תחילת הבדיקה.
הערה: זה חשוב לפירוק גזים של צלחת התא, ומאפשר דיפוזיה שלCO2 . מכיוון שהתאים כבר לא נמצאים במצע הגידול שלהם וכבר לא באינקובטור עםCO2, הכדאיות שלהם תדרדר עם הזמן, ולכן יש להקפיד לבצע את הבדיקה בצורה יעילה ככל האפשר. כמו כן, יש להקפיד על כך שאין בועות בצלחת תרבית התא; אם יש כאלה, פוצצו אותם עם פיפטה או מחט. - לכל מחסנית חיישן יש ארבע יציאות משלוח ריאגנטים לכל באר להזרקת תרכובות בדיקה לבארות של צלחת תרבית התאים במהלך הבדיקה (איור 1C,D). הכינו ~3 מ"ל של תמיסות התרופות פי 10 על ידי דילול מלאי התרופות במדיית הבדיקה המתאימה לפי טבלה 2. לדוגמה, טען את פורט A עם 25 מיקרומטר של אוליגומיצין מומס במדיית בדיקת המאמץ של מיטו, כך שכאשר נפח התרופה מוזרק לבאר על ידי המכשיר, הריכוז הסופי שכל תא נחשף אליו הוא 2.5 מיקרומטר. פיפטה 20 מיקרוליטר של מלאי התרופות פי 10 לפורט A, 22 מיקרוליטר לפורט B, ו-25 μL לתוך פורט C, כדי להשיג את ריכוז התרופה הסופי שצוין בכל באר. עבור פרוטוקולים המחייבים את כל ארבע יציאות התרופות, פיפטה 28 μL לתוך פורט D.
הערה: עיין באיור 1B בעת החדרת התרופות לתוך יציאות הסמים כדי לראות את ההתמצאות הנכונה של יציאות A/B/C/D. החריץ בקצה המחסנית צריך להיות ממוקם בפינה השמאלית התחתונה בעת טעינת יציאות הסמים. על ידי זינוק בזווית לתוך כל יציאת סמים, ניתן למזער בועות. אם יש בועות קיימות, יש להקפיד לפוצץ אותן עם פיפטה או מחט. - פתח את הכרטיסיה תבניות בתוכנת הניתוח, בחר מבחן מאמץ מיטו ומלא את הגדרות הקבוצה.
- פרטי קלט על אסטרטגיית ההזרקה (במקרה זה, היא מוזנת מראש כתרופות מבחן הלחץ של מיטו). הזן פרטים לגבי קבוצות הניסוי השונות בבדיקה (למשל, בקרה או טיפול). הזן פרטים על מדיית ה- Assay ( הוספת תוספים שונים וריכוזיהם הספציפיים למדיית הבדיקה הבסיסית) ולבסוף הוסף את סוג התא.
- לחץ על הכרטיסייה הבאה, מפת לוחות, שבה הקבוצות השונות הנבחנות ישובצו למיקומן הספציפי במפת לוחות 96 הקידוחים. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה פרוטוקול כדי לסקור את פרוטוקול המכשיר עבור פרוטוקול ברירת המחדל של מבחן המאמץ Mito .
הערה: תבנית ברירת המחדל Mito Stress Test מוכנה לשימוש, אך ניתן לשנות אותה בכל דרך כדי להתאים לעיצוב הניסוי. לדוגמה, זמן המדידה המוגדר כברירת מחדל הוא 3 דקות, אך ניתן לשנות אותו ל- 5 דקות אם תרצה בכך.
- לחץ על הפעל את הבדיקה והכנס את מחסנית החיישן השקועה בתמיסת הכיול בלוח השירות. תהליך זה אורך כ-25 דקות. בשלב זה, כל ביו-חיישן מכויל באופן עצמאי בהתבסס על תפוקת החיישן הנמדדת בתמיסה המכוילת של pH ידוע וריכוז חמצן.
- לאחר כיול, הסר את צלחת השירות והכנס את צלחת תרבית התא.
הערה: לוחית תרבית התאים מאוזנת תחילה, ולאחר מכן, המכשיר מתחיל לערבב את מדיית הבדיקה ולמדוד את ערכי OCR ו- ECAR. שלב זה אורך כשעה וחצי ומתבצע בתוך המכשיר ללא כל התערבות מצד המשתמש. קריאה בסיסית של OCR ו- ECAR נוצרת תחילה על ידי ערבוב מדיית הבדיקה למשך 3 דקות ולאחר מכן מדידת OCR ו- ECAR למשך 3 דקות. הכלי מבצע שלוש לולאות של ערבוב ומדידה. - לאחר המדידה הבסיסית, המכשיר מזריק באופן אוטומטי את תמיסת התרופה Port A לכל באר. לאחר מכן מופיעות שלוש לולאות של ערבוב ומדידה (3 דקות כל אחת). אותו דפוס מתרחש לאחר כל הזרקת תרופה עוקבת (יציאות B ו-C).
- לאחר כיול, הסר את צלחת השירות והכנס את צלחת תרבית התא.
- לאחר השלמת ההפעלה, הסר את לוחית תרבית התאים ואת מחסנית החיישן. למטרות בקרת איכות, ודא שכל יציאות התרופות במחסנית החיישן הוזרקו על ידי בדיקת היציאות כדי לבדוק שלא נותרה תרופה שיורית. יש להשליך את מחסנית החיישן ואת לוחית השירות מכיוון שהם פריטים לשימוש חד-פעמי.
- בחנו את התאים במיקרו-צלחת של תרבית התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שעדיין קיימת שכבה חד-שכבתית של תאים. השליכו את מדיית הבדיקה והחליפו אותה ב-60 μL של חיץ ליזה 1x בכל באר.
הערה: חיץ הליזיס עשוי ממאגר ליזיס 10x מדולל ל-1x במים נטולי יונים, בתוספת של 1 mM פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF). - עטפו את שולי הצלחת בפרפילם כדי למנוע אידוי והכניסו אותה למקפיא בטמפרטורה של -80°C כדי לסייע בליזה של התא למשך הלילה, לפני כימות תכולת החלבון באמצעות בדיקת BCA.
- לניתוח נתונים, נרמל את כל הנתונים על ידי חלוקת ערכי OCR ו- ECAR במיקרוגרם של חלבון בכל באר. יצא את מחולל הדוחות Mito Stress Test, המשתמש בפקודות מאקרו של Excel כדי לחשב באופן אוטומטי את הפרמטרים של Mito Stress Test באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים.
הערה: ניתן להשתמש בו כדי לקבוע נשימה בסיסית, נשימה מרבית, יכולת נשימה רזרבי, דליפת פרוטונים, ייצור ATP ונשימה שאינה מיטוכונדריאלית. ההגדרות של חישובים אלה מפורטות בטבלה 3.
4. בדיקת מאמץ גליקוליטי בזמן אמת באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי
- בצע את מבחן המאמץ הגליקוליטי על-ידי ביצוע אותם שלבים כמו מבחן המאמץ של מיטו, למעט שימוש בתוספי המדיה השונים של הבדיקה ובזריקות התרופות המוצגים בטבלה 1 ובטבלה 2.
- לצורך ניתוח נתונים, יצא את מחולל הדוחות של בדיקת מאמץ גליקוליטית, המשתמש בפקודות מאקרו של Excel כדי לחשב באופן אוטומטי את הפרמטרים של בדיקת מאמץ גליקוליטית מתוכנת ניתוח הנתונים.
הערה: ניתן להשתמש בו כדי לקבוע החמצה לא גליקוליטית, גליקוליזה, קיבולת גליקוליטית ועתודה גליקוליטית. ההגדרות של חישובים אלה מפורטות בטבלה 3.
5. בדיקת כימות חלבון BCA
הערה: בדיקת כימות החלבון של חומצה דו-כיוונית (BCA) (ידועה גם בשם מבחן סמית15) היא בדיקה קולורימטרית מבוססת נחושת המשמשת לקביעת תכולת החלבון הכוללת בדגימה. נרמול נתוני OCR ו-ECAR למיקרוגרם של חלבון בכל באר מבטיח שכמויות שונות של תאים/חלבון בכל באר לא יטו את הקריאות. המנגנון של בדיקת BCA מבוסס על שתי תגובות כימיות. ראשית, הקשרים הפפטידים בחלבונים מפחיתים יונים קופריקליים (Cu2+) ליונים קופרוסים (Cu+), שהיא תגובה תלוית טמפרטורה הנעזרת בטמפרטורות גבוהות יותר (37 עד 60 מעלות צלזיוס). אם יש יותר קשרים פפטידיים, מה שהופך את כמות Cu2+ פרופורציונלית לתכולת החלבון בתמיסה16. תגובה זו גורמת לשינוי צבע מירוק לתמיסה סגולה עזה, עם ספיגת שיא של 562 ננומטר16. ככל שתכולת החלבון בדגימה גבוהה יותר, כך הספיגה באורך גל זה גבוהה יותר. טווח העבודה של ערכה זו הוא 20-2,000 מיקרוגרם/מ"ל.
- ערכת בדיקת BCA מכילה 1 מ"ל aliquots של אלבומין בסרום בקר (BSA) ב 2 מ"ג / מ"ל, המשמש תקן ייחוס ריכוז חלבון. הכינו דילול סדרתי בצלחת שקופה בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות על ידי התחלה מ-BSA לא מדולל של 2 מ"ג/מ"ל ולאחר מכן הפחתת הריכוז בחצי על ידי דילול במים שעברו דה-יוניזציה (למשל, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 מ"ג/מ"ל וכו'). שימוש בריכוז ידוע של חלבון מאפשר חישוב של עקומה סטנדרטית, המשמשת לחישוב תכולת החלבון של דגימות הניסוי. כדי לשפר את הדיוק של מדידות תכולת החלבון המחושבות, מדדו את קריאות הספיגה של תקני הייחוס של ריכוז החלבונים לצד דגימות הניסוי עבור כל בדיקה.
- פיפטה 25 μL של כל דילול סדרתי BSA בשכפול לתוך צלחת 96 באר.
- פיפטה 25 μL של חיץ ליזיס 1x בשכפול לתוך צלחת 96 באר לשמש ריק.
- הפשירו את צלחת תרבית התא לטמפרטורת החדר ואת פיפטה 25 μL של כל תא ליזט בשכפול לתוך צלחת 96 בארות.
- הכינו את מגיב העבודה ביחס של 50:1 של ריאגנטים של ערכת BCA A:B. ערבבו היטב על ידי מערבולות כדי להסיר כל עכירות בריאגנטים העובדים, כך שמדובר בתמיסה ירוקה הומוגנית. הוסף 200 μL של מגיב עובד לכל באר.
- הגנו על הצלחת מפני אור על ידי כיסוי הצלחת בנייר כסף ודגרו בתנור של 18 מעלות למשך 20 דקות.
- מדוד את הספיגה ב- 562 ננומטר בקורא לוחות של 96 בארות.
- לצורך ניתוח נתונים, בצע ממוצע של כל הערכים הכפולים. הפחת את רמות הספיגה הריקות שנקבעו מבארות החיץ של ליזיס 1x מהמדידות של כל הדגימות. קבע את עקומת התקן על ידי התוויית הספיגה של כל תקן BSA לריכוז הידוע שלו במק"ג/מ"ל. השתמש במשוואה הליניארית הנגזרת מהעקומה הסטנדרטית כדי לקבוע את ריכוז החלבונים של דגימות הניסוי.
Representative Results
המכשיר מודד בו זמנית גם OCR וגם ECAR עבור כל ריצה. עבור מבחן המאמץ של מיטו, חישובי הפרמטרים מבוססים על קריאות של זיהוי תווים אופטי (OCR) (איור 3A), ואילו עבור מבחן המאמץ הגליקוליטי, חישובי הפרמטרים מבוססים על קריאות ECAR (איור 3B). איור 3 מציג גרפים מייצגים עבור עקומת OCR של מבחן מאמץ מיטו לאורך זמן (איור 3C) וחישובי פרמטרים בצורה של תרשימי עמודות עבור H-RPE (איור 3D). מבחן המאמץ הגליקוליטי מיוצג כעקומת ECAR לאורך זמן (איור 3E), וחישובי פרמטרים מוצגים בגרפים של עמודות עבור H-RPE (איור 3F).
נשימה בזאלית מספקת הבנה של הדרישות האנרגטיות של התאים בתנאי בסיס17. זריקת התרופה הראשונה, אוליגומיצין (אוליגו), היא מעכב ATP סינתאז, ולכן כל הפחתה של OCR לאחר הזרקת התרופה הראשונה היא מדד לנשימה מקושרת ATP18. כל נשימה בסיסית שנותרה לאחר זריקות התרופות הבאות נחשבת לדליפת פרוטונים מכיוון שהיא אינה צמודה לסינתזה של ATP. דליפת פרוטונים מוגברת עשויה להצביע על צימוד מיטוכונדריאלי מוגבר, אשר מווסת על ידי חלבונים uncoupling כי הם נוכחים פיזיולוגית אבל נקשרו גם פתולוגיות כגון השמנת יתר, סרטן, סוכרת מסוג 2, ומחלות לב וכלי דם19. הזריקה השנייה היא של חומר uncoupling, כגון BAM15 או FCCP, כדי לקבוע את פוטנציאל הנשימה המרבי של המיטוכונדריה. חומרי פירוק צימוד ממוטטים את שיפוע הפרוטון ומפחיתים את כוח המניע של הפרוטון על פני הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה. התוצאה היא זרימה בלתי מרוסנת של אלקטרונים דרך שרשרת הובלת האלקטרונים (ETC), אשר מעלה את קצב צריכת החמצן וגורמת לנשימה המיטוכונדריאלית להגיע לקיבולת המקסימלית שלה20. קיבולת נשימה רזרביות (SRC) היא ההבדל בין נשימה מקסימלית לבסיסית, מה שמצביע על יכולתם של התאים להגיב לשינויים בדרישות אנרגטיות כאשר הם מאותגרים, מה שמצביע על כושר תאי. חשוב לציין כי עבור מבחן המאמץ של מיטו ב-H-RPE, BAM15 עדיף על FCCP בשיפור יכולת הנשימה של המיטוכונדריה (איור 4A,B), שכן נשימה מרבית ויכולת נשימה רזרביות גבוהות משמעותית עם 10 מיקרומטר BAM15 בהשוואה ל-500 ננומטר או 1 מיקרומטר FCCP. לא נצפו הבדלים משמעותיים בין מנות FCCP. הזריקה השלישית והאחרונה של רוטנון ואנטימיצין A (Rot/AA) מעכבת קומפלקסים מיטוכונדריאליים I ו-III, בהתאמה, של ה-ETC, אשר מכבה את הנשימה המיטוכונדריאלית; כל שארית של זיהוי תווים אופטי (OCR) נובעת ממקורות שאינם מיטוכונדריאליים21.
במהלך גליקוליזה, מולקולה אחת של גלוקוז מומרת לשתי מולקולות של לקטט בהיעדר חמצן. שחול הלקטט מהתא מלווה בשטף של פרוטון אחד לכל מולקולת לקטט, ובכך גורם להחמצה של החלל החוץ תאי. שטף ייצור הפרוטונים במדיה נמדד על ידי שינויים ב-ECAR. רמות הגליקוליזה הבסיסית נקבעות תחילה, ולאחר מכן גלוקוז מוזרק לתוך מדיה assay, אשר נטול גלוקוז, כדי לגרום glycolysis ובכך לשפר את רמות ECAR22. אוליגומיצין מוזרק כדי לגרום ל-ECAR "הגבוה ביותר" מכיוון שהוא עוצר את ייצור ה-ATP במיטוכונדריה, ובכך מאלץ את התא להפיק את ה-ATP שלו באמצעות גליקוליזה. לבסוף, גליקוליזה נסגרת על ידי הוספת 2DG, אשר מעכב hexokinase, האנזים הראשון של glycolysis23. כל ECAR שנותר נובע ככל הנראה ממקורות אחרים של החמצה, כגון ייצור CO2 על ידי מחזור TCA במהלך OXPHOS, והוא מסומן כ- ECAR שאינו גליקוליטי. הרזרבה הגליקוליטית מחושבת כהפרש בין ECAR "הגבוה" ביותר לבין ECAR בנוכחות גלוקוז. היכולת הגליקוליטית היא סכום הגליקוליזה והרזרבה הגליקוליטית.
איור 1: רכיבי לוחית הלוח ומחסנית החיישן . (A) המכשיר, תוכנת ניתוח הנתונים וממשק הגדרת הפרוטוקול מוצגים. בפריסת לוחות התרבית של 96 בארות, התאים מצופים בבארות בצבע כחול וארבע הבארות הפינתיות מסומנות בשחור, שכן הן משמשות כבארות תיקון אחוריות המכילות מדיה בלבד (וללא תאים). (B) לכל באר של מחסנית החיישן יש ארבע יציאות סמים שבהן ניתן לטעון תרופות A, B, C ו-D. הנפחים לפיפט לכל יציאה מפורטים על סמך החישובים עבור הכנות מלאי תרופות פי 10. (C) מחסנית החיישן מורכבת מבדיקות חיישנים הממוקמות ישירות בלוח השירות המלא בכיול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ציר הזמן של הבדיקה. התאים נזרעים בצלחת תרבית התא. לאחר המוכן, הבדיקה כוללת הליך של יומיים ואחריו כימות של תכולת החלבון באמצעות בדיקת BCA וניתוח נתונים לאחר מכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: גרפים מייצגים של מבחן המאמץ של מיטו ומבחן המאמץ הגליקוליטי. חישובים של (A) מבחן מאמץ מיטו ו- (ב) פרמטרים של מבחן מאמץ גליקוליטי מתוארים בסכמה. (C) עקומת צריכת חמצן מייצגת (OCR) ו-(D) פרמטרים של בדיקת מאמץ מיטו עבור H-RPE מוצגים. (E) עקומת קצב החמצה חוץ-תאית מייצגת (ECAR) ו-(F) פרמטרים של בדיקת מאמץ גליקוליטית עבור H-RPE מוצגים. קווי שגיאה הם אמצעים ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השוואה של BAM15 לעומת FCCP כסוכן ניתוק צימוד. בדיקת מאמץ מיטו על H-RPE המשווה את היעילות של גרימת נשימה מקסימלית באמצעות 10 μM BAM15, 500 nM FCCP או 1 μM FCCP, ומראה את (A) עקומת צריכת החמצן (OCR) ו-(B) פרמטרים של בדיקת מאמץ מיטו. קווי שגיאה הם אמצעים ± SEM. **** p ≤ 0.0001; NS, לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מבחן | גלוקוז (mM) | גלוטמקס (mM) | נתרן פירובט (mM) | HEPES (mM) |
| מבחן מאמץ מיטו | 25 | 2 | 1 | 1 |
| מבחן מאמץ גליקוליטי | ללא | 0.5 | ללא | 1 |
טבלה 1: ריכוז התוספים שנוספו למצע הבדיקה עבור מבחני המאמץ המיטו והגליקוליטיים.
| מבחן | יציאה A | יציאה B | יציאה C |
| מבחן מאמץ מיטו | אוליגומיצין 2.5 מיקרומטר | FCCP 500 ננומטר או BAM15 10 מיקרומטר | רוטנון 2 מיקרומטר ואנטימיצין A 2 מיקרומטר |
| מבחן מאמץ גליקוליטי | גלוקוז 10 מ"מ | אוליגומיצין 2 מיקרומטר | 2-Deoxyglucose 50 מ"מ |
טבלה 2: ריכוזי זריקות פורט תרופתי למבחני המאמץ המיטו והגליקוליטי. חשוב לציין שאלו הריכוזים הסופיים אליהם נחשפים התאים בעקבות הזרקת התרופות לכל באר. התרופות צריכות להיות מוכנות פי 10 חזק יותר בעת טעינת יציאות הסמים.
| מונח | הגדרה | |||
| כיול | הכיול הוא פתרון המשמש לכיול מחסנית החיישן. הניסוח שלה הוא קנייני ויש לו הרכב דומה PBS. | |||
| מחסנית חיישן | מחסנית החיישן מכילה שני פלואורופורים המוטבעים בשרוול מחסנית החיישן, המחוברים לצרורות סיבים אופטיים הפולטים אור, ומרגשים את הפלואורופורים. פלואורופור אחד מודד שטף חמצן והשני מודד שטף פרוטונים. כל מחסנית חיישן מצוידת גם ב-4 יציאות כדי לאפשר ניהול רציף של עד 4 תרכובות לכל באר במהלך הבדיקה. | |||
| צלחת שירות | לוחית השירות (המכונה גם צלחת כיול) משמשת לכיול החיישנים. פתרון הכיול ממוקם בלוח השירות. | |||
| מבחן מאמץ מיטו | מבחן המאמץ של מיטו הוא השם לבדיקה המספקת את הפרופיל הביו-אנרגטי של הנשימה המיטוכונדריאלית על ידי תכנון שינויים ב-OCR לאורך זמן. | |||
| מבחן מאמץ גליקוליטי | מבחן המאמץ הגליקוליטי הוא שמו של המבחן המספק את הפרופיל הביו-אנרגטי הגליקוליטי על ידי תכנון שינויים ב- ECAR לאורך זמן. | |||
| קצב צריכת חמצן (OCR) | קצב צריכת החמצן הוא מדד לשטף חמצן (pmol/min) ומציין את המצב המטבולי של המיטוכונדריה. | |||
| קצב החמצה חוץ-תאי (ECAR) | קצב החמצה חוץ-תאי הוא מדד לשטף פרוטונים (mpH/min) ומציין את המצב המטבולי הגליקוליטי. | |||
| תוכנת Wave | תוכנת Wave משמשת לתכנות הבדיקה וניתוח הנתונים הבאים | |||
| צריכת חמצן שאינה מיטוכונדריאלית | מדידת קצב מינימלי לאחר זריקת רוטנון/אנטימיצין A | |||
| נשימה בסיסית | (מדידת קצב אחרון לפני הזריקה הראשונה) – (קצב נשימה לא מיטוכונדריאלי) | |||
| נשימה מקסימלית | (מדידת קצב מקסימלי לאחר הזרקת FCCP) – (נשימה לא מיטוכונדריאלית) | |||
| דליפת H+ (פרוטון) | (מדידת קצב מינימלי לאחר הזרקת אוליגומיצין) – (נשימה לא מיטוכונדריאלית | |||
| ייצור ATP | (מדידת שיעור אחרון לפני הזרקת אוליגומיצין) – (מדידת קצב מינימלי לאחר הזרקת אוליגומיצין) | |||
| קיבולת נשימה רזרביות | (נשימה מקסימלית) – (נשימה בסיסית) | |||
| קיבולת נשימה עודפת כאחוז | (נשימה מקסימלית) / (נשימה בסיסית) × 100 | |||
| יעילות צימוד | קצב ייצור ATP) / (קצב נשימה בסיסי) × 100 | |||
| גליקוליזה | (מדידת קצב מקסימלי לפני הזרקת אוליגומיצין) – (מדידת שיעור אחרון לפני הזרקת גלוקוז) | |||
| קיבולת גליקוליטית | (מדידת קצב מקסימלי לאחר הזרקת אוליגומיצין) – (מדידת שיעור אחרון לפני הזרקת גלוקוז) | |||
| רזרבה גליקוליטית | (יכולת גליקוליטית) – (גליקוליזה) | |||
| רזרבה גליקוליטית כאחוז | (קצב קיבולת גליקוליטית) /(גליקוליזה) × 100 | |||
| החמצה לא גליקוליטית | מדידת שיעור אחרון לפני הזרקת גלוקוז | |||
טבלה 3: רשימת ההגדרות של רכיבי מפתח של הבדיקה.
Discussion
פרוטוקול אופטימלי זה עבור ספירומטריה ברזולוציה גבוהה של H-RPE כולל את השימוש ב- BAM15 כמפריד במקום FCCP הנפוץ. בעוד שמחקרים קודמים על ספירומטריה ברזולוציה גבוהה של RPE השתמשו ב-FCCP 9,24, נראה כי BAM15 גורם להשראת רמות נשימה מקסימליות ב-H-RPE בהשוואה ל-FCCP. בעוד שגם FCCP וגם BAM15 בטוחים לשימוש בתאים, BAM15 מדווח כבעל פחות תופעות לוואי בתאים נורמליים בהשוואה ל-FCCP או קרבוניל-ציאניד-3-כלורופנילהידראזון (CCCP)25. Kenwood et al. הראו כי BAM15 עושה דה-פולריזציה של המיטוכונדריה מבלי להשפיע על פוטנציאל קרום הפלזמה, ובכך גורם לקצב נשימה מיטוכונדריאלי מקסימלי מתמשך בציטוטוקסיות נמוכה26. FCCP, לעומת זאת, עושה דה-פולריזציה הן למיטוכונדריה והן לקרום הפלזמה ומציג ציטוטוקסיות גבוהה יותר26.
ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול, כולל וידוא שהתאים מצופים כראוי בשכבה אחידה, אחידה והומוגנית של RPE בכל בארות הניסוי של המיקרו-לוחית. RPE בוגר תלוי מאוד ב-OXPHOS לייצור אנרגיה, ולכן יש לאפשר לתאים להבשיל לפחות חודש אחד כדי להבטיח שה-RPE יפיק קריאות OCR בסיסיות ומקסימליות תקינות במהלך הבדיקה. פירוק הגז של צלחת תרבית התאים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C בתנור לח (ללא CO2) לפני הכנסתו למכשיר חיוני לקריאות ECAR מדויקות, מכיוון ש-CO2 יכול להשפיע על רמת החומציות של מדיית הבדיקה. חשוב לזכור לחלח את מחסנית החיישן יום לפני הבדיקה כדי להבטיח שהיא מספקת קריאות OCR ו-ECAR אמינות ביום הבדיקה. יש להקפיד לשחזר כראוי את התרופות שיש להזריק ולהעביר את מלאי התרופות המשוחזרות לכמויות קטנות יותר לאחסון לטווח ארוך כדי למזער מחזורי הקפאה/הפשרה. זה קריטי להכין 10x פתרונות תרופות כי הם מדוללים במדיה assay המתאים (למשל, לדלל ב Mito מבחן מאמץ מדיה עבור מבחן מאמץ Mito) כדי לקחת בחשבון את הדילול מהזרקת התרופה לתוך כל באר מלא מדיה assay. עם כל הזרקת תרופה עוקבת יש יותר מדיה בכל באר, ולכן נפחי התרופה המוטענת גדלים עם כל זריקה, ויש להקפיד לעקוב אחר הנפחים המפורטים בפרוטוקול. חשוב לבצע בדיקות איכות עם השלמת הניסוי על ידי בחינת מחסנית החיישן כדי לוודא שלא ניכרת תרופה שיורית ותצפית על לוח תרבית התא תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שחד-שכבת התא האחידה וההומוגנית נשארת.
שינויים בפרוטוקול זה כוללים הזרקת תרופות שונות ביציאות וקביעת האופן שבו תרופות אלה משפיעות על קריאות OCR ו- ECAR. שינוי פופולרי אחד הוא להזריק תרופה ניסיונית לפי בחירה כפורט A לפני הזרקת התרופות הרגילות לבדיקת מאמץ מיטו או גליקוליטי. פרוטוקול מסוג זה מספק תובנות כיצד הזרקה חריפה של תרופת הבחירה משפיעה על ה-OXPHOS והפרמטרים הגליקוליטיים הבאים. שינויים אחרים כוללים בחינת סוגי תאים שונים; זה דורש פתרון בעיות ראשוני של צפיפות תאי הזריעה האופטימלית ואופטימיזציה של מדיית הבדיקה על ידי הבטחה שהקריאות הבסיסיות ינועו בין 50-100 pmol לדקה עבור OCR ו- 10-20 mpH לדקה עבור ECAR. יש לקבוע את הריכוזים האופטימליים של התרופות המוזרקות עבור כל סוג תא חדש הנבדק על ידי התבוננות בתגובות OCR ו- ECAR לדילול סדרתי של התרופות.
מגבלה מרכזית של הפרוטוקול היא שיכולת הקיום של התא פוחתת עם הזמן, מכיוון שהתאים אינם נמצאים באינקובטורCO2 במצע הגידול הרגיל שלהם, ולכן יש להשלים את הבדיקה תוך 3-4 שעות כדי להבטיח כדאיות תאים מקסימלית. יתר על כן, חשיפה לרעלנים מיטוכונדריאליים המוזרקים לכל באר יכולה להפחית עוד יותר את יכולת הקיום של התאים לאורך זמן. לאחר השלמת הבדיקה, יש ליזה את התאים להערכת תכולת החלבונים כדי לנרמל את קריאות OCR ו- ECAR, ולכן לא ניתן לקצור את אותם תאים לבדיקות ביולוגיה מולקולרית עוקבות.
חלופות לסוסון הים לפרופיל ביו-אנרגטי כוללות את Oroboros Oxygraph 2k (O2k)27, BaroFuse28,29 ו-Resipher (Lucid Scientific)7. Oroboros O2k הוא רספירומטר דו-תאי סגור המשתמש באלקטרודות חמצן פולרוגרפיות מסוג S1 Clark. בעוד Oroboros O2k מייצר מדידות רגישות ביותר של שטף מטבולי בזמן אמת, המכשיר הוא עתיר עבודה כמו המפעיל נדרש להזריק באופן ידני כל תרופה30. BaroFuse היא מערכת זילוח מיקרופלואידית רב-ערוצית חדשנית המשתמשת בלחץ גז כדי לאפשר ניסויים מרובים בזילוח מקבילי ומקושרת למערכת גילוי חמצן למדידת OCR. היתרון של מערכת תרביות זרימה זו הוא שתפקוד הרקמה ויכולת הקיום נשמרים, בניגוד לסוסון ים שבו יכולת הקיום של התאים פוחתת לאורך זמן רב יותר. ה-Resipher משתמש בחיישני חמצן אופטיים רגישים במיוחד כדי למדוד OCR בזמן שהתאים נמצאים בלוח של 96 בארות באינקובטור, ובכך מאפשר מדידות OCR רציפות במשך מספר שבועות עד חודשים. יש לציין כי מכשירים אלה אינם מודדים ECAR, ולכן לסוסון הים יש את היתרון של חקירה סימולטנית של OXPHOS וגליקוליזה.
חקירת פרופילים ביו-אנרגטיים בזמן אמת של OXPHOS וגליקוליזה מתגלה כגורם מפתח באפיון הבריאות והתפקוד של RPE. ספירומטריה ברזולוציה גבוהה מאפשרת אמצעי יעיל להשוואת המצב המטבולי של RPE תקין וחולה, ובכך פותחת אפיקים חדשים של בדיקת יעילות תרופות למחלות רשתית כגון AMD ו- PVR. כיוונים עתידיים לרספירומטריה ברזולוציה גבוהה על RPE כוללים אופטימיזציה של פרוטוקול לבחינת פרופילים ביו-אנרגטיים עבור מונו-שכבות RPE מקוטבות מאוד הגדלות על מסנני טרנסוול. Calton et al. (2016) השיגו זאת בהצלחה על ידי חיתוך חתך משולש של חד-שכבה RPE מקוטבת שגדלה על מסנני טרנסוול31. הרחבה נוספת של המתודולוגיה כוללת בחינת פרופילים ביו-אנרגטיים של RPE המושרה פלוריפוטנטית שמקורה בתאי גזע (iPSC-RPE), שבודדו מחולים עם מצבים ניווניים שונים ברשתית32. חקר האופן שבו ציטוקינים פתוגניים המעורבים ב-AMD וב-PVR משפיעים על האופי הדינמי של חילוף החומרים של RPE יכול לחשוף נקודות תורפה מטבוליות שיכולות לסייע בזיהוי מטרות חדשות הניתנות לתרופות.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים מ: Fight for Sight Leonard & Robert Weintraub Postdoctoral Fellowship (D.Y.S.); תוכנית מלגות פוסט-דוקטורט של קרן BrightFocus במחקר ניוון מקולרי (M2021010F, D.Y.S.); משרד ההגנה, תוכנית מחקר ראיית עמוד השדרה תחת פרס מס 'VR180132 (M.S.-G. ו- L.A.K.); המכון הלאומי לעיניים של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מס 'R01EY027739 (L.A.K). הוקרה ניתנת לתורמים של Macular Degeneration Research M2021010F, תוכנית של קרן BrightFocus, לתמיכה במחקר זה. סכמות נוצרו עם Biorender.com
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375-5G | Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection) |
| 96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile | VWR | 229597 | BCA Assay 96-well plate |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma | A8674-25MG | Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone) |
| BAM15 | Sigma | SML1760-5MG | Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection) |
| BCA Assay | ThermoFisher | 23225 | To determine total protein content in each well |
| Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge |
| Cell Lysis buffer 10x | Cell Signaling Technologies | 9803S | Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection) |
| DMSO, Cell culture grade | Sigma-aldrich | D4540-100ML | For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG |
| FCCP | Sigma | C2920-10MG | Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests |
| HEPES solution | Sigma | H0887-100ML | Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests |
| H-RPE – Human Retinal Pigment Epithelial Cells | Lonza | 194987 | Primary human fetal RPE cells |
| Oligomycin - CAS 1404-19-9 - Calbiochem | Sigma | 495455-10MG | ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection) |
| Parafilm | Bemis | PM996 | To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor | Gold Biotechnology Inc | 50-153-2823 | Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution |
| ReagentPack Subculture Reagents, 100 mL | Lonza | CC-5034 | Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline |
| Rotenone | Sigma | R8875-1G | Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A) |
| RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit - RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407) | Lonza | 195409 | Media for primary human fetal RPE cells |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | High-Resolution Respirometry Instrument | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution |
| Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636-100ML | Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 µm pore size | Millipore-Sigma | SCGP00525 | Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media |
| Synergy H1 Plate Reader | BioTek | Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay | |
| XF base medium without phenol red | Agilent | 103335-100 | Base media for running the Seahorse assay |
References
- He, Y., et al. Mitochondria impairment correlates with increased sensitivity of aging RPE cells to oxidative stress. Journal of Ocular Biology Diseases and Informatics. 3 (3), 92-108 (2010).
- Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: Emerging roles in age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4271 (2020).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 2-16 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protocol. 8 (10), 2850 (2018).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFbeta2-induced EMT of retinal pigment epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4701 (2021).
- Shu, D. Y., et al. Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium. Frontiers in Molecular Neuroscience. 15, 896786 (2022).
- Satish, S., Philipose, H., Rosales, M. A. B., Saint-Geniez, M. Pharmaceutical induction of PGC-1α promotes retinal pigment epithelial cell metabolism and protects against oxidative damage. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 9248640 (2018).
- Ferrington, D. A., et al. Altered bioenergetics and enhanced resistance to oxidative stress in human retinal pigment epithelial cells from donors with age-related macular degeneration. Redox Biology. 13, 255-265 (2017).
- Cai, H., et al. High-throughput screening identifies compounds that protect RPE cells from physiological stressors present in AMD. Experimental Eye Research. 185, 107641 (2019).
- Kurihara, T., et al. Hypoxia-induced metabolic stress in retinal pigment epithelial cells is sufficient to induce photoreceptor degeneration. Elife. 5, 14319 (2016).
- Ishii, M., Beeson, G., Beeson, C., Rohrer, B. Mitochondrial C3a receptor activation in oxidatively stressed epithelial cells reduces mitochondrial respiration and metabolism. Frontiers in Immunology. 12, 628062 (2021).
- Rosales, M. A. B., Shu, D. Y., Iacovelli, J., Saint-Geniez, M. Loss of PGC-1α in RPE induces mesenchymal transition and promotes retinal degeneration. Life Science Alliance. 2 (3), 201800212 (2019).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Smith, P. K., et al.
- Huang, T., Long, M., Huo, B. Competitive binding to cuprous ions of protein and BCA in the bicinchoninic acid protein assay. Open Biomedical Engineering Journal. 4, 271-278 (2010).
- Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).
- Symersky, J., Osowski, D., Walters, D. E., Mueller, D. M. Oligomycin frames a common drug-binding site in the ATP synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13961-13965 (2012).
- Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26 (3), 192-205 (2011).
- Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
- Herst, P. M., Tan, A. S., Scarlett, D. J., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption by mitochondrial gene knockout cells. Biochimica Biophysica Acta. 1656 (2-3), 79-87 (2004).
- Pike Winer, L. S., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PLoS One. 9 (10), 109916 (2014).
- Laussel, C., Leon, S. Cellular toxicity of the metabolic inhibitor 2-deoxyglucose and associated resistance mechanisms. Biochemical Pharmacology. 182, 114213 (2020).
- Miyagishima, K. J., et al. AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration. Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).
- Gao, Z. X., et al. The new mitochondrial uncoupler BAM15 induces ROS production for treatment of acute myeloid leukemia. Biochemical Pharmacology. 198, 114948 (2022).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
- Ye, F., Hoppel, C. L. Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts. Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).
- Rountree, A., et al. Barofuse a novel pressure-driven, adjustable-throughput perfusion system for tissue maintenance and assessment. Heliyon. 2 (12), 00210 (2016).
- Kamat, V., et al. Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism. Elife. 10, 66716 (2021).
- Mas-Bargues, C., Garcia-Dominguez, E., Borras, C. Recent approaches to determine static and dynamic redox state-related parameters. Antioxidants. 11 (5), 864 (2022).
- Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).
- Chichagova, V., et al. Human iPSC disease modelling reveals functional and structural defects in retinal pigment epithelial cells harbouring the m.3243A > G mitochondrial DNA mutation. Scientific Reports. 7 (1), 12320 (2017).
