Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

भ्रूण माउस में संरचनात्मक हृदय दोषों को चिह्नित करने के लिए एक पाइपलाइन

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64582
Automatic Translation
*1, *2, *1, *3, *1, 2, 2, 1, 1,4
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh, 3Département de Biologie, École Normale Supérieure de Lyon, 4Department of Critical Care Medicine, University of Pittsburgh
* These authors contributed equally

Summary

यह लेख एपिस्कोपिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (ईसीएम) का उपयोग करके भ्रूण इकोकार्डियोग्राफी, नेक्रोपसी और एपिस्कोपिक फ्लोरेसेंस इमेज कैप्चर (ईएफआईसी) का उपयोग करके मुराइन जन्मजात हृदय रोग (सीएचडी) नैदानिक विधियों का विवरण देता है, जिसके बाद त्रि-आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण होता है।

Abstract

जन्मजात हृदय रोग (सीएचडी) संयुक्त राज्य अमेरिका में शिशु मृत्यु के प्रमुख कारण हैं। 1980 के दशक में और उससे पहले, मध्यम या गंभीर सीएचडी वाले अधिकांश रोगियों की वयस्कता से पहले मृत्यु हो गई, जीवन के पहले सप्ताह के दौरान अधिकतम मृत्यु दर के साथ। सर्जिकल तकनीकों, नैदानिक दृष्टिकोण और चिकित्सा प्रबंधन में उल्लेखनीय प्रगति ने परिणामों में उल्लेखनीय सुधार किया है। जन्मजात हृदय दोषों को समझने की महत्वपूर्ण शोध आवश्यकताओं को संबोधित करने के लिए, मुराइन मॉडल ने एक आदर्श शोध मंच प्रदान किया है, क्योंकि उनके पास मनुष्यों के समान हृदय शरीर रचना विज्ञान और कम गर्भधारण दर है। उच्च-थ्रूपुट फेनोटाइपिंग टूल के साथ जेनेटिक इंजीनियरिंग के संयोजन ने संरचनात्मक हृदय दोषों की प्रतिकृति और निदान के लिए सीएचडी के पीछे आणविक मार्गों को और स्पष्ट करने की अनुमति दी है। माउस मॉडल में कार्डियक फेनोटाइप्स को स्क्रीन करने के लिए नॉनइनवेसिव भ्रूण इकोकार्डियोग्राफी का उपयोग एपिस्कोपिक फ्लोरेसेंस इमेज कैप्चर (ईएफआईसी) की उच्च निष्ठा के साथ-साथ एपिस्कोपिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (ईसीएम) हिस्टोपैथोलॉजी का उपयोग तीन आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण के साथ विभिन्न जन्मजात हृदय दोषों की शारीरिक रचना में एक विस्तृत दृश्य को सक्षम बनाता है। यह प्रोटोकॉल मुराइन जन्मजात हृदय दोषों का सटीक निदान प्राप्त करने के लिए इन तरीकों के पूर्ण वर्कफ़्लो को रेखांकित करता है। जीवों को मॉडल करने के लिए इस फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल को लागू करने से सटीक सीएचडी निदान की अनुमति मिलेगी, जिससे सीएचडी के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्राप्त होगी। सीएचडी के अंतर्निहित तंत्र की पहचान करना संभावित उपचारों और हस्तक्षेपों के लिए अवसर प्रदान करता है।

Introduction

जन्मजात हृदय रोग (सीएचडी) सबसे आम नवजात जन्म दोष 1,2 हैं, जो लगभग 0.8% -1.7% नवजात शिशुओं को प्रभावित करते हैं और इसके परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण नवजात मृत्यु दर और रुग्णताहोती है। एक आनुवंशिक एटियलजि को सीएचडी 4,5 के साथ दृढ़ता से इंगित किया जाता है। आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल का उपयोग सीएचडी की जटिलता और तंत्र को समझने के लिए व्यापक रूप से किया गया है जो चूहों के चार-कक्ष हृदय और माउस और मानव भ्रूण में तुलनीय कार्डियक विकास डीएनएअनुक्रमों के कारण उनका कारण बनता है। माउस उत्परिवर्ती के फेनोटाइप की पहचान करना लक्षित जीन के कार्य को चिह्नित करने में मौलिक पहला कदम है। जीन खुराक प्रभाव व्यक्त करने वाले माउस मॉडल, जिसमें एक एकल आनुवंशिक उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप हृदय संबंधी दोषों का एक स्पेक्ट्रम हो सकता है जो मानव सीएचडी की नकल करते हैं, सीएचडी की जटिलता और उनके कारण होने वाले तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

यह लेख माउस मॉडल में कार्डियक फेनोटाइप को चिह्नित करने के लिए एक पाइपलाइन की रूपरेखा तैयार करता है। लागू विधियों में भ्रूण इकोकार्डियोग्राम 7 का उपयोग किया जाताहै, इसके बाद नेक्रोपसी और ईसीएम हिस्टोपैथोलॉजी 7,8, जो मुराइन कार्डियक फेनोटाइप ्स के विकास की विस्तृत शारीरिक रचना प्रदर्शित कर सकते हैं। एक भ्रूण इकोकार्डियोग्राम एक गैर-आक्रामक साधन है जो उचित इमेजिंग संकल्प के साथ कई भ्रूणों के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। इसके अलावा, एक भ्रूण इकोकार्डियोग्राम एक कूड़े में भ्रूण की कुल संख्या, उनके विकासशील चरणों और गर्भाशय के सींग में सापेक्ष अभिविन्यास और स्थान का त्वरित निर्धारण प्रदान करता है। रंग प्रवाह का उपयोग करके, असामान्य भ्रूण को संरचना, हेमोडायनामिक गड़बड़ी, विकास प्रतिबंध, या हाइड्रोप्स के विकास के आधार पर पहचाना जा सकता है। चूंकि एक भ्रूण इकोकार्डियोग्राम अध्ययन एक गैर-आक्रामक तकनीक है, इसलिए इसका उपयोग कई दिनों पर स्कैन करने और हेमोडायनामिक्स या कार्डियक आकृति विज्ञान में परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। भ्रूण इकोकार्डियोग्राम की उच्च गुणवत्ता वाली इमेजिंग प्राप्त करने के लिए अभ्यास और कौशल की आवश्यकता होती है, क्योंकि अनुभव और ज्ञान की कमी के कारण विशिष्ट हृदय दोष छूट सकते हैं। इस वजह से, नेक्रोपसी और ईसीएम हिस्टोपैथोलॉजी के संयोजन के माध्यम से कार्डियक आकृति विज्ञान का अधिक निश्चित विश्लेषण प्राप्त किया जा सकता है। नेक्रोपसी आर्क संरचना, महाधमनी और फुफ्फुसीय धमनी के सापेक्ष संबंधों, वेंट्रिकल्स और एट्रिया का आकार, छाती के सापेक्ष हृदय की स्थिति और ब्रोन्कोपुलमोनरी संरचनाओं का प्रत्यक्ष दृश्य प्रदान करता है। हालांकि, आंतरिक विशेषताएं जैसे हृदय वाल्व और दीवार मोटाई अकेले नेक्रोपसी के माध्यम से आकलन करना मुश्किल हो सकता है। इस प्रकार, एक निर्णायक निदान के लिए ईसीएम हिस्टोपैथोलॉजी की सिफारिश की जाती है। ईसीएम हिस्टोपैथोलॉजी एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन विज़ुअलाइज़ेशन तकनीक है जो छवि स्टैक9 के 2 डी और 3 डी पुनर्निर्माण दोनों की अनुमति देती है। ये छवियां एक पैराफिन-एम्बेडेड नमूने के सीरियल एपिस्कोपिक फ्लोरोसेंट इमेजिंग के माध्यम से प्राप्त की जाती हैं क्योंकि इसे स्वचालित माइक्रोटोम द्वारा लगातार अंतराल पर पतला रूप से वर्गीकृत किया जाता है। शास्त्रीय हिस्टोलॉजी के विपरीत, छवियों को ब्लॉक से काटने से पहले एक खंड के रूप में कैप्चर किया जाता है जैसे कि सभी छवियों को एक ही संदर्भ फ्रेम के भीतर कैप्चर किया जाता है। इस वजह से, ईसीएम हिस्टोपैथोलॉजी द्वारा उत्पादित 2 डी छवि स्टैक को आसानी से और मज़बूती से तीन आयामों में पुनर्निर्मित किया जा सकता है। यह एक DICOM दर्शक का उपयोग करके किया जाता है, जो तीन शारीरिक विमानों में छवियों के 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है: कोरोनल, कोरोनल और अनुप्रस्थ। इन उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी पुनर्निर्माण से, एक निश्चित कार्डियक निदान किया जा सकता है। इन तीन अलग-अलग विज़ुअलाइज़ेशन तौर-तरीकों का आवेदन, या तो व्यक्तिगत रूप से या संयोजन में, माउस भ्रूण में संरचनात्मक हृदय दोषों के सटीक लक्षण वर्णन प्रदान कर सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इन अध्ययनों के लिए चूहों का उपयोग आवश्यक है क्योंकि चूहों में चार-कक्षीय दिल होते हैं जो मानव सीएचडी की नकल कर सकते हैं। चूहों को पशु चिकित्सा देखभाल प्रदान की गई और संस्थान के एसोसिएशन फॉर असेसमेंट एंड एक्रेडिटेशन ऑफ लेबोरेटरी एनिमल केयर (एएएएलएसी) -मान्यता प्राप्त पशु देखभाल सुविधा में रखा गया। चूहों की असुविधा, तनाव, दर्द और चोट को कम करने के लिए सख्त प्रोटोकॉल का पालन किया गया था। चूहों को सीओ2 गैस का उपयोग करके इच्छामृत्यु दी गई थी, जो इच्छामृत्यु पर अमेरिकन वेटरनरी मेडिकल एसोसिएशन दिशानिर्देशों के अनुसार छोटे कृन्तकों के लिए स्वीकार्य है। इस पांडुलिपि में चूहों पर अध्ययन पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय में एक अनुमोदित आईएसीयूसी प्रोटोकॉल के साथ किया गया था।

1. भ्रूण इकोकार्डियोग्राम

नोट: एक इकोकार्डियोग्राम चूहों में कार्डियोवैस्कुलर विकृति और एक्स्ट्राकार्डियक दोषों की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। माउस भ्रूण के छोटे आकार के कारण (मध्य में लगभग 1-2 मिमी, जन्म के समय 3.5 मिमी), अल्ट्रासाउंड बायोमाइक्रोस्कोपी (यूबीएम) के साथ अल्ट्राहाई-आवृत्ति इकोकार्डियोग्राफिक उपकरण की आवश्यकता होती है। यूबीएम एक छोटी इमेजिंग विंडो (15 मिमी x 14 मिमी) के साथ विभिन्न उच्च आवृत्ति (30-50 मेगाहर्ट्ज) जांच प्रदान करता है जो एक समय में एक माउस भ्रूण की कल्पना करने के लिए रिज़ॉल्यूशन (30 μm अक्षीय x 68 μm पार्श्व) प्रदान करता है। एक 40 मेगाहर्ट्ज ट्रांसड्यूसर कार्डियोवैस्कुलर फेनोटाइप7 की पहचान करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां प्रदान करता है।

  1. इकोकार्डियोग्राम मशीन चालू करें और प्रोग्राम कार्डियोलॉजी का चयन करें।
    नोट: निम्न प्रोटोकॉल भ्रूण दिवस (ई) 14.5 से 19.5 तक किसी भी माउस पृष्ठभूमि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. एनेस्थेटिक प्रेरण कक्ष में वांछित माउस को एनेस्थेटाइज करें। 1 एल / मिनट की प्रवाह दर पर 4% आइसोफ्लुरेन और मेडिकल ऑक्सीजन की एकाग्रता का उपयोग करके संज्ञाहरण को प्रेरित करें और रखरखाव के लिए इसे 2% -3% तक कम करें।
  3. माउस को इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर जल्दी से रखें। इमेजिंग प्लेटफॉर्म में प्रक्रिया के दौरान माउस को गर्म रखने के लिए गर्म स्टील है। माउस के मुंह और नाक को एनेस्थेटिक नाक शंकु में डालें। आंदोलन से बचने के लिए अंगों को टेप के साथ सुरक्षित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए हृदय गति की निगरानी करें कि यह 400-450 बीपीएम के बीच रहता है।
  4. रेक्टल थर्मामीटर जांच का उपयोग करके तापमान की निगरानी करें और सुनिश्चित करें कि यह 37 डिग्री सेल्सियस ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर टिका है। हाइपोक्सिया से बचने के लिए सांस लेने की निगरानी करें। नुकसान को रोकने के लिए जांच पर एक सौम्य बल रखें।
    नोट: हाइपोथर्मिया को रोकने और संज्ञाहरण से उबरने के लिए माउस के ऊपर एक गर्मी लैंप सेट किया जा सकता है। सूखी आंखों से बचने के लिए पेट्रोलाटम ऑप्थेल्मिक मलहम का उपयोग स्नेहक के रूप में किया जा सकता है।
  5. डेपिलेटरी क्रीम का उपयोग करके वक्ष और पेट से फर को हटा दें। क्रीम लागू करें और हटाने से पहले 3 मिनट प्रतीक्षा करें। 70% इथेनॉल के साथ क्षेत्र को साफ करें। इथेनॉल शेविंग स्नेहक के रूप में पानी से बेहतर काम करता है।
  6. अल्ट्रासाउंड जेल को सामान्य शरीर के तापमान पर गर्म करें। अल्ट्रासाउंड जेल को उदारता से लागू करें और ट्रांसड्यूसर को क्षैतिज विमान में उन्मुख करने और स्क्रीन पर मूत्राशय की पहचान करने के लिए पेट पर रखें। एक बार मूत्राशय की पहचान हो जाने के बाद, मूत्राशय से कपाल को स्कैन करें और भ्रूण की तलाश करें। गर्भकालीन आयु10 (चित्रा 1 और तालिका 1) निर्धारित करने के लिए क्राउन-टू-रम्प लंबाई को मापें।
    नोट: ट्रांसड्यूसर की स्थिति को विभिन्न विमानों की कल्पना करने के लिए बदलें, जिसमें अनुप्रस्थ चार-कक्ष, धनु, और फ्रंटल / कोरोनल इमेजिंग विमानशामिल हैं (चित्रा 1)।
  7. दिल से रक्त प्रवाह का विश्लेषण करने के लिए रंग डॉपलर का उपयोग करें।
  8. माउस को पिंजरे में वापस रखें यदि भ्रूण इच्छित चरण तक नहीं पहुंचा है। अन्यथा, फसल के लिए माउस तैयार करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि माउस पहले से ही जाग रहा है और पिंजरे में वापस डालने से पहले संज्ञाहरण से अच्छी तरह से ठीक हो रहा है।
  9. आइसोफ्लुरेन और ऑक्सीजन बंद करें, कार्य क्षेत्र को साफ करें, और मशीन को बंद करें।
    नोट: ट्रांसड्यूसर से जेल को निकालना महत्वपूर्ण है।

2. नेक्रोपसी

नोट: भ्रूण इकोकार्डियोग्राफी का उपयोग करके असामान्य कार्डियक फेनोटाइप का संदेह होने के बाद, भ्रूण को फिक्सेटिव समाधान में पूर्ण शरीर के पनडुब्बी के माध्यम से एकत्र और तय किया जाता है: या तो 10% बफर फॉर्मेलिन फॉस्फेट या 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए)। मैक्रोस्कोपिक शारीरिक असामान्यताओं या विकृतियों की तलाश में नमूने की बाहरी और आंतरिक आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें।

  1. माउस तैयार करें।
    1. यदि माउस एक वयस्क है, तो मानक सीओ2 प्रोटोकॉल का उपयोग करके माउस को इच्छामृत्यु दें। आंतरिक अंगों में फिक्सेटिव के प्रवेश की अनुमति देने के लिए पार्श्व वक्ष और पेट में चीरे (लगभग 3 सेमी) बनाने के लिए बल या विच्छेदन कैंची का उपयोग करें।
      नोट: नमूना नेक्रोपसी से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए तय किया जाना चाहिए यदि भ्रूण ई 14.5 से पुराना है।
  2. शरीर के बाहरी हिस्से का विश्लेषण करें।
    1. नमूने की पहचान, माइक्रोस्कोप आवर्धन और चित्र की सामग्री सहित चित्रों को एक नाम के साथ सहेजने के लिए सॉफ़्टवेयर सेट करें।
      नोट: ई 14.5 चूहों या उससे अधिक उम्र के अधिकांश संरचनाओं की इमेजिंग के लिए 1.0x से 3.2x का आवर्धन पर्याप्त होना चाहिए।
    2. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप लेंस के नीचे प्लेट पर माउस रखें। चित्रों में निर्जलीकरण और प्रतिबिंब को रोकने के लिए नमूने को पूरी तरह से कवर करने के लिए प्लेट को फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (पीबीएस) से भरें। आवर्धन को समायोजित करें ताकि स्क्रीन में पूरे भ्रूण शामिल हों, और फिर भ्रूण के बाएं और दाएं दोनों किनारों की तस्वीर लें।
      नोट: प्लेट के निचले हिस्से को पिनिंग की सुविधा के लिए पैराफिन, सिलिकॉन या किसी अन्य ऐसे सब्सट्रेट में लेपित किया जाना चाहिए।
    3. नमूने को उसके गले के माध्यम से पिन करें, ऊपर की ओर रखें, और एक और तस्वीर लें।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए पिन को थोड़ा ऊपर की ओर उन्मुख करें कि वक्ष गुहा की कोई महत्वपूर्ण संरचना छिदी हुई नहीं है।
  3. छाती का विश्लेषण करें।
    1. गर्दन के बीच में त्वचा को बल के साथ उठाते समय, त्वचा को कैंची से दोनों बगलों की ओर काटें, इससे पहले कि त्वचा को पूंछ की ओर मध्य अक्ष के साथ काट दिया जाए। फिर, त्वचा को उम्बिलिकस से पैरों तक काट लें। नमूने को अपनी कलाई और टखनों के माध्यम से पिन करें।
      नोट: केवल त्वचा को काटने के लिए सावधान रहें। कैंची के ब्लेड को क्षैतिज रूप से या ऊपर की ओर घुमाने की सिफारिश की जाती है।
    2. संयोजी ऊतक को तोड़ने के लिए, त्वचा को एक जोड़ी बल के साथ उठाएं, जबकि अंतर्निहित ऊतक को दूसरी जोड़ी के साथ पकड़ें। छाती और पेट को उजागर करने में मदद करने के लिए त्वचा के माध्यम से नमूने को पिन करें (चित्रा 2)।
      नोट: पिनिंग, काटने या स्क्रैपिंग के दौरान बहुत अधिक स्ट्रेचिंग के परिणामस्वरूप ऊतक क्षति हो सकती है।
    3. उजागर मांसपेशियों की एक तस्वीर लें, और फिर पसलियों को उजागर करने के लिए मांसपेशियों को धीरे से खुरचें।
    4. उजागर पसलियों की एक तस्वीर लें। पसलियों को डायाफ्राम से अलग करें और गर्दन की ओर पार्श्व अक्ष पर जहां तक संभव हो दोनों तरफ पसलियों को काटें।
    5. कटी हुई पसलियों को हटाकर दिल को उजागर करें। दिल की एक तस्वीर ले लो।
    6. थाइमस को एक जोड़ी बल के साथ छीलकर हटा दें। किसी भी अंतर्निहित वाहिकाओं को फाड़ने से बचने के लिए थाइमस के आधार को स्थिर करने के लिए बल की दूसरी जोड़ी का उपयोग करें। दिल और महान जहाजों की तस्वीरें लें।
      नोट: कुछ आसन्न संरचनाओं को फैलाने के लिए पिन का उपयोग करने से बेहतर इमेजिंग दृश्य प्राप्त करने में मदद मिल सकती है। इसके अतिरिक्त, महान धमनियों, हृदय और रुचि की अन्य संरचनाओं पर केंद्रित अलग-अलग तस्वीरें लें क्योंकि वे एक साथ फोकस में नहीं हो सकते हैं।
  4. पेट का विश्लेषण करें।
    1. इसे हटाने के लिए डायाफ्राम को खींचें और यकृत को उजागर करें। एक तस्वीर ले लो।
    2. पेट और अग्न्याशय को उजागर करने के लिए यकृत को वापस पिन करें। एक तस्वीर ले लो।
    3. अन्नप्रणाली को काट लें। बृहदान्त्र और आंतों को बल के साथ बाहर खींचकर निकालें। जिगर के ठीक ऊपर काटें और गुर्दे और अधिवृक्क ग्रंथियों को प्रकट करने के लिए इसे हटा दें। एक तस्वीर ले लो।
      नोट: हटाए गए अंगों को फिक्सेटिव समाधान में रखा जाना चाहिए।
  5. ईसीएम विश्लेषण के लिए वक्ष को अलग करें।
    1. जिगर और फेफड़ों के बीच एक सीधी रेखा के साथ निचले वक्ष को काटें। कैरोटिड धमनियों की शाखाओं को न काटने के लिए सिर को काफी ऊंचा काट लें।
    2. पृष्ठीय पसलियों और रीढ़ की हड्डी को बनाए रखते हुए पार्श्व पसलियों को धीरे से हटा दें। पृष्ठीय वसा को छीलकर खुरच लें।
    3. वक्ष को शरीर के बाकी हिस्सों से अलग करें और इसे 10% बफर फॉर्मलिन फॉस्फेट समाधान में रखें।

3. एम्बेडिंग

  1. फिक्सेटिव को एक उपयुक्त खतरनाक अपशिष्ट बोतल में विभाजित करें। नमूने को 1x PBS के साथ 15 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  2. नमूनों को निर्जलित करने के लिए इथेनॉल, और जाइलीन की बढ़ती सांद्रता का उपयोग करें। निम्नलिखित सभी चरणों की अवधि भ्रूण के चरण पर निर्भर करती है। कृपया विवरण के लिए तालिका 2 देखें।
    नोट: नमूनों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए समाधान बदलते समय सावधानी बरतनी चाहिए। नमूना प्रसंस्करण के लिए इष्टतम मापदंडों को अनुभवजन्य रूप से समायोजित किया जा सकता है। जाइलीन कुछ प्लास्टिक को भंग कर देगा; कांच के उपकरणों और कंटेनरों का उपयोग किया जाना चाहिए।
  3. वांछित अवधि के लिए पैराफिन के साथ जाइलीन को बदलें। बोतलों को उचित अवधि के लिए 65 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में छोड़ दें (तालिका 2)।
  4. वांछित स्थिति में नमूने एम्बेड करने के लिए ताजा पैराफिन का उपयोग करें।
    नोट: नमूना को पैराफिन ब्लॉक के बीच में उन्मुख करने की सिफारिश की जाती है, जिसमें इसके पृष्ठीय पक्ष को शीर्ष के सामने और पीछे की तरफ ब्लॉक के सामने रखा जाता है। नमूने को उन्मुख करते समय, याद रखें कि नमूना ब्लॉक के साथ उल्टा है।

4. एपिस्कोपिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (ईसीएम)

नोट: उपयुक्त एम्बेडिंग के बाद, भ्रूण हिस्टोपैथोलॉजी विश्लेषण के लिए ईसीएम के माध्यम से क्रमिक रूप से छवि संग्रह से गुजरते हैं। आगे के अध्ययन के लिए माइक्रोटोम से व्यक्तिगत स्लाइड पुनर्प्राप्त की जा सकती हैं।

  1. -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से पैराफिन ब्लॉक को बाहर निकालें और धातु के सांचे को हटा दें।
  2. कैसेट के किनारों और पीछे मोम को ट्रिम करने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें। नमूने के आसपास मोम को तब तक काटें जब तक कि यह कैसेट से जुड़े मोम के एक छोटे वर्ग में संलग्न न हो जाए।
    नोट: ब्लेड को संभालते समय अत्यधिक सावधानी बरतें।
  3. माइक्रोटोम के स्लाइसिंग चरण के खिलाफ पैराफिन ब्लॉक को दबाने के लिए धातु लीवर का उपयोग करें। रन मोड में मैन (मैनुअल) फ़ंक्शन का चयन करें, पैराफिन की सतह को ब्लेड के करीब उठाएं, और यह सुनिश्चित करने के लिए कुछ स्लाइड चलाएं कि ब्लेड पैराफिन ब्लॉक से संपर्क करता है।
  4. LAS AF अनुप्रयोग खोलें और मैट्रिक्सस्क्रीनर का चयन करें। एकल नियमित मैट्रिक्स का चयन करें और पहले से सहेजे गए उपयुक्त टेम्पलेट लोड करें। सफेद और नारंगी ओम्ब्रे पर स्विच करने के लिए त्वरित एलयूटी बटन पर क्लिक करें।
  5. सेट अप जॉब्स का चयन करें और 405 एनएम दृश्यमान लेजर को अधिकतम तक खींचें। स्पेक्ट्रम ब्लॉक के बाएं किनारे को 405 एनएम लाइन से मिलान करें और दाएं किनारे को 800 एनएम लाइन तक खींचें। पिनहोल विकल्प को चिह्नित करें और लाइव दृश्य प्रारंभ करें।
  6. स्क्रीन पर नमूना केंद्र में रखने के लिए लेजर प्रक्षेपण की स्थिति को समायोजित करें और ज़ूम नॉब को ~ 20x पर समायोजित करें। रिज़ॉल्यूशन को अनुकूलित करने के लिए, लाभ को 1,250 वी पर सेट करें और फोकस नॉब का उपयोग करके नीले क्षेत्र को अधिकतम करें; फिर, इमेजिंग के लिए लाभ को लगभग 750 वी पर रीसेट करें।
    नोट: भ्रूण की स्थिति के आधार पर विशिष्ट मान भिन्न हो सकते हैं।
  7. काटने की विधि को ऑटो में स्विच करें, मोटाई को लगभग 50 μm पर सेट करें, और स्लाइड चलाएं। जब फेफड़े और वायुमार्ग दिखाई देते हैं तो काटना बंद कर दें।
  8. 8-10 μm के बीच कटिंग मोटाई चुनें और लाइव दृश्य को रोकें। इमेजिंग शुरू करने के लिए माइक्रोटोम कम्युनिकेटर खोलें। सुनिश्चित करें कि छवियों को एकत्र करने से पहले अस्थायी संग्रहण फ़ोल्डर खाली है।
  9. जब कोई अतिरिक्त हृदय संरचना की कल्पना नहीं की जाती है तो काटना बंद कर दें। माइक्रोटोम कम्युनिकेटर एप्लिकेशन को बंद करें, और अस्थायी फ़ाइल को बाद में 3 डी पुनर्निर्माण के लिए छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के माध्यम से एक .tiff छवि श्रृंखला में निर्यात करें।

5. त्रि-आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण

नोट: 3 डी पुनर्निर्माण का उद्देश्य कोरोनल, धनु और अनुप्रस्थ अभिविन्यास में ईसीएम इमेजिंग से 3 डी वीडियो में 2 डी इमेज स्टैक को संसाधित करना है और नमूनों में संरचनात्मक और शारीरिक असामान्यताओं के निदान के लिए 3 डी वीडियो का उपयोग करना है।

  1. छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में ईसीएम छवि स्टैक खोलें।
    1. छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में फ़ाइलों को खींचें और छोड़ दें। मेनू पट्टी में छवि > ट्रांसफॉर्म > फ्लिप क्षैतिज रूप से ऑप्टिमल का चयन करके ईसीएम छवियों को क्षैतिज रूप से फ्लिप करें।
    2. फ़्लिप की गई छवि सहेजें और छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर बंद करें।
  2. DICOM देखने वाले सॉफ़्टवेयर में ECM छवि स्टैक आयात करें।
    1. क्षैतिज रूप से फ़्लिप किए गए ईसीएम छवियों को DICOM देखने वाले सॉफ़्टवेयर में खींचें और छोड़ दें। सुनिश्चित करें कि नमूना सूची के चारों ओर एक हल्की नीली सीमा है, या छवियों को मौजूदा नमूना फ़ोल्डर में जोड़ा जा सकता है।
    2. पॉप-अप विंडो प्रकट होने पर डेटाबेस में प्रतिलिपि बनाने के लिए लिंक या फ़ाइलों का चयन करें. DICOM देखने वाले सॉफ़्टवेयर में कॉपी की गई फ़ाइल के समान नाम के साथ नमूना सूची में एक नया नमूना दिखाई देगा।
    3. इसे खोलने के लिए नई जोड़ी गई फ़ाइल पर क्लिक करें।
  3. 3 डी पुनर्निर्माण करें।
    1. एक बार फ़ाइल खुलने के बाद, टूलबार से 2 डी / 3 डी पुनर्निर्माण उपकरण मेनू पर क्लिक करें और 3 डी एमपीआर का चयन करें।
    2. Pixel X रिज़ॉल्यूशन और Pixel Y रिज़ॉल्यूशन के लिए, ईसीएम इमेजिंग के दौरान उपयोग किए गए ज़ूम देकर छवि रिज़ॉल्यूशन इनपुट करें। स्लाइस अंतराल के लिए, ईसीएम इमेजिंग के दौरान काटने के लिए उपयोग की जाने वाली स्लाइस मोटाई को इनपुट करें।
      नोट: कैमरा रिज़ॉल्यूशन कैमरे के ज़ूम के आधार पर बदलता है और कैमरे से कैमरे में भिन्न हो सकता है।
  4. वांछित रूप से छवि ढेर को समायोजित करने के लिए बाईं ओर टूल टैब से विभिन्न उपकरणों का उपयोग करें।
    1. विंडो चौड़ाई और विंडो स्तर समायोजित करने के लिए WW/WL उपकरण का उपयोग करें। छवि चमक को कम करने के लिए छवि पर टूल को ऊपर की ओर क्लिक करें और खींचें और इसे बढ़ाने के लिए नीचे की ओर खींचें। छवि कंट्रास्ट को कम करने के लिए छवि पर टूल को दाईं ओर क्लिक करें और खींचें और इसे बढ़ाने के लिए बाईं ओर खींचें।
      नोट: एक संरचना के लिए इष्टतम डब्ल्यूडब्ल्यू / डब्ल्यूएल सेटिंग्स दूसरे के लिए उप-मानक हो सकती हैं। इस कारण से, विभिन्न संरचनाओं को देखने के लिए अलग-अलग वीडियो बनाने की सिफारिश की जाती है।
    2. छवियों को वांछित स्थितियों में खींचने के लिए पैन टूल का उपयोग करें। छवि को इच्छानुसार बड़ा या सिकोड़ने के लिए ज़ूम टूल का उपयोग करें और छवि को वांछित रूप से घुमाने के लिए रोटेट टूल का उपयोग करें।
      नोट: छवियों को बढ़ाने से छवि की गुणवत्ता में कमी आ सकती है। छवियों को घुमाते समय सतर्क रहें, क्योंकि ऐसा करने से कुल्हाड़ियां पलट सकती हैं।
  5. पहले पैनल के रंगीन अक्ष पर क्लिक करें और खींचें। ध्यान दें कि इस अक्ष को घुमाने से अन्य दो पैनलों के अभिविन्यास में कैसे बदलाव होता है। तीन पैनलों के अक्षों को तब तक घुमाएं जब तक कि तीन पैनल नमूने के कोरोनल, धनु और अनुप्रस्थ दृश्यों का प्रतिनिधित्व न करें।
    नोट: नमूने को पुन: उन्मुख करते समय, सही पूर्ववर्ती / पीछे अभिविन्यास बनाए रखें।
  6. वीडियो बनाएँ.
    1. एक बार जब सभी तीन पैनल ठीक से तैनात, उन्मुख और उज्ज्वल हो जाते हैं, तो कोरोनल दृश्य का प्रतिनिधित्व करने वाले पैनल पर क्लिक करें।
    2. मेनू बार के दाईं ओर मूवी निर्यात पर क्लिक करें। बैच पर क्लिक करें और रुचि के पूरे क्षेत्र को शामिल करने के लिए फ्रॉम एंड टू स्लाइडर्स खींचें। अंतराल के लिए, मोटाई के समान विकल्प का चयन करें। दृश्य के अभिविन्यास को इंगित करने वाले वीडियो को सहेजें।
    3. यह देखने के लिए वीडियो की समीक्षा करें कि क्या रुचि की संरचनाओं को पर्याप्त रूप से पहचाना जा सकता है। यदि नहीं, तो आवश्यकतानुसार वीडियो को रीडजस्ट करने और वीडियो को फिर से सहेजने के लिए टूल (चरण 5.4) का उपयोग करें।
  7. अनुप्रस्थ और दृश्यों के लिए चरण 5.6 दोहराएँ. पुनर्निर्मित वीडियो का उपयोग करके नमूने का निदान करें।
    नोट: नमूना किसी भी शारीरिक असामान्यताओं या रोग फेनोटाइप (चित्रा 3) को प्रदर्शित करता है या नहीं, इसका पूरा आकलन करने के लिए प्रत्येक अभिविन्यास में वीडियो को ध्यान से देखें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

महत्वपूर्ण हेमोडायनामिक दोषों वाले माउस भ्रूण को भ्रूण घातक माना गया था। विभिन्न दृश्यों का उपयोग करके उच्च आउटपुट, नॉनइनवेसिव भ्रूण इकोकार्डियोग्राम के माध्यम से सीएचडी की एक विस्तृत विविधता की पहचान की जा सकती है (चित्रा 1)।

सेप्टल दोष: सबसे आम सीएचडी सेप्टल दोष हैं जैसे वेंट्रिकुलर सेप्टल दोष (वीएसडी), एक एट्रियोवेंट्रिकुलर सेप्टल दोष (एवीएसडी), और एक एट्रियल सेप्टल दोष (एएसडी)1। वीएसडी या एवीएसडी को 2 डी छवियों और रंग प्रवाह छवियों का उपयोग करके आसानी से कल्पना की जा सकती है। वेंट्रिकल्स में या एट्रिया और वेंट्रिकल्स के बीच रक्त प्रवाह को आसानी से पहचाना जा सकता है (चित्रा 3)। एएसडी को भ्रूण में पेटेंट फोरमेन ओवल के साथ अंतर करना मुश्किल है।

बहिर्वाह पथ विसंगतियां: जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, मुख्य फुफ्फुसीय धमनी में प्रवाह सामान्य भ्रूण में आरोही महाधमनी प्रवाह में होता है। दाएं वेंट्रिकल (डीओआरवी) के डबल आउटलेट वाले भ्रूण में, दोनों महान धमनियों को दाएं वेंट्रिकल से उत्पन्न होते देखा जा सकता है। डीओआरवी वीएसडी (चित्रा 3 डी) से भी जुड़ा हुआ है और रंग प्रवाह का उपयोग करके पहचाना जा सकता है। हालांकि, भ्रूण के छोटे आकार को देखते हुए, डीओआरवी को कभी-कभी महाधमनी, फुफ्फुसीय एट्रेसिया, या लगातार ट्रंकस आर्टेरियोसस (पीटीए) के ओवरराइडिंग से मज़बूती से अलग नहीं किया जा सकता है। पीटीए में, भ्रूण इकोकार्डियोग्राम (चित्रा 3 ई) में केवल एक बहिर्वाह पथ प्रवाह देखा जा सकता है। नेक्रोपसी (चित्रा 2 ई, एफ) का उपयोग करके विस्तृत आर्क संरचना और मुख्य फुफ्फुसीय धमनी देखी जा सकती है।

नेक्रोपसी छाती और पेट में साइटस स्थिति और छाती के सापेक्ष हृदय की स्थिति (या तो लेवोकार्डिया (चित्रा 2 सी-ई) या डेक्सट्रोकार्डिया) का जल्दी से निदान कर सकती है। बहिर्वाह पथ संरचनाओं और एट्रिया और वेंट्रिकल्स दोनों के सापेक्ष आकार को आसानी से देखा जा सकता है (चित्रा 2 ई, एफ)।

ईसीएम हिस्टोपैथोलॉजी किसी भी संरचनात्मक हृदय विसंगति 8,11,12 का आकलन करने के लिए स्वर्ण मानक तकनीक है। यह भ्रूण की संरचनाओं के लिए एक अद्वितीय संकल्प और विवरण प्रदान करता है। विभिन्न विमानों और दृश्यों का उपयोग करके त्रि-आयामी पुनर्निर्माण आसानी से महान धमनियों और वेंट्रिकल्स (चित्रा 3) और वेंट्रिकल्स और एट्रिया के बीच दोष के बीच संबंधों की पहचान कर सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: गर्भकालीन आयु निर्धारित करने के लिए भ्रूण की 2 डी इकोकार्डियोग्राम छवियों में क्राउन-रम्प लंबाई को मापने के लिए स्थान। (ए) ई 11.5, (बी) ई 12.5, (सी, डी) ई 13.5-ई 14.5 पर भ्रूण की 2 डी इकोकार्डियोग्राम छवियां। (डी) रोगग्रस्त भ्रूण अपने (सी) भाई-बहन से छोटा होता है और हाइड्रोप्स (तीर) के साथ "मुशी" उपस्थिति के लिए जाना जाता है। (ए-सी) जीवित भ्रूण अलग-अलग अंगों का प्रदर्शन करते हैं। कोरोनल 4-चैंबर दृश्य में ई 14.5 हृदय की रंगीन छवियों के साथ प्रतिनिधि वीबी-मोड (ई) बहिर्वाह पथ को चित्रित करने के लिए पूर्ववर्ती रूप से झुका हुआ है, जो महान धमनियों के सामान्य संबंध के साथ बरकरार वेंट्रिकुलर सेप्टम प्रदर्शित करता है, जिसकी पुष्टि (ई') कोरोनल दृश्य में ईसीएम के साथ की जाती है। (च) ई145 हृदय का प्रतिनिधि दृश्य बाएं वेंट्रिकुलर और दाएं वेंट्रिकुलर बहिर्वाह पथ को दर्शाता है जिसमें आरोही महाधमनी (एओ) कपाल की ओर और फुफ्फुसीय धमनी पीछे की ओर (रीढ़ की ओर) की ओर इंगित होती है, जिसकी पुष्टि (एफ') दृश्य में ईसीएम के साथ की जाती है। (जी) बाएं वेंट्रिकल (एलवी) और दाएं वेंट्रिकल (आरवी) का प्रतिनिधि अनुप्रस्थ दृश्य, जिसे (जी') अनुप्रस्थ दृश्य में ईसीएम के साथ पुष्टि की जाती है। (एच) ईसीएम में हृदय के आधार पर एक अनुप्रस्थ दृश्य एक अलग और अलग महाधमनी वाल्व (एवी) और फुफ्फुसीय वाल्व (पीवी) को दर्शाता है। (एच') प्रतिनिधि ईसीएम अनुप्रस्थ दृश्य छवि लगातार ट्रंकस धमनी (पीटीए) की बाईं फुफ्फुसीय धमनी और दाईं फुफ्फुसीय धमनी को अविभाजित लगातार ट्रंकल धमनी से पीछे की ओर उत्पन्न होती है, जिसमें बाईं कैरोटिड धमनी पूर्ववर्ती और कपाल रूप से लगातार ट्रंकल धमनी से उत्पन्न होती है। संक्षिप्तरूप: ए: पूर्वकाल, एओ: महाधमनी, एवी: महाधमनी वाल्व, सीडी: पुच्छल, सीआर: कपाल, डीएओ: अवरोही महाधमनी, एल: बाएं, एलए: बाएं आलिंद, एलसीए: बाएं कैरोटिड धमनी, एलपीए: बाएं फुफ्फुसीय धमनी, एलवी: बाएं वेंट्रिकल, पी: पश्चवर्ती, पीए: फुफ्फुसीय धमनी, पीटीए: लगातार ट्रंकस धमनी, आर: दाएं, आरए: दाएं आलिंद, आरपीए: दाएं फुफ्फुसीय धमनी, आरवी: दाएं वेंट्रिकल। स्केल पट्टी: 0.5 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: कार्डियोवैस्कुलर असामान्यताओं का निरीक्षण करने के लिए नेक्रोपसी की प्रतिनिधि छवियां। (ए) एक भ्रूण जिसे बिना किसी स्पष्ट फेनोटाइप के काले-पृष्ठभूमि विच्छेदन डिश पर पिन किया गया है। छवि सिर, डिजिटल, छाती गुहा और पेट की सकल शारीरिक रचना दिखाती है। (बी) डर्मिस को पिल्ले से हटा दिया जाता है, जिससे सबमैंडिबुलर ग्रंथियों, रिबकेज और पेट का पता चलता है। (सी) रिबकेज उठाया जाता है, जिससे थाइमस, हृदय, फेफड़े और डायाफ्राम सहित छाती गुहा की सकल शारीरिक रचना का पता चलता है। (डी) रिबकेज को हटाने के साथ छाती का एक ज़ूम दृश्य। (ई) थाइमस को हटा दिया जाता है, जिससे महान वाहिकाओं और श्वासनली का पता चलता है। (एफ) महान जहाजों का एक ज़ूम दृश्य। संक्षिप्तरूप: एएओ: आरोही महाधमनी, डी: डायाफ्राम, एलए: बाएं आलिंद, एलसीए: बाएं कैरोटिड धमनी, एलएसवीसी: बाएं सुपीरियर वेना कावा, एलवी: बाएं वेंट्रिकल, पी: पेरिकार्डियम, आरए: दाएं आलिंद, आरबी: पसलियों, आरसीए: दाएं कैरोटिड धमनी, आरएल: दाएं फेफड़े, आरएसवीसी: दाएं सुपीरियर वेना कावा, आरवी: दाएं वेंट्रिकल, एस: उरोस्थि, एससीए: दाएं सबक्लेवियन धमनी, एसएमजी: सबमैंडिब ग्रंथियां। स्केल पट्टी: 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: प्रतिनिधि भ्रूण इकोकार्डियोग्राम (इको) और एपिस्कोपिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (ईसीएम) से छवियां। (ए) इको सामान्य नियंत्रण में एक इंटरवेंट्रिकुलर शंट और सामान्य संबंधित महान धमनियों के बिना एक बरकरार वेंट्रिकुलर सेप्टम प्रदर्शित करता है, जिसकी पुष्टि ई 14.5-15.5 चरण में (ए') ईसीएम द्वारा की जाती है। (बी) एक एट्रियोवेंट्रिकुलर सेप्टल दोष (एवीएसडी) का अल्ट्रासाउंड पता लगाना। 4-कक्ष दृश्य में इको इमेजिंग एलए, आरए, एलवी और आरवी के बीच संचार को प्रदर्शित करता है, जिसकी पुष्टि ई 14.5 चरण में (बी') ईसीएम द्वारा की जाती है। (सी) रंग प्रवाह के साथ वेंट्रिकुलर सेप्टल दोष (वीएसडी) का अल्ट्रासाउंड निदान एलवी और आरवी में प्रवाह को दर्शाता है, जिसकी पुष्टि ई 16.5 चरण में (सी') ईसीएम द्वारा की जाती है। (डी) इको और (डी') ईसीएम ई 14.5 चरण में एलवी और आरवी के बीच एक वीएसडी के साथ डीओआरवी का प्रदर्शन करते हैं, जिसमें साइड-बाय-साइड ग्रेट धमनियां (महाधमनी फुफ्फुसीय धमनी के ठीक है) होती है। (ई) लगातार ट्रुनकस आर्टेरियोसस (पीटीए) का अल्ट्रासाउंड निदान एलवी और आरवी के बीच संचार को दर्शाता है जिसमें दोनों वेंट्रिकल्स (पीटीए) को ओवरराइड करने वाले एकल बहिर्वाह पथ होते हैं। (E') इस विकृति की पुष्टि ईसीएम द्वारा ई 14.5 चरण में की जाती है। स्केल बार: 0.5 मिमी एओ: महाधमनी, एवीएसडी: एट्रिओवेंट्रिकुलर सेप्टल दोष, सीडी: पुच्छल, सीआर: कपाल, एल: बाएं, एलए: बाएं आलिंद, एलवी: बाएं वेंट्रिकल, पीए: फुफ्फुसीय धमनी, पीटीए: लगातार ट्रंकस धमनी, आर: दाएं, आरए: दाएं आलिंद, आरवी: दाएं वेंट्रिकल, वीएसडी: वेंट्रिकुलर सेप्टल दोष। स्केल पट्टी: 0.5 मिमी . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

मंच क्राउन-टू-रंप लंबाई (मिमी) भ्रूण क्षेत्र (मिमी2) हृदय क्षेत्र (मिमी2) हृदय क्षेत्र / भ्रूण क्षेत्र
E12.5 7.9 ± 0.8 (n = 77) 23.2 ± 5 (n = 77)
E13.5 10.5 ± 0.9 (n = 92) 40.9 ± 7 (n = 92)
E14.5 12.5 ± 0.9 (n = 101) 57.6 ± 8 (n = 101) 2.9 ± 0.5 (n = 70) 0.050 ± 0.004 (n = 70)
E15.5 14.1 ± 0.5 (n = 134) 71.4 ± 6 (n = 134) 3.8 ± 0.4 (n = 87) 0.053 ± 0.004 (n = 87)
E16.5 15.4 ± 0.6 (n = 112) 82.7 ± 6 (n = 112) 4.9 ± 0.5 (n = 87) 0.058 ± 0.007 (n = 87)
E17.5 16.6 ± 0.4 (n = 211) 96.9 ± 7 (n = 211) 6.1 ± 0.6 (n = 146) 0.063 ± 0.004 (n = 146)
E18.5 17.7 ± 0.6 (n = 139) 112.1 ± 8 (n = 139) 7.1 ± 0.8 (n = 93) 0.063 ± 0.005 (n = 93)
E19.5 18.7 ± 0.7 (n = 57) 126.7 ± 8 (n = 57) 7.7 ± 0.7 (n = 36) 0.062 ± 0.005 (n = 36)

तालिका 1: भ्रूण के विकास की विकासात्मक प्रोफ़ाइल।

E14.5 E16.5 E18.5 नवजात
70% इथेनॉल 1 घंटे 1.5 घंटे 3 घंटे 4 घंटे
95% इथेनॉल 35 मिनट 45 मिनट 1 घंटे 1 घंटे
95% इथेनॉल 35 मिनट 45 मिनट 1 घंटे 1 घंटे
100% इथेनॉल 15 मिनट 15 मिनट 30 मिनट 6 मिनट
जाइलीन 1 20 मिनट 30 मिनट 40 मिनट 30 मिनट
जाइलीन 2 20 मिनट 30 मिनट 40 मिनट 30 मिनट
मोम 1 20 मिनट 20 मिनट 20 मिनट 30 मिनट
मोम 2 20 मिनट 20 मिनट 20 मिनट 30 मिनट
मोम 3 रातोंरात रातोंरात रातोंरात रातोंरात

तालिका 2: भ्रूण के दिनों के आधार पर भ्रूण एम्बेडिंग के लिए प्रोटोकॉल।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उपयोग जन्मजात हृदय दोषों के पैथोमैकेनिज्म को समझने के लिए किया गया है। इस अध्ययन में हम जो प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, वे मुराइन भ्रूण हृदय दोषों का आकलन करने की प्रक्रिया को सुव्यवस्थित और मानकीकृत करने का प्रयास करते हैं। हालांकि, प्रोटोकॉल के दौरान ध्यान देने योग्य महत्वपूर्ण कदम हैं। माउस भ्रूण गर्भावस्था के प्रत्येक दिन के दौरान काफी बढ़ते हैं, और माउस की कटाई का सही समय भ्रूण इकोकार्डियोग्राम को सटीक रूप से करके निर्धारित किया जा सकता है। भ्रूण इकोकार्डियोग्राम का उपयोग भ्रूण कार्डियोवैस्कुलर पैथोलॉजी की जांच के लिए किया जा सकता है। एक 2 डी छवि रक्त प्रवाह की जांच करने और हृदय के कक्षों या असामान्य बहिर्वाह और प्रवाह ट्रैक्ट के बीच किसी भी संचार का पता लगाने के लिए कलर डॉप्लर की सहायता से असामान्य शरीर रचना विज्ञान और हृदय समारोह की पहचान करने की अनुमति देती है। सीएचडी निदान निर्धारित करने के लिए, भ्रूण को भ्रूण के दिन ई 14.5 से स्कैन किया जाता है जब बहिर्वाह पथ सेप्टेशन और कार्डियक चैंबर गठन पूरा हो जाता है। पहले चरणों में स्कैनिंग विकास ता्मक देरी को प्रतिबिंबित कर सकती है।

हिस्टोपैथोलॉजी ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप विज़ुअलाइज़ेशन के बाद माइक्रोटोम का उपयोग करके सीएचडी8 को चिह्नित करने का मानक है। मानक विधि का प्रमुख नुकसान निदान के लिए कार्डियोवैस्कुलर संरचनाओं के सहज ज्ञान युक्त 3 डी प्रदर्शन की कमी और नमूनों के विभिन्न विचारों को प्रदान करने की कमी में सीमा है। एक ईसीएम हिस्टोलॉजी हृदय दोषों को चिह्नित करने के लिए सबसे समय-कुशल विधि है। यदि ईसीएम अनुपलब्ध है, तो भ्रूण को वर्गीकृत करने और कार्डियक फेनोटाइप निर्धारित करने के लिए एक माइक्रोटोम का उपयोग किया जा सकता है। कार्डियक इमेजिंग प्राप्त करने के अन्य विकल्प उच्च-थ्रूपुट, उच्च-रिज़ॉल्यूशन चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) या कंप्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी) कर रहे हैं। एमआरआई या सीटी का एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि कई भ्रूणों को एक साथ चित्रित किया जा सकता है; हालांकि, अल्ट्रासाउंड, सीटी, या एमआरआई फेनोटाइपिंग के बाद भी, हिस्टोपैथोलॉजी को किसी भी सीएचडी निदान की पुष्टि करने की आवश्यकता होती है।

हिस्टोपैथोलॉजी के लिए ईसीएम इमेजिंग का उपयोग करके, भ्रूण को स्वचालित स्लाइडिंग माइक्रोटोम पर लगाए गए लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रत्येक कट के बाद क्रमिक रूप से चित्रित किया जाता है। ईसीएम से एकत्र की गई व्यक्तिगत छवियां बाद में 3 डी पुनर्निर्माण की अनुमति देती हैं और नमूनोंको छवियों को फिर से लेने के बिना किसी भी इमेजिंग विमान में डिजिटल रूप से पुन: आकार देने की अनुमति देती हैं। इस तरह के एक ऑपरेशन कार्डियक एनाटॉमी का व्यापक मूल्यांकन सक्षम बनाता है, जिसका उपयोग विभिन्न विकास चरणों में किया जा सकता है। इसके अलावा, ईसीएम उपकरण से डेटा एकत्र करते समय माइक्रोटोम से अलग-अलग स्लाइड पुनर्प्राप्त किए जा सकते हैं। यद्यपि ईसीएम हिस्टोपैथोलॉजी किसी भी संरचनात्मक हृदय विसंगति का आकलन करने के लिए स्वर्ण मानक है, लेकिन प्रति भ्रूण उपकरण, सॉफ्टवेयर और चलने के समय की उपलब्धता के साथ सीमाएं हैं। भ्रूण के दिल को वर्गीकृत करने का समय इसके आकार के आधार पर प्रति नमूना 1-3 घंटे से भिन्न हो सकता है। उपकरण की जटिलता के कारण, शोधकर्ताओं को यह सुनिश्चित करने के लिए नियमित रूप से कंप्यूटर पर जांच करनी चाहिए कि क्षेत्र के अंदर रुचि का क्षेत्र दर्ज किया जा रहा है। शोधकर्ताओं को यह सुनिश्चित करने के लिए नमूने की भी जांच करनी चाहिए कि कोई पैराफिन मोम शेविंग लेजर स्कैनर से नमूने को बाधित नहीं करता है।

ईसीएम और बाद में 3 डी पुनर्निर्माण नमूने की एम्बेडिंग योजना की परवाह किए बिना किसी भी संरचनात्मक हृदय दोष का पूर्ण उच्च-रिज़ॉल्यूशन मूल्यांकन प्रदान करता है। इन प्रोटोकॉल ने सीएचडी की एक श्रृंखला का सफलतापूर्वक निदान करने में मदद की है और हमें म्यूरिन मॉडल और आनुवंशिक उत्परिवर्तन से संबंधित विकृति में कार्डियक भ्रूणजनन को समझने की अनुमति दी है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक इस पांडुलिपि में हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

कोई नहीं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 Sigma Aldrich P3813
1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) SealRite 1615-5599
10% buffered formalin phosphate solution Fisher Chemical SF100-4
100% Ethanol Decon Laboratories 2701
16% paraformaldehyde (PFA) fixative  ThermoScientific 28908 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C
50 mL tubes Falcon 352070
6–12 Well plate or 20 mL vial  for embryo storage Falcon 353046
Dissecting microscope  Leica MDG36
Dissecting Pins (A1 or A2 grade) F.S.T 26002-15
Dissecting Plate  F.S.T FB0875713 Petri dish with paraffin base
Embedding molds Sakura 4133
Extra narrow scissors (10.5 cm) F.S.T 14088-10 1–2 pairs 
Fiji application/Image J NIH Fiji.sc
Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) F.S.T 11252-00 2 Pairs
Hot forceps  F.S.T 11252-00 For orientation of embryos
Industrial Marker for Wax Blocks  Sharpie 2003898 Formatted for labratory use
Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera  Jenoptik 017953-650-26
Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software Jenoptik jenoptik.com
Large glass beaker  Fisher Scientific S111053 For melting paraffin
Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) Leica M165 FC
OsiriX MD Version 12.0 OsiriX osirix-viewer.com 
Paraplast embedding paraffin wax Millipore Sigma 1003230215
Small glass beaker Fisher Scientific S111045
Small, perforated spoon (14.5 cm) F.S.T 10370-17
Straight Vannas Scissors (4–8 mm) F.S.T 15018-10 A pair
Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope FUJIFILM VisualSonics Inc. Vevo2100
Xylene Fisher Chemical UN1307

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593 (2020).
  2. vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
  3. Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
  4. Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
  5. Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
  6. Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
  7. Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
  8. Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
  9. Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
  10. Yu, Q., Tian Leatherbury,, Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
  11. Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
  12. Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).

Tags

विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 190 जन्मजात हृदय दोष भ्रूण इकोकार्डियोग्राम नेक्रोपसी एम्बेडिंग एपिस्कोपिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 3 डी पुनर्निर्माण
भ्रूण माउस में संरचनात्मक हृदय दोषों को चिह्नित करने के लिए एक पाइपलाइन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guzman-Moreno, C., Zhang, P.,… More

Guzman-Moreno, C., Zhang, P., Phillips, O. R., Block, M., Glennon, B. J., Holbrook, M., Weigand, L., Lo, C. W., Lin, J. H. I. A Pipeline to Characterize Structural Heart Defects in the Fetal Mouse. J. Vis. Exp. (190), e64582, doi:10.3791/64582 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter