Summary
Denna artikel beskriver murina medfödda hjärtsjukdomar (CHD) diagnostiska metoder med fetal ekokardiografi, obduktion och episkopisk fluorescensbildtagning (EFIC) med episkopisk konfokalmikroskopi (ECM) följt av tredimensionell (3D) rekonstruktion.
Abstract
Medfödda hjärtsjukdomar (CHD) är viktiga orsaker till spädbarnsdöd i USA. På 1980-talet och tidigare dog de flesta patienter med måttlig eller svår kranskärlssjukdom före vuxen ålder, med maximal dödlighet under den första levnadsveckan. Anmärkningsvärda framsteg inom kirurgiska tekniker, diagnostiska metoder och medicinsk hantering har lett till markanta förbättringar av resultaten. För att tillgodose de kritiska forskningsbehoven för att förstå medfödda hjärtfel har murina modeller gett en idealisk forskningsplattform, eftersom de har mycket liknande hjärtanatomi som människor och korta graviditetshastigheter. Kombinationen av genteknik med fenotypningsverktyg med hög kapacitet har möjliggjort replikation och diagnos av strukturella hjärtfel för att ytterligare belysa de molekylära vägarna bakom CHD. Användningen av icke-invasiv fetal ekokardiografi för att screena hjärtfenotyperna i musmodeller i kombination med den höga troheten hos episkopisk fluorescensbildtagning (EFIC) med hjälp av episkopisk konfokalmikroskopi (ECM) histopatologi med tredimensionella (3D) rekonstruktioner möjliggör en detaljerad bild av anatomin hos olika medfödda hjärtfel. Detta protokoll beskriver ett komplett arbetsflöde av dessa metoder för att få en korrekt diagnos av murina medfödda hjärtfel. Att tillämpa detta fenotypningsprotokoll på modellorganismer kommer att möjliggöra noggrann CHD-diagnos, vilket ger insikter i mekanismerna för CHD. Att identifiera de underliggande mekanismerna för CHD ger möjligheter till potentiella terapier och interventioner.
Introduction
Medfödda hjärtsjukdomar (CHD) är den vanligaste neonatala fosterskadan 1,2, som påverkar cirka 0,8% -1,7% av nyfödda och resulterar i signifikant neonatal dödlighet och sjuklighet3. En genetisk etiologi är starkt indicerad med CHD 4,5. Genmodifierade musmodeller har använts i stor utsträckning för att förstå komplexiteten hos CHD och de mekanismer som orsakar dem på grund av att mössen har fyrkammarhjärtan och jämförbara hjärtutvecklings-DNA-sekvenser hos mus och mänskliga foster6. Att identifiera fenotypen hos musmutanterna är det grundläggande första steget i att karakterisera funktionen hos den riktade genen. Musmodeller som uttrycker gendoseringseffekter, där en enda genetisk mutation kan resultera i ett spektrum av hjärtfel som efterliknar mänskliga CHD, är viktiga för att förstå komplexiteten hos CHD och de mekanismer som orsakar dem.
Den här artikeln beskriver en pipeline för att karakterisera hjärtfenotyper i musmodeller. De tillämpade metoderna använder fetalt ekokardiogram 7, följt av obduktion och ECM-histopatologi 7,8, som kan visa den detaljerade anatomin för att utveckla murina hjärtfenotyper. Ett fetalt ekokardiogram är en icke-invasiv modalitet som möjliggör direkt visualisering av flera embryon med rimlig bildupplösning. Dessutom ger ett fetalt ekokardiogram en snabb bestämning av det totala antalet embryon i en kull, deras utvecklingsstadier och den relativa orienteringen och platsen i livmoderhornet. Med hjälp av ett spektralt doppler/färgflöde kan onormala embryon identifieras baserat på strukturen, den hemodynamiska störningen, tillväxtbegränsningen eller utvecklingen av hydrops. Eftersom en fosterekokardiogramstudie är en icke-invasiv teknik kan den användas för att skanna på flera dagar och för att observera förändringarna i hemodynamik eller hjärtmorfologi. Att få högkvalitativ avbildning av fostrets ekokardiogram kräver övning och skicklighet, eftersom specifika hjärtfel kan missas på grund av brist på erfarenhet och kunskap. På grund av detta kan en mer definitiv analys av hjärtmorfologi erhållas genom en kombination av obduktion och ECM-histopatologi. Obduktion ger direkt visualisering av bågstrukturen, de relativa relationerna mellan aorta och lungartär, storleken på ventriklerna och atrierna, hjärtans position i förhållande till bröstet och bronkopulmonala strukturer. Inre detaljer som hjärtklaffar och väggtjocklek kan dock vara svåra att bedöma genom obduktion ensam. Således rekommenderas ECM-histopatologi för en avgörande diagnos. ECM-histopatologi är en högupplöst visualiseringsteknik som möjliggör både 2D- och 3D-rekonstruktion av bildstacken9. Dessa bilder erhålls genom seriell episkopisk fluorescerande avbildning av ett paraffininbäddat prov eftersom det är tunt snittat med ett konsekvent intervall av en automatisk mikrotom. Till skillnad från klassisk histologi fångas bilder som en sektion innan den klipps ut från blocket så att alla bilder tas inom samma referensram. På grund av detta kan 2D-bildstacken som produceras av ECM-histopatologi enkelt och tillförlitligt rekonstrueras i tre dimensioner. Detta görs med hjälp av en DICOM-tittare, vilket möjliggör 3D-visualisering av bilderna i de tre anatomiska planen: koronal, sagittal och tvärgående. Från dessa högupplösta 3D-rekonstruktioner kan en definitiv hjärtdiagnos göras. Tillämpningen av dessa tre olika visualiseringsmodaliteter, antingen var för sig eller i kombination, kan ge noggranna karakteriseringar av strukturella hjärtfel i musembryon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användningen av möss för dessa studier är nödvändig eftersom möss har fyrkammarhjärtan som kan efterlikna mänskliga CHD. Möss tillhandahölls veterinärvård och inrymdes i institutionens Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) -ackrediterade djurvårdsanläggning. Strikta protokoll följdes för att minimera mössens obehag, stress, smärta och skada. Möss avlivades med CO2-gas , vilket är acceptabelt för små gnagare enligt American Veterinary Medical Association Guidelines on Euthanasia. Studierna på möss i detta manuskript utfördes med ett godkänt IACUC-protokoll vid University of Pittsburgh.
1. Fetalt ekokardiogram
OBS: Ett ekokardiogram är ett kraftfullt verktyg för att identifiera kardiovaskulära missbildningar och extrakardiella defekter hos möss. På grund av musembryons lilla storlek (ca 1-2 mm vid midgestation, 3,5 mm vid födseln) krävs ultrahögfrekvent ekokardiografisk utrustning med ultraljudsbiomikroskopi (UBM). UBM tillhandahåller olika högfrekventa (30-50 MHz) prober med ett litet bildfönster (15 mm x 14 mm) som ger upplösningen (30 μm axiell x 68 μm lateral) för att visualisera ett musfoster i taget. En 40 MHz-givare ger högupplösta bilder för att identifiera kardiovaskulära fenotyper7.
- Slå på ekokardiogrammaskinen och välj programmet Kardiologi.
OBS: Följande protokoll kan användas för alla musbakgrunder från embryonal dag (E)14,5 till 19,5. - Bedöva den önskade musen i en anestesiinduktionskammare. Inducera anestesi med en koncentration av 4% isofluran och medicinsk oxygen med en flödeshastighet på 1 l/min och reducera den till 2%-3% för underhåll.
- Placera musen snabbt på bildplattformen. Bildplattformen har uppvärmt stål för att hålla musen varm under proceduren. Sätt musens mun och näsa i bedövningsnoskonen. Säkra lemmarna med tejp för att undvika rörelse. Övervaka hjärtfrekvensen för att säkerställa att den stannar mellan 400-450 slag per minut.
- Övervaka temperaturen med en rektal termometersond och se till att den vilar vid 37 °C ± 0,5 °C. Övervaka andningen för att undvika hypoxi. Håll en mild kraft på sonden för att förhindra skada.
OBS: En värmelampa kan ställas in ovanför musen för att förhindra hypotermi under och för att återhämta sig från anestesi. Petrolatum oftalmisk salva kan användas som smörjmedel för att undvika torra ögon. - Ta bort pälsen från bröstkorgen och buken med hårborttagningskräm. Applicera krämen och vänta 3 minuter innan du tar bort den. Rengör området med 70% etanol. Etanol fungerar bättre än vatten som raksmörjmedel.
- Värm upp ultraljudsgel till normal kroppstemperatur. Applicera ultraljudsgelen generöst och placera givaren på buken för att orientera den i ett horisontellt plan och identifiera blåsan på skärmen. När blåsan har identifierats, skanna kranialt från urinblåsan och leta efter fostret. Mät krona-till-rumplängden för att bestämma graviditetsåldern10 (figur 1 och tabell 1).
OBS: Ändra givarpositionerna för att visualisera olika plan, inklusive de tvärgående fyrkammar-, sagittal- och frontal-/koronala bildplanen7 (figur 1). - Använd färgdopplern för att analysera blodflödet från hjärtat.
- Sätt tillbaka musen i buret om embryon inte har nått det avsedda skedet. Annars förbereder du musen för skörd.
OBS: Se till att musen redan är vaken och återhämtar sig väl från anestesi innan du sätter tillbaka den i buren. - Stäng av isofluran och syre, rengör arbetsområdet och stäng av maskinen.
OBS: Det är viktigt att ta bort gelén från givaren.
2. Obduktion
OBS: När onormala hjärtfenotyper misstänks med hjälp av fetal ekokardiografi samlas foster och fixeras via nedsänkning i hela kroppen i fixeringslösningen: antingen 10% buffrat formalinfosfat eller 4% paraformaldehyd (PFA). Inspektera provets externa och interna morfologi, leta efter makroskopiska anatomiska abnormiteter eller missbildningar.
- Förbered musen.
- Om musen är vuxen, avliva musen med ett standard CO2-protokoll . Använd pincett eller dissekerande sax för att göra snitt (ca 3 cm) i den laterala bröstkorgen och buken för att möjliggöra penetrering av fixeringsmedlet i de inre organen.
OBS: Provet bör fixeras i minst 24 timmar före obduktion om embryot är äldre än E14.5.
- Om musen är vuxen, avliva musen med ett standard CO2-protokoll . Använd pincett eller dissekerande sax för att göra snitt (ca 3 cm) i den laterala bröstkorgen och buken för att möjliggöra penetrering av fixeringsmedlet i de inre organen.
- Analysera utsidan av kroppen.
- Ställ in programvaran för att spara bilderna med ett namn, inklusive provets identifiering, mikroskopförstoring och bildens innehåll.
OBS: Förstoring av 1,0x till 3,2x bör vara tillräcklig för att avbilda de flesta strukturer i E14,5-möss eller äldre. - Placera musen på plattan under stereomikroskoplinsen. Fyll plattan med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att helt täcka provet för att förhindra uttorkning och reflektion i bilderna. Justera förstoringen så att skärmen innehåller hela embryot och ta sedan en bild av både vänster och höger sida av embryot.
OBS: Plattans botten ska beläggas med paraffin, kisel eller annat sådant substrat för att underlätta fästningen. - Fäst provet genom halsen, vänd uppåt och ta en annan bild.
OBS: Rikta stiftet något uppåt för att säkerställa att inga viktiga strukturer i brösthålan är genomborrade.
- Ställ in programvaran för att spara bilderna med ett namn, inklusive provets identifiering, mikroskopförstoring och bildens innehåll.
- Analysera bröstet.
- Medan du lyfter huden i mitten av nacken med pincett, skär huden mot båda armhålorna med saxen innan du skär huden längs medianaxeln mot svansen. Skär sedan huden från naveln till benen. Fäst provet genom handlederna och vristerna.
OBS: Var noga med att bara skära huden. Det rekommenderas att hålla saxens blad horisontellt eller vinklat uppåt. - För att bryta bort bindväven, lyft huden med ett par pincett medan du håller den underliggande vävnaden på plats med det andra paret. Fäst provet genom huden för att exponera bröstet och buken (figur 2).
OBS: För mycket sträckning under fästning, skärning eller skrapning kan leda till vävnadsskada. - Ta ett foto av de exponerade musklerna och skrapa sedan försiktigt bort musklerna för att exponera revbenen.
- Ta en bild av de exponerade revbenen. Separera revbenen från membranet och skär revbenen på båda sidor så långt som möjligt på sidoaxeln mot nacken.
- Exponera hjärtat genom att ta bort de skurna revbenen. Ta en bild av hjärtat.
- Ta bort tymus genom att skala upp den med ett par pincett. Använd det andra paret pincett för att stabilisera tymusens bas för att undvika att riva några underliggande kärl. Ta bilder av hjärtat och de stora kärlen.
OBS: Att använda stift för att sträcka ut några intilliggande strukturer kan hjälpa till att få bättre bildvyer. Ta dessutom separata bilder fokuserade på de stora artärerna, hjärtat och andra strukturer av intresse eftersom de kanske inte är i fokus tillsammans.
- Medan du lyfter huden i mitten av nacken med pincett, skär huden mot båda armhålorna med saxen innan du skär huden längs medianaxeln mot svansen. Skär sedan huden från naveln till benen. Fäst provet genom handlederna och vristerna.
- Analysera buken.
- Dra i membranet för att ta bort det och exponera levern. Ta en bild.
- Fäst tillbaka levern för att exponera magen och bukspottkörteln. Ta en bild.
- Skär matstrupen. Ta bort tjocktarmen och tarmarna genom att dra ut dem med pincett. Skär strax ovanför levern och ta bort den för att avslöja njurarna och binjurarna. Ta en bild.
OBS: De borttagna organen ska förvaras i fixeringslösningen.
- Isolera bröstkorgen för ECM-analysen.
- Skär den nedre bröstkorgen längs en rak linje mellan levern och lungorna. Klipp av huvudet tillräckligt högt för att inte skära förgreningarna i halspulsådern.
- Ta försiktigt bort sidoribborna medan du behåller dorsala revben och ryggraden. Skala upp och skrapa bort ryggfettet.
- Lossa bröstkorgen från resten av kroppen och placera den i en 10% buffrad formalinfosfatlösning.
3. Inbäddning
- Häll fixeringsmedlet i en lämplig flaska för farligt avfall. Tvätta proverna med 1x PBS i 15 min tre gånger.
- Använd ökande koncentrationer av etanol och xylen för att dehydrera proverna. Varaktigheten av alla följande steg beror på embryonernas stadium. Se tabell 2 för mer information.
OBS: Försiktighet bör iakttas vid byte av lösningar för att undvika att skada proverna. De optimala parametrarna för provbearbetning kan justeras empiriskt. Xylen löser upp vissa plaster; Glasinstrument och behållare ska användas. - Byt ut xylen med paraffin under önskad tid. Låt flaskorna ligga i en 65 °C inkubator under lämplig tid (tabell 2).
- Använd färskt paraffin för att bädda in proverna i önskad position.
OBS: Det rekommenderas att orientera provet i mitten av paraffinblocket, med ryggsidan vänd mot toppen och den bakre sidan vänd mot blockets framsida. När du orienterar provet, kom ihåg att provet är inbäddat med blocket vänt upp och ner.
4. Episkopisk konfokalmikroskopi (ECM)
OBS: Efter lämplig inbäddning genomgår embryon bildinsamling seriellt via ECM för histopatologisk analys. Enskilda bilder kan återvinnas från mikrotomen för vidare studier.
- Ta ut paraffinblocket från frysen på -20 °C och ta bort metallformarna.
- Använd ett rakblad för att trimma vaxet på kanterna och baksidan av kassetten. Skär vaxet som omger provet tills det är inneslutet i en liten vaxruta fäst vid kassetten.
OBS: Var mycket försiktig vid hantering av blad. - Använd metallspaken för att klämma paraffinblocket mot mikrotomens skivningssteg. Välj MAN-funktionen (manuell) i körläge, höj paraffinets yta nära bladet och kör några bilder för att säkerställa att bladet kommer i kontakt med paraffinblocket.
- Öppna LAS AF-programmet och välj MatrixScreener. Välj Enkel vanlig matris och läs in lämplig tidigare sparad mall. Klicka på Quick LUT-knappen för att växla till vit och orange ombre.
- Välj Ställ in jobb och dra den 405 nm synliga lasern maximalt. Matcha spektrumblockets vänstra kant med 405 nm-linjen och dra den högra kanten till 800 nm-linjen. Markera alternativet Pinhole och starta Live-vyn .
- Justera laserprojektionens position för att centrera provet på skärmen och justera zoomratten till ~ 20x. För att optimera upplösningen, ställ in förstärkningen på 1,250 V och maximera det blå området med fokusratten; Återställ sedan förstärkningen till cirka 750 V för avbildning.
OBS: Specifika värden kan variera beroende på embryonets tillstånd. - Byt skärmetoden till Auto, ställ in tjockleken till cirka 50 μm och kör bilderna. Sluta skära när lungorna och luftvägarna är i sikte.
- Välj en skärtjocklek mellan 8-10 μm och stoppa Live-vyn . Öppna Microtome Communicator för att starta bildbehandling. Se till att den tillfälliga lagringsmappen är tom innan du samlar in bilder.
- Sluta skära när ingen ytterligare hjärtstruktur visualiseras. Stäng Microtome Communicator-programmet och exportera den temporära filen till en .tiff bildserie via bildbehandlingsprogrammet för 3D-rekonstruktioner senare.
5. Tredimensionell (3D) rekonstruktion
OBS: Syftet med 3D-rekonstruktion är att bearbeta en 2D-bildstack från ECM-avbildning till 3D-videor i koronala, sagittala och tvärgående orienteringar och att använda 3D-videor för diagnos av strukturella och anatomiska abnormiteter i proverna.
- Öppna ECM-bildstacken i bildbehandlingsprogrammet.
- Dra och släpp bilden filerna i bildbehandlingsprogrammet. Vänd ECM-bilderna horisontellt genom att välja Bild > Omforma > Vänd horisontellt i menyraden.
- Spara den vända bilden och stäng bildbehandlingsprogrammet.
- Importera ECM-bildstacken i DICOM-visningsprogramvaran.
- Dra och släpp de horisontellt vända ECM-bilderna till DICOM-visningsprogramvaran. Kontrollera att det finns en ljusblå kantlinje runt exempellistan, annars kan bilder läggas till i en befintlig exempelmapp.
- Markera länkarna eller filerna som ska kopieras till databasen när popup-fönstret visas. Ett nytt exempel visas i exempellistan med samma namn som filen som kopierades till DICOM-visningsprogramvaran.
- Klicka på den nyligen tillagda filen för att öppna den.
- Utför 3D-rekonstruktion.
- När filen har öppnats klickar du på menyn 2D/3D Reconstruction Tools i verktygsfältet och väljer 3D MPR.
- För Pixel X-upplösning och Pixel Y-upplösning anger du bildupplösningen genom att ange zoomen som används under ECM-avbildning. För segmentintervallet anger du segmenttjockleken som används för att klippa under ECM-avbildning.
OBS: Kameraupplösningen ändras beroende på kamerans zoom och kan skilja sig från kamera till kamera.
- Använd de olika verktygen från fliken Verktyg till vänster för att justera bildstaplar efter behov.
- Använd WW/WL-verktyget för att justera fönsterbredd och fönsternivå. Klicka och dra verktyget på bilden uppåt för att minska bildens ljusstyrka och nedåt för att öka den. Klicka och dra verktyget på bilden åt höger för att minska bildkontrasten och åt vänster för att öka den.
OBS: De optimala WW/WL-inställningarna för en struktur kan vara suboptimala för en annan. Av denna anledning rekommenderas att skapa separata videor för att visa olika strukturer. - Använd Panorera verktyg för att dra bilderna till önskade positioner. Använd zoomverktyget för att förstora eller förminska bilden efter behov och roteringsverktyget för att rotera bilden efter behov.
Om du förstorar bilder kan bildkvaliteten försämras. Var försiktig när du roterar bilder, eftersom det kan leda till att axlarna vänds.
- Använd WW/WL-verktyget för att justera fönsterbredd och fönsternivå. Klicka och dra verktyget på bilden uppåt för att minska bildens ljusstyrka och nedåt för att öka den. Klicka och dra verktyget på bilden åt höger för att minska bildkontrasten och åt vänster för att öka den.
- Klicka och dra den färgade axeln på den första panelen. Lägg märke till hur rotation av denna axel ändrar orienteringen för de andra två panelerna. Rotera de tre panelernas axlar tills de tre panelerna representerar koronala, sagittala och tvärgående vyer av provet.
OBS: Vid omorientering av proverna, behåll korrekt främre/bakre orientering. - Generera videor.
- När alla tre panelerna är korrekt placerade, orienterade och ljusare, klicka på panelen som representerar koronalvyn.
- Klicka på Filmexport till höger i menyraden. Klicka på Batch och dra skjutreglagen Från och Till för att omfatta hela intresseområdet. För Intervall väljer du alternativet Samma som tjocklek . Spara videon som visar vyns orientering.
- Granska videon för att se om strukturerna av intresse kan identifieras tillräckligt. Om inte, använd verktygen (steg 5.4) för att justera videorna efter behov och spara videon igen.
- Upprepa steg 5.6 för tvärgående och sagittala vyer. Diagnostisera exemplen med hjälp av rekonstruerade videor.
OBS: Titta noga på videorna i varje orientering för att göra en fullständig bedömning av om provet uppvisar några anatomiska abnormiteter eller sjukdomsfenotyper (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Musembryon med signifikanta hemodynamiska defekter noterades vara embryonalt dödliga. En mängd olika CHD kan identifieras genom det högeffektiva, icke-invasiva fetalt ekokardiogrammet med olika vyer (figur 1).
Septumdefekter: De vanligaste CHD är septumdefekter såsom en ventrikulär septumdefekt (VSD), en atrioventrikulär septumdefekt (AVSD) och en förmaksseptumdefekt (ASD)1. VSD eller AVSD kan enkelt visualiseras med hjälp av 2D-bilder och färgflödesbilder. Blodflödet över ventriklerna eller mellan förmaken och ventriklerna kan lätt identifieras (figur 3). ASD är svårt att skilja med patent foramen ovale hos ett foster.
Anomalier i utflödeskanalen: Som visas i figur 3 är flödet i huvudlungartären över det stigande aortaflödet i normala embryon. I embryon med ett dubbelt utlopp av höger kammare (DORV) kan båda stora artärerna ses som härrör från höger kammare. DORV är också associerad med VSD (figur 3D) och kan identifieras med hjälp av färgflöde. Men med tanke på embryonas lilla storlek kan DORV ibland inte på ett tillförlitligt sätt särskiljas från åsidosättandet av aorta, pulmonell atresi eller ihållande truncus arteriosus (PTA). Vid PTA kan endast ett utflödesflöde ses i fostrets ekokardiogram (figur 3E). Den detaljerade bågstrukturen och huvudlungartären kan observeras med obduktion (figur 2E, F).
Obduktion kan snabbt diagnostisera situsstatus i bröstet och buken och hjärtpositionen i förhållande till bröstet (antingen levokardi (figur 2C-E) eller dextrokardi). Utflödeskanalstrukturer och den relativa storleken på både förmak och kammare kan lätt visualiseras (figur 2E,F).
ECM-histopatologi är guldstandardtekniken för att bedöma någon strukturell hjärtanomali 8,11,12. Det ger en oöverträffad upplösning och detalj till embryonernas strukturer. Tredimensionell rekonstruktion med olika plan och vyer kan enkelt identifiera förhållandet mellan de stora artärerna och ventriklarna (figur 3) och defekten mellan ventriklerna och förmaken.
Figur 1: Platserna för mätning av kron-gumplängden i 2D-ekokardiogrambilder av embryon för att bestämma graviditetsåldern. 2D-ekokardiogrambilder av embryon vid (A) E11.5, (B) E12.5, (C, D) E13.5-E14.5. (D) Det sjuka embryot är mindre än sitt (C) syskon och noteras ha ett "grumligt" utseende med hydrops (pil). (A–C) Levande embryon visar distinkta organ. Representativt VB-läge med färgbilder av E14.5-hjärta i en koronal 4-kammarvy lutad framåt för att avbilda (E) utflödeskanalerna visar intakt ventrikulär septum med det normala förhållandet mellan stora artärer, vilket bekräftas med ECM i (E ') koronalvyn. (F) Representativ sagittal bild av E14.5-hjärtat visar vänster kammare och höger kammares utflödeskanaler med stigande aorta (AO) spetsad kranialt och lungartären riktad bakåt (mot ryggraden), vilket bekräftas med ECM i (F ') sagittal vy. (G) Representativ tvärvy av vänster kammare (LV) och höger kammare (RV), vilket bekräftas med ECM i (G') tvärvy. (H) En tvärgående vy vid basen av hjärtat i ECM visar en distinkt och separerad aortaklaffen (AV) och lungventilen (PV). PV är främre till AV. (H') Representativ ECM-tvärgående bild av ihållande truncus arteriosus (PTA) visar vänster lungartär och höger lungartär som uppstår bakom den odelade ihållande truncal artären, med vänster halspulsåder som uppstår främre och kraniellt från den ihållande truncal artären. Förkortningar: A: främre, AO: aorta, AV: aortaklaff, Cd: caudal, Cr: kranial, DAO: fallande aorta, L: vänster, LA: vänster förmak, LCA: vänster halspulsåder, LPA: vänster lungartär, LV: vänster kammare, P: bakre, PA: lungartär, PTA: ihållande truncus arteriosus, R: höger, RA: höger förmak, RPA: höger lungartär, RV: höger kammare. Skalstång: 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa bilder av obduktion för att observera kardiovaskulära avvikelser . (A) Ett embryo fäst vid en dissekeringsskål med svart bakgrund utan uppenbara fenotyper. Bilden visar huvudets grova anatomi, digitaler, brösthålighet och buk. (B) Dermis avlägsnas från valpen och avslöjar submandibulära körtlar, bröstkorg och buk. (C) Bröstkorgen lyfts och avslöjar brösthålans grova anatomi, inklusive bräss, hjärta, lungor och mellangärde. (D) En zoomad vy av bröstet med bröstkorgen borttagen. (E) Thymus avlägsnas och avslöjar stora kärl och luftstrupar. (F) En zoomad vy över stora fartyg. Förkortningar: AAO: stigande aorta, D: membran, LA: vänster förmak, LCA: vänster halspulsåder, LSVC: vänster överlägsen vena cava, LV: vänster kammare, P: perikardium, RA: höger förmak, Rb: revben, RCA: höger halspulsåder, RL: höger lunga, RSVC: höger överlägsen vena cava, RV: höger kammare, S: sternum, SCA: höger subklavisk artär, SMG: submandibulära körtlar, T: luftstrupen, Th: bräss. Skalstång: 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativt fetalt ekokardiogram (Echo) och bilder från episkopiskt konfokalmikroskop (ECM). (A) Echo visar en intakt ventrikulär septum utan interventrikulär shunt och normala relaterade stora artärer i den normala kontrollen, bekräftad av (A') ECM vid E14.5-15.5-steget. (B) Ultraljudsdetektering av en atrioventrikulär septumdefekt (AVSD). Ekoavbildning i 4-kammarvyn visar kommunikationen mellan LA, RA, LV och RV, bekräftad av (B ') ECM vid E14.5-steget. (C) Ultraljudsdiagnos av ventrikelseptumdefekten (VSD) med färgflöde visar flödet över LV och RV, bekräftat av (C ') ECM vid E16.5-steget. (D) Echo och (D') ECM demonstrerar DORV med en VSD mellan LV och RV med sida vid sida stora artärer (aorta är rätt till lungartären) vid E14.5-stadiet. (E) Ultraljudsdiagnos av ihållande truncus arteriosus (PTA) visar kommunikation mellan LV och RV med en enda utflödeskanal som åsidosätter båda ventriklarna (PTA). (E') Denna patologi bekräftas av ECM vid E14.5-steget. Skalstång: 0,5 mm. AO: aorta, AVSD: atrioventrikulär septumdefekt, Cd: caudal, Cr: kranial, L: vänster, LA: vänster förmak, LV: vänster kammare, PA: lungartär, PTA: ihållande truncus arteriosus, R: höger, RA: höger förmak, RV: höger kammare, VSD: ventrikelseptumdefekt. Skalstång: 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Etapp | Krona-till-gump Längd (mm) | Fosterområde (mm2) | Hjärtområde (mm2) | Hjärtområde/fosterområde |
| E12.5 | 7,9 ± 0,8 (n = 77) | 23,2 ± 5 (n = 77) | ||
| E13.5 | 10,5 ± 0,9 (n = 92) | 40,9 ± 7 (n = 92) | ||
| E14.5 | 12,5 ± 0,9 (n = 101) | 57,6 ± 8 (n = 101) | 2,9 ± 0,5 (n = 70) | 0,050 ± 0,004 (n = 70) |
| E15.5 | 14,1 ± 0,5 (n = 134) | 71,4 ± 6 (n = 134) | 3,8 ± 0,4 (n = 87) | 0,053 ± 0,004 (n = 87) |
| E16.5 | 15,4 ± 0,6 (n = 112) | 82,7 ± 6 (n = 112) | 4,9 ± 0,5 (n = 87) | 0,058 ± 0,007 (n = 87) |
| E17.5 | 16,6 ± 0,4 (n = 211) | 96,9 ± 7 (n = 211) | 6,1 ± 0,6 (n = 146) | 0,063 ± 0,004 (n = 146) |
| E18.5 | 17,7 ± 0,6 (n = 139) | 112,1 ± 8 (n = 139) | 7,1 ± 0,8 (n = 93) | 0,063 ± 0,005 (n = 93) |
| E19.5 | 18,7 ± 0,7 (n = 57) | 126,7 ± 8 (n = 57) | 7,7 ± 0,7 (n = 36) | 0,062 ± 0,005 (n = 36) |
Tabell 1: Utvecklingsprofil för fostertillväxt.
| E14.5 | E16.5 | E18.5 | Nyfödd | |
| 70% etanol | 1 tim | 1,5 timmar | 3 timmar | 4 timmar |
| 95% etanol | 35 minuter | 45 minuter | 1 tim | 1 tim |
| 95% etanol | 35 minuter | 45 minuter | 1 tim | 1 tim |
| 100% etanol | 15 minuter | 15 minuter | 30 minuter | 6 minuter |
| Xylen 1 Annonser | 20 minuter | 30 minuter | 40 minuter | 30 minuter |
| Xylen 2 | 20 minuter | 30 minuter | 40 minuter | 30 minuter |
| Vax 1 | 20 minuter | 20 minuter | 20 minuter | 30 minuter |
| Vax 2 | 20 minuter | 20 minuter | 20 minuter | 30 minuter |
| Vax 3 | Övernattning | Övernattning | Övernattning | Övernattning |
Tabell 2: Protokoll för inbäddning av embryon baserat på embryonala dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genmodifierade möss har använts för att förstå patomekanismerna vid medfödda hjärtfel. De protokoll vi tillhandahåller i denna studie försöker effektivisera och standardisera processen för att bedöma murina fosterhjärtfel. Det finns dock kritiska steg att notera under protokollet. Musembryon växer betydligt under varje graviditetsdag, och rätt tid att skörda en mus kan bestämmas genom att utföra ett fosterekokardiogram exakt. Fostrets ekokardiogram kan användas för att screena fostrets kardiovaskulära patologi. En 2D-bild möjliggör identifiering av onormal anatomi och hjärtfunktion, med hjälp av färgdoppler för att undersöka blodflödet och upptäcka eventuell kommunikation mellan hjärtkamrarna eller onormala utflödes- och inflödeskanaler. För att bestämma CHD-diagnosen skannas foster från embryonal dag E14.5 när utflödeskanalseptationen och hjärtkammarbildningen är klara. Skanning i tidigare skeden kan återspegla utvecklingsfördröjningen.
Histopatologi är standarden för att karakterisera CHD8 genom att använda en mikrotom följt av optisk mikroskopvisualisering. Den största nackdelen med standardmetoden är bristen på en intuitiv 3D-visning av kardiovaskulära strukturer för diagnos och begränsningen i bristen på att ge olika vyer av proverna. En ECM-histologi är den mest tidseffektiva metoden för att karakterisera hjärtfel. Om ECM inte är tillgängligt kan en mikrotom användas för att sektionera embryot och bestämma hjärtfenotyper. Andra alternativ för att erhålla hjärtavbildning är att utföra hög genomströmning, högupplöst magnetisk resonanstomografi (MRT) eller datortomografi (CT). En viktig aspekt av MR eller CT är att flera embryon kan avbildas samtidigt; Men även efter en ultraljud-, CT- eller MR-fenotypning krävs histopatologi för att bekräfta någon CHD-diagnos.
Med hjälp av ECM-avbildning för histopatologi avbildas embryot seriellt efter varje snitt med hjälp av ett laserskanningskonfokalmikroskop monterat över den automatiska glidmikrotomen. De enskilda bilderna som samlats in från ECM möjliggör efterföljande 3D-rekonstruktioner och gör att proverna kan reliceras digitalt i vilket bildplan som helst utan att ta om bilderna 8,11. En sådan operation möjliggör en omfattande bedömning av hjärtats anatomi, som kan användas i olika utvecklingsstadier. Dessutom kan enskilda glas återvinnas från mikrotommen medan data samlas in från ECM-utrustningen. Även om ECM-histopatologi är guldstandarden för att bedöma någon strukturell hjärtanomali, finns det begränsningar med tillgängligheten av utrustning, programvara och körtid per embryo. Körtiden till sektion av ett embryonalt hjärta kan variera från 1-3 timmar per prov, beroende på dess storlek. På grund av utrustningens komplexitet måste forskare regelbundet kontrollera på datorn för att se till att intresseområdet inom fältet registreras. Forskare måste också kontrollera provet för att säkerställa att inga paraffinvaxspån hindrar provet från laserskannern.
ECM och efterföljande 3D-rekonstruktion ger en fullständig högupplöst bedömning av eventuella strukturella hjärtfel oavsett inbäddningsplanen för provet. Dessa protokoll har hjälpt till att framgångsrikt diagnostisera en rad CHD och gjort det möjligt för oss att förstå hjärtembryogenesen i murina modeller och patologier relaterade till genetiska mutationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter i detta manuskript.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593 (2020).
- vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
- Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
- Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
- Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
- Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
- Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
- Yu, Q., Tian Leatherbury,, Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).
