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Immunology and Infection

ड्रग-एल्यूटिंग सामग्री की अनुदैर्ध्य जीवाणुरोधी गतिविधि निर्धारित करने के लिए एक नई विधि

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64641
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Harris Orthopaedics Laboratory, Massachusetts General Hospital, 2Department of Orthopaedic Surgery, Harvard Medical School

Summary

यहां, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वास्तविक समय एटीपी-आधारित ल्यूमिनेसेंट माइक्रोबियल व्यवहार्यता परख का उपयोग करके रोगनिरोधी नैदानिक अनुप्रयोग का अनुकरण करने के लिए एंटीबायोटिक-एल्यूटिंग बहुलक की जीवाणुरोधी प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह विधि ड्रग-एल्यूटिंग सामग्री की अनुदैर्ध्य गतिविधि की निगरानी को सक्षम करती है और इसे व्यापक रूप से एंटी-माइक्रोबियल दवा वितरण प्लेटफार्मों का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

अल्ट्राहाई आणविक भार पॉलीथीन (यूएचएमडब्ल्यूपीई) का व्यापक रूप से भार-असर सतह के रूप में कुल संयुक्त आर्थ्रोप्लास्टी में उपयोग किया जाता है। पेरिप्रोस्थेटिक संयुक्त संक्रमण, जिनमें से अधिकांश संयुक्त प्रतिस्थापन के तुरंत बाद होते हैं, कुल घुटने संशोधन सर्जरी का लगभग 25% हिस्सा बनाते हैं, और जीवाणु संक्रमण का पूर्ण उन्मूलन एक बड़ी चुनौती है। इस समस्या से निपटने का एक आशाजनक तरीका नियमित प्रणालीगत एंटीबायोटिक प्रोफिलैक्सिस का समर्थन करने के लिए बैक्टीरिया को रोकने के लिए पर्याप्त एंटीबायोटिक सांद्रता के स्थानीय निरंतर वितरण को सुनिश्चित करना है। कुशल स्थानीय दवा वितरण उपकरणों के विकास में अनुसंधान में वृद्धि हुई है। यद्यपि दवाओं के लिए स्थापित जीवाणुरोधी परीक्षण विधियों का उपयोग दवा-एल्यूटिंग सामग्री की जीवाणुरोधी प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन वास्तविक समय और अनुदैर्ध्य जीवाणुरोधी प्रभावकारिता डेटा प्रदान करने के मामले में उनकी कमी है जो इन उपकरणों से एंटीबायोटिक दवाओं के क्षालन प्रोफाइल से संबंधित हो सकती है। यहां, हम एंटीबायोटिक-एल्यूटिंग यूएचएमडब्ल्यूपीई प्रत्यारोपण की जीवाणुरोधी प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए एक प्रत्यक्ष और बहुमुखी पद्धति की रिपोर्ट करते हैं। इस पद्धति का उपयोग एक लंबे प्रयोग के प्रत्येक समय बिंदु पर बैक्टीरिया संस्कृति से बचने के लिए एक मंच के रूप में किया जा सकता है और इसे अन्य स्थानीय दवा वितरण उपकरणों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

ऑस्टियोआर्थराइटिस एक महत्वपूर्ण अपक्षयी स्थिति हैजो दुनिया भर में 500 मिलियन वयस्कों को प्रभावित करती है। अंत-चरण गठिया के उपचार में स्वर्ण मानक कुल संयुक्त प्रतिस्थापन है, जो 2030 2 तक अकेले संयुक्त राज्य अमेरिका में सालाना 2 मिलियन से अधिक रोगियों में किए जाने का अनुमान है, वैश्विक मांग में भी जबरदस्त वृद्धि हुई 3,4। इस प्रक्रिया में जोड़ों की कार्टिलाजिनस सतहों को धातु/सिरेमिक और अत्यधिक क्रॉसलिंक्ड अल्ट्राहाई मॉलिक्यूलर वेट पॉलीथीन (यूएचएमडब्ल्यूपीई) से बने लोड-असर सिंथेटिक सामग्री के साथ बदलना शामिल है। कुल संयुक्त प्रतिस्थापन गठिया5 से पीड़ित रोगियों के लिए जीवन की गुणवत्ता में काफी सुधार करते हैं, लेकिन एक महत्वपूर्ण जटिलता जो प्रत्यारोपण के प्रदर्शन और रोगियों की संतुष्टि को खतरे में डालती है, वह है पेरिप्रोस्थेटिक संयुक्त संक्रमण (पीजेआई), जो संशोधन सर्जरी के 15% -25% के लिएजिम्मेदार है। ज्यादातर मामलों में संक्रमण का कारण सर्जरीके दौरान इम्प्लांट साइट का माइक्रोबियल संदूषण माना जाता है। दूषित आबादी तब प्रत्यारोपण और ऊतक सतहों पर फैलतीहै। मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली प्रतिक्रिया में ट्रिगर होती है, लेकिन दूषित जीवों की वृद्धि दर और बायोफिल्म गठन उन्हें प्रतिरक्षा कोशिकाओं से बचने में सक्षम बना सकता है,जिससे बैक्टीरिया 9,10,11 के उन्मूलन के बिना साइटोकिन और केमोकाइन तूफान बढ़ सकता है। हड्डी के परिणामस्वरूप गहरा संक्रमण प्रत्यारोपण के निर्धारण और प्रदर्शन के साथ-साथरोगी के स्वास्थ्य को खतरे में डालता है।

स्टेफिलोकोकस ऑरियस और कोगुलेस-नकारात्मक स्टेफिलोकोसी पीजेआई13 के प्रमुख प्रेरक जीव हैं। स्टेफिलोकोकल संक्रमण की गंभीरता एंटीबायोटिक दवाओं के लिए उनके बढ़ते प्रतिरोध, बायोफिल्म गठन और छोटे कॉलोनी वेरिएंट14,15,16 के रूप में बने रहने की क्षमता के कारण अधिक है। इम्प्लांट से जुड़े संक्रमण इम्प्लांट की सतह पर सूक्ष्मजीवों के आसंजन और एक जटिल बायोफिल्म मैट्रिक्स की स्थापना के कारण होते हैं जो बैक्टीरिया को हानिकारक मेजबान प्रतिरक्षा कारकों और एंटीबायोटिक दवाओं की प्रभावी सांद्रता से बचने में सक्षम बनाता है14,15,16. पारंपरिक उपचार विधियों में लंबे समय तक अंतःशिरा और मौखिक एंटीबायोटिक संयोजन शामिलहैं। इस दृष्टिकोण का एक बड़ा दोष संक्रमण स्थल पर दवा की कम जैव उपलब्धता और उपचार अवधि में लगातार बैक्टीरिया को खत्म करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं की पर्याप्त सांद्रता प्राप्त करने की कठिनाई है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सरखराब परिणाम होते हैं। इन कमियों को दूर करने के लिए, एक पूरी तरह कार्यात्मक स्थानीयकृत ड्रग-एल्यूटिंग यूएचएमडब्ल्यूपीई प्रत्यारोपण को संयुक्त स्थानमें एंटीबायोटिक दवाओं की प्रभावी सांद्रता की निरंतर रिहाई सुनिश्चित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। ड्रग-एल्यूटिंग इम्प्लांट से स्थानीय क्षालन का उपयोग प्रत्यारोपण हटाने और ऊतक के विघटन के बाद शेष किसी भी बैक्टीरिया के विकास और उपनिवेशीकरण को रोकने के लिए एक पूरक उपकरण के रूप में किया जाता है। इस एंटीबायोटिक-एल्यूटिंग यूएचएमडब्ल्यूपीई का इन विट्रो जीवाणुरोधी परीक्षण सामग्री को सीधे बैक्टीरिया के साथ इंजेक्ट करके और स्प्रेड-प्लेट विधि20,21 द्वारा बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करके किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एलुएंट मीडिया के एलिकोट को एगर डिस्क-प्रसार विधि, शोरबा कमजोर पड़ने के तरीकों और टाइम-किल परीक्षण22 जैसे तरीकों का उपयोग करके बैक्टीरिया के खिलाफ परीक्षण किया जा सकता है। ये सभी विधियां कॉलोनी गिनती और टर्बिडिटी माप के माध्यम से एलिकोट के संग्रह के लगभग 16-18 घंटे बाद विकास अवलोकन पर निर्भर करती हैं। ऐसे उपकरणों से एंटीबायोटिक दवाओं के क्षालन को इन इन विट्रो विधियों का उपयोग करके अनुदैर्ध्य रूप से निर्धारित किया जा सकता है; हालांकि, इन एकाग्रता प्रोफाइल के ट्रांसलेशनल मूल्य को निर्धारित करने के लिए, जीवाणुरोधी गतिविधि का आकलन करने के लिए एक मजबूत वास्तविक समय इन विट्रो विधि की आवश्यकता होती है।

इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली माइक्रोबियल व्यवहार्यता परख को ल्यूसिफेरिन-ल्यूसिफेरस-आधारित पहचान तकनीक का उपयोग करके एक जीवित जीवाणु कोशिका से जारी एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) के अनुरूप ल्यूमिनेसेंस को मापकर व्यवहार्य बैक्टीरिया की मात्रा का ठहराव के लिए विकसित किया गया था। एटीपी, जीवित कोशिकाओं की ऊर्जा मुद्रा के रूप में, शारीरिक रूप से व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रत्यक्ष संकेतक के रूप में कार्य करता है। अभिकर्मक सेल लाइसिस करता है, जो व्यवहार्य कोशिकाओं से एटीपी अणुओं को जारी करता है जो तब ल्यूमिनेसेंस के रूप में पाए जाते हैं। इस ल्यूमिनेसेंस का नमूना23 के भीतर व्यवहार्य जीवाणु कोशिकाओं के अनुपात से सीधा संबंध है। यह एक वास्तविक समय, सरल, बहुमुखी, तेज, एकल अभिकर्मक-आधारित परख है जिसे ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक सूक्ष्मजीवों दोनों के साथ विभिन्न प्रकार के परख डिजाइनों और स्थितियों में अनुकूलित किया जा सकता है। यहां हम माइक्रोबियल व्यवहार्यता परख (जैसे, बैकटिटर ग्लो) के आधार पर एक संशोधित टाइम-किल परख का उपयोग करके एस ऑरियस के प्रयोगशाला और नैदानिक उपभेदों के साथ इनक्यूबेट किए गए एंटीबायोटिक-एल्यूटिंग यूएचएमडब्ल्यूपीई की वास्तविक समय जीवाणुरोधी गतिविधि को निर्धारित करने के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं। जबकि कार्यप्रणाली को एक विशिष्ट प्रत्यारोपण सामग्री और एक विशिष्ट आर्थोपेडिक अनुप्रयोग के साथ वर्णित किया गया है, विधि नैदानिक अनुप्रयोगों के साथ अन्य एंटीबायोटिक-एल्यूटिंग डिलीवरी उपकरणों के परीक्षण के लिए एक मंच प्रदान कर सकती है।

Protocol

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. मुलर-हिंटन शोरबा (एमएचबी) तैयारी: विआयनीकृत पानी के 1 एल में 22 ग्राम केशन-समायोजित एमएचबी को घोलें। 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस और 15 पाउंड दबाव पर मीडिया को ऑटोक्लेव करें, यह सुनिश्चित करें कि बोतल शिथिल रूप से ढकी हुई है। उपयोग तक तैयार बाँझ शोरबा को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. ट्राइप्टिक सोया एगर (टीएसए) तैयारी: 500 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में 20 ग्राम टीएसए पाउडर घोलें। 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस और 15 पाउंड पर आटोक्लेव करें। पिघले हुए आगर के तापमान को कम करने के लिए बाँझ मीडिया को 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में स्थानांतरित करें। ठंडा तैयार एगर को बाँझ पेट्री व्यंजन (~ 15 एमएल) पर डालें, और इसे जमने दें। संक्षेपण से बचने के लिए ठोस आगर प्लेटों को उल्टा स्टोर करें।
  3. ट्राइप्टिक सोया शोरबा (टीएसबी) तैयारी: 500 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में 15 ग्राम टीएसबी पाउडर घोलें। 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस और 15 पाउंड पर शोरबा मिश्रण को आटोक्लेव करें। उपयोग तक तैयार बाँझ शोरबा को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस): आटोक्लेव ने बाँझ उपयोग से पहले 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस और 15 पाउंड पर व्यावसायिक रूप से 1x पीबीएस खरीदा।
  5. माइक्रोबियल व्यवहार्यता परख अभिकर्मक तैयारी: परख की सामग्री को कमरे के तापमान से समतुल्य करें। लियोफिलाइज्ड ल्यूमिनेसेंट अभिकर्मक पाउडर के साथ 10 एमएल बफर मिलाएं, और तैयार अभिकर्मक को -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल एलिकोट के रूप में स्टोर करें। प्रत्येक समय बिंदु से पहले, प्रकाश-संवेदनशील अभिकर्मक को पिघलाएं, और इसे कमरे के तापमान पर लाएं।
  6. जेंटामाइसिन सल्फेट स्टॉक समाधान: 1x पीबीएस के 10 एमएल में 80 मिलीग्राम जेंटामाइसिन सल्फेट (जीएस) को घोलें। 8 मिलीग्राम / एमएल जीएस स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए दवा समाधान को अच्छी तरह से भंवर करें।
  7. वैनकोमाइसिन हाइड्रोक्लोराइड स्टॉक समाधान: 1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए 10 मिलीग्राम वैनकोमाइसिन हाइड्रोक्लोराइड पाउडर को 10 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में अच्छी तरह से घोलें।
  8. बोरिक एसिड बफर समाधान: विआयनीकृत पानी के 900 एमएल में 24.7 ग्राम (0.4 एम) बोरिक एसिड घोलें। 50% (डब्ल्यू / वी) सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान के साथ समाधान के पीएच को 10.4 तक समायोजित करें। इस चरण के आगे, इसे 1 एल बनाने के लिए विआयनीकृत पानी जोड़ें।
  9. ओ-प्थाल्डिएल्डिहाइड अभिकर्मक (ओपीए): 1 एमएल मेथनॉल में 0.2 ग्राम ओपीए घोलें। ओपीए समाधान में 0.4 एम बोरिक एसिड बफर (पीएच 10.4) के 19 एमएल जोड़ें। ओपीए-बोरिक एसिड मिश्रण में 2-मर्कैप्टोइथेनॉल के 0.4 एमएल जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी में अभिकर्मक शीशी को कवर करें, और तैयारी के बाद 2-3 दिनों तक उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    सावधानी: त्वचा, आंखों और कपड़ों के संपर्क से बचें। ओपीए और 2 मर्कैप्टोइथेनॉल अभिकर्मकों की हैंडलिंग केवल उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने के दौरान उचित निकास वेंटिलेशन के साथ फ्यूम हुड के तहत की जानी चाहिए। वाष्प, धूल या एरोसोल में सांस लेने से बचें।

2. कुंवारी और दवा से भरे यूएचएमडब्ल्यूपीई की तैयारी

  1. जेंटामाइसिन सल्फेट और वैनकोमाइसिन हाइड्रोक्लोराइड पाउडर के प्रत्येक 2 ग्राम को छलनी (75 μm छिद्र आकार) के साथ छान लें, और 18-24 घंटे के लिए वैक्यूम ओवन (<0.1 एटीएम) में 45 डिग्री सेल्सियस पर निर्जलित करें।
  2. 5 मिनट के लिए यांत्रिक मिक्सर का उपयोग करके एक कंटेनर में 7% डब्ल्यू / डब्ल्यू (1.12 ग्राम एंटीबायोटिक + 14.88 ग्राम यूएचएमडब्ल्यूपीई) पर यूएचएमडब्ल्यूपीई पाउडर के साथ निर्जलित दवा को मिलाएं।
  3. स्टेनलेस स्टील के साथ एक एल्यूमीनियम कांस्य कस्टम मोल्ड (85 मिमी x 50 मिमी) को 1 घंटे के लिए संवहन ओवन में 180 डिग्री सेल्सियस तक डालें। प्रेस के प्लेटन्स को 170 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें।
  4. मोल्ड में मिश्रित पाउडर जोड़ें, और 10 एमपीए, 10 मिनट के लिए 170 डिग्री सेल्सियस पर संपीड़ित करें, इसके बाद 10 एमपीए पर 45 मिनट पानी ठंडा चक्र करें।
  5. हाइड्रोलिक प्रेस का उपयोग करके प्रेस से मोल्ड किए गए यूएचएमडब्ल्यूपीई ब्लॉक (~ 3.5 मिमी) को हटा दें।
  6. किसी भी सतह की अनियमितताओं और दूषित पदार्थों को हटाने के लिए कम्प्यूटरीकृत संख्यात्मक नियंत्रण (सीएनसी) का उपयोग करके ब्लॉक की शीर्ष और निचली सतहों को मिलाएं।
  7. सीएनसी का उपयोग करके ब्लॉक को 3 मिमी x 5 मिमी x 20 मिमी स्ट्रिप्स में काटें।
  8. अध्ययन के लिए नियंत्रण के रूप में वर्णित उसी पद्धति का उपयोग करके कुंवारी यूएचएमडब्ल्यूपीई (एंटीबायोटिक दवाओं के अतिरिक्त के बिना) तैयार करें।

पूरक चित्र 1: यूएचएमडब्ल्यूपीई नमूनों को ढालने के लिए उपयोग किए जाने वाले मोल्ड के हिस्से। (ए) स्टेनलेस स्टील इंसर्ट प्लेट; (बी) मोल्ड गुहा; (ग) प्लंजर; (डी) बैकप्लेट कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

3. ड्रग-एल्यूटिंग यूएचएमडब्ल्यूपीई के क्षालन कैनेटीक्स का निर्धारण

  1. 3 मिमी x 5 मिमी x 20 मिमी पट्टी को 3 एमएल सिरिंज में एक लुयर लॉक और 25 ग्राम सुई के साथ रखें।
  2. सिरिंज को विआयनीकृत पानी से भरकर और सिरिंज को कई बार घुमाकर पट्टी को धो लें।
  3. 2 एमएल स्नातक स्तर तक विआयनीकृत पानी के साथ सिरिंज भरें।
  4. कमरे के तापमान पर 100 आरपीएम पर एक शेकर पर सिरिंज सेटअप रखें।
  5. प्रत्येक समय बिंदु (6 घंटे, 1 दिन, 2 दिन, 3 दिन, 1 सप्ताह) पर, 2 एमएल शीशी में एलुएंट एकत्र करें।
  6. प्रत्येक समय बिंदु पर, सिरिंज को विआयनीकृत पानी से भरकर और सिरिंज को रोककर पट्टी को धो लें। समाधान को त्याग दें, और अगले समय बिंदु तक प्रयोग जारी रखने के लिए 2 एमएल स्नातक स्तर तक डी-आयनीकृत पानी के साथ सिरिंज भरें।

4. वैनकोमाइसिन एकाग्रता का निर्धारण

  1. 280 एनएम के चरम अवशोषण तरंग दैर्ध्य पर विआयनीकृत पानी में वैनकोमाइसिन एकाग्रता स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से पता लगाएं।
  2. यूवी 96-वेल प्लेट में 100 μL 1 mg/mL स्टॉक घोल जोड़कर और ज्ञात सांद्रता के छह स्तरों (1 mg/mL से 0.03125 mg/mL) को प्राप्त करने के लिए 100 μL विआयनीकृत पानी का उपयोग करके क्रमिक रूप से पतला करके ज्ञात सांद्रता सीमा मानक तैयार करें।
  3. 100 μL एलुएंट्स को यूवी-क्लियर 96-वेल प्लेटों में स्थानांतरित करें, और माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 280 एनएम पर एकाग्रता निर्धारित करें।
  4. संबंधित अवशोषण मूल्यों के खिलाफ ज्ञात दवा सांद्रता को प्लॉट करके एक अंशांकन वक्र उत्पन्न करें। अंशांकन वक्र द्वारा उत्पन्न रैखिक समीकरण का उपयोग करके एलुएंट में अज्ञात दवा एकाग्रता की गणना करें।
  5. एलुएंट वॉल्यूम (~ 1.7 एमएल) के साथ एकाग्रता को गुणा करके दवा द्रव्यमान निर्धारित करें।
  6. सभी पूर्ववर्ती समय बिंदुओं से दवा रिलीज को सारांशित करके एक समय बिंदु पर संचयी दवा रिलीज (मिलीग्राम) की गणना करें।
  7. इम्प्लांट के प्रति सेंटीमीटर वर्ग (सेमी 2) संचयी दवा रिलीज को निर्धारित करने के लिए पट्टी (3.5 सेमी2) के सतह क्षेत्र में दवा रिलीज को सामान्य करें।

5. ओपीए टैगिंग विधि 27 द्वारा जेंटामाइसिन एकाग्रता का निर्धारण।

  1. ओपीए परख करने के लिए जीएस मानक समाधान तैयार करें।
    1. 80 μg / mL GS समाधान के 1 mL को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. पांच और सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में पीबीएस के 500 μL जोड़ें।
    3. 80 μg /mL, 40 μg /mL, 20 μg /mL, 10 μg /mL, 5 μg / mL, और 2.5 μg / mL की GS सांद्रता प्राप्त करने के लिए इन ट्यूबों के साथ एक सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें। ये परख के लिए अंशांकन समाधान के रूप में काम करते हैं।
  2. एक स्पष्ट 96-वेल प्लेट में, अच्छी तरह से ए -1 में पीबीएस के 80 μL और बढ़ते एकाग्रता में कुएं ए -2 से ए -7 के अंशांकन समाधान के 80 μL जोड़ें। यह परख के लिए एक आंतरिक अंशांकन के रूप में कार्य करता है।
  3. एक ही 96-वेल प्लेट में विश्लेषण करने के लिए तीन प्रतियों में खाली कुओं में प्रत्येक नमूने के 80 μL जोड़ें। प्रति वेल प्लेट में नमूनों की संख्या <50 तक सीमित करें ताकि नमूनों में ओपीए समाधान जोड़ने का समय सभी नमूनों के लिए लगभग समान हो और वाष्पीकरण से बचा जा सके।
  4. सभी मानकों और नमूना समाधानों में OPA अभिकर्मक जोड़ें।
    1. फ्यूम हुड में, मेथनॉल के साथ 25 एमएल अभिकर्मक जलाशय भरें।
    2. दूसरे अभिकर्मक जलाशय (खंड 1.8) में 8 मिलीलीटर मेथनॉल और तैयार ओपीए समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें। घोल को ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं।
    3. मल्टीचैनल 100 μL माइक्रोपिपेट के साथ, पहले जलाशय से 96-वेल प्लेट में सभी नमूना युक्त कुओं में 48 μL मेथनॉल जोड़ें।
    4. इस चरण के अलावा, 96-वेल प्लेट में सभी नमूना युक्त कुओं में दूसरे जलाशय से पतला ओपीए समाधान के 72 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए कुएं की प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  5. 10 मिनट के इनक्यूबेशन के तुरंत बाद माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति तीव्रता (340 एनएम की उत्तेजना, 455 एनएम का उत्सर्जन) को मापें।
  6. जीएस की ज्ञात सांद्रता वाले समाधानों के लिए तीव्रता रीडिंग का उपयोग करके अंशांकन वक्र को प्लॉट करें। सबसे अच्छा फिट निर्धारित करने और संबंधित समीकरण उत्पन्न करने के लिए एक रैखिक रेखा जोड़ें।
  7. संबंधित अवशोषण मूल्यों के खिलाफ ज्ञात दवा सांद्रता को प्लॉट करके उत्पन्न अंशांकन वक्रों से एलुएंट में दवा एकाग्रता की गणना करें।
  8. एलुएंट वॉल्यूम (~ 1.7 एमएल) के साथ एकाग्रता को गुणा करके दवा द्रव्यमान की गणना करें।
  9. सभी पूर्ववर्ती समय बिंदुओं से दवा रिलीज को सारांशित करके एक समय बिंदु पर संचयी दवा रिलीज (मिलीग्राम) निर्धारित करें।
  10. इम्प्लांट के प्रति सेंटीमीटर वर्ग (सेमी 2) संचयी दवा रिलीज को निर्धारित करने के लिए पट्टी (3.5 सेमी2) के सतह क्षेत्र में दवा रिलीज को सामान्य करें।

6. बैक्टीरिया की तैयारी

नोट: इस अध्ययन में निम्नलिखित एस ऑरियस उपभेदों का उपयोग किया गया था: टाइप स्ट्रेन 12600, नैदानिक उपभेद एल 1101 और एल 1163 (रोड आइलैंड विश्वविद्यालय में डॉ केरी लाप्लांट से प्राप्त)। इन उपभेदों की संवेदनशीलता प्रोफाइल तालिका 1 में प्रस्तुत की गई है।

बैक्टीरियल उपभेद जेंटामाइसिन एमआईसी वैनकोमाइसिन एमआईसी
ATCC 12600 ≤1 μg/mL (संवेदनशील) ≤0.5 μg/mL (संवेदनशील)
एल 1101 (नैदानिक तनाव) ≥16 μg/mL (प्रतिरोधी) 8 μg/mL (इंटरमीडिएट)
एल 1163 (नैदानिक तनाव) ≤1 μg/mL (संवेदनशील) 8 μg/mL (इंटरमीडिएट)

तालिका 1: नियंत्रण और नैदानिक एस ऑरियस उपभेदों के एंटीबायोटिक संवेदनशीलता प्रोफाइल।

चेतावनी: बैक्टीरियल कल्चर और सस्पेंशन को संभालने से जुड़े सभी कदम कक्षा II, टाइप ए 2 बायोसेफ्टी कैबिनेट के भीतर बीएसएल -2 लैब स्पेस में किए गए थे।

  1. एस ऑरियस के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए टीएसए प्लेटों पर -80 डिग्री सेल्सियस से बैक्टीरिया के स्टॉक को पिघलाएं। 35 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटों को स्थिर रूप से इनक्यूबेट करें।
  2. रात भर उगाए गए आगर प्लेट संस्कृतियों से दो से तीन कॉलोनियों को 1 एमएल बाँझ टीएसबी में स्थानांतरित करें, और 35 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्थिर रूप से इनक्यूबेट करें।
  3. 600 एनएम पर अवशोषण का निर्धारण करके मैलापन को स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से मापने के लिए बैक्टीरिया के 100 μL को एक स्पष्ट 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें।
  4. ल्यूमिनेसेंट परख का उपयोग करके व्यवहार्य बैक्टीरिया गिनती निर्धारित करने से पहले बाँझ एमएचबी का उपयोग करके बैक्टीरिया को 10,000 x पतला करें।

7. वास्तविक समय माइक्रोबियल व्यवहार्यता परख का प्रदर्शन

  1. सफेद अपारदर्शी-तल 96-वेल प्लेटों का उपयोग करके ल्यूमिनेसेंस-आधारित परख करें।
  2. खंड 1.5 में तैयार परख अभिकर्मक के 100 μL के साथ पतला जीवाणु निलंबन के 100 μL मिलाएं।
  3. तैयार 96-वेल प्लेट पर एल्यूमीनियम पन्नी से ढका एक ढक्कन रखें, और 100 आरपीएम झटकों के साथ 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. Gen5 3.11 सॉफ्टवेयर में निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके माइक्रोप्लेट रीडर के साथ तुरंत ल्यूमिनेसेंस को मापें।
    1. कार्य प्रबंधक विंडो में प्रोटोकॉल सेट करने के लिए नया क्लिक करें.
    2. प्लेट प्रकार के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू में कोस्टार 96 सफेद अपारदर्शी का चयन करें।
    3. क्रियाएँ > चरणों का चयन करें मेनू के अंतर्गत पठन पर क्लिक करें.
    4. पठन विधि विंडो के भीतर ल्यूमिनेसेंस पर क्लिक करें। काइनेटिक और ल्यूमिनेसेंस फाइबर विकल्पों को क्रमशः रीड टाइप और ऑप्टिक्स प्रकार के तहत चुना जाता है। OK पर क्लिक करें।
    5. पठन चरण विंडो में <डिफ़ॉल्ट> सेटिंग्स रखें (लाभ = 135; एकीकरण समय = 1 सेकंड; ऊंचाई पढ़ें = 4.5 मिमी)। OK पर क्लिक करें।
    6. प्लेट लेआउट विंडो रन के लिए तैयार दिखाई देती है। लोड प्लेट विंडो में ढक्कन का उपयोग करें बॉक्स की जाँच करें, और OK पर क्लिक करें।
    7. ल्यूमिनेसेंस मानों को पढ़ने के लिए मशीन में 96-वेल प्लेट रखें।

8. प्रत्येक जीवाणु तनाव के लिए एक ल्यूमिनेसेंस बनाम व्यवहार्य गणना मानक वक्र उत्पन्न करना।

नोट: संस्कृति और धारा 6 में वर्णित पद्धति के अनुसार सभी एस ऑरियस उपभेदों की गणना करें।

  1. मानकों के रूप में सेवा करने के लिए क्रमिक रूप से पतला जीवाणु निलंबन तैयार करें।
    1. मैलापन को स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से मापकर रात भर विकसित होने वाले जीवाणु निलंबन की गणना करें।
    2. बैक्टीरिया को पेलेट करने के लिए 5 मिनट के लिए 6,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और एकाग्रता को 1 x 109 सीएफयू / एमएल तक समायोजित करने के लिए बाँझ एमएचबी में गोली को फिर से निलंबित करें।
    3. MHB के 900 μL का उपयोग करके 100 μL स्वच्छ निलंबन को पतला करें, और 1 x 101 CFU / mL तक पहुंचने के लिए 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।
  2. अनुभाग 7 में वर्णित के रूप में तैयार जीवाणु निलंबन पर ल्यूमिनेसेंस परख करें।
  3. प्रयोग के लिए एक रिक्त नियंत्रण के रूप में बाँझ एमएचबी का उपयोग करें, और परीक्षण नमूना ल्यूमिनेसेंस मानों से रिक्त ल्यूमिनेसेंस मान घटाएं।
  4. एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए लॉग (ल्यूमिनेसेंस) के खिलाफ लॉग (सीएफयू) को प्लॉट करें। समीकरण और R2 मान रिकॉर्ड करें।
  5. पूरे अध्ययन में तनाव-विशिष्ट समीकरण का उपयोग करके ल्यूमिनेसेंस मूल्यों के अनुरूप सीएफयू / एमएल निर्धारित करें।

9. समय-निर्भर जीवाणुरोधी गतिविधि अध्ययन सेटअप।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक सेटअप का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. टीएसबी शोरबा के 1 एमएल में रात भर बैक्टीरिया को कल्चर करें।
  2. बाँझ एमएचबी (धारा 6) में रात भर उगाए गए जीवाणु निलंबन को 105 सीएफयू / एमएल तक पतला करें, और प्रयोग की शुरुआत से पहले ल्यूमिनेसेंस इकाइयों का उपयोग करके व्यवहार्य जीवाणु गणना को सत्यापित करें (धारा 7)।
  3. वर्जिन यूएचएमडब्ल्यूपीई और ड्रग-लोडेड यूएचएमडब्ल्यूपीई स्ट्रिप्स (3 मिमी x 5 मिमी x 10 मिमी, सेक्शन 2 में क्षालन अध्ययन के लिए तैयार स्ट्रिप्स का आधा आयाम) को 3 एमएल सिरिंज के भीतर रखें।
  4. 1.5 एमएल मार्क तक संलग्न सुई के माध्यम से सिरिंज में 105 सीएफयू / एमएल युक्त एमएचबी खींचें, जो एमएचबी के 1.35 एमएल के बराबर है (चित्रा 1: चरण 1)।
  5. सिरिंज सेटअप को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हिलने वाले इनक्यूबेटर (100 आरपीएम) पर 6 घंटे, दिन 1, दिन 2, दिन 3, दिन 4, दिन 5, दिन 6 और दिन 7 (चित्रा 1: चरण 2) के संकेतित समय बिंदुओं तक रखें।
  6. प्रत्येक संकेतित समय बिंदु पर, सिरिंज सेटअप को बाहर निकालें, और बैक्टीरियल सस्पेंशन के 100 μL पर धारा 7 के अनुसार वास्तविक समय माइक्रोबियल व्यवहार्यता परख करें (चित्रा 1: चरण 3-4)।
  7. 6 घंटे, दिन 1, दिन 2, दिन 3 और दिन 7 समय बिंदुओं के लिए व्यवहार्य बैक्टीरिया गिनती निर्धारित करें। संबंधित मानक वक्र का उपयोग करके ल्यूमिनेसेंस इकाइयों से सीएफयू / एमएल निर्धारित करें।
  8. टीएसए प्लेटों पर स्प्रेड-प्लेट विधि का प्रदर्शन करके और रात भर 35 डिग्री सेल्सियस पर इंक्यूबेटिंग करके पता लगाने की सीमा से नीचे ल्यूमिनेसेंस मान दिखाने वाले नमूनों में व्यवहार्य बैक्टीरिया की अनुपस्थिति को सत्यापित करें। अगले दिन कॉलोनियों की उपस्थिति की जांच करें।
  9. 10 मिनट के लिए 10,000 × ग्राम पर शेष जीवाणु निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, और धीरे से खर्च किए गए मीडिया को हटा दें। उन ट्यूबों के लिए जिनमें दवाओं की जीवाणुरोधी गतिविधि के कारण छर्रों को नेत्रहीन रूप से नहीं देखा जाता है, यह सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब में 100 μL छोड़ दें कि अनदेखी गोली परेशान न हो (चित्रा 1: चरण 5)।
  10. ताजा एमएचबी में पेलेट बैक्टीरिया को फिर से निलंबित करें, और संलग्न सुई के माध्यम से उसी सिरिंज सेटअप में बैक्टीरिया निलंबन को वापस खींचें (चित्रा 1: चरण 6)।

10. यूएचएमडब्ल्यूपीई सतह पर अनुयायी बैक्टीरिया का परिमाणीकरण।

  1. 7 वें दिन अध्ययन के पूरा होने के बाद सिरिंज सेटअप से वर्जिन यूएचएमडब्ल्यूपीई और ड्रग-लोडेड यूएचएमडब्ल्यूपीई सतहों को पुनः प्राप्त करें।
  2. सतहों को 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और 1 एमएल बाँझ पीबीएस (तीन बार) के साथ कुल्ला करें।
  3. बाँझ पीबीएस के 1 मिलीलीटर में 40 मिनट के लिए सतह को सोनिकेट करें। धारा 7 में वर्णित सोनिकेटेड नमूने के 100 μL पर ल्यूमिनेसेंस परख करके अनुयायी बैक्टीरिया व्यवहार्यता निर्धारित करें।

Representative Results

प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, यूएचएमडब्ल्यूपीई को 7% डब्ल्यू / डब्ल्यू पर जेंटामाइसिन और वैनकोमाइसिन के साथ ढाला गया और विआयनीकृत पानी में बदल दिया गया। सामग्री से एलुएंट में दवा एकाग्रता 6 घंटे, 1 दिन, 2 दिन, 3 दिन और 1 सप्ताह में निर्धारित की गई थी। वैनकोमाइसिन और जेंटामाइसिन-लोडेड यूएचएमडब्ल्यूपीई से दवा रिलीज ने 6 घंटे में एक विस्फोट रिलीज का प्रदर्शन किया, जिसके बाद 7 दिनों तक न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) से अधिक रिलीज एकाग्रता के साथ एक स्थिर रिलीज दर हुई (चित्रा 2, तालिका 2)।

जीवाणुरोधी अध्ययन से पहले, प्रत्येक एस ऑरियस स्ट्रेन (एटीसीसी 12600, एल 1101 और एल 1163) के लिए बैक्टीरिया के सीएफयू / एमएल के लिए ल्यूमिनेसेंस इकाइयों को सहसंबंधित करने के लिए एक मानक वक्र उत्पन्न किया गया था। मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए लॉग (सीएफयू / एमएल) के खिलाफ संबंधित लॉग (ल्यूमिनेसेंस) मान प्लॉट किए गए थे (चित्रा 3)। गणना किए गए आर2 मान क्रमशः एटीसीसी 12600, एल 1101 और एल 1163 के लिए 0.997, 0.996 और 0.994 थे, जो एकाग्रता सीमा के लिए एक मजबूत फिट का संकेत देते हैं। व्युत्पन्न समीकरण का उपयोग बाद में सभी प्रयोगों में जीवाणु व्यवहार्यता की गणना करने के लिए किया गया था। ATCC 12600 और L1101 ने 1 x 102-1 x 103 CFU / mL की सीमा के भीतर पहचान की सीमा का प्रदर्शन किया। दूसरी ओर, एल 1163 स्ट्रेन के लिए पहचान की सीमा 1 x 104 सीएफयू / एमएल दिखाई गई थी।

समय-निर्भर जीवाणुरोधी गतिविधि परख 12600, एल 1163 और एल 1101 के लिए शुरुआती इनोकुलम के रूप में 1 x 105 सीएफयू / एमएल का उपयोग करके किया गया था, जो 1 सप्ताह की अवधि के लिए 7% डब्ल्यू / डब्ल्यू ड्रग-एल्यूटिंग सामग्री के संपर्क में थे। प्रत्येक समय बिंदु (6 घंटे, 1 दिन, 2 दिन, 3 दिन, 1 सप्ताह) पर, माध्यम को ताज़ा किया गया था, और बैक्टीरिया की आबादी को फिर से निलंबित कर दिया गया था। सामग्री से दवाओं की बाद की रिहाई के लिए बैक्टीरिया का जोखिम अगली बार बिंदु तक जारी रखा गया था। 7% डब्ल्यू/डब्ल्यू वैनकोमाइसिन के साथ यूएचएमडब्ल्यूपीई और 7% डब्ल्यू/डब्ल्यू जेंटामाइसिन के साथ यूएचएमडब्ल्यूपीई ने 6 घंटे से शुरू होने वाले अतिसंवेदनशील एटीसीसी 12600 के लिए >3लॉग कमी का प्रदर्शन किया, और 3 दिनों के अंत में पूर्ण उन्मूलन (कोई कॉलोनी वृद्धि नहीं) देखा गया (चित्रा 4 ए)। जेंटामाइसिन-अतिसंवेदनशील और वैनकोमाइसिन-मध्यवर्ती तनाव एल 1163 के लिए, दोनों दवा-एल्यूटिंग सामग्री ने 6 घंटे में >3लॉग कमी का कारण बना, और प्रयोग के पहले दिन पूर्ण उन्मूलन (कोई कॉलोनी वृद्धि नहीं) देखा गया (चित्रा 4 बी)। जेंटामाइसिन-प्रतिरोधी और वैनकोमाइसिन-मध्यवर्ती तनाव एल 1101 के लिए, यूएचएमडब्ल्यूपीई से जेंटामाइसिन क्षालन ने एल 1101 (चित्रा 4 सी) की जीवाणु व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं किया। बैक्टीरिया का प्रसार हुआ, और एंटीबायोटिक क्षालन के बिना कुंवारी यूएचएमडब्ल्यूपीई की उपस्थिति में 6 घंटे के भीतर आबादी स्थिर हो गई। जेंटामाइसिन-एल्यूटिंग यूएचएमडब्ल्यूपीई की उपस्थिति में, जनसंख्या 2 दिन एक समान विकास स्तर पर पहुंच गई। इसके विपरीत, यूएचएमडब्ल्यूपीई से वैनकोमाइसिन क्षालन ने 6 घंटे में बैक्टीरिया व्यवहार्यता (>3लॉग) को काफी कम कर दिया, और दिन 4 तक पूर्ण व्यवहार्यता हानि (कोई कॉलोनी वृद्धि नहीं) का प्रदर्शन किया गया।

जेंटामाइसिन-एल्यूटिंग और वैनकोमाइसिन-एल्यूटिंग यूएचएमडब्ल्यूपीई दोनों की सतहों ने 7 वें दिन या पूर्ण उन्मूलन के बाद अतिसंवेदनशील और मध्यवर्ती-प्रतिरोधी उपभेदों के संपर्क में आने पर कोई व्यवहार्य अनुयायी बैक्टीरिया नहीं दिखाया, जो भी पहले आया था। कुछ व्यवहार्य बैक्टीरिया (1 x 105 सीएफयू / एमएल) जेंटामाइसिन-एल्यूटिंग यूएचएमडब्ल्यूपीई पर मौजूद थे, जो जेंटामाइसिन-प्रतिरोधी एल 1101 के संपर्क में थे। इसी तरह, नियंत्रण वर्जिन पीई (चित्रा 5) से व्यवहार्य अनुयायी बैक्टीरिया के लगभग 1 x 105 सीएफयू / एमएल बरामद किए गए थे।

Figure 2
चित्रा 2: एंटीबायोटिक-लोडेड यूएचएमडब्ल्यूपीई पट्टी से 7% डब्ल्यू / डब्ल्यू से समय-निर्भर औसत एंटीबायोटिक रिलीज। समय बिंदुओं के बीच औसत एंटीबायोटिक रिलीज एक 7% डब्ल्यू / डब्ल्यू जेंटामाइसिन और वैनकोमाइसिन-लोडेड यूएचएमडब्ल्यूपीई पट्टी (3 मिमी 3 x 5 मिमी 3 x 10 मिमी3 ~ 2 सेमी2 सतह क्षेत्र) से होता है। नियंत्रण तनाव एटीसीसी 12600 के खिलाफ एमआईसी को जेंटामाइसिन के लिए एक बिंदीदार रेखा और वैनकोमाइसिन के लिए एक ठोस रेखा के रूप में दिखाया गया है। त्रुटि पट्टियाँ छह प्रतिकृतियों (n = 6) से माध्य के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सभी एस ऑरियस उपभेदों के लिए वास्तविक समय ल्यूमिनेसेंट परख मानक वक्र। लॉग (ल्यूमिनेसेंस) को नियंत्रण के लिए मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए लॉग (सीएफयू / एमएल) के खिलाफ प्लॉट किया गया था, (ए) एटीसीसी 12600, और नैदानिक उपभेदों, (बी) एल 1101 और (सी) एल 1163। सबसे अच्छा फिट और संबंधित आर2 मूल्यों की रेखा का वर्णन करने वाले समीकरण भूखंडों पर इंगित किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: बैक्टीरियल व्यवहार्यता 7% डब्ल्यू / डब्ल्यू जेंटामाइसिन-एल्यूटिंग और 7% डब्ल्यू / डब्ल्यू वैनकोमाइसिन-एल्यूटिंग यूएचएमडब्ल्यूपीई के लिए ल्यूमिनेसेंट परख का उपयोग करके निर्धारित की जाती है। नियंत्रण उपभेदों के खिलाफ यूएचएमडब्ल्यूपीई से प्राप्त जेंटामाइसिन और वैनकोमाइसिन की समय-निर्भर जीवाणुरोधी गतिविधि, (ए) एटीसीसी 12600, और नैदानिक उपभेदों, (बी) एल 1163 और (सी) एल 1101, दिखाए गए हैं। वर्जिन 1020 पीई ने प्रयोग के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। भूखंडों में पीली रेखा संबंधित एस ऑरियस स्ट्रेन के लिए पहचान की सीमा को इंगित करती है। डेटा को मानक विचलन (n = 3) ± माध्य के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: सभी एस ऑरियस उपभेदों के खिलाफ 7% डब्ल्यू / डब्ल्यू जेंटामाइसिन-एल्यूटिंग और 7% डब्ल्यू / डब्ल्यू वैनकोमाइसिन-एल्यूटिंग यूएचएमडब्ल्यूपीई के लिए ल्यूमिनेसेंट परख ग्लो परख का उपयोग करके निर्धारित किए गए अनुयायी बैक्टीरिया व्यवहार्यता। बार चार्ट इंगित करता है कि परीक्षण किए गए सभी उपभेदों के लिए अध्ययन अवधि के अंत में 7% जेंटामाइसिन-लोडेड और 7% वैनकोमाइसिन-लोडेड यूएचएमडब्ल्यूपीई के प्रति सेंटीमीटर वर्ग (सेमी2) से बरामद किए गए अनुयायी बैक्टीरिया (सीएफयू) हैं। सलाखों में डेटा को मानक विचलन (n = 3) ± औसत के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

समय बिंदु वैंकोमाइसिन जेंटामाइसिन
पीक एकाग्रता (μg / mL) पीक एकाग्रता (μg / mL)
0 - 6 घंटे 336 ± 72 263 ± 24
6 घंटे -1 दिन 57 ± 18 16 ± 2
1 दिन - 2 दिन 60 ± 18 7 ± 1
2 दिन - 3 दिन 23 ± 6 5 ± 0.4
3 दिन - 7 दिन 49 ± 20 15 ± 1

तालिका 2: विभिन्न समय बिंदुओं पर पीक दवा एकाग्रता (μg / mL)। डेटा को मानक विचलन (n = 6) ± माध्य के रूप में दिखाया गया है।

पूरक चित्र 2: नमूने में परख अभिकर्मक को जोड़ने से 10 मिनट की अवधि में ल्यूमिनेसेंस सिग्नल क्षय। सिग्नल में ±5% का अंतर एक डॉटेड लाइन के रूप में दिखाया गया है कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

एंटीबायोटिक दवाओं का स्थानीयकृत निरंतर वितरण पेरिप्रोस्थेटिक संयुक्त संक्रमण के प्रबंधन में एक आवश्यक उपकरण है। जीवाणु संक्रमण को खत्म करने में प्रणालीगत एंटीबायोटिक्स प्राथमिक रणनीति है, और स्थानीय क्षालन का उपयोग प्रत्यारोपण हटाने और ऊतक के विघटन के बाद शेष किसी भी बैक्टीरिया के विकास और उपनिवेशीकरण को रोकने के लिए एक पूरक उपकरण के रूप में किया जाता है। स्थानीय प्रशासन के साथ एंटीबायोटिक दवाओं के लिए वक्र (एक अवधि में एकाग्रता) के तहत प्रभावी क्षेत्र का लक्ष्य अच्छी तरह से समझा नहीं गया है। ऐसे उपकरणों से एंटीबायोटिक दवाओं के क्षालन को विट्रो में अनुदैर्ध्य रूप से निर्धारित किया जा सकता है; हालांकि, इन एकाग्रता प्रोफाइल के ट्रांसलेशनल मूल्य को निर्धारित करने के लिए, जीवाणुरोधी गतिविधि का आकलन करने के लिए एक मजबूत इन विट्रो विधि की आवश्यकता होती है। इस पेपर में, संयुक्त प्रतिस्थापन में निरंतर वितरण उपकरण के रूप में उपयोग किए जाने वाले ड्रग-एल्यूटिंग यूएचएमडब्ल्यूपीई की जीवाणुरोधी गतिविधि को निर्धारित करने के लिए एक ऐसी वास्तविक समय विधि का वर्णन किया गया है।

जीवाणु व्यवहार्यता की वास्तविक समय की निगरानी रुचि का एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है, और पारंपरिक सूक्ष्मजीवविज्ञानी विधियों में अध्ययन के इस विशिष्ट पहलू को समायोजित करने के लिए ढांचे की कमी है। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली माइक्रोबियल व्यवहार्यता परख एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) के अनुरूप ल्यूमिनेसेंस को मापकर व्यवहार्य बैक्टीरिया की मात्रा का ठहराव के लिए विकसित की गई थी। इम्प्लांट सामग्री से प्राप्त एंटीबायोटिक दवाओं की समय-निर्भर गतिविधि की सीधे जांच करने के लिए, अलग-अलग एंटीबायोटिक संवेदनशीलता प्रोफाइल वाले तीन अलग-अलग उपभेदों को उनके साथ इनक्यूबेट किया गया था। जेंटामाइसिन और वैनकोमाइसिन के लिए अलग-अलग प्रतिरोध के साथ प्रयोगशाला और नैदानिक उपभेदों का उपयोग करने का तर्क किसी दिए गए प्रत्यारोपण सूत्रीकरण के लिए गतिविधि की सीमा को समझना था। इसके अलावा, इन अलग-अलग आबादी के खिलाफ जीवाणुरोधी गतिविधि और प्रभावकारिता प्रशासन के समय पर निर्भर है। यहविधि सर्जरी के समय घाव के संदूषण के कारण होने वाले >70% पेरिप्रोस्थेटिक संयुक्त संक्रमण के आधार पर इन उपभेदों के खिलाफ प्रोफिलैक्सिस की व्यवहार्यता पर केंद्रित है।

इस विधि को विकसित करने के लिए एक प्रारंभिक इनोकुलम के रूप में, 1 x 105 सीएफयू / एमएल का उपयोग किया गया था। पशु मॉडल के लिए विभिन्न दूषित सांद्रता का उपयोग किया गया है, हालांकि पीजेआई के लिए नैदानिक रूप से प्रासंगिक संक्रमण भार के बारे में बहुत कुछ ज्ञात नहीं है। पीजेआई के लिए पशु संक्रमण मॉडल नियमित रूप से 1 x 105 सीएफयू का उपयोग करके स्थापित किए गए हैं, और जीवाणुरोधी गतिविधि 25,26,27 निर्धारित करने के लिए मानकीकृत तरीकों (सीएलएसआई) में एक समान सीमा का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। प्रारंभिक दूषित एकाग्रता के रूप में 1 x 105 सीएफयू / एमएल का उपयोग करने से हमें एक ही समय में विकास और उन्मूलन दोनों मापदंडों का मूल्यांकन करने की अनुमति मिली।

परंपरागत रूप से, एमआईसी मान बैक्टीरिया की एक विशिष्ट संख्या के लिए एक निरंतर एंटीबायोटिक एकाग्रता के लिए निर्धारित किए जाते हैं, और वे जीवाणुरोधी कार्रवाई की दर को प्रदर्शित करने में विफल रहते हैं। इस पहलू के कारण, एमआईसी मान रोगाणुरोधी गतिविधि प्रोफ़ाइल28 का वर्णन करने के लिए मात्रात्मक भेदभाव प्रदान नहीं करते हैं। वर्तमान विधि के डेटा खुराक निर्णय लेने के लिए एमआईसी का उपयोग करने के बजाय एंटीबायोटिक दवाओं के तनाव-निर्भर किलिंग कैनेटीक्स के मूल्यांकन के लाभ पर जोर देते हैं। इस पद्धति का उपयोग करके, उस सीमा और दर दोनों को अलग करना संभव था जिस पर प्रत्यारोपण सामग्री ने विभिन्न उपभेदों को प्रभावित किया था। इम्प्लांट सामग्री स्ट्रिप्स से प्राप्त जेंटामाइसिन 1 दिन में एल 1163 को खत्म करने और 2-3 दिनों में एटीसीसी 12600 को खत्म करने में प्रभावी था, लेकिन यह एल 1101 को मिटाने में अप्रभावी था (चित्रा 4)। इसके अंतर्निहित जेंटामाइसिन प्रतिरोध (चित्रा 4 सी) के कारण एल 1101 (एमआईसी >32 μg / mL) के खिलाफ जेंटामाइसिन क्षालन की गतिविधि की अपेक्षित कमी के अलावा, वैनकोमाइसिन के संपर्क में आने पर उप-आबादी की दृढ़ता देखी गई, जिसके लिए L1101 मध्यवर्ती प्रतिरोध प्रदर्शित करता है। इसके विपरीत, एल 1163 को वैनकोमाइसिन-एल्यूटिंग यूएचएमडब्ल्यूपीई की उपस्थिति में निश्चित रूप से मिटा दिया गया था, जबकि एल 1101 के रूप में वैनकोमाइसिन के समान मध्यवर्ती प्रतिरोध का प्रदर्शन किया गया था (दोनों उपभेदों के लिए 8 μg / mL का एमआईसी देखा गया है)।

अवलोकन कि 12600 और एल 1163 के खिलाफ जेंटामाइसिन की गतिविधि की दर, जो समान एमआईसी मूल्यों के साथ जेंटामाइसिन-अतिसंवेदनशील हैं (दोनों उपभेदों के लिए 1μg / mL का एमआईसी देखा गया है), अलग था, साथ ही साथ मध्यवर्ती प्रतिरोधी L1101 और L1163 के खिलाफ वैनकोमाइसिन की गतिविधि की सीमा अलग थी (चित्रा 4 ए, बी), इस परिकल्पना का समर्थन किया कि सलामी सामग्री की उपस्थिति में यह वास्तविक समय विधि गतिविधि में अनुदैर्ध्य अंतर को अलग कर सकती है।

इन जीवाणुओं के खिलाफ किसी दिए गए एल्यूटेड एकाग्रता कितने प्रभावी हो सकते हैं, इसकी व्याख्या करने में परिणामों के ट्रांसलेशनल मूल्य के अलावा, कई प्रयोगात्मक पद्धतिगत फायदे हैं। (1) बैक्टीरिया की एकाग्रता एक निश्चित समय पर तुरंत निर्धारित की जाती है, पारंपरिक तरीकों के विपरीत जिसमें व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए बैक्टीरिया को शोरबा या आगर पर 18-24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाता है। विकास की यह अवधि बैक्टीरिया को एंटीबायोटिक तनाव से उबरने के लिए अतिरिक्त समय प्रदान कर सकती है, त्रुटि / परिवर्तनशीलता का एक अतिरिक्त संभावित स्रोत पेश करती है। (2) बैक्टीरिया को बनाए रखते हुए मीडिया को लगातार प्रतिस्थापित किया जाता है, जो स्थैतिक स्थितियों की तुलना में विवो स्थितियों में अधिक निकटता से मिलता जुलता है। (3) इस परख में स्वाभाविक रूप से प्रत्यारोपण से दवा रिलीज कैनेटीक्स शामिल है, जो बेहतर प्रदर्शन की भविष्यवाणी की अनुमति देता है। (4) विधि को किसी विशिष्ट या महंगी मशीनरी की आवश्यकता के बिना आमतौर पर उपलब्ध उपभोग्य सामग्रियों का उपयोग करके विकसित किया गया है।

विवो पशु अध्ययन और नैदानिक परीक्षणों में आगे बढ़ने से पहले दवा-वितरण अनुप्रयोगों का मूल्यांकन करने के लिए मजबूत इन विट्रो परीक्षण विधियां आवश्यक हैं। इस परख को एक नकली इन विट्रो सेटअप में जीवाणु उन्मूलन की दक्षता निर्धारित करने के लिए कणों, जैल, फिल्मों और अन्य ड्रग-एल्यूटिंग सामग्री जैसे विभिन्न दृष्टिकोणों और दवा वितरण प्लेटफार्मों को समायोजित करने के लिए संशोधित और अनुकूलित किया जा सकता है। एक उपयुक्त इन विट्रो मध्यम वातावरण में बदलकर नमूना सेटअप के लिए संशोधन किए जा सकते हैं, जिसे कई एंटीबायोटिक दवाओं29,30 की गतिविधि को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है।

विधि व्यवहार्य अनुयायी बैक्टीरिया निर्धारण की सुविधा भी प्रदान करती है, जो आशाजनक है, क्योंकि न्यूनतम बायोफिल्म उन्मूलन एकाग्रता निर्धारित करने के पारंपरिक तरीके समय लेने वाले हैं और असंगत परिणाम प्रदान करते हैं। हालांकि, इसकी संवेदनशीलता निर्धारित करने के लिए एक विश्वसनीय और मजबूत पद्धति विकसित करने के लिए बायोफिल्म पर विधि का कड़ाई से परीक्षण किया जाना है। एटीपी-आधारित ल्यूमिनेसेंट विधि बायोफिल्म में बैक्टीरिया के व्यवहार्य रूपों का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील हो सकती है, जिसमें परसिस्टर्स भी शामिल हैं, जो दृश्य मान कॉलोनियों के रूप में एगर प्लेट पर पता लगाया जा सकता है या नहीं भी लगाया जा सकता है। एक साथ लिया गया, इस बहुमुखी मंच में रुचि की दवाओं की एंटी-बैक्टीरियल और एंटी-बायोफिल्म गतिविधि पर वास्तविक समय के अवलोकन ों को रिकॉर्ड करने के लिए प्रासंगिक मापदंडों को शामिल करने की क्षमता है।

इस विधि की प्रभावकारिता निम्नलिखित पहलुओं द्वारा नियंत्रित होती है:

पूर्व निर्धारित क्षालन विशेषताओं और नमूना आकार
इस जीवाणुरोधी गतिविधि माप से पहले एक अलग प्रयोग में एंटीबायोटिक-एल्यूटिंग सामग्री की क्षालन प्रोफ़ाइल की पहचान की जा सकती है ताकि निर्धारित समय के भीतर प्रयोग को सक्रिय रूप से संचालित करने के लिए आवश्यक सामग्री की मात्रा निर्धारित की जा सके।

कंटेनर और मात्रा निर्धारण
एक सेटअप तैयार करना महत्वपूर्ण है जिसमें प्रयोग की मीडिया मात्रा एक ही सामग्री के पूरे सतह क्षेत्र को समायोजित कर सकती है और दवा-भरी सतह से दवा की निर्बाध रिहाई के लिए पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित कर सकती है। उपयोग किया गया सेटअप पिछले प्रयोग पर आधारित था, जो इन हाइड्रोफिलिक दवाओं के लिए "सही सिंक" स्थितियों को सुनिश्चित करता है जैसे कि उनके प्रसार को घुलनशीलता सीमाओं से बाधित नहीं किया जाता है।

विकास मीडिया विशेषताएं
चयनित दवा (ओं) की स्थिरता और इष्टतम प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए विकास मीडिया चयन की जांच की जानी चाहिए। केशन-समायोजित मुलर हिंटन ब्रोथ (सीएएमएचबी), जो शोरबा कमजोर पड़ने की विधि में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, का उपयोग ज्ञात एंटीबायोटिक दवाओं के एमआईसी को निर्धारित करने के लिए किया गया था। माध्यम विषाक्त माध्यमिक मेटाबोलाइट संचय31 के हस्तक्षेप के बिना इष्टतम दवा गतिविधि को सक्षम बनाता है। परख अभिकर्मक का परीक्षण किया गया है और विभिन्न प्रकार के मीडिया में स्थिर रिपोर्ट किया गया है, जिसमें सीरम घटक23,28 शामिल हैं। यद्यपि सापेक्ष ल्यूमिनेसेंस यूनिट मान विभिन्न मीडिया में भिन्न हो सकते हैं, मीडिया के घटकों को परख32,33 के साथ हस्तक्षेप नहीं करने के लिए प्रदर्शित किया गया है। प्रयोगात्मक मात्रा को आगे 1.5 एमएल तक अनुकूलित किया गया था, जो एक वयस्क घुटने के संयुक्त स्थान34 में मौजूद श्लेष द्रव की मात्रा के करीब है।

परख के लिए तापमान स्थिरता
परख में ल्यूमिनेसेंट अभिकर्मक की हैंडलिंग और जोड़ प्रयोगों में एक सुसंगत तरीके से किया जाना है। तापमान में परिवर्तन परख की संवेदनशीलता को बदल देता है, इसलिए बैक्टीरिया23 में जोड़ने से पहले 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अभिकर्मक को इनक्यूबेट करना महत्वपूर्ण है।

अभिकर्मक इनक्यूबेशन समय
अभिकर्मक से ल्यूमिनेसेंस समय के साथ क्षय हो जाता है। ल्यूमिनेसेंट सिग्नल में 30 मिनट से अधिक का आधा जीवन होता है, जो काफी हद तक माध्यम और प्रयोग23 में उपयोग किए जाने वाले जीवाणु के प्रकार पर निर्भर करता है। इसके अतिरिक्त, इनक्यूबेशन समय में कोई भी अंतर (यानी, बैक्टीरिया में अभिकर्मक को जोड़ने और ल्यूमिनेसेंस को पढ़ने के बीच का समय) बैक्टीरिया की समान एकाग्रता के लिए असंगत रीडिंग का परिणाम होगा। निर्माता के निर्देशों के अनुसार 5 मिनट इनक्यूबेशन समय के बाद 1 मिनट के भीतर लेने पर ल्यूमिनेसेंट सिग्नल में 5% का अंतर देखा गया (पूरक चित्र 2)। इस डेटा को ध्यान में रखते हुए, ल्यूमिनेसेंस रीडिंग को पूरे अध्ययन में 1 मिनट के भीतर दर्ज किया गया था ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सिग्नल हानि 5% से अधिक नहीं थी। इसके अलावा, पहले कुएं से अंतिम कुएं तक ल्यूमिनेसेंस क्षय के कारण पेश की गई त्रुटि को कम करने के लिए प्रति प्लेट नमूनों की संख्या को सीमित करना महत्वपूर्ण है।

पूरे अध्ययन में बैक्टीरिया की आबादी का रखरखाव।
विधि ने 10 मिनट35 के लिए 10,000 x g पर उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके प्रत्येक समय बिंदु पर बैक्टीरिया की आबादी से खर्च किए गए मीडिया को लगातार अलग करके दवा निकासी और श्लेष मात्रा कारोबार को मॉडल करने का प्रयास किया। यह महत्वपूर्ण कदम सभी व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य जीवाणु कोशिकाओं के अवसादन को सुनिश्चित करता है। इसके अलावा, तलछट वाले बैक्टीरिया को समान रूप से ताजा एमएचबी में पुनर्गठित किया जाता है और सिरिंज सेटअप में स्थानांतरित किया जाता है, जिससे प्रभावित माइक्रोबियल आबादी को प्रयोगात्मक सेटअप में वापस ले जाने की सुविधा मिलती है। इस विधि की प्रजनन क्षमता और विश्वसनीयता प्रारंभिक इनोकुलम से प्राप्त माइक्रोबियल आबादी के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के निरंतर जोखिम का अनुकरण करने पर बहुत अधिक निर्भर करती है।

इस विधि की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि यह एक अर्ध-स्थैतिक परख है जो दवा के आधे जीवन और निरंतर श्लेष कारोबार को सटीक रूप से अनुकरण नहीं करता है। हालांकि, निरंतर मध्यम प्रतिस्थापन आंशिक रूप से इस सीमा के लिए क्षतिपूर्ति करता है। माइक्रोबियल व्यवहार्यता परख की संवेदनशीलता तनाव-निर्भर थी, जो 1 x 102-1 x 104 सीएफयू / एमएल से थी, जो पहचान क्षमता को सीमित करती है। इसके अलावा, प्रत्येक जीव के लिए एक मानक वक्र को प्लॉट करने की आवश्यकता होती है क्योंकि तनाव प्रकार ल्यूमिनेसेंट अभिकर्मक की संवेदनशीलता और प्रदर्शन में योगदान देता है। बैक्टीरिया के विकास की गतिशीलता और प्रयुक्त दवा यौगिक की गतिविधि दोनों मध्यम घटकों से प्रभावित हो सकती है, जिसकी आगे जांच की जानी चाहिए।

Disclosures

वरिष्ठ लेखक (ईओ) निम्नलिखित कंपनियों को बौद्धिक संपदा के लाइसेंस से उत्पन्न रॉयल्टी प्राप्त करता है: कोरिन, आइकनेसी, रेनोविस, आर्थ्रेक्स, कॉनफोरएमआईएस, मेरिल हेल्थकेयर, एक्सटेक। यहां प्रस्तुत किसी भी अध्ययन के साथ हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को आंशिक रूप से नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट नंबर एआर 077023 (आर 01) और हैरिस ऑर्थोपेडिक प्रयोगशाला द्वारा वित्त पोषित किया गया था। केरी लैप्लांट और रोड आइलैंड विश्वविद्यालय में उनकी टीम को नैदानिक उपभेद एल 1101 और एल 1163 प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 96 well plates - polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs Corning, NY, USA CLS3922-100EA
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich, Germany
ATCC 12600 American Type culture Collection, VA, USA
BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay Promega Corporation, USA G8231
BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) Becton-Dickinson, USA BD 211825 purchased from Fisher Scientific, USA
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL BD, USA 309657
BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G BD, USA 305122
BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) Becton-Dickinson, USA B12322 purchased from Fisher Scientific, USA
BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) Becton-Dickinson, USA DF0369-17-6 purchased from Fisher Scientific, USA
Boric Acid  Fisher Chemical, NJ, USA
Branson 1800 ultrasonic bath Emerson, MO, USA
Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid Fisher Scientific, USA 08-757-100D
Gentamicin Sulfate  Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China
Greiner UV-Star 96 well plates Sigma Aldrich, Germany M3812-40EA
Hydraulic press Carver, Inc. Wabash, IN, USA
L1101  Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island
L1163  Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island
LSE benchtop shaking incubator Corning, NY, USA
Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical Fisher Scientific, NJ, USA A454-1
Napco CO2 6000 Thermo Scientific, MA, USA
PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents Fisher Scientific, USA BP24384
Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) Sigma Aldrich, Germany P1378-5g
Plate reader (Synergy H1 Biotek, VT, USA
press Carver, Inc. Wabash, IN, USA
shaker Innova 2100 New Brunswick Scientific, NJ, USA
ShopBot D2418 ShopBot Tools, Inc., NC, USA
Sodium Hydroxide  Sigma Aldrich, Germany
Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water Fisher Scientific, USA 23-751628
UHMWPE GUR1020, Celanese, TX, USA
Vancomycin Hydrochloride  Fagron, The Netherlands 804148
WAB Turbula WAB Turbula, Switzerland

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References

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ड्रग-एल्यूटिंग सामग्री की अनुदैर्ध्य जीवाणुरोधी गतिविधि निर्धारित करने के लिए एक नई विधि
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Sekar, A., Lekkala, S., Oral, E. A Novel Method to Determine the Longitudinal Antibacterial Activity of Drug-Eluting Materials. J. Vis. Exp. (193), e64641, doi:10.3791/64641 (2023).

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