Summary
Den metaboliska statusen för humana retinala pigmentepitelceller (H-RPE) återspeglar deras hälsa och funktion. Här presenteras ett optimerat protokoll för att undersöka det metaboliska flödet i realtid av H-RPE med hjälp av högupplöst respirometri.
Abstract
Metabolisk dysfunktion av retinala pigmentepitelceller (RPE) är en viktig patogen drivkraft för retinala sjukdomar som åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) och proliferativ vitreoretinopati (PVR). Eftersom RPE är mycket metaboliskt aktiva celler återspeglar förändringar i deras metaboliska status förändringar i deras hälsa och funktion. Högupplöst respirometri möjliggör kinetisk analys i realtid av de två huvudsakliga bioenergetiska vägarna, glykolys och mitokondriell oxidativ fosforylering (OXPHOS), genom kvantifiering av extracellulär försurningshastighet (ECAR) respektive syreförbrukningshastighet (OCR). Följande är ett optimerat protokoll för att utföra högupplöst respirometri på primära humana retinala pigmentepitelceller (H-RPE). Detta protokoll ger en detaljerad beskrivning av stegen som är involverade i att producera bioenergetiska profiler av RPE för att definiera deras basala och maximala OXFOS och glykolytiska kapacitet. Att exponera H-RPE för olika läkemedelsinjektioner riktade mot mitokondriella och glykolytiska maskiner resulterar i definierade bioenergetiska profiler, från vilka viktiga metaboliska parametrar kan beräknas. Detta protokoll belyser det förbättrade svaret hos BAM15 som ett frikopplingsmedel jämfört med karbonylcyanid p-trifluormetoxifenylhydrazon (FCCP) för att inducera maximal andningskapacitet i RPE. Detta protokoll kan användas för att studera den bioenergetiska statusen för RPE under olika sjukdomsförhållanden och testa effekten av nya läkemedel för att återställa den basala metaboliska statusen för RPE.
Introduction
Retinala pigmentepitelceller (RPE) existerar som ett monolager av pigmenterade epitelceller strategiskt placerade mellan fotoreceptorerna och det fenestrerade endotelet i choriocapillaris. RPE är mycket metaboliskt aktiva med många funktioner, inklusive (1) fagocytos av skurna fotoreceptorskivor, (2) återvinning av visuellt pigment för att upprätthålla den visuella cykeln, (3) transport av näringsämnen, metaboliter, joner och vatten, (4) absorption av ljus, (5) skydd mot fotooxidation, (6) utsöndring av väsentliga faktorer för att stödja retinal integritet och (7) bildning av den yttre blod-retinala barriären1 . Degeneration av RPE är associerad med metabolisk dysfunktion och mitokondriella defekter, vilket leder till blindande ögonsjukdomar som åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) och proliferativ vitreoretinopati (PVR)2.
Två viktiga bioenergetiska vägar inkluderar glykolys, som förekommer i cytoplasman, och oxidativ fosforylering (OXPHOS), som förekommer i mitokondrier. Under glykolys omvandlas en molekyl glukos till två molekyler pyruvat och en nettoproduktion av två molekyler adenosintrifosfat (ATP). I motsats till glykolys producerar OXPHOS mycket högre nivåer av ATP (~ 32-38 molekyler ATP per glukosmolekyl). I synnerhet förbrukar OXPHOS syre och kräver funktionell mitokondrier, medan glykolys sker i cytoplasman och inte kräver syre.
Före introduktionen av fluorescens- eller fosforescensbaserade tekniker för att undersöka mitokondriell andning mättes syrehalten i permeabiliserade cellsuspensioner i kammare utrustade med en syrgaselektrod av Clark-typ3. Medan Clark-elektroden är mycket billigare än fluorescensbaserad respirometri och fungerar i icke-vidhäftande celler, är den relativt låg genomströmning, med varje andningskörning som varar cirka 15-20 minuter och kräver mycket högre mängder celler för varje prov3. Således har den fluorescensbaserade respirometritekniken till stor del ersatt Clark-elektroden och har blivit en populär teknik inom metabolism och mitokondriell forskning.
Detta protokoll beskriver en fluorescensbaserad respirometriteknik med hög genomströmning och hög upplösning som kinetiskt mäter OXFOS och glykolytiska bioenergetiska profiler hos levande celler. Eftersom processen med OXPHOS förbrukar syre produceras den bioenergetiska profilen för OXPHOS genom att kartlägga förändringar i syreförbrukningshastigheten (OCR) över tid4. I denna teknik är två fluoroforer inbäddade i sensorpatronhylsan som är ansluten till fiberoptiska buntar som avger ljus, spännande fluoroforerna. Förändringar i fluoroforemission mäts av mycket känsliga fluorescenssensorer och överförs genom det fiberoptiska knippet för att omvandlas till en OCR-avläsning5. Fluoroforen släcks av syre, vilket möjliggör bestämning av extracellulära syrenivåer i analysmediet, känt som syreflöde eller OCR. Den andra fluoroforen är en pH-sensorsond som är känslig för förändringar i protonutflöde, som omvandlas till ett mått på extracellulär försurningshastighet (ECAR). Under mätningarna sänks de fiberoptiska buntarna med inbäddade fluoroforer till 200 μm över cellmonolagret, vilket skapar en övergående mikrokammare som möjliggör snabba realtidsavläsningar. När en 10% förändring av syre- eller protonnivåerna detekteras lyfts sensorerna uppåt, vilket gör att en större volym media kan blandas med det övergående mikrokammarmediet, vilket återställer OCR- och ECAR-värdena tillbaka till baslinjen. Varje sensorpatron är utrustad med fyra portar för att möjliggöra sekventiell administrering av upp till fyra föreningar per brunn under analysen. Mätningar kan samlas in före och efter injektion av föreningarna i varje port, vilket avslöjar viktig information om cellernas metaboliska status.
Att undersöka dessa två distinkta metaboliska vägar kan ge viktiga upptäckter om RPE: s metaboliska status efter exponering för olika patogena stimuli och kan därför användas för att testa effekten av läkemedel för att återställa den metaboliska integriteten hos RPE 6,7,8. Tillkomsten av respirometri med hög genomströmning och tillgängligheten av specifika mitokondriella hämmare har stimulerat mer forskning för att definiera de bioenergetiska profilerna för RPE och identifiera defekter i metabolism och mitokondrier under sjukdomstillstånd 6,7,8,9,10,11,12,13 . Högupplöst respirometri har belyst nyckelrollen för metabolisk omprogrammering av RPE i retinala patologier som AMD och PVR. Två viktiga cytokiner involverade i patogenesen av AMD och PVR är transformerande tillväxtfaktor-beta 2 (TGFβ2) och tumörnekrosfaktor-alfa (TNFα). Induktionen av epitelial-mesenkymal övergång (EMT) med TGFβ2 åtföljs av mitokondriell dysfunktion, OXFOS-undertryckning och en kompensatorisk ökning av glykolytisk kapacitet i RPE6. På senare tid har det proinflammatoriska cytokinet, TNFα, visat sig inducera en signifikant uppreglering av basal OXPHOS och minskad glykolys i H-RPE7. Administrering av dimetylfumarat undertryckte signifikant TNFα-inducerad inflammation i H-RPE och återställde mitokondriell morfologi och basala bioenergetiska profiler7. De divergerande metaboliska profilerna som induceras av dessa två tillväxtfaktorer stimulerar spännande mekanistiska frågor om involvering av metabolisk omprogrammering i näthinnesjukdomar. Följande protokoll beskriver stegen för att bedöma OXPHOS och glykolytiska bioenergetiska profiler i H-RPE med högupplöst respirometri.
Protocol
1. Plätering H-RPE i cellodlingsplattan
- Tina H-RPE i en T25-kolv i humant RPE-medium kompletterat med RPE-tillväxtmediumtillskott (4 mM L-glutamin, 25 ng/ml FGF-2, 2 % FBS, 30 mg/ml gentamicin och 15 μg/ml amfotericin).
- Inkubera cellerna vid 37 °C och 5 %CO2 i en fuktad inkubator. Uppdatera mediet nästa dag och vänta tills cellerna når minst 80% sammanflöde innan de passerar i förhållandet 1: 3 i en T75-kolv.
- När de är sammanflytande, passera cellerna med hjälp av subodlingsreagenssatsen bestående av trypsin / EDTA 0,025% lösning, trypsinneutraliserande lösning och HEPES-buffrad saltlösning (pH 7,0-7,6).
- Skölj H-RPE försiktigt med 3 ml HEPES-buffrad saltlösning. Tillsätt sedan 3 ml trypsin/EDTA och inkubera (37 °C och 5 %CO2) i 5 minuter (eller tills cellerna har lyft från kolvens botten, vilket observerats under mikroskopet). Neutralisera trypsin / EDTA med 3 ml trypsinneutraliserande lösning.
- Centrifugera cellerna vid 200 x g i 3,5 minuter för att bilda cellpelleten. Aspirera försiktigt och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i humant RPE-medium till en slutlig koncentration på 20 000 celler per 100 μl per brunn.
- Pipettera upp och ner flera gånger för att säkerställa att cellsuspensionen är homogen med hjälp av en flerkanalig pipett för enkel och konsekvent pipettering i 96-brunnscellodlingsmikroplattan. Vila pipettspetsen strax under den cirkulära kanten på toppen av brunnen för ett jämnt, homogent cellskikt.
OBS: Ingen beläggning krävs eftersom cellerna fäster väl vid mikroplattan. - Var noga med att lämna de fyra hörnbrunnarna tomma på celler (endast 100 μL media) för att fungera som bakgrundskorrigeringsbrunnar (figur 1A).
OBS: Mikroplattan är formaterad i en typisk 96-brunns plattdesign; Ytan på varje brunn är emellertid 0,106 cm2, vilket är 40% mindre än en standard 96-brunnsplatta. Vid denna celldensitet bör cellerna vara 100% sammanflytande nästa dag. Det rekommenderas att utföra ett celldensitetsoptimeringsexperiment först innan man testar behandlingar för att säkerställa att basala OCR- och ECAR-avläsningar är cirka 50-100 pmol / min respektive 10-20 mpH / min.
- Pipettera upp och ner flera gånger för att säkerställa att cellsuspensionen är homogen med hjälp av en flerkanalig pipett för enkel och konsekvent pipettering i 96-brunnscellodlingsmikroplattan. Vila pipettspetsen strax under den cirkulära kanten på toppen av brunnen för ett jämnt, homogent cellskikt.
- Låt cellodlingsplattan stå i rumstemperatur (RT) i 1 timme innan du placerar den tillbaka i inkubatorn (5% CO2, 37 °C, fuktad) för att minimera kanteffekterna. Kanteffekter är förändringar i medievolymen i brunnarna i de perifera gränserna på 96-brunnsplattan på grund av avdunstning14.
OBS: Cellerna kommer att fästa över natten och bilda ett sammanflytande monolager nästa dag. H-RPE mognar i plattan i minst 1 månad genom att uppdatera hälften av tillväxtmediet var 2-3: e dag. - Undersök cellerna under mikroskopet innan du byter media för att kontrollera deras morfologi och pigmenteringsnivå. Se till att cellerna är sammanflytande med en karakteristisk kullerstensliknande morfologi och förvärvar pigmentering över tiden, vilket ses i morfologibilderna i Shu et al.7.
2. Dagen innan analysen körs
- Se till att sensorpatronen hydreras dagen före analysen genom att fylla varje brunn på verktygsplattan med 200 μL avjoniserat vatten.
OBS: Locket på verktygsplattan innehåller fluorescerande biosensorer för mätning av syre- och pH-nivåer för varje brunn. Sensorerna är kopplade till fiberoptiska vågledare som levererar ljus vid olika excitationsvåglängder och överför en fluorescerande signal genom optiska filter till fotodetektorer. - Placera sensorpatronen nedsänkt i vatten i verktygsplattan tillsammans med ~ 20 ml av kaliberaren (för att värma upp för användning nästa dag) i en 37 ° C fuktad ugn (utan CO2) över natten.
OBS: Kalibern är en patentskyddad lösning avsedd för kalibrering av sensorpatroner och har sannolikt samma sammansättning som fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Minsta tid för patronhydrering är 4 timmar, men de bästa resultaten uppnås med hydrering över natten. - Kontrollera att instrumentet är påslaget och starta programvaran så att instrumentet stabiliseras till 37 °C över natten (bild 2). I allmänhet kan instrumentet lämnas på även när det inte används.
3. Mito stresstest i realtid med hjälp av den extracellulära flödesanalysatorn
- På analysdagen ersätts vattnet i bruksplattan med en lika stor volym uppvärmd kalibrat minst 45 minuter innan testet körs.
- Gör Mito Stress Test-analysmediet med basmediet utan fenolrött genom tillsats av kosttillskott, som visas i tabell 1. Värm mediet till 37 °C, justera pH-värdet till 7,4 och vakuumfiltrera mediet med hjälp av en rörfilterenhet. För att köra en hel platta, gör ~ 25 ml analysmedia.
- Ta bort det humana RPE-mediet och ersätt det med 180 μl nyberett analysmedium (steg 3.2). Placera cellodlingsplattan i en fuktad ugn på 37 °C (utanCO2) i 1 timme innan analysen påbörjas.
OBS: Detta är viktigt för avgasning av cellplattan, vilket möjliggör CO 2-diffusion. Eftersom cellerna inte längre finns i sina tillväxtmedier och inte längre i en inkubator med CO2, kommer deras livskraft att försämras med tiden, därför bör man se till att utföra analysen så effektivt som möjligt. Försiktighet bör också vidtas för att säkerställa att det inte finns några bubblor i cellodlingsplattan; Om några är närvarande, poppa dem med en pipett eller nål. - Varje sensorpatron har fyra reagenstillförselportar per brunn för injektion av testföreningar i cellodlingsplattans brunnar under analysen (figur 1C,D). Bered ~ 3 ml av de 10x läkemedelslösningarna genom att späda läkemedelslagren i respektive analysmedia enligt tabell 2. Till exempel ladda Port A med 25 μM oligomycin upplöst i Mito Stress Test-analysmediet, så att när läkemedelsvolymen injiceras i brunnen av instrumentet är den slutliga koncentrationen som varje cell utsätts för 2,5 μM. Pipettera 20 μL av 10x läkemedelsstammen till Port A, 22 μL till Port B, och 25 μl in i port C för att uppnå den specificerade slutliga läkemedelskoncentrationen i varje brunn. För protokoll som kräver alla fyra läkemedelsportar, pipettera 28 μL in i Port D.
OBS: Se figur 1B när du pipetterar drogerna i läkemedelsportarna för korrekt orientering av portarna A / B / C / D. Skåran på patronens kant ska placeras i nedre vänstra hörnet när du laddar läkemedelsportarna. Genom att pipettera i en vinkel in i varje läkemedelsport kan bubblor minimeras. Om det finns några bubblor närvarande, bör man se till att poppa dem med en pipett eller nål. - Öppna fliken Mallar i analysprogrammet, välj Mito stresstest och fyll i gruppdefinitionerna.
- Ange information om injektionsstrategin (i det här fallet matas den in i förväg som Mito Stress Test-läkemedel). Inmatningsdetaljer om de olika experimentgrupperna i analysen (t.ex. kontroll eller behandling). Ange information om analysmediet (tillägg av olika kosttillskott och deras specifika koncentrationer till basanalysmediet) och slutligen lägga till celltypen.
- Klicka på nästa flik, Plåtkarta, där de olika grupperna som undersöks kommer att tilldelas sin specifika plats på plattkartan med 96 brunnar. När detta är gjort klickar du på fliken Protokoll för att granska instrumentprotokollet för standard Mito Stress Test-protokollet .
Standardmallen för Mito Stress Test är klar att användas men kan ändras på något sätt för att passa den experimentella designen. Till exempel är standardmättiden 3 min, men detta kan ändras till 5 min om så önskas.
- Klicka på Kör analysen och sätt in sensorpatronen som är nedsänkt i calibrant-lösningen i verktygsplattan. Denna process tar cirka 25 minuter. I detta steg kalibreras varje biosensor oberoende baserat på sensorutgången uppmätt i den kalibrerande lösningen av känt pH och syrekoncentration.
- När detta är kalibrerat, ta bort verktygsplattan och sätt in cellodlingsplattan.
OBS: Cellodlingsplattan balanseras först, varefter instrumentet börjar blanda analysmediet och mäta OCR- och ECAR-värdena. Detta steg tar cirka 1,5 h och utförs inuti instrumentet utan något ingripande från användaren. En baslinjeavläsning av OCR och ECAR fastställs först genom att blanda analysmediet i 3 minuter och sedan mäta OCR och ECAR i 3 minuter. Instrumentet utför tre slingor av blandning och mätning. - Efter baslinjemätningen injicerar instrumentet automatiskt Port A-läkemedelslösningen i varje brunn. Detta följs av tre slingor av blandning och mätning (3 min vardera). Samma mönster inträffar efter varje efterföljande läkemedelsinjektion (portarna B och C).
- När detta är kalibrerat, ta bort verktygsplattan och sätt in cellodlingsplattan.
- När körningen är klar, ta bort cellodlingsplattan och sensorpatronen. För kvalitetskontrolländamål, se till att alla läkemedelsportar i sensorpatronen har injicerats genom att undersöka portarna för att kontrollera att inget kvarvarande läkemedel kvarstår. Kassera sensorkassetten och verktygsplattan eftersom de är engångsartiklar.
- Undersök cellerna i cellodlingsmikroplattan under mikroskopet för att säkerställa att det fortfarande finns ett konfluent monolager av celler. Kassera analysmediet och ersätt det med 60 μl 1x lysbuffert i varje brunn.
OBS: Lysbufferten är gjord av 10x lysbuffert utspädd till 1x i avjoniserat vatten med tillsats av 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF). - Linda in plattans kanter i Parafilm för att förhindra avdunstning och placera den i en frys på -80 °C för att underlätta celllysen över natten, före kvantifiering av proteininnehållet med BCA-testet.
- För dataanalys, normalisera alla data genom att dividera OCR- och ECAR-värdena med mikrogrammet protein i varje brunn. Exportera rapportgeneratorn för Mito stresstest, som använder Excel-makron för att automatiskt beräkna Mito Stress Test-parametrarna med hjälp av dataanalysprogramvaran.
OBS: Detta kan användas för att bestämma basal andning, maximal andning, ledig andningskapacitet, protonläckage, ATP-produktion och icke-mitokondriell andning. Definitioner av dessa beräkningar anges i tabell 3.
4. Glykolytiskt stresstest i realtid med hjälp av den extracellulära flödesanalysatorn
- Utför det glykolytiska stresstestet genom att följa samma steg som Mito stresstest, förutom att använda de olika analysmedietillskott och läkemedelsinjektioner som visas i tabell 1 och tabell 2.
- För dataanalys exporterar du rapportgeneratorn för glykolytiskt stresstest, som använder Excel-makron för att automatiskt beräkna parametrarna för glykolytiskt stresstest från dataanalysprogramvaran.
OBS: Detta kan användas för att bestämma icke-glykolytisk försurning, glykolys, glykolytisk kapacitet och glykolytisk reserv. Definitioner av dessa beräkningar anges i tabell 3.
5. Analys av BCA-proteinkvantifiering
OBS: Proteinkvantifieringsanalysen av bicinchonic acid (BCA) (även känd som Smith assay15) är en kopparbaserad kolorimetrisk analys som används för att bestämma det totala proteininnehållet i ett prov. Normalisering av OCR- och ECAR-data till mikrogrammet protein i varje brunn säkerställer att olika mängder celler / protein i varje brunn inte snedvrider avläsningarna. Mekanismen för BCA-analysen är baserad på två kemiska reaktioner. För det första reducerar peptidbindningarna i proteiner kopparjoner (Cu2+) till kopparjoner (Cu +), vilket är en temperaturberoende reaktion som stöds av högre temperaturer (37 till 60 ° C). Om det finns fler peptidbindningar, vilket gör mängdenCu2+ proportionell mot proteininnehållet i lösningen16. Denna reaktion resulterar i en färgförändring från grön till en intensiv lila lösning, med en toppabsorbans vid 562 nm16. Ju högre proteininnehåll i provet, desto högre absorbans vid denna våglängd. Arbetsområdet för detta kit är 20-2,000 μg / ml.
- BCA-analyssatsen innehåller 1 ml alikvoter av bovint serumalbumin (BSA) vid 2 mg/ml, som fungerar som referensstandard för proteinkoncentration. Bered en serieutspädning i en klar, flatbottnad platta med 96 brunnar genom att utgå från den outspädda BSA på 2 mg/ml och därefter halvera koncentrationen genom utspädning i avjoniserat vatten (t.ex. 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 mg/ml osv.). Genom att använda en känd koncentration av protein kan man beräkna en standardkurva, som används för att beräkna proteininnehållet i experimentproverna. För att förbättra noggrannheten i de beräknade proteininnehållsmätningarna, mät absorbansavläsningarna av referensstandarderna för proteinkoncentration tillsammans med experimentproverna för varje analys.
- Pipettera 25 μL av varje BSA serieutspädning i två exemplar till 96-brunnsplattan.
- Pipettera 25 μL av 1x lysbufferten i två exemplar till 96-brunnsplattan för att fungera som blindämne.
- Tina cellodlingsplattan till rumstemperatur och pipettera 25 μL av varje celllysat i två exemplar till 96-brunnsplattan.
- Bered arbetsreagenset i förhållandet 50:1 av BCA-kitreagens A:B. Blanda noggrant genom virvling för att avlägsna eventuell grumlighet i arbetsreagenset så att det blir en homogen grön lösning. Tillsätt 200 μl arbetsreagens till varje brunn.
- Skydda plattan från ljus genom att täcka plattan i folie och inkubera i en ugn på 37 °C i 20 minuter.
- Mät absorbansen vid 562 nm i en plattläsare med 96 brunnar.
- För dataanalys beräknar du medelvärdet för alla dubblettvärden. Subtrahera de blindabsorbansnivåer som bestämts från 1x lysbuffertbrunnarna från mätningarna av alla prover. Bestäm standardkurvan genom att plotta absorbansen hos varje BSA-standard till dess kända koncentration i μg/ml. Använd den linjära ekvationen härledd från standardkurvan för att bestämma proteinkoncentrationen hos experimentproverna.
Representative Results
Instrumentet mäter samtidigt både OCR och ECAR för varje körning. För Mito Stress Test baseras parameterberäkningarna på OCR-avläsningar (figur 3A), medan parameterberäkningarna för glykolytiska stresstestet baseras på ECAR-avläsningar (figur 3B). Figur 3 visar representativa diagram för Mito Stress Test OCR-kurvan över tid (figur 3C) och parameterberäkningar i form av stapeldiagram för H-RPE (figur 3D). Det glykolytiska stresstestet representeras som en ECAR-kurva över tid (figur 3E) och parameterberäkningar visas i stapeldiagram för H-RPE (figur 3F).
Basal andning ger en förståelse för cellernas energiska krav under basala förhållanden17. Den första läkemedelsinjektionen, oligomycin (Oligo), är en ATP-syntashämmare, och därmed är varje minskning av OCR efter den första läkemedelsinjektionen ett mått på ATP-bunden andning18. Eventuell återstående basal andning efter efterföljande läkemedelsinjektioner betraktas som en protonläcka eftersom den inte är kopplad till ATP-syntes. Ökad protonläckage kan indikera ökad mitokondriell frikoppling, som regleras av frikopplingsproteiner som är fysiologiskt närvarande men också har kopplats till patologier som fetma, cancer, typ 2-diabetes och hjärt-kärlsjukdom19. Den andra injektionen är av ett frikopplingsmedel, såsom BAM15 eller FCCP, för att bestämma mitokondriernas maximala andningspotential. Frikopplingsmedel kollapsar protongradienten och minskar protondrivkraften över det mitokondriella inre membranet. Resultatet är ett ohämmat flöde av elektroner genom elektrontransportkedjan (ETC), vilket höjer syreförbrukningen och får mitokondriell andning att nå sin maximala kapacitet20. Spare respiratory capacity (SRC) är skillnaden mellan maximal och basal andning, vilket indikerar cellernas förmåga att svara på förändringar i energiska krav när de utmanas, vilket indikerar cellkondition. Viktigt är att för Mito stresstest i H-RPE är BAM15 överlägsen FCCP när det gäller att förbättra mitokondriell andningskapacitet (figur 4A, B), eftersom maximal andning och ledig andningskapacitet är signifikant högre med 10 μM BAM15 jämfört med 500 nM eller 1 μM FCCP. Inga signifikanta skillnader observerades mellan någon av FCCP-doserna. Den tredje och sista injektionen av rotenon och antimycin A (Rot/AA) hämmar mitokondriella komplex I respektive III av ETC, vilket stänger av mitokondriell andning; eventuell kvarvarande OCR beror på icke-mitokondriella källor21.
Under glykolys omvandlas en molekyl glukos till två molekyler laktat i frånvaro av syre. Extruderingen av laktat från cellen åtföljs av utflödet av en proton per laktatmolekyl, vilket orsakar försurning av det extracellulära utrymmet. Flödet av protonproduktion i media mäts genom förändringar i ECAR. Basalglykolysnivåerna fastställs först, varefter glukos injiceras i analysmediet, som saknar glukos, för att inducera glykolys och därmed förbättra ECAR-nivåerna22. Oligomycin injiceras för att inducera den "högsta" ECAR eftersom den stoppar mitokondriell ATP-produktion, vilket tvingar cellen att härleda sin ATP genom glykolys. Slutligen stängs glykolysen av genom tillsats av 2DG, som hämmar hexokinas, det första enzymet i glykolys23. Eventuell återstående ECAR beror sannolikt på andra källor till syrning, såsom CO2-produktion genom TCA-cykeln under OXPHOS, och betecknas som icke-glykolytisk ECAR. Den glykolytiska reserven beräknas som skillnaden mellan den "högsta" ECAR och ECAR i närvaro av glukos. Den glykolytiska kapaciteten är summan av glykolys och glykolytisk reserv.
Figur 1: Komponenter i plattan och sensorpatronen . (A) Instrumentet, dataanalysprogramvaran och gränssnittet för protokollinställning visas. I layouten med 96-brunnsodlingsplattan pläteras cellerna i de blåfärgade brunnarna och de fyra hörnbrunnarna är markerade i svart, eftersom de fungerar som de bakre korrigeringsbrunnarna som endast innehåller media (och inga celler). (B) Det finns fyra läkemedelsportar för varje brunn i sensorpatronen där läkemedel A, B, C och D kan laddas. Volymerna som ska pipetteras in i varje hamn listas baserat på beräkningarna för 10x läkemedelsberedningar. (C) Sensorpatronen består av sensorprober som placeras direkt i den kalibrerade verktygsplattan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Tidslinje för analysen. Cellerna sås i cellodlingsplattan. När analysen är klar innefattar den en 2-dagarsprocedur följt av kvantifiering av proteininnehållet med hjälp av BCA-analysen och efterföljande dataanalys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa diagram för mitostresstestet och glykolytiskt stresstest. Beräkningar av parametrarna (A) Mito Stress Test och (B) Glycolytic Stress Test visas i schemat. (C) Representativ syreförbrukningskurva (OCR) och (D) Mito stresstestparametrar för H-RPE visas. (E) Representativ kurva för extracellulär försurningshastighet (ECAR) och (F) Glykolytisk stresstestparametrar för H-RPE visas. Felstaplar är medel ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Jämförelse mellan BAM15 och FCCP som frikopplingsmedel. Mito stresstest på H-RPE som jämför effekten av att inducera maximal andning med 10 μM BAM15, 500 nM FCCP eller 1 μM FCCP, som visar (A) syreförbrukningskurvan (OCR) och (B) Mito Stress Test-parametrarna. Felstaplar är medel ± SEM. **** p ≤ 0,0001; ns, inte signifikant. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Test | Glukos (mM) | GlutaMax (mM) | Natriumpyruvat (mM) | HEPES (mM) |
| Mito stresstest | 25 | 2 | 1 | 1 |
| Glykolytiskt stresstest | Ingen | 0.5 | Ingen | 1 |
Tabell 1: Koncentration av kosttillskott som läggs till analysmediet för Mito och glykolytiska stresstester.
| Test | Hamn A | Hamn B | Hamn C |
| Mito stresstest | Oligomycin 2,5 μM | FCCP 500 nM ELLER BAM15 10 μM | Rotenon 2 μM OCH antimycin A 2 μM |
| Glykolytiskt stresstest | Glukos 10 mM | Oligomycin 2 μM | 2-Deoxiglukos 50 mM |
Tabell 2: Koncentrationer av läkemedelsportinjektioner för Mito och glykolytiska stresstester. Det är viktigt att notera att dessa är de slutliga koncentrationerna som cellerna utsätts för efter injektion av läkemedlen i varje brunn. Läkemedlen bör beredas 10 gånger starkare när läkemedelsportarna laddas.
| Term | Definition | |||
| Kalibrant | Kalibraren är en lösning som används för att kalibrera sensorpatronen. Dess formulering är proprietär och har en liknande sammansättning som PBS. | |||
| Sensor patron | Sensorpatronen innehåller två fluoroforer inbäddade i sensorpatronhylsan som är anslutna till fiberoptiska buntar som avger ljus, spännande fluoroforerna. En fluorofor mäter syreflöde och den andra mäter protonflöde. Varje sensorpatron är också utrustad med 4 portar för att möjliggöra sekventiell administrering av upp till 4 föreningar per brunn under analysen. | |||
| Verktygsplatta | Verktygsplattan (även känd som kalibreringsplattan) används för kalibrering av sensorerna. Calibrant-lösningen placeras i verktygsplattan. | |||
| Mito stresstest | Mito Stress Test är namnet på analysen som ger den mitokondriella andningens bioenergetiska profil genom att plotta förändringar i OCR över tiden. | |||
| Glykolytiskt stresstest | Det glykolytiska stresstestet är namnet på analysen som ger den glykolytiska bioenergetiska profilen genom att plotta förändringar i ECAR över tiden. | |||
| Syreförbrukningshastighet (OCR) | Syreförbrukningshastigheten är ett mått på syreflödet (pmol/min) och indikerar mitokondriell metabolisk status. | |||
| Extracellulär försurningshastighet (ECAR) | Extracellulär försurningshastighet är ett mått på protonutflöde (mpH / min) och indikerar glykolytisk metabolisk status. | |||
| Wave-programvara | Wave-programvaran används för programmering av analysen och efterföljande dataanalys | |||
| Icke-mitokondriell syreförbrukning | Mätning av lägsta hastighet efter injektion med rotenon/antimycin A | |||
| Basal andning | (Mätning av sista dosering före första injektionen) – (icke-mitokondriell andningsfrekvens) | |||
| Maximal andning | (Mätning av maximal hastighet efter FCCP-injektion) – (icke-mitokondriell andning) | |||
| H+ (proton) läcka | (Mätning av minimihastighet efter injektion av oligomycin) – (Icke-mitokondriell andning | |||
| ATP-produktion | (Sista hastighetsmätning före oligomycininjektion) – (Mätning av lägsta hastighet efter oligomycininjektion) | |||
| Reserv andningsförmåga | (Maximal andning) – (Basal andning) | |||
| Reservandningskapacitet i % | (Maximal andning) / (Basal andning) × 100 | |||
| Kopplingens effektivitet | ATP-produktionshastighet) / (basal andningshastighet) × 100 | |||
| Glykolys | (Maximal hastighetsmätning före oligomycininjektion) – (Sista hastighetsmätning före glukosinjektion) | |||
| Glykolytisk kapacitet | (Mätning av maximal hastighet efter injektion av oligomycin) – (Mätning av sista hastighet före glukosinjektion) | |||
| Glykolytisk reserv | (Glykolytisk kapacitet) – (glykolys) | |||
| Glykolytisk reserv i % | (Glykolytisk kapacitet) /(glykolys) × 100 | |||
| Icke-glykolytisk försurning | Sista hastighetsmätning före glukosinjektion | |||
Tabell 3: Förteckning över definitioner av huvudkomponenter i analysen.
Discussion
Detta optimerade protokoll för högupplöst respirometri av H-RPE innebär användning av BAM15 som frånkoppling istället för den vanliga FCCP. Medan tidigare studier på högupplöst respirometri av RPE använde FCCP 9,24, verkar BAM15 inducera en mer robust induktion av maximala andningsnivåer i H-RPE jämfört med FCCP. Medan både FCCP och BAM15 är säkra att använda i celler, rapporteras BAM15 ha färre biverkningar i normala celler jämfört med FCCP eller karbonylcyanid-3-klorfenylhydrazon (CCCP)25. visade att BAM15 depolariserar mitokondrier utan att påverka plasmamembranpotentialen, vilket inducerar en ihållande maximal mitokondriell andningshastighet vid låg cytotoxicitet26. FCCP, å andra sidan, depolariserar både mitokondrier och plasmamembranet och uppvisar högre cytotoxicitet26.
Det finns flera kritiska steg i protokollet, inklusive att säkerställa att cellerna är ordentligt pläterade i ett sammanflytande, jämnt och homogent monolager av RPE i alla experimentella brunnar i mikroplattan. Mogna RPE är starkt beroende av OXPHOS för energiproduktion, och därför bör cellerna tillåtas mogna i minst 1 månad för att säkerställa att RPE genererar korrekta basala och maximala OCR-avläsningar under analysen. Avgasning av cellodlingsplattan i 1 timme vid 37 °C i en fuktad ugn (utan CO 2) innan den placeras i instrumentet är avgörande för noggranna ECAR-avläsningar, eftersom CO2 kan påverka analysmediets pH. Det är viktigt att komma ihåg att hydrera sensorpatronen dagen före analysen för att säkerställa att den ger tillförlitliga OCR- och ECAR-avläsningar på analysdagen. Försiktighet bör iakttas för att korrekt rekonstituera de läkemedel som ska injiceras och fördela de rekonstituerade läkemedelslagren i mindre volymer för långtidsförvaring för att minimera frys-/upptiningscykler. Det är viktigt att förbereda 10x läkemedelslösningar som späds ut i respektive analysmedium (t.ex. utspädd i Mito Stress Test-analysmedia för Mito Stress Test) för att ta hänsyn till utspädningen från injektion av läkemedlet i varje brunn fylld med analysmedia. Med varje efterföljande läkemedelsinjektion finns det mer media i varje brunn, och därmed ökar volymerna av läkemedel som laddas med varje injektion, och försiktighet bör iakttas för att följa de volymer som anges i protokollet. Det är viktigt att utföra kvalitetskontroller efter avslutad experiment genom att undersöka sensorpatronen för att säkerställa att inget kvarvarande läkemedel är uppenbart och observera cellodlingsplattan under ett mikroskop för att säkerställa att det sammanflytande och homogena cellmonoskiktet kvarstår.
Ändringar av detta protokoll inkluderar att injicera olika läkemedel i portarna och bestämma hur dessa läkemedel påverkar OCR- och ECAR-avläsningar. En populär modifiering är att injicera ett experimentellt läkemedel av val som Port A innan du injicerar de vanliga Mito eller glykolytiska stresstestdrogerna. Denna typ av protokoll ger insikter i hur en akut injektion av det valda läkemedlet påverkar de efterföljande OXFOS- och glykolytiska parametrarna. Andra modifieringar inkluderar att undersöka olika celltyper; Detta kräver initial felsökning av den optimala såddcelldensiteten och optimering av analysmediet genom att säkerställa att basala avläsningar sträcker sig från 50-100 pmol / min för OCR och 10-20 mpH / min för ECAR. De optimala koncentrationerna av de injicerade läkemedlen måste bestämmas för varje ny celltyp som undersöks genom att observera OCR- och ECAR-svaren på en serieutspädning av läkemedlen.
En viktig begränsning i protokollet är att cellviabiliteten minskar med tiden, eftersom cellerna inte befinner sig i en CO2-inkubator i sina normala tillväxtmedier, och därför bör analysen slutföras inom 3-4 timmar för att säkerställa maximal cellviabilitet. Dessutom kan exponering för mitokondriella toxiner som injiceras i varje brunn ytterligare minska cellens livskraft över tiden. När analysen är klar måste cellerna lyseras för utvärdering av proteininnehållet för att normalisera OCR- och ECAR-avläsningar, och därför kan samma celler inte skördas för efterföljande molekylärbiologiska analyser.
Alternativ till Seahorse för bioenergetisk profilering inkluderar Oroboros Oxygraph 2k (O2k)27, BaroFuse28,29 och Resipher (Lucid Scientific)7. Oroboros O2k är en sluten tvåkammars respirometer som använder polarografiska syreelektroder av S1 Clark-typ. Medan Oroboros O2k producerar mycket känsliga mätningar av metaboliskt flöde i realtid, är enheten arbetsintensiv eftersom operatören måste injicera varje läkemedel30 manuellt. BaroFuse är ett nytt flerkanaligt mikrofluidiskt perfusionssystem som använder gastryck för att möjliggöra flera parallella perfusionsexperiment och är kopplat till ett syredetekteringssystem för att mäta OCR. Fördelen med detta flödesodlingssystem är att vävnadens funktion och livskraft bibehålls, i motsats till Seahorse där cellviabiliteten minskar under längre analyser. Resipher använder mycket känsliga optiska syresensorer för att mäta OCR medan cellerna befinner sig i en 96-brunnsplatta i inkubatorn, vilket möjliggör kontinuerliga OCR-mätningar under flera veckor till månader. Noterbart är att dessa instrument inte mäter ECAR, och därmed har Seahorse fördelen att samtidigt utforska både OXPHOS och glykolys.
Att ifrågasätta bioenergetiska profiler i realtid av OXPHOS och glykolys framträder som en nyckelfaktor för att karakterisera RPE-hälsa och funktion. Högupplöst respirometri möjliggör ett effektivt sätt att jämföra den metaboliska statusen för normal och sjuk RPE, vilket öppnar nya vägar för screening av läkemedelseffektivitet för retinala sjukdomar som AMD och PVR. Framtida riktningar för högupplöst respirometri på RPE inkluderar optimering av ett protokoll för att undersöka bioenergetiska profiler för högpolariserade RPE-monolager odlade på transwellfilter. Calton et al. (2016) uppnådde framgångsrikt detta genom att skära en triangulär sektion av det polariserade RPE-monolagret odlat på transwellfilter31. Ytterligare utvidgning av metoden inkluderar att undersöka de bioenergetiska profilerna för inducerad pluripotent stamcellshärledd RPE (iPSC-RPE), isolerad från patienter med olika retinala degenerativa tillstånd32. Utforskning av hur patogena cytokiner involverade i AMD och PVR påverkar RPE-metabolismens dynamiska natur kan avslöja metaboliska sårbarheter som kan informera identifieringen av nya läkemedelsmål.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes delvis av bidrag från: Fight for Sight Leonard & Robert Weintraub Postdoctoral Fellowship (D.Y.S.); BrightFocus Foundation Postdoctoral Fellowship Program i makuladegenerationsforskning (M2021010F, D.Y.S.); Department of Defense, Spinal Vision Research Program under Award no. VR180132 (M.S.-G. och L.A.K.); National Eye Institute of National Institutes of Health under Award no. R01EY027739 (L.A.K.). Erkännande görs till givarna av Macular Degeneration Research M2021010F, ett program från BrightFocus Foundation, för stöd till denna forskning. Scheman skapades med Biorender.com
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375-5G | Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection) |
| 96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile | VWR | 229597 | BCA Assay 96-well plate |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma | A8674-25MG | Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone) |
| BAM15 | Sigma | SML1760-5MG | Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection) |
| BCA Assay | ThermoFisher | 23225 | To determine total protein content in each well |
| Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge |
| Cell Lysis buffer 10x | Cell Signaling Technologies | 9803S | Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection) |
| DMSO, Cell culture grade | Sigma-aldrich | D4540-100ML | For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG |
| FCCP | Sigma | C2920-10MG | Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests |
| HEPES solution | Sigma | H0887-100ML | Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests |
| H-RPE – Human Retinal Pigment Epithelial Cells | Lonza | 194987 | Primary human fetal RPE cells |
| Oligomycin - CAS 1404-19-9 - Calbiochem | Sigma | 495455-10MG | ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection) |
| Parafilm | Bemis | PM996 | To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor | Gold Biotechnology Inc | 50-153-2823 | Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution |
| ReagentPack Subculture Reagents, 100 mL | Lonza | CC-5034 | Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline |
| Rotenone | Sigma | R8875-1G | Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A) |
| RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit - RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407) | Lonza | 195409 | Media for primary human fetal RPE cells |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | High-Resolution Respirometry Instrument | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution |
| Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636-100ML | Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 µm pore size | Millipore-Sigma | SCGP00525 | Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media |
| Synergy H1 Plate Reader | BioTek | Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay | |
| XF base medium without phenol red | Agilent | 103335-100 | Base media for running the Seahorse assay |
References
- He, Y., et al. Mitochondria impairment correlates with increased sensitivity of aging RPE cells to oxidative stress. Journal of Ocular Biology Diseases and Informatics. 3 (3), 92-108 (2010).
- Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: Emerging roles in age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4271 (2020).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 2-16 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protocol. 8 (10), 2850 (2018).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFbeta2-induced EMT of retinal pigment epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4701 (2021).
- Shu, D. Y., et al. Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium. Frontiers in Molecular Neuroscience. 15, 896786 (2022).
- Satish, S., Philipose, H., Rosales, M. A. B., Saint-Geniez, M. Pharmaceutical induction of PGC-1α promotes retinal pigment epithelial cell metabolism and protects against oxidative damage. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 9248640 (2018).
- Ferrington, D. A., et al. Altered bioenergetics and enhanced resistance to oxidative stress in human retinal pigment epithelial cells from donors with age-related macular degeneration. Redox Biology. 13, 255-265 (2017).
- Cai, H., et al. High-throughput screening identifies compounds that protect RPE cells from physiological stressors present in AMD. Experimental Eye Research. 185, 107641 (2019).
- Kurihara, T., et al. Hypoxia-induced metabolic stress in retinal pigment epithelial cells is sufficient to induce photoreceptor degeneration. Elife. 5, 14319 (2016).
- Ishii, M., Beeson, G., Beeson, C., Rohrer, B. Mitochondrial C3a receptor activation in oxidatively stressed epithelial cells reduces mitochondrial respiration and metabolism. Frontiers in Immunology. 12, 628062 (2021).
- Rosales, M. A. B., Shu, D. Y., Iacovelli, J., Saint-Geniez, M. Loss of PGC-1α in RPE induces mesenchymal transition and promotes retinal degeneration. Life Science Alliance. 2 (3), 201800212 (2019).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Smith, P. K., et al.
- Huang, T., Long, M., Huo, B. Competitive binding to cuprous ions of protein and BCA in the bicinchoninic acid protein assay. Open Biomedical Engineering Journal. 4, 271-278 (2010).
- Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).
- Symersky, J., Osowski, D., Walters, D. E., Mueller, D. M. Oligomycin frames a common drug-binding site in the ATP synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13961-13965 (2012).
- Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26 (3), 192-205 (2011).
- Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
- Herst, P. M., Tan, A. S., Scarlett, D. J., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption by mitochondrial gene knockout cells. Biochimica Biophysica Acta. 1656 (2-3), 79-87 (2004).
- Pike Winer, L. S., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PLoS One. 9 (10), 109916 (2014).
- Laussel, C., Leon, S. Cellular toxicity of the metabolic inhibitor 2-deoxyglucose and associated resistance mechanisms. Biochemical Pharmacology. 182, 114213 (2020).
- Miyagishima, K. J., et al. AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration. Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).
- Gao, Z. X., et al. The new mitochondrial uncoupler BAM15 induces ROS production for treatment of acute myeloid leukemia. Biochemical Pharmacology. 198, 114948 (2022).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
- Ye, F., Hoppel, C. L. Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts. Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).
- Rountree, A., et al. Barofuse a novel pressure-driven, adjustable-throughput perfusion system for tissue maintenance and assessment. Heliyon. 2 (12), 00210 (2016).
- Kamat, V., et al. Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism. Elife. 10, 66716 (2021).
- Mas-Bargues, C., Garcia-Dominguez, E., Borras, C. Recent approaches to determine static and dynamic redox state-related parameters. Antioxidants. 11 (5), 864 (2022).
- Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).
- Chichagova, V., et al. Human iPSC disease modelling reveals functional and structural defects in retinal pigment epithelial cells harbouring the m.3243A > G mitochondrial DNA mutation. Scientific Reports. 7 (1), 12320 (2017).
