Summary
Her præsenterer vi en protokol til evaluering af den antibakterielle virkning af en antibiotikaeluerende polymer for at simulere profylaktisk klinisk anvendelse ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt ATP-baseret selvlysende mikrobielt levedygtighedsassay i realtid. Denne metode muliggør overvågning af den langsgående aktivitet af lægemiddeleluerende materialer og kan i vid udstrækning tilpasses til at teste antimikrobielle lægemiddelafgivelsesplatforme.
Abstract
Polyethylen med ultrahøj molekylvægt (UHMWPE) anvendes i vid udstrækning i samlede ledartroplastier som en bærende overflade. Periprostetiske ledinfektioner, hvoraf størstedelen opstår kort efter ledudskiftning, udgør næsten 25% af de samlede knærevisionsoperationer, og fuldstændig udryddelse af bakteriel infektion udgør en stor udfordring. En lovende måde at tackle dette problem på er at sikre lokal vedvarende levering af antibiotikakoncentrationer, der er tilstrækkelige til at hæmme bakterierne til at understøtte rutinemæssig systemisk antibiotikaprofylakse. Der forskes i øget forskning i udviklingen af effektive lokale anordninger til indgivelse af lægemidler. Selvom etablerede antibakterielle testmetoder for lægemidler kan bruges til at teste den antibakterielle virkning af lægemiddeleluerende materialer, mangler de med hensyn til at tilvejebringe realtids- og langsgående antibakterielle effektivitetsdata, der kan korreleres med elueringsprofilerne for antibiotika fra disse enheder. Her rapporterer vi en direkte og alsidig metode til bestemmelse af den antibakterielle virkning af antibiotikaeluerende UHMWPE-implantater. Denne metode kan bruges som en platform til at undgå bakteriekultur på hvert tidspunkt i et langvarigt eksperiment og kan også tilpasses andre lokale lægemiddelafgivelsesanordninger.
Introduction
Slidgigt er en betydelig degenerativ tilstand, der rammer 500 millioner voksne verden over1. Guldstandarden i behandlingen af slutstadiet arthritis er total ledudskiftning, som forventes at blive udført hos over 2 millioner patienter årligt alene i USA inden 20302, hvor den globale efterspørgsel også stiger enormt 3,4. Proceduren indebærer udskiftning af leddets leddelte bruskoverflader med bærende syntetiske materialer fremstillet af metal/keramik og stærkt tværbundet polyethylen med ultrahøj molekylvægt (UHMWPE). Samlede ledudskiftninger forbedrer livskvaliteten betydeligt for patienter, der lider af gigt5, men en betydelig komplikation, der bringer implantaternes ydeevne og patienternes tilfredshed i fare, er periprostetisk ledinfektion (PJI), som tegner sig for 15% -25% af revisionsoperationer6. Årsagen til infektion menes i de fleste tilfælde at være mikrobiel kontaminering af implantatstedet under operationen7. Den kontaminerende population udvider sig derefter på implantat- og vævsoverfladerne8. Værtsimmunsystemet udløses som reaktion, men væksthastigheden og biofilmdannelsen af de forurenende organismer kan gøre det muligt for dem at undgå immuncellerne, hvilket kan føre til en øget cytokin- og kemokinstorm uden udryddelse af bakterierne 9,10,11. Den resulterende dybe infektion i knoglen bringer implantatets fiksering og ydeevne i fare såvel som patientens helbred12.
Staphylococcus aureus og koagulase-negative stafylokokker er de dominerende forårsagende organismer af PJI13. Sværhedsgraden af stafylokokinfektioner er høj på grund af deres øgede resistens over for antibiotika, biofilmdannelse og evne til at fortsætte som små kolonivarianter14,15,16. Implantatassocierede infektioner opstår på grund af vedhæftning af mikroorganismer på implantatets overflade og etablering af en kompleks biofilmmatrix, der gør det muligt for bakterierne at undgå skadelige værtsimmunfaktorer og effektive koncentrationer af antibiotika14,15,16. Konventionelle behandlingsmetoder omfatter intravenøse og orale antibiotikakombinationer i en længere periode17. En stor ulempe ved denne tilgang er lægemidlets lave biotilgængelighed på infektionsstedet og vanskeligheden ved at opnå tilstrækkelige koncentrationer af antibiotika til at udrydde bakterierne konsekvent i behandlingsperioden, hvilket ofte resulterer i dårlige resultater18. For at afhjælpe disse mangler blev et fuldt funktionelt lokaliseret lægemiddeleluerende UHMWPE-implantat designet til at sikre en vedvarende frigivelse af effektive koncentrationer af antibiotika i det fælles rum19. Lokal eluering fra lægemiddelelueringsimplantatet anvendes som et komplementært værktøj til at forhindre vækst og kolonisering af eventuelle bakterier, der er tilbage efter implantatfjernelse og debridering af vævet. In vitro antibakteriel test af denne antibiotikaeluerende UHMWPE kan udføres ved at inkubere materialet direkte med bakterierne og kvantificere bakterierne ved spredningsplademetoden20,21. Alternativt kan alikvoter af elueringsmedier testes mod bakterier ved hjælp af metoder som agardiskdiffusionsmetoden, bouillonfortyndingsmetoder og tidsdræbende test22. Alle disse metoder er afhængige af vækstobservation ca. 16-18 timer efter indsamlingen af alikvoterne ved hjælp af kolonitælling og turbiditetsmålinger. Elueringen af antibiotika fra sådanne anordninger kan kvantificeres i længderetningen ved hjælp af disse in vitro-metoder. For at bestemme translationsværdien af disse koncentrationsprofiler er der imidlertid behov for en robust in vitro-metode i realtid til vurdering af antibakteriel aktivitet.
Det mikrobielle levedygtighedsassay, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev udviklet til kvantificering af levedygtige bakterier ved at måle luminescensen svarende til adenosintrifosfat (ATP) frigivet fra en levende bakteriecelle ved hjælp af luciferin-luciferase-baseret detektionsteknologi. ATP, som levende cellers energivaluta, tjener som en direkte indikator for fysiologisk levedygtige celler. Reagenset udfører cellelyse, som frigiver ATP-molekyler fra levedygtige celler, der derefter detekteres i form af luminescens. Denne luminescens har en direkte korrelation til andelen af levedygtige bakterieceller i prøven23. Dette er et enkelt, alsidigt, hurtigt, enkelt reagensbaseret assay i realtid, der kan tilpasses til en række forskellige analysedesign og tilstande med både gram-positive og gram-negative mikroorganismer. Her rapporterer vi en metode til bestemmelse af antibakteriel aktivitet i realtid af antibiotikaeluerende UHMWPE inkuberet med laboratorie- og kliniske stammer af S. aureus ved hjælp af et modificeret tidsdræbende assay baseret på det mikrobielle levedygtighedsassay (f.eks. BacTiter Glo). Mens metoden er beskrevet med et specifikt implantatmateriale og en specifik ortopædisk anvendelse, kan metoden give en platform til test af andre antibiotikaeluerende leveringsenheder med kliniske anvendelser.
Protocol
1. Fremstilling af reagenser
- Mueller-Hinton bouillon (MHB) præparat: Opløs 22 g kationjusteret MHB i 1 liter deioniseret vand. Autoklave mediet ved 121 °C og 15 lb tryk i 20 minutter, og sørg for, at flasken er løst lukket. Den tilberedte sterile bouillon opbevares ved 4 °C indtil brug.
- Tryptisk sojaagar (TSA) præparat: Opløs 20 g TSA-pulver i 500 ml deioniseret vand. Agarblandingen autoklave ved 121 °C og 15 lb i 20 min. Overfør det sterile medie til et 55 °C vandbad for at nedbringe temperaturen af den smeltede agar. Hæld den afkølede tilberedte agar på sterile petriskåle (~ 15 ml), og lad den størkne. Opbevar de størknede agarplader omvendt for at undgå kondens.
- Tryptisk sojabuljong (TSB) forberedelse: Opløs 15 g TSB-pulver i 500 ml deioniseret vand. Autoklave bouillonblandingen ved 121 °C og 15 lb i 20 min. Den tilberedte sterile bouillon opbevares ved 4 °C indtil brug.
- Fosfatbufret saltvand (PBS): Autoklave købt kommercielt 1x PBS ved 121 °C og 15 lb i 20 minutter før steril brug.
- Fremstilling af reagens til mikrobiel levedygtighed: Indholdet af analysen afbalanceres til stuetemperatur. 10 ml buffer blandes med det frysetørrede selvlysende reagenspulver, og det fremstillede reagens opbevares ved -20 °C som 1 ml alikvoter. Før hvert tidspunkt optø det lysfølsomme reagens og bring det til stuetemperatur.
- Gentamicinsulfatstamopløsning: Opløs 80 mg gentamicinsulfat (GS) i 10 ml 1x PBS. Vortex lægemiddelopløsningen grundigt for at opnå en 8 mg / ml GS-stamopløsning.
- Stamopløsning af vancomycinhydrochlorid: 10 mg vancomycinhydrochloridpulver opløses grundigt i 10 ml deioniseret vand for at opnå en 1 mg/ml stamopløsning.
- Borsyrebufferopløsning: 24,7 g (0,4 M) borsyre opløses i 900 ml deioniseret vand. Opløsningens pH-værdi justeres til 10,4 med en 50% (w/v) natriumhydroxidopløsning. Ud over dette trin tilsættes deioniseret vand for at gøre det til 1 L.
- O-pthaldialdehydreagens (OPA): Opløs 0,2 g OPA i 1 ml methanol. Der tilsættes 19 ml 0,4 M borsyrebuffer (pH 10,4) til OPA-opløsningen. Tilsæt 0,4 ml 2-mercaptoethanol til OPA-borsyreblandingen. Hætteglasset med reagens dækkes med aluminiumsfolie, og det opbevares ved 4 °C til brug op til 2-3 dage efter tilberedningen.
FORSIGTIG: Undgå kontakt med hud, øjne og tøj. Håndtering af OPA og 2 mercaptoethanolreagenser bør kun udføres under en stinkhætte med passende udstødningsventilation, mens du bærer korrekt personligt beskyttelsesudstyr. Undgå at indånde dampe, støv eller aerosoler.
2. Forberedelse af jomfru og lægemiddelbelastet UHMWPE
- Sigt 2 g hver af gentamicinsulfat og vancomycinhydrochloridpulver med en sigte (75 μm porestørrelse) og dehydrer ved 45 ° C i en vakuumovn (<0,1 atm) i 18-24 timer.
- Bland det dehydrerede lægemiddel med UHMWPE-pulver ved 7% w / w (1,12 g antibiotikum + 14,88 g UHMWPE) i en beholder ved hjælp af en mekanisk mixer i 5 minutter.
- Forvarm en brugerdefineret form af aluminiumbronze (85 mm x 50 mm) med indsatsplader i rustfrit stål til 180 °C i en varmluftsovn i 1 time. Forvarm pressens plader til 170 °C.
- Tilsæt det blandede pulver til formen, og komprimer ved 10 MPa, 170 ° C i 10 minutter, efterfulgt af en 45 minutters vandkølingscyklus ved 10 MPa.
- Fjern den støbte UHMWPE-blok (~ 3,5 mm) fra pressen ved hjælp af en hydraulisk presse.
- Fræs blokkens øverste og nederste overflader ved hjælp af en computerstyret numerisk kontrol (CNC) for at fjerne eventuelle uregelmæssigheder og forurenende stoffer på overfladen.
- Skær blokken i strimler på 3 mm x 5 mm x 20 mm ved hjælp af CNC.
- Forbered jomfru UHMWPE (uden tilsætning af antibiotika) ved hjælp af samme metode som beskrevet som en kontrol til undersøgelsen.
Supplerende figur 1: Dele af formen, der anvendes til støbning af UHMWPE-prøverne. (A) Indsatsplade af rustfrit stål; (B) skimmelhulrum; C) stempel (D) bagplade Klik her for at downloade denne fil.
3. Bestemmelse af elueringskinetikken for lægemiddeleluerende UHMWPE
- Anbring en 3 mm x 5 mm x 20 mm strimmel i en 3 ml sprøjte med en Luer-lås og en 25 G kanyle.
- Vask strimlen ved at fylde sprøjten med deioniseret vand og vende sprøjten flere gange.
- Fyld sprøjten med deioniseret vand op til 2 ml graduering.
- Placer sprøjteopsætningen på en ryster ved 100 o / min ved stuetemperatur.
- På hvert tidspunkt (6 timer, 1 dag, 2 dage, 3 dage, 1 uge) opsamles elueringsmidlet i et 2 ml hætteglas.
- På hvert tidspunkt vaskes strimlen ved at fylde sprøjten med deioniseret vand og vende sprøjten på hovedet. Kassér opløsningen, og fyld sprøjten med deioniseret vand op til 2 ml gradueringen for at fortsætte forsøget indtil næste tidspunkt.
4. Bestemmelse af vancomycinkoncentrationen
- Vancomycinkoncentration påvises specrophotometrisk i deioniseret vand ved en maksimal absorptionsbølgelængde på 280 nm.
- Forbered kendte koncentrationsstandarder ved at tilsætte 100 μL 1 mg/ml stamopløsning til UV 96-brøndpladen og seriefortynde ved hjælp af 100 μL deioniseret vand for at opnå seks niveauer af kendte koncentrationer (1 mg/ml til 0,03125 mg/ml).
- 100 μL elueringsmidler overføres til UV-klare plader med 96 huller, og koncentrationen bestemmes ved 280 nm ved hjælp af en mikropladelæser.
- Der genereres en kalibreringskurve ved at plotte de kendte lægemiddelkoncentrationer mod de tilsvarende absorbansværdier. Den ukendte lægemiddelkoncentration i elueringsmidlet beregnes ved hjælp af den lineære ligning, der genereres af kalibreringskurven.
- Bestem lægemiddelmassen ved at multiplicere koncentrationen med elueringsvolumenet (~ 1,7 ml).
- Beregn den kumulative lægemiddelfrigivelse (mg) på et tidspunkt ved at opsummere lægemiddelfrigivelsen fra alle de foregående tidspunkter.
- Normaliser lægemiddelfrigivelsen til overfladen af strimlen (3,5 cm 2) for at bestemme den kumulative lægemiddelfrigivelse pr. centimeter kvadreret (cm2) af implantatet.
5. Bestemmelse af gentamicinkoncentrationen ved OPA-mærkningsmetoden 27
- Forbered GS-standardløsninger til at udføre OPA-analysen.
- 1 ml af 80 μg/ml GS-opløsningen overføres til et centrifugeglas.
- Der tilsættes 500 μL PBS til yderligere fem centrifugeglas.
- Udfør en seriel fortynding med disse rør for at opnå GS-koncentrationer på 80 μg/ml, 40 μg/ml, 20 μg/ml, 10 μg/ml, 5 μg/ml og 2,5 μg/ml. Disse tjener som kalibreringsopløsninger til analysen.
- I en klar plade med 96 huller tilsættes 80 μL PBS til hul A-1 og 80 μL kalibreringsopløsninger til hul A-2 til A-7 i stigende koncentration. Dette tjener som en intern kalibrering for analysen.
- Der tilsættes 80 μL af hver prøve til de tomme brønde i tre eksemplarer, der skal analyseres i samme plade med 96 huller. Antallet af prøver pr. brøndplade begrænses til <50, således at tidspunktet for tilsætning af OPA-opløsningen til prøverne er omtrent det samme for alle prøver, og for at undgå fordampning.
- Tilsæt OPA-reagens til alle standarder og prøveopløsninger.
- I en damphætte fyldes et 25 ml reagensreservoir med methanol.
- Der tilsættes 8 ml methanol og 1 ml af den fremstillede OPA-opløsning til en anden reagensbeholder (punkt 1.8). Bland opløsningen grundigt ved pipettering op og ned.
- Med en multikanal 100 μL mikropipette tilsættes 48 μL methanol fra det første reservoir til alle de prøveholdige brønde i 96-brøndpladen.
- Ud over dette trin tilsættes 72 μL fortyndet OPA-opløsning fra det andet reservoir til alle de prøveholdige brønde i 96-brøndpladen. Brøndpladen inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Fluorescensintensiteten (excitation på 340 nm, emission på 455 nm) måles ved hjælp af en mikropladelæser umiddelbart efter 10 min. inkubationen.
- Kalibreringskurven afbildes ved hjælp af intensitetsaflæsningerne for opløsningerne med kendte koncentrationer af GS. Tilføj en lineær linje for at bestemme den bedste pasform og generere den tilsvarende ligning.
- Lægemiddelkoncentrationen i elueringsmidlet beregnes ud fra de kalibreringskurver, der fremkommer ved at plotte de kendte lægemiddelkoncentrationer op mod de tilsvarende absorbansværdier.
- Beregn lægemiddelmassen ved at gange koncentrationen med elueringsvolumenet (~ 1,7 ml).
- Bestem den kumulative lægemiddelfrigivelse (mg) på et tidspunkt ved at opsummere lægemiddelfrigivelsen fra alle de foregående tidspunkter.
- Normaliser lægemiddelfrigivelsen til overfladen af strimlen (3,5 cm 2) for at bestemme den kumulative lægemiddelfrigivelse pr. centimeter kvadreret (cm2) af implantatet.
6. Bakterie forberedelse
BEMÆRK: Følgende S. aureus-stammer blev anvendt i denne undersøgelse: typestamme 12600, kliniske stammer L1101 og L1163 (opnået fra Dr. Kerry LaPlante ved University of Rhode Island). Følsomhedsprofilerne for disse stammer er vist i tabel 1.
| Bakteriestammer | Gentamicin MIC | Vancomycin MIC | |
| ATCC 12600 | ≤1 μg/ml (følsom) | ≤0,5 μg/ml (følsom) | |
| L1101 (Klinisk stamme) | ≥16 μg/ml (resistent) | 8 μg/ml (mellemliggende) | |
| L1163 (Klinisk stamme) | ≤1 μg/ml (følsom) | 8 μg/ml (mellemliggende) | |
Tabel 1: Antibiotikafølsomhedsprofiler for kontrol- og kliniske S. aureus-stammer.
FORSIGTIG: Alle trin, der involverer håndtering af bakteriekulturer og suspensioner, blev udført i et BSL-2-laboratorierum i et klasse II, Type A2 biosikkerhedsskab.
- Optø bakteriestammerne fra -80 °C på TSA-plader for at lette væksten af S. aureus. Pladerne inkuberes statisk natten over ved 35 °C.
- To til tre kolonier overføres fra de nattedyrkede agarpladekulturer til 1 ml steril TSB og inkuberes statisk natten over ved 35 °C.
- 100 μL bakterier overføres til en klar plade med 96 huller for at måle turbiditeten spektrotermisk ved at bestemme absorbansen ved 600 nm.
- Fortynd bakterierne 10.000x ved hjælp af steril MHB, før du bestemmer det levedygtige bakterieantal ved hjælp af selvlysende assay.
7. Udførelse af realtidsanalysen af mikrobiel levedygtighed
- Udfør det luminescensbaserede assay ved hjælp af hvide uigennemsigtige plader med 96 brønde.
- 100 μl fortyndede bakteriesuspensioner blandes med 100 μl assayreagens fremstillet i punkt 1.5.
- Anbring et låg dækket med aluminiumsfolie over den forberedte plade med 96 brønde, og inkuber i 5 minutter med 100 o / min omrystning.
- Mål luminescensen med det samme med en mikropladelæser ved hjælp af følgende indstillinger i Gen5 3.11-softwaren.
- Klik på Ny for at konfigurere en protokol i vinduet Jobliste .
- Vælg Costar 96 hvid uigennemsigtig i rullemenuen for Pladetype.
- Klik på Læs under menuen Vælg trin > handlinger .
- Klik på Luminescens i vinduet Læs metode. Sørg for, at indstillingerne Slutpunkt/kinetisk og Luminescensfiber er valgt under henholdsvis læsetype og optiktype. Klik på OK.
- Behold indstillingerne
i vinduet Læs trin (forstærkning = 135; integrationstid = 1 sek.; læsehøjde = 4,5 mm). Klik på OK. - Vinduet med pladelayout ser ud til at være klar til kørslen. Marker feltet Brug låg i vinduet med lastpladen, og klik på OK.
- Placer 96-brøndspladen i maskinen for at læse luminescensværdierne.
8. Generering af en luminescens versus levedygtig tællestandardkurve for hver bakteriestamme
BEMÆRK: Kultur og opregne alle S. aureus-stammer i henhold til metoden beskrevet i afsnit 6.
- Forbered serielt fortyndede bakteriesuspensioner til at tjene som standarder.
- Den natligt dyrkede bakteriesuspension opregnes ved spektrophotometrisk måling af turbiditeten.
- Centrifuger ved 6.000 × g i 5 minutter for at pelletere bakterierne, og resuspender pellet i steril MHB for at justere koncentrationen til 1 x 109 CFU / ml.
- Fortynd 100 μL ren suspension med 900 μL MHB, og udfør en 10 gange seriel fortynding for at nå 1 x 101 CFU/ml.
- Der udføres luminescensassay på de tilberedte bakteriesuspensioner som beskrevet i punkt 7.
- Brug steril MHB som blindprøve til forsøget, og træk den tomme luminescensværdi fra testprøvens luminescensværdier.
- Afbild loggen (CFU) mod loggen (luminescens) for at generere en standardkurve. Optag ligningen ogR2-værdien .
- Bestem CFU/ml svarende til luminescensværdierne ved hjælp af den stammespecifikke ligning under hele undersøgelsen.
9. Opsætning af tidsafhængig antibakteriel aktivitetsundersøgelse
Figur 1: En skematisk gengivelse af den eksperimentelle opsætning. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Dyrk bakterierne natten over i 1 ml TSB bouillon.
- Den bakterieopslæmning, der dyrkes natten over, fortyndes til 10,5 CFU/ml i steril MHB (afsnit 6), og det levedygtige bakterietal kontrolleres ved hjælp af luminescensenhederne, inden forsøget påbegyndes (afsnit 7).
- De nye UHMWPE- og lægemiddelfyldte UHMWPE-strimler (3 mm x 5 mm x 10 mm, halvdelen af dimensionen af strimler, der er forberedt til elueringsundersøgelserne i punkt 2) anbringes i en 3 ml sprøjte.
- Træk MHB indeholdende 10 5 CFU/ml ind i sprøjten gennem den påsatte kanyle op til1,5 ml mærket, hvilket svarer til 1,35 ml MHB (figur 1: Trin 1).
- Placer sprøjteopsætningen på en rysteinkubator (100 omdr./min.) ved 37 °C indtil de angivne tidspunkter på 6 timer, dag 1, dag 2, dag 3, dag 4, dag 5, dag 6 og dag 7 (figur 1: trin 2).
- På hvert angivet tidspunkt tages sprøjteopsætningen ud, og der udføres en realtidsanalyse af mikrobiel levedygtighed i henhold til afsnit 7 på 100 μL bakteriel suspension (figur 1: Trin 3-4).
- Bestem antallet af levedygtige bakterier for tiderne 6 timer, dag 1, dag 2, dag 3 og dag 7. CFU/ml bestemmes ud fra luminescensenhederne ved hjælp af den tilsvarende standardkurve.
- Kontrol af, at der ikke forekommer levedygtige bakterier i prøverne, som viste luminescensværdier under detektionsgrænsen, ved at udføre spredningsplademetoden på TSA-plader og inkubere ved 35 °C natten over. Kontroller for tilstedeværelsen af kolonier den næste dag.
- Den resterende bakteriesuspension centrifugeres ved 10.000 × g i 10 minutter, og de brugte medier suges forsigtigt. For rør, hvor pellets ikke observeres visuelt på grund af lægemidlets antibakterielle aktivitet, skal du lade 100 μL være i røret for at sikre, at den usete pellet ikke forstyrres (figur 1: Trin 5).
- Resuspender de pelleterede bakterier i frisk MHB, og træk bakteriesuspensionen tilbage i den samme sprøjteopsætning gennem den påsatte nål (figur 1: Trin 6).
10. Kvantificering af klæbende bakterier på UHMWPE-overfladen
- Udtag jomfru UHMWPE og lægemiddelbelastede UHMWPE-overflader fra sprøjteopsætningen efter afslutningen af undersøgelsen på dag 7.
- Overfør overfladerne til 1,5 ml rør, og skyl med 1 ml steril PBS (tre gange).
- Sonikere overfladen i 40 min i 1 ml steril PBS. Bestem vedhængende bakteriers levedygtighed ved at udføre en luminescensanalyse på 100 μL af den sonikerede prøve, som beskrevet i afsnit 7.
Representative Results
Efter protokollen blev UHMWPE støbt med gentamicin og vancomycin ved 7% w / w og elueret i deioniseret vand. Lægemiddelkoncentrationen i elueringsmidlet fra materialet blev bestemt ved 6 timer, 1 dag, 2 dage, 3 dage og 1 uge. Lægemiddelfrigivelsen fra vancomycin og gentamicinbelastet UHMWPE viste en burstfrigivelse efter 6 timer efterfulgt af en stabil frigivelseshastighed med en frigivelseskoncentration større end den mindste hæmmende koncentration (MIC) indtil 7 dage (figur 2, tabel 2).
Forud for den antibakterielle undersøgelse blev der genereret en standardkurve for at korrelere luminescensenhederne med CFU / ml af bakterierne for hver S. aureus-stamme (ATCC 12600, L1101 og L1163). De tilsvarende log-værdier (luminescens) blev plottet mod loggen (CFU/ml) for at generere en standardkurve (figur 3). De beregnedeR2-værdier var 0,997, 0,996 og 0,994 for henholdsvis ATCC 12600, L1101 og L1163, hvilket indikerer en stærk pasform til koncentrationsområdet. Den afledte ligning blev efterfølgende brugt til at beregne bakteriel levedygtighed på tværs af alle eksperimenterne. ATCC 12600 og L1101 viste en detektionsgrænse inden for et område på 1 x 102-1 x 103 CFU/ml. På den anden side viste detektionsgrænsen for L1163-stammen sig at være 1 x 104 CFU/ml.
Det tidsafhængige antibakterielle aktivitetsassay blev udført under anvendelse af 1 x 105 CFU/ml som startinokulum for 12600, L1163 og L1101, som blev udsat for 7% w/w lægemiddeleluerende materialer i en periode på 1 uge. På hvert tidspunkt (6 timer, 1 dag, 2 dage, 3 dage, 1 uge) blev mediet forfrisket, og bakteriepopulationen blev suspenderet igen. Eksponeringen af bakterierne for den efterfølgende frigivelse af lægemidler fra materialet blev fortsat indtil næste tidspunkt. UHMWPE med 7 % w/w vancomycin og UHMWPE med 7 % w/w gentamycin viste >3log reduktion for modtagelig ATCC 12600 startende ved 6 timer, og fuldstændig udryddelse (ingen kolonivækst) blev observeret efter 3 dage (figur 4A). For den gentamicin-modtagelige og vancomycin-mellemliggende stamme L1163 forårsagede begge lægemiddeleluerende materialer >3log reduktion ved 6 timer, og fuldstændig udryddelse (ingen kolonivækst) blev observeret på eksperimentets dag 1 (figur 4B). For den gentamicinresistente og vancomycin-mellemliggende stamme L1101 påvirkede gentamicineluering fra UHMWPE ikke L1101's bakterielle levedygtighed (figur 4C). Bakterierne spredte sig, og befolkningen stabiliserede sig inden for 6 timer i nærværelse af jomfru UHMWPE uden antibiotikaeluering. I nærvær af gentamicin-eluerende UHMWPE nåede befolkningen et lignende vækstniveau på dag 2. Tværtimod reducerede vancomycineluering fra UHMWPE signifikant bakteriel levedygtighed (>3log) ved 6 timer, og fuldstændigt levedygtighedstab (ingen kolonivækst) blev demonstreret på dag 4.
Overfladerne af både gentamicin-eluerende og vancomycin-eluerende UHMWPE viste ingen levedygtige klæbende bakterier, når de blev udsat for modtagelige og mellemresistente stammer efter dag 7 eller fuldstændig udryddelse, alt efter hvad der kom først. Nogle levedygtige bakterier (1 x 105 CFU / ml) var til stede på gentamicin-eluerende UHMWPE udsat for gentamicinresistent L1101. Tilsvarende blev ca. 1 x 105 CFU/ml levedygtige vedhængende bakterier genfundet fra kontroljomfru PE (figur 5).
Figur 2: Tidsafhængig gennemsnitlig antibiotikafrigivelse fra 7% w / w antibiotikabelastet UHMWPE strip. Den gennemsnitlige antibiotikafrigivelse mellem tidspunkter fra en 7% w / w gentamicin og vancomycinbelastet UHMWPE strip (3 mm 3 x 5 mm 3 x 10 mm3 ~ 2 cm2 overfladeareal). MIC mod kontrolstamme ATCC 12600 er vist som en stiplet linje for gentamicin og en solid linje for vancomycin. Fejlbjælkerne repræsenterer middelværdiens standardafvigelse fra seks replikater (n = 6). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Standardkurve for selvlysende assay i realtid for alle S. aureus-stammer. Log (luminescens) blev plottet mod log (CFU/ml) for at generere standardkurver til kontrol, (A) ATCC 12600, og kliniske stammer, (B) L1101 og (C) L1163. Ligningerne, der beskriver linjen med bedst pasform og tilsvarendeR2-værdier , er angivet på plottene. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Bakteriel levedygtighed bestemt ved hjælp af et selvlysende assay for 7% w / w gentamicin-eluering og 7% w / w vancomycin-eluerende UHMWPE. Den tidsafhængige antibakterielle aktivitet af gentamicin og vancomycin elueret fra UHMWPE mod kontrolstammer, (A) ATCC 12600, og kliniske stammer, (B) L1163 og (C) L1101, er vist. Virgin 1020 PE fungerede som kontrol for eksperimentet. Den gule linje i afbildningerne angiver detektionsgrænsen for den respektive S. aureus-stamme. Data vises som gennemsnit ± standardafvigelse (n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Vedhængende bakteriers levedygtighed bestemt ved hjælp af selvlysende assay Glo-assay for 7% w / w gentamicin-eluering og 7% w / w vancomycin-eluerende UHMWPE mod alle S. aureus-stammer. Søjlediagrammet angiver klæbende bakterier (CFU) genvundet pr. centimeter kvadreret (cm2) af 7% gentamicinbelastet og 7% vancomycinbelastet UHMWPE i slutningen af undersøgelsesperioden for alle de testede stammer. Søjlerne viser data som gennemsnit ± standardafvigelse (n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Tidspunkter | Vancomycin | Gentamicin |
| Maksimal koncentration (μg/ml) | Maksimal koncentration (μg/ml) | |
| 0 - 6 timer | 336 ± 72 | 263 ± 24 |
| 6 timer -1 dag | 57 ± 18 | 16 ± 2 |
| 1 dag - 2 dage | 60 ± 18 | 7 ± 1 |
| 2 dage - 3 dage | 23 ± 6 | 5 ± 0.4 |
| 3 dage - 7 dage | 49 ± 20 | 15 ± 1 |
Tabel 2: Maksimal lægemiddelkoncentration (μg/ml) på forskellige tidspunkter. Data vises som gennemsnit ± standardafvigelse (n = 6).
Supplerende figur 2: Luminescenssignalets henfald over en periode på 10 minutter fra tilsætning af assayreagens til prøven. En forskel på ±5% i signalet vises som en stiplet linje Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Den lokaliserede vedvarende levering af antibiotika er et nødvendigt redskab til styring af periprostetiske ledinfektioner. Systemiske antibiotika er den primære strategi til udryddelse af bakteriel infektion, og den lokale eluering bruges som et komplementært værktøj til at forhindre vækst og kolonisering af eventuelle bakterier, der er tilbage efter implantatfjernelse og debridering af vævet. Målet for det effektive område under kurven (koncentration over en periode) for antibiotika med lokal administration er ikke godt forstået. Elueringen af antibiotika fra sådant udstyr kan kvantificeres in vitro i længderetningen; For at bestemme translationsværdien af disse koncentrationsprofiler er der imidlertid behov for en robust in vitro-metode til vurdering af antibakteriel aktivitet. I dette papir beskrives en sådan realtidsmetode til bestemmelse af den antibakterielle aktivitet af lægemiddeleluerende UHMWPE, der skal anvendes som en vedvarende leveringsanordning i ledudskiftninger.
Realtidsovervågning af bakteriers levedygtighed er et afgørende interesseparameter, og konventionelle mikrobiologiske metoder mangler rammerne for at imødekomme dette specifikke aspekt af undersøgelsen. Det mikrobielle levedygtighedsassay, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev udviklet til kvantificering af levedygtige bakterier ved at måle luminescensen svarende til adenosintrifosfat (ATP). For direkte at undersøge den tidsafhængige aktivitet af antibiotika, der elueres fra implantatmaterialerne, blev tre forskellige stammer med forskellige antibiotikafølsomhedsprofiler inkuberet med dem. Begrundelsen for at anvende laboratorie- og kliniske stammer med varierende resistens over for gentamicin og vancomycin var at forstå aktivitetsområdet for en given implantatformulering. Endvidere er den antibakterielle aktivitet og effekt mod disse forskellige populationer afhængig af tidspunktet for administration. Metoden fokuserer på gennemførligheden af profylakse mod disse stammer baseret på, at >70% af periprostetiske ledinfektioner skyldes forurening af såret på operationstidspunktet24.
Som startpodning til udvikling af denne metode blev der anvendt 1 x 105 CFU/ml. Forskellige kontaminerende koncentrationer er blevet anvendt til dyremodeller, selvom der ikke vides meget om den klinisk relevante infektionsbelastning for PJI. Dyreinfektionsmodeller for PJI er rutinemæssigt etableret ved hjælp af 1 x 105 CFU, og et lignende interval anvendes i vid udstrækning i standardiserede metoder (CLSI) til bestemmelse af antibakteriel aktivitet25,26,27. Ved at bruge 1 x 105 CFU/ml som en indledende kontaminerende koncentration kunne vi evaluere både vækst- og udryddelsesparametrene på samme tid.
Konventionelt bestemmes MIC-værdier for en konstant antibiotikakoncentration for et bestemt antal bakterier, og de viser ikke hastigheden af antibakteriel virkning. På grund af dette aspekt giver MIC-værdierne ikke en kvantitativ differentiering til beskrivelse af den antimikrobielle aktivitetsprofil28. Data fra den nuværende metode understreger fordelen ved at evaluere antibiotikas stammeafhængige dræbende kinetik frem for at bruge MIC til at træffe doseringsbeslutninger. Ved hjælp af denne metode var det muligt at differentiere både omfanget og hastigheden, hvormed implantatmaterialerne påvirkede de forskellige stammer. Gentamicin elueret fra implantatmaterialestrimlerne var effektivt til at udrydde L1163 på 1 dag og udrydde ATCC 12600 på 2-3 dage, men det var ineffektivt til udryddelse af L1101 (figur 4). Ud over den forventede mangel på aktivitet af gentamicin eluering mod L1101 (MIC >32 μg/ml) på grund af dets iboende gentamicinresistens (figur 4C) blev persistensen af subpopulationer observeret, når de blev eksponeret for vancomycin, for hvilket L1101 udviser intermediær resistens. I modsætning hertil blev L1163 endeligt udryddet i nærvær af vancomycineluerende UHMWPE på trods af at der udviste lignende mellemliggende resistens over for vancomycin som L1101 (en MIC på 8 μg / ml er blevet observeret for begge stammer).
Observationerne af, at aktivitetshastigheden for gentamicin mod 12600 og L1163, som er gentamicin-modtagelige med lignende MIC-værdier (en MIC på 1μg/ml er blevet observeret for begge stammer), var forskellige, samt at omfanget af vancomycins aktivitet mod mellemresistent L1101 og L1163 var forskellig (figur 4A,B), støttede hypotesen om, at denne realtidsmetode i nærværelse af elueringsmaterialet kunne differentiere langsgående forskelle i aktiviteten.
Ud over resultaternes translationelle værdi i fortolkningen af, hvor effektiv en given elueret koncentration kan være mod disse bakterier, er der flere eksperimentelle metodologiske fordele. (1) Bakteriekoncentrationen bestemmes øjeblikkeligt på et givet tidspunkt i modsætning til konventionelle metoder, hvor bakterierne inkuberes i bouillon eller agar i 18-24 timer for at bestemme levedygtigheden. Denne vækstperiode kan give bakterierne ekstra tid til at komme sig efter antibiotikastress, hvilket introducerer en yderligere mulig fejlkilde / variabilitet. (2) Mediet udskiftes løbende, samtidig med at bakterierne bevares, hvilket minder mere om in vivo-betingelser end statiske forhold. (3) Dette assay inkluderer i sagens natur lægemiddelfrigivelseskinetikken fra implantatet, hvilket giver mulighed for bedre forudsigelse af ydeevnen. (4) Metoden er udviklet under anvendelse af almindeligt tilgængelige hjælpematerialer uden behov for specifikke eller dyre maskiner.
Robuste in vitro-testmetoder til evaluering af lægemiddelleveringsapplikationer er nødvendige, før man går videre til in vivo-dyreforsøg og kliniske forsøg. Dette assay kan modificeres og tilpasses til at rumme forskellige tilgange og lægemiddelafgivelsesplatforme såsom partikler, geler, film og andre lægemiddeleluerende materialer for at bestemme effektiviteten af bakteriel udryddelse i en simuleret in vitro-opsætning. Ændringer kan udføres for prøveopsætningen ved at skifte til et passende in vitro-mediummiljø, hvilket har vist sig at påvirke aktiviteten af flere antibiotika29,30.
Metoden letter også levedygtig bestemmelse af klæbende bakterier, hvilket er lovende, da konventionelle metoder til bestemmelse af minimal koncentration af biofilmudryddelse er tidskrævende og leverer inkonsekvente resultater. Metoden skal dog testes grundigt på biofilm for at udvikle en pålidelig og robust metode til at bestemme dens følsomhed. Den ATP-baserede selvlysende metode kan være følsom nok til at detektere levedygtige former for bakterier i biofilm, herunder persisterende, som måske eller måske ikke påvises på en agarplade som synlige kolonier. Samlet set har denne alsidige platform potentialet til at inkorporere relevante parametre til registrering af realtidsobservationer af antibakteriel og antibiofilmaktivitet af lægemidler af interesse.
Effektiviteten af denne metode styres af følgende aspekter:
Forudbestemte elueringskarakteristika og prøvestørrelse
Elueringsprofilen for det antibiotiske elueringsmateriale kan identificeres i et separat forsøg forud for denne måling af antibakteriel aktivitet, således at den mængde materiale, der kræves for aktivt at gennemføre forsøget inden for en fastsat tid, kan bestemmes.
Bestemmelse af beholder og volumen
Det er vigtigt at udtænke en opsætning, hvor eksperimentets medievolumen kan rumme hele overfladearealet af det samme materiale og for at sikre tilstrækkelig volumen til uhindret frigivelse af lægemidlet fra den lægemiddelbelastede overflade. Den anvendte opsætning var baseret på tidligere eksperimenter, hvilket sikrer "perfekte synke" -betingelser for disse hydrofile lægemidler, således at deres diffusion ikke hindres af opløselighedsbegrænsninger.
Vækstmedie egenskaber
Valg af vækstmedier bør undersøges for at sikre stabiliteten og den optimale virkning af de(t) valgte lægemiddel(er)29. Kationjusteret Mueller Hinton bouillon (CAMHB), som er meget udbredt i bouillonfortyndingsmetoden, blev brugt til at bestemme MIC af kendte antibiotika. Mediet muliggør optimal lægemiddelaktivitet uden interferens fra toksisk sekundær metabolitakkumulering31. Assayreagenset er blevet testet og rapporteret stabilt i forskellige typer medier, herunder dem med serumkomponenter23,28. Selvom de relative luminescensenhedsværdier kan variere på tværs af forskellige medier, er det påvist, at mediets komponenter ikke interfererer med analysen32,33. Det eksperimentelle volumen blev yderligere optimeret til 1,5 ml, hvilket er tæt på det synovialvæskevolumen, der er til stede i et voksent knæledsrum34.
Temperaturstabilitet for analysen
Håndtering og tilsætning af selvlysende reagens til analysen skal udføres på en ensartet måde under alle forsøg. Temperaturændringer ændrer analysens følsomhed, så det er vigtigt at inkubere reagenset ved stuetemperatur i 2 timer, før det tilsættes til bakterierne23.
Reagens inkubationstid
Luminescensen fra reagenset henfalder med tiden. Det selvlysende signal har en halveringstid på over 30 min, hvilket i høj grad afhænger af mediet og den type bakterie, der anvendes i forsøget23. Derudover vil eventuelle forskelle i inkubationstid (dvs. tiden mellem tilsætning af reagenset til bakterierne og aflæsning af luminescensen) resultere i inkonsekvente aflæsninger for den samme koncentration af bakterier. Der blev observeret en forskel på 5 % i det selvlysende signal, når det blev taget inden for 1 minut efter inkubationstiden på 5 minutter i henhold til producentens anvisninger (supplerende figur 2). Under hensyntagen til disse data blev luminescensaflæsningerne registreret inden for 1 min under hele undersøgelsen for at sikre, at signaltabet ikke var mere end 5%. Endvidere er det vigtigt at begrænse antallet af prøver pr. plade for at reducere den fejl, der indføres på grund af luminescenshenfald fra den første brønd til den sidste brønd.
Vedligeholdelse af bakteriepopulationen gennem hele undersøgelsen
Metoden forsøgte at modellere lægemiddelclearance og synovial volumenomsætning ved kontinuerligt at adskille de brugte medier fra bakteriepopulationen på hvert tidspunkt ved hjælp af højhastighedscentrifugering ved 10.000 x g i 10 min35. Dette kritiske trin sikrer sedimentering af alle de levedygtige og ikke-levedygtige bakterieceller. Derudover rekonstitueres de sedimenterede bakterier ensartet i frisk MHB og overføres til sprøjteopsætningen, hvilket letter fuldstændig overførsel af den berørte mikrobielle population tilbage til den eksperimentelle opsætning. Reproducerbarheden og pålideligheden af denne metode afhænger i høj grad af simulering af den vedvarende eksponering af antibiotika for den mikrobielle population, der stammer fra det oprindelige podemateriale.
En vigtig begrænsning ved denne metode er, at det er et semistatisk assay, der ikke nøjagtigt simulerer lægemiddelhalveringstider og kontinuerlig synovial omsætning. Løbende udskiftning af mediet kompenserer dog delvist for denne begrænsning. Følsomheden af analysen af mikrobiel levedygtighed var stammeafhængig og varierede fra 1 x 102-1 x 104 CFU/ml, hvilket begrænser detektionskapaciteten. Desuden skal der plottes en standardkurve for hver organisme, da stammetypen bidrager til det selvlysende reagens' følsomhed og ydeevne. Både bakterievækstdynamikken og aktiviteten af den anvendte lægemiddelforbindelse kan påvirkes af mediekomponenterne, som bør undersøges yderligere.
Disclosures
Seniorforfatteren (E.O.) modtager royalties, der stammer fra licensering af intellektuel ejendomsret til følgende virksomheder: Corin, Iconacy, Renovis, Arthrex, ConforMIS, Meril Healthcare, Exactech. Der er ingen interessekonflikt med nogen af de undersøgelser, der præsenteres her.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist finansieret af National Institutes of Health Grant No. AR077023 (R01) og af Harris Orthopaedic Laboratory. Forfatterne takker Dr. Kerry Laplante og hendes team ved University of Rhode Island for at levere de kliniske stammer L1101 og L1163.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plates - polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs | Corning, NY, USA | CLS3922-100EA | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich, Germany | ||
| ATCC 12600 | American Type culture Collection, VA, USA | ||
| BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay | Promega Corporation, USA | G8231 | |
| BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) | Becton-Dickinson, USA | BD 211825 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL | BD, USA | 309657 | |
| BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G | BD, USA | 305122 | |
| BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton-Dickinson, USA | B12322 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) | Becton-Dickinson, USA | DF0369-17-6 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| Boric Acid | Fisher Chemical, NJ, USA | ||
| Branson 1800 ultrasonic bath | Emerson, MO, USA | ||
| Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid | Fisher Scientific, USA | 08-757-100D | |
| Gentamicin Sulfate | Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China | ||
| Greiner UV-Star 96 well plates | Sigma Aldrich, Germany | M3812-40EA | |
| Hydraulic press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| L1101 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| L1163 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| LSE benchtop shaking incubator | Corning, NY, USA | ||
| Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical | Fisher Scientific, NJ, USA | A454-1 | |
| Napco CO2 6000 | Thermo Scientific, MA, USA | ||
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents | Fisher Scientific, USA | BP24384 | |
| Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) | Sigma Aldrich, Germany | P1378-5g | |
| Plate reader (Synergy H1 | Biotek, VT, USA | ||
| press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| shaker Innova 2100 | New Brunswick Scientific, NJ, USA | ||
| ShopBot D2418 | ShopBot Tools, Inc., NC, USA | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich, Germany | ||
| Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water | Fisher Scientific, USA | 23-751628 | |
| UHMWPE | GUR1020, Celanese, TX, USA | ||
| Vancomycin Hydrochloride | Fagron, The Netherlands | 804148 | |
| WAB Turbula | WAB Turbula, Switzerland |
References
- Hunter, D. J., March, L., Chew, M. Osteoarthritis in 2020 and beyond: A Lancet Commission. Lancet. 396 (10264), 1711-1712 (2020).
- Sloan, M., Premkumar, A., Sheth, N. P. Projected volume of primary total joint arthroplasty in the U.S., 2014 to 2030. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 100 (17), 1455-1460 (2018).
- Gao, J., Xing, D., Dong, S., Lin, J. The primary total knee arthroplasty: A global analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 190 (2020).
- UpToDate. Prosthetic joint infection: Treatment. , Available from: https://www.uptodate.com/contents/prosthetic-joint-infection-treatment (2022).
- Dapunt, U., Radzuweit-Mihaljevic, S., Lehner, B., Haensch, G. M., Ewerbeck, V. Bacterial infection and implant loosening in hip and knee arthroplasty: Evaluation of 209 cases. Materials. 9 (11), 871 (2016).
- Kamath, A. F., et al. Quantifying the burden of revision total joint arthroplasty for periprosthetic infection. The Journal of Arthroplasty. 30 (9), 1492-1497 (2015).
- Tande, A. J., Patel, R.
- Davidson, D. J., Spratt, D., Liddle, A. D. Implant materials and prosthetic joint infection: The battle with the biofilm. EFORT Open Reviews. 4 (11), 633-639 (2019).
- de Vor, L., Rooijakkers, S. H. M., van Strijp, J. A. G. Staphylococci evade the innate immune response by disarming neutrophils and forming biofilms. FEBS Letters. 594 (16), 2556-2569 (2020).
- Dapunt, U., Giese, T., Stegmaier, S., Moghaddam, A., Hänsch, G. M. The osteoblast as an inflammatory cell: Production of cytokines in response to bacteria and components of bacterial biofilms. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 243 (2016).
- González, J. F., Hahn, M. M., Gunn, J. S. Chronic biofilm-based infections: Skewing of the immune response. Pathogens and Disease. 76 (3), 023 (2018).
- Dapunt, U., Giese, T., Prior, B., Gaida, M. M., Hänsch, G. M. Infectious versus non-infectious loosening of implants: activation of T lymphocytes differentiates between the two entities. International Orthopaedics. 38 (6), 1291-1296 (2014).
- Tai, D. B. G., Patel, R., Abdel, M. P., Berbari, E. F., Tande, A. J. Microbiology of hip and knee periprosthetic joint infections: A database study. Clinical Microbiology and Infection. 28 (2), 255-259 (2022).
- Foster, T. J. Antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Current status and future prospects. FEMS Microbiology Reviews. 41 (3), 430-449 (2017).
- Kranjec, C., et al. Staphylococcal biofilms: challenges and novel therapeutic perspectives. Antibiotics. 10 (2), 131 (2021).
- Kahl, B. C., Becker, K., Löffler, B. Clinical significance and pathogenesis of staphylococcal small colony variants in persistent infections. Clinical Microbiology Reviews. 29 (2), 401-427 (2016).
- Li, C., Renz, N., Trampuz, A.
- Davis, J. S., et al. Predictors of treatment success after periprosthetic joint infection: 24-month follow up from a multicenter prospective observational cohort study of 653 patients. Open Forum Infectious Diseases. 9 (3), (2022).
- Suhardi, V. J., et al. A fully functional drug-eluting joint implant. Nature Biomedical Engineering. 1, 0080 (2017).
- Gil, D., Grindy, S., Muratoglu, O., Bedair, H., Oral, E. Antimicrobial effect of anesthetic-eluting ultra-high molecular weight polyethylene for post-arthroplasty antibacterial prophylaxis. Journal of Orthopaedic Research. 37 (4), 981-990 (2019).
- Robu, A., et al. Additives imparting antimicrobial properties to acrylic bone cements. Materials. 14 (22), 7031 (2021).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- BacTiter-Glo microbial cell viability assay instructions for use of products G8230, G8231, G8232 and G8233. <101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol. Promega Corporation. , Available from: https://www.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol/ (2022).
- Izakovicova, P., Borens, O., Trampuz, A. Periprosthetic joint infection: Current concepts and outlook. EFORT Open Reviews. 4 (7), 482-494 (2019).
- López-Torres, I. I., Sanz-Ruíz, P., Navarro-García, F., León-Román, V. E., Vaquero-Martín, J. Experimental reproduction of periprosthetic joint infection: Developing a representative animal model. The Knee. 27 (3), 1106-1112 (2020).
- Carli, A. v, et al. Quantification of peri-implant bacterial load and in vivo biofilm formation in an innovative, clinically representative mouse model of periprosthetic joint infection. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 99 (6), 25 (2017).
- Humphries, R. M., et al. CLSI Methods Development and Standardization Working Group best practices for evaluation of antimicrobial susceptibility tests. Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), 01934 (2018).
- Mueller, M., de la Peña, A., Derendorf, H. Issues in pharmacokinetics and pharmacodynamics of anti-infective agents: Kill curves versus MIC. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (2), 369-377 (2004).
- Wijesinghe, G., et al. Influence of laboratory culture media on in vitro growth, adhesion, and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Medical Principles and Practice. 28 (1), 28-35 (2019).
- Steixner, S. J. M., et al. Influence of nutrient media compared to human synovial fluid on the antibiotic susceptibility and biofilm gene expression of coagulase-negative Staphylococci In vitro. Antibiotics. 10 (7), 790 (2021).
- Sigma Aldrich. Mueller Hinton Broth (M-H Broth). Sigma Aldrich. , 70192 (2018).
- Thiriard, A., Raze, D., Locht, C. Development and standardization of a high-throughput Bordetella pertussis growth-inhibition assay. Frontiers in Microbiology. 11, 777 (2020).
- Clow, F., O'Hanlon, C. J., Christodoulides, M., Radcliff, F. J. Feasibility of using a luminescence-based method to determine serum bactericidal activity against Neisseria gonorrhoeae. Vaccines. 7 (4), 191 (2019).
- Kraus, V. B., Stabler, T. v, Kong, S. Y., Varju, G., McDaniel, G. Measurement of synovial fluid volume using urea. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (10), 1217-1220 (2007).
- Gonçalves, F. D. A., de Carvalho, C. C. C. R. Phenotypic modifications in Staphylococcus aureus cells exposed to high concentrations of vancomycin and teicoplanin. Frontiers in Microbiology. 7, 13 (2016).
