Summary
在这里，我们提出了一种协议来评估抗生素洗脱聚合物的抗菌功效，以通过使用市售的基于ATP的实时发光微生物活力测定来模拟预防性临床应用。该方法能够监测药物洗脱材料的纵向活性，并且可以广泛地适用于测试抗菌药物输送平台。
Abstract
超高分子量聚乙烯（UHMWPE）作为承重表面广泛用于全关节置换术。假体周围关节感染，其中大部分发生在关节置换后不久，占整个膝关节翻修手术的近25%，完全根除细菌感染是一个重大挑战。解决这个问题的一个有希望的方法是确保局部持续输送足以抑制细菌的抗生素浓度，以支持常规的全身性抗生素预防。对开发有效的当地药物输送装置的研究越来越多。尽管已建立的药物抗菌测试方法可用于测试药物洗脱材料的抗菌功效，但它们缺乏提供实时和纵向抗菌功效数据，这些数据可以与抗生素从这些设备中洗脱曲线相关联。在这里，我们报告了一种直接和通用的方法来确定抗生素洗脱UHMWPE植入物的抗菌功效。该方法可用作在漫长实验的每个时间点避免细菌培养的平台，也可以适用于其他局部给药装置。
Introduction
骨关节炎是一种严重的退行性疾病，困扰着全世界5亿成年人1。治疗终末期关节炎的金标准是全关节置换术，预计到 2030 年，仅在美国每年就有超过 200 万患者进行全关节置换术2，全球需求也将大幅增加3，4。该过程涉及用金属/陶瓷和高交联超高分子量聚乙烯（UHMWPE）制成的承重合成材料替换关节的关节软骨表面。全关节置换术显着改善了患有关节炎的患者的生活质量5，但危及植入物性能和患者满意度的重大并发症是假体周围关节感染（PJI），占翻修手术的15%-25%6。在大多数情况下，感染的原因被认为是手术期间植入部位的微生物污染7。然后，污染群体在植入物和组织表面扩大8。宿主免疫系统作为响应被触发，但污染生物的生长速度和生物膜形成可以使它们逃避免疫细胞，这可能导致细胞因子和趋化因子风暴增加，而不会根除细菌9，10，11。由此产生的骨骼深度感染危及植入物的固定和性能以及患者的健康12。
金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌是PJI13的主要致病微生物。葡萄球菌感染的严重程度很高，因为它们对抗生素的耐药性增加，生物膜形成以及作为小菌落变异体持续存在的能力14，15，16。植入物相关感染是由于微生物粘附在植入物表面上以及建立复杂的生物膜基质，使细菌能够逃避有害的宿主免疫因子和有效浓度的抗生素14，15，16而发生的。常规治疗方法包括长时间静脉注射和口服抗生素组合17。这种方法的一个主要缺点是药物在感染部位的生物利用度低，并且难以达到足够浓度的抗生素以在治疗期间始终如一地根除细菌，这通常会导致不良结果18。为了解决这些缺点，设计了一种功能齐全的局部药物洗脱UHMWPE植入物，以确保有效浓度的抗生素持续释放到关节间隙19。药物洗脱植入物的局部洗脱用作补充工具，以防止植入物移除和组织清创后残留的任何细菌的生长和定植。这种抗生素洗脱UHMWPE的体外抗菌测试可以通过将材料直接与细菌孵育并通过铺板方法20，21定量细菌来进行。或者，可以使用琼脂盘扩散法、肉汤稀释法和定时杀灭测试等方法对淋洗液培养基的等分试样进行细菌测试22。所有这些方法都依赖于通过菌落计数和浊度测量收集等分试样后约16-18小时的生长观察。使用这些体外方法可以纵向定量抗生素从这些装置中洗脱;然而，为了确定这些浓度曲线的转化值，需要一种强大的实时体外方法来评估抗菌活性。
本研究中使用的微生物活力测定是通过使用基于荧光素-荧光素酶的检测技术测量活细菌细胞释放的对应于三磷酸腺苷（ATP）的发光来定量活细菌的。ATP作为活细胞的能量货币，是生理上可行的细胞的直接指标。该试剂进行细胞裂解，从活细胞中释放ATP分子，然后以发光的形式进行检测。这种发光与样品中活细菌细胞的比例直接相关23。这是一种实时、简单、多功能、快速、基于单一试剂的检测方法，可适应革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的各种检测设计和条件。在这里，我们报告了一种使用基于微生物活力测定（例如BacTiter Glo）的改良时间杀灭测定法来确定与实验室和临床金 黄色葡萄 球菌菌株一起孵育的抗生素洗脱UHMWPE的实时抗菌活性的方法。虽然该方法是用特定的植入材料和特定的骨科应用来描述的，但该方法可以为测试具有临床应用的其他抗生素洗脱递送装置提供一个平台。
Protocol
1. 试剂的制备
- Mueller-Hinton肉汤（MHB）制备：将22克阳离子调节的MHB溶解在1升去离子水中。在121°C和15lb压力下高压灭菌培养基20分钟，确保瓶子松散盖上。将准备好的无菌肉汤储存在4°C直至使用。
- 胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）制备：将20克TSA粉末溶解在500毫升去离子水中。将琼脂混合物在121°C和15lb高压灭菌20分钟。将无菌培养基转移到55°C水浴中以降低熔融琼脂的温度。将冷却的制备琼脂倒入无菌培养皿（~15mL）上，并使其凝固。将凝固的琼脂平板倒置存放以避免冷凝。
- 胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）制备：将15克TSB粉末溶解在500毫升去离子水中。将肉汤混合物在121°C和15lb高压灭菌20分钟。将准备好的无菌肉汤储存在4°C直至使用。
- 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：在无菌使用前，在121°C和15磅下商业购买1x PBS的高压灭菌器20分钟。
- 微生物活性测定试剂制备：将测定内容物平衡至室温。将10 mL缓冲液与冻干发光试剂粉末混合，并将制备的试剂作为1 mL等分试样储存在−20°C。在每个时间点之前，解冻光敏试剂，并将其置于室温。
- 硫酸庆大霉素储备溶液：将 80 mg 硫酸庆大霉素 （GS） 溶解在 10 mL 的 1x PBS 中。彻底涡旋药物溶液以获得 8 mg/mL GS 储备溶液。
- 盐酸万古霉素储备溶液：将10 mg盐酸万古霉素粉末彻底溶解在10 mL去离子水中，得到1 mg/mL储备溶液。
- 硼酸缓冲溶液：将 24.7 g （0.4 M） 硼酸溶解在 900 mL 去离子水中。用50%（w / v）氢氧化钠溶液将溶液的pH值调节至10.4。在此步骤中，加入去离子水使其达到 1 L。
- 邻硫二醛试剂（OPA）：将0.2克OPA溶解在1毫升甲醇中。向 OPA 溶液中加入 19 mL 的 0.4 M 硼酸缓冲液 （pH 10.4）。向 OPA-硼酸混合物中加入 0.4 mL 2-巯基乙醇。用铝箔覆盖试剂瓶，并在4°C下储存，以便在制备后使用长达2-3天。
注意：避免接触皮肤、眼睛和衣服。OPA 和 2 种巯基乙醇试剂的处理只能在通风橱下进行，并适当排气通风，同时穿戴适当的个人防护设备。避免吸入蒸气、灰尘或气溶胶。
2. 处女和载药超高分子量聚乙烯的制备
- 用筛子（75μm孔径）分别筛2g硫酸庆大霉素和盐酸万古霉素粉末，并在真空炉（<0.1atm）中于45°C脱水18-24小时。
- 使用机械混合器将脱水药物与UHMWPE粉末以7%w / w（1.12g抗生素+ 14.88gUHMWPE）在容器中混合5分钟。
- 将带有不锈钢插入板的铝青铜定制模具（85 mm x 50 mm）在对流烤箱中预热至180°C1小时。将压板预热至170°C。
- 将混合粉末加入模具中，并在10MPa，170°C下压缩10分钟，然后在10MPa下进行45分钟的水冷循环。
- 使用液压机从压力机上拆下模制的UHMWPE块（~3.5毫米）。
- 使用计算机数控 （CNC） 铣削块的顶部和底部表面，以去除任何表面不规则和污染物。
- 使用 CNC 将块切成 3 mm x 5 mm x 20 mm 的条带。
- 使用与研究对照相同的方法制备原始UHMWPE（不添加抗生素）。
补充图1：用于成型UHMWPE样品的模具部件。 （一）不锈钢插入板;（二）模腔;（三）柱塞;（四）背板 请点击这里下载此文件。
3. 药物洗脱UHMWPE洗脱动力学的测定
- 将 3 mm x 5 mm x 20 mm 条带放入带有鲁尔锁和 25 G 针头的 3 mL 注射器中。
- 通过用去离子水填充注射器并多次倒置注射器来清洗条带。
- 用去离子水填充注射器，直至 2 mL 刻度。
- 将注射器设置在室温下以100rpm的速度放在摇床上。
- 在每个时间点（6小时，1天，2天，3天，1周），将洗脱液收集在2mL小瓶中。
- 在每个时间点，通过用去离子水填充注射器并倒置注射器来清洗条带。丢弃溶液，并用去离子水填充注射器直至2 mL刻度以继续实验直到下一个时间点。
4.万古霉素浓度的测定
- 在去离子水中以280nm的峰值吸收波长检测万古霉素浓度分光光度法。
- 通过向UV 96孔板中加入100 μL 1 mg/mL储备溶液并使用100 μL去离子水连续稀释以获得六种水平的已知浓度（1 mg/mL至0.03125 mg/mL），制备已知浓度范围的标准品。
- 将 100 μL 洗脱液转移到紫外清除的 96 孔板中，并使用酶标仪测定 280 nm 处的浓度。
- 通过将已知药物浓度与相应的吸光度值绘制成图表来生成校准曲线。使用校准曲线生成的线性方程计算淋洗液中的未知药物浓度。
- 通过将浓度乘以淋洗液体积（~1.7 mL）来确定药物质量。
- 通过对之前所有时间点的药物释放求和来计算某个时间点的累积药物释放量（mg）。
- 将药物释放归一化到条带的表面积（3.5 cm 2）以确定植入物每平方厘米（cm2）的累积药物释放量。
5.用OPA标记法测定庆大霉素浓度 27
- 准备GS标准溶液以进行OPA测定。
- 将 1 mL 的 80 μg/mL GS 溶液转移到离心管中。
- 将 500 μL PBS 添加到另外五个离心管中。
- 使用这些试管进行连续稀释，以获得 80 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL 和 2.5 μg/mL 的 GS 浓度。这些用作测定的校准溶液。
- 在透明的 96 孔板中，按升序向孔 A-1 中加入 80 μL PBS，向孔 A-2 至 A-7 中加入 80 μL 校准溶液。这可作为测定的内部校准。
- 将每个样品的 80 μL 一式三份加入空孔中，以在同一 96 孔板中进行分析。将每个孔板的样品数量限制为<50，以便所有样品向样品中添加OPA溶液的时间大致相同，并避免蒸发。
- 将OPA试剂添加到所有标准品和样品溶液中。
- 在通风橱中，用甲醇填充 25 mL 试剂储液槽。
- 将 8 mL 甲醇和 1 mL 制备的 OPA 溶液加入第二个试剂储液槽中（第 1.8 节）。通过上下移液彻底混合溶液。
- 使用多通道 100 μL 微量移液器，将第一个储液槽中的 48 μL 甲醇添加到 96 孔板中的所有含样品孔中。
- 在此步骤中，将来自第二个储液槽的 72 μL 稀释的 OPA 溶液添加到 96 孔板中的所有含样品孔中。将孔板在室温下孵育10分钟。
- 孵育10分钟后立即使用酶标仪测量荧光强度（激发340nm，发射455nm）。
- 使用具有已知GS浓度的溶液的强度读数绘制校准曲线。添加一条线性线以确定最佳拟合并生成相应的方程。
- 根据通过绘制已知药物浓度与相应吸光度值的校准曲线生成的校准曲线计算淋洗液中的药物浓度。
- 通过将浓度乘以淋洗液体积（~1.7mL）来计算药物质量。
- 通过对之前所有时间点的药物释放求和来确定某个时间点的累积药物释放量（mg）。
- 将药物释放归一化到条带的表面积（3.5 cm 2）以确定植入物每平方厘米（cm2）的累积药物释放量。
6. 细菌制备
注意：本研究使用了以下 金黄色葡萄球菌 菌株：类型菌株12600，临床菌株L1101和L1163（从罗德岛大学的Kerry LaPlante博士获得）。这些菌株的敏感性特征如 表1所示。
| 菌株 | 庆大霉素 MIC | 万古霉素 MIC | |
| ATCC 12600 | ≤1 微克/毫升（灵敏） | ≤0.5 微克/毫升（灵敏） | |
| L1101（临床菌株） | ≥16 微克/毫升（耐久） | 8 微克/毫升（中间） | |
| L1163 （临床菌株） | ≤1 微克/毫升（灵敏） | 8 微克/毫升（中间） | |
表1：对照和临床 金黄色葡萄球菌 菌株的抗生素敏感性概况。
注意：涉及处理细菌培养物和悬浮液的所有步骤均在II类A2型生物安全柜内的BSL-2实验室空间中进行。
- 将细菌原液从-80°C解冻到TSA平板上，以促进 金黄色葡萄球菌的生长。将板在35°C下静态孵育过夜。
- 将过夜生长的琼脂平板培养物中的两到三个菌落转移到1mL无菌TSB中，并在35°C下静态孵育过夜。
- 将 100 μL 细菌转移到透明的 96 孔板中，通过测定 600 nm 处的吸光度来分光光度法测量浊度。
- 使用无菌MHB稀释细菌10，000倍，然后使用发光测定法确定活细菌计数。
7. 进行实时微生物活力测定
- 使用白色不透明底部96孔板进行基于发光的测定。
- 将 100 μL 稀释的细菌悬浮液与第 1.5 节中制备的 100 μL 测定试剂混合。
- 将盖子上覆盖有铝箔的盖子放在准备好的96孔板上，并以100rpm振荡孵育5分钟。
- 使用Gen5 3.11软件中的以下设置立即使用酶标仪测量发光。
- 单击“ 新建 ”以在 “任务管理器 ”窗口中设置协议。
- 在板类型下拉菜单中选择 Costar 96 白色不透明。
- 单击“选择步骤>操作”菜单下的“读取”。
- 单击“读取方法”窗口中的“发光”。将端点/动力学和发光光纤选项分别在读取类型和光学类型下保持选中状态。单击确定。
- 保留“ 读取步进 ”窗口中的<默认>设置（增益 = 135;积分时间 = 1 秒;读取高度 = 4.5 mm）。单击 确定。
- 板布局窗口将显示为运行准备就绪。选中负载板窗口中的使用盖框，然后单击确定。
- 将96孔板放入机器中以读取发光值。
8. 为每种细菌菌株生成发光与活计数标准曲线
注意：根据第6节中描述的方法培养和列举所有 金黄色葡萄球菌 菌株。
- 准备连续稀释的细菌悬浮液作为标准品。
- 通过分光光度法测量浊度来枚举过夜生长的细菌悬浮液。
- 以 6，000 × g 离心 5 分钟以沉淀细菌，并将沉淀重悬于无菌 MHB 中以将浓度调节至 1 x 109 CFU/mL。
- 使用 900 μL MHB 稀释 100 μL 纯悬浮液，并进行 10 倍连续稀释以达到 1 x 101 CFU/mL。
- 如第7节所述，对制备的细菌悬浮液进行发光测定。
- 使用无菌MHB作为实验的空白对照，并从测试样品发光值中减去空白发光值。
- 将对数 （CFU） 与对数（发光）绘制以生成标准曲线。记录方程和 R2 值。
- 在整个研究中，使用应变特异性方程确定对应于发光值的CFU/mL。
9. 时间依赖性抗菌活性研究设置
图 1：实验设置的示意图。 请点击此处查看此图的大图。
- 将细菌在 1 mL TSB 肉汤中培养过夜。
- 在无菌MHB中将过夜生长的细菌悬浮液稀释至105 CFU /mL（第6节），并在实验开始前使用发光单元验证活细菌计数（第7节）。
- 将原始UHMWPE和载药UHMWPE试纸（3 mm x 5 mm x 10 mm，第2节洗脱研究准备的试纸尺寸的一半）放入3 mL注射器中。
- 通过连接的针头将含有 105 CFU/mL 的 MHB 吸入注射器中，直至 1.5 mL 标记，相当于 1.35 mL MHB（图 1：步骤 1）。
- 将注射器设置置于37°C的振荡培养箱（100rpm）上，直到指示的时间点6小时，第1天，第2天，第3天，第4天，第5天，第6天和第7天（图1：步骤2）。
- 在每个指定的时间点，取出注射器设置，并根据100μL细菌悬浮液的第7节进行实时微生物活力测定（图1：步骤3-4）。
- 确定 6 小时、第 1 天、第 2 天、第 3 天和第 7 天时间点的活菌计数。使用相应的标准曲线从发光单位确定CFU/mL。
- 通过在TSA板上执行扩展板方法并在35°C孵育过夜，验证发光值低于检测限的样品中是否存在活细菌。第二天检查菌落的存在。
- 将剩余的细菌悬浮液以10，000× g 离心10分钟，并轻轻吸出用过的培养基。对于由于药物的抗菌活性而无法目视观察颗粒的管，在管中留100μL以确保看不见的沉淀不受干扰（图1：步骤5）。
- 将沉淀的细菌重悬于新鲜的MHB中，并通过连接的针头将细菌悬浮液拉回相同的注射器设置中（图1：步骤6）。
10. 超高分子量聚乙烯表面贴壁细菌的定量
- 在第7天完成研究后，从注射器设置中取出原始UHMWPE和载药UHMWPE表面。
- 将表面转移到 1.5 mL 管中，并用 1 mL 无菌 PBS 冲洗（三次）。
- 在 1 mL 无菌 PBS 中超声处理表面 40 分钟。如第 7 节所述，通过对 100 μL 超声样品进行发光测定来确定贴壁细菌活力。
Representative Results
按照该方案，用庆大霉素和万古霉素以7%w / w模制UHMWPE并洗脱到去离子水中。在6小时，1天，2天，3天和1周测定材料洗脱液中的药物浓度。万古霉素和负载庆大霉素的UHMWPE的药物释放在6小时时表现出爆发释放，然后是稳定的释放速率，释放浓度大于最小抑制浓度（MIC），直到7天（图2， 表 2）。
在抗菌研究之前，生成标准曲线以将发光单位与每种 金黄色葡萄球菌 菌株（ATCC 12600、L1101 和 L1163）细菌的 CFU/mL 相关联。将相应的对数（发光）值与对数（CFU/mL）作图，以生成标准曲线（图3）。ATCC 12600、L1101 和 L1163 计算的 R2 值分别为 0.997、0.996 和 0.994，表明与浓度范围非常吻合。随后，推导出的方程用于计算所有实验中的细菌活力。ATCC 12600 和 L1101 的检测限在 1 x 102-1 x 103 CFU/mL 范围内。另一方面，L1163菌株的检测限显示为1 x 104 CFU/mL。
使用1 x 105 CFU/mL作为12600、L1163和L1101的起始接种物进行时间依赖性抗菌活性测定，将其暴露于7%w/w药物洗脱材料中1周。在每个时间点（6小时，1天，2天，3天，1周），刷新培养基，并重新悬浮细菌种群。细菌暴露于随后从材料中释放的药物一直持续到下一个时间点。含有7%w/w万古霉素的UHMWPE和含有7%w/w庆大霉素的UHMWPE显示，从6小时开始，敏感的ATCC 12600的>3对数减少，并且在3天结束时观察到完全根除（无菌落生长）（图4A）。对于庆大霉素敏感和万古霉素中间菌株L1163，两种药物洗脱材料在6小时引起>3log减少，并且在实验的第1天观察到完全根除（无菌落生长）（图4B）。对于庆大霉素耐药和万古霉素中间体菌株L1101，UHMWPE中的庆大霉素洗脱不影响L1101的细菌活力（图4C）。细菌增殖，并且在没有抗生素洗脱的原始UHMWPE存在下，种群在6小时内稳定下来。在庆大霉素洗脱的UHMWPE存在下，人群在第2天达到了类似的增长水平。相反，从UHMWPE洗脱的万古霉素在6小时显着降低了细菌活力（>3log），并且在第4天证明完全活力丧失（无菌落生长）。
庆大霉素洗脱和万古霉素洗脱UHMWPE的表面在第7天或完全根除后暴露于敏感和中等耐药菌株时没有活的贴壁细菌，以先到者为准。一些活细菌（1 x 105 CFU/mL）存在于暴露于庆大霉素耐药L1101的庆大霉素洗脱UHMWPE上。同样，从对照原始PE中回收约1 x 10 5 CFU/mL的活贴壁细菌（图5）。
图 2：7% w/w 负载抗生素的 UHMWPE 条的时间依赖性平均抗生素释放量。从一条7%w/w庆大霉素和加载万古霉素的UHMWPE条（3 mm 3 x 5 mm 3 x 10 mm 3 ~ 2 cm2表面积）的时间点之间的平均抗生素释放量。对照菌株ATCC 12600的MIC显示为庆大霉素的虚线和万古霉素的实线。误差线表示六个重复的平均值的标准偏差 （n = 6）。请点击此处查看此图的大图。
图 3：所有 金黄色葡萄 球菌菌株的实时发光测定标准曲线。 对数（发光）与对数（CFU/mL）作图，以生成对照（A）ATCC 12600和临床菌株（B）L1101和（C）L1163的标准曲线。图中显示了描述最佳拟合线和相应 R2 值的方程。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：使用发光测定法测定 7% w/w 庆大霉素洗脱和 7% w/w 万古霉素洗脱 UHMWPE 的细菌活力。图中显示了从UHMWPE洗脱的庆大霉素和万古霉素对对照菌株（A）ATCC 12600和临床菌株（B）L1163和（C）L1101的时间依赖性抗菌活性。Virgin 1020 PE作为实验的对照。图中的黄线表示相应金黄色葡萄球菌菌株的检测限。数据显示为平均值±标准差 （n = 3）。请点击此处查看此图的大图。
图 5：使用发光测定法 Glo 测定对所有 金黄色葡萄球菌 菌株的 7% w/w 庆大霉素洗脱和 7% w/w 万古霉素洗脱 UHMWPE 测定的贴壁细菌活力。 条形图表示在研究期结束时，对于所有测试的菌株，7%庆大霉素负载和7%万古霉素负载UHMWPE每平方厘米（cm2）回收的贴壁细菌（CFU）。条形将数据显示为平均值±标准差 （n = 3）。 请点击此处查看此图的大图。
| 时间点 | 万古霉素 | 庆大霉素 |
| 峰浓度（微克/毫升） | 峰浓度（微克/毫升） | |
| 0 - 6 小时 | 336±72 | 263±24 |
| 6小时-1天 | 57±18 | 16 ± 2 |
| 1 天 - 2 天 | 60±18 | 7 ± 1 |
| 2 天 - 3 天 | 23±6 | 5 ± 0.4 |
| 3 天 - 7 天 | 49±20 | 15 ± 1 |
表2：不同时间点的药物峰浓度（μg/mL）。 数据显示为平均值±标准差 （n = 6）。
补充图2：向样品中添加测定试剂后10分钟内的发光信号衰减。信号的±5%差异显示为虚线 请点击这里下载此文件。
Discussion
局部持续输送抗生素是治疗假体周围关节感染的必要工具。全身性抗生素是根除细菌感染的主要策略，局部洗脱被用作补充工具，以防止植入物移除和清创组织后残留的任何细菌的生长和定植。局部给药抗生素的曲线下有效面积（一段时间内的浓度）的目标尚不清楚。抗生素从这些装置中的洗脱可以在 体外纵向定量;然而，为了确定这些浓度曲线的翻译值，需要一种稳健的 体外 方法来评估抗菌活性。在本文中，描述了一种这样的实时方法来确定药物洗脱UHMWPE的抗菌活性，以用作关节置换的持续递送装置。
细菌活力的实时监测是一个令人感兴趣的关键参数，传统的微生物学方法缺乏适应研究这一特定方面的框架。本研究中使用的微生物活力测定是通过测量对应于三磷酸腺苷（ATP）的发光来定量活细菌的。为了直接研究从植入材料中洗脱的抗生素的时间依赖性活性，将三种具有不同抗生素敏感性特征的不同菌株与它们一起孵育。使用对庆大霉素和万古霉素具有不同耐药性的实验室和临床菌株的基本原理是了解给定植入物配方的活性范围。此外，针对这些不同人群的抗菌活性和功效取决于给药时间。该方法侧重于基于>70%的假体周围关节感染是由手术时伤口污染引起的预防这些菌株的可行性24。
作为开发该方法的起始接种物，使用1 x 105 CFU/mL。动物模型使用了不同的污染浓度，尽管对PJI的临床相关感染负荷知之甚少。PJI的动物感染模型已常规使用1 x 105 CFU建立，并且在标准化方法（CLSI）中广泛使用类似的范围来确定抗菌活性25，26，27。使用 1 x 105 CFU/mL 作为初始污染浓度，我们可以同时评估生长和根除参数。
传统上，MIC值是根据特定数量的细菌的恒定抗生素浓度确定的，并且它们无法证明抗菌作用的速率。由于这一方面，MIC值不提供定量区分来描述抗微生物活性谱28。当前方法的数据强调了评估抗生素的菌株依赖性杀伤动力学的优势，而不是使用MIC做出剂量决策。使用这种方法，可以区分植入材料影响不同菌株的程度和速率。从植入材料条中洗脱的庆大霉素在1天内有效根除L1163，在2-3天内根除ATCC 12600，但在根除L1101方面无效（图4）。除了庆大霉素洗脱对L1101（MIC >32μg/mL）由于其固有的庆大霉素耐药性（图4C）而预期缺乏活性外，当暴露于万古霉素时观察到亚群的持久性，其中L1101表现出中间耐药性。相比之下，L1163在万古霉素洗脱UHMWPE存在下被最终根除，尽管对万古霉素表现出与L1101相似的中间耐药性（两种菌株的MIC均为8μg/ mL）。
观察结果表明，庆大霉素对12600和L1163的活性率不同，庆大霉素敏感且MIC值相似（两种菌株的MIC为1μg/mL），以及万古霉素对中耐药L1101和L1163的活性程度不同（图4A，B），支持了这种在洗脱材料存在下的实时方法可以区分活性的纵向差异的假设。
除了解释给定洗脱浓度对这些细菌的有效性的结果的翻译价值外，还有几个实验方法学优势。（1）细菌浓度在给定时间瞬间测定，这与将细菌在肉汤或琼脂中孵育18-24小时以确定活力的传统方法相反。这段生长期可以为细菌从抗生素应激中恢复提供额外的时间，从而引入额外的可能的错误/变异性来源。（2）在保留细菌的同时不断更换培养基，与静态条件相比，细菌更类似于 体内 条件。（3）该测定固有地包括植入物的药物释放动力学，从而可以更好地预测性能。（4）该方法是使用常用的耗材开发的，不需要任何特定或昂贵的机器。
在进行体内动物研究和临床试验之前，需要强大的体外测试方法来评估药物递送应用。该测定可以修改和调整以适应各种方法和药物递送平台，例如颗粒、凝胶、薄膜和其他药物洗脱材料，以确定在模拟体外设置中根除细菌的效率。可以通过更改为合适的体外培养基环境来对样品设置进行修改，这已被证明会影响几种抗生素的活性29，30。
该方法还有助于确定活的贴壁细菌，这是有希望的，因为确定最低生物膜根除浓度的传统方法非常耗时并且提供不一致的结果。然而，该方法将在生物膜上进行严格测试，以开发一种可靠且稳健的方法来确定其灵敏度。基于ATP的发光方法可能足够灵敏，可以检测生物膜中包括持久性在内的活细菌形式，这些细菌可能会也可能不会在琼脂平板上作为可见菌落检测到。综上所述，这个多功能平台有可能结合相关参数来记录对目标药物的抗菌和抗生物膜活性的实时观察。
该方法的有效性取决于以下几个方面：
预先确定的洗脱特性和样品量
抗生素洗脱材料的洗脱曲线可以在该抗菌活性测量之前的单独实验中确定，以便可以确定在规定时间内积极进行实验所需的材料量。
容器和体积测定
重要的是设计一种设置，其中实验的培养基体积可以容纳相同材料的整个表面积，并确保有足够的体积使药物从载药表面畅通无阻地释放出来。所使用的设置基于先前的实验，确保这些亲水性药物的“完美下沉”条件，使其扩散不受溶解度限制的阻碍。
生长培养基特征
应研究生长培养基的选择，以确保所选药物的稳定性和最佳性能29。阳离子调节的Mueller Hinton肉汤（CAMHB）广泛用于肉汤稀释法，用于测定已知抗生素的MIC。该培养基可实现最佳的药物活性，而不会受到有毒次级代谢物积累的干扰31。该测定试剂已经过测试，并报告在不同类型的培养基中稳定，包括含有血清成分23，28的培养基。尽管相对发光单位值可能因不同介质而异，但已证明培养基的组分不会干扰测定32，33。实验体积进一步优化至1.5 mL，其接近成人膝关节间隙34中存在的滑液体积。
测定的温度稳定性
在测定中处理和添加发光试剂应在实验中以一致的方式进行。温度变化会改变测定的灵敏度，因此在将其添加到细菌中之前，重要的是在室温下孵育试剂2小时23。
试剂孵育时间
试剂的发光会随着时间的推移而衰减。发光信号的半衰期超过30分钟，这在很大程度上取决于实验中使用的培养基和细菌类型23。此外，孵育时间的任何差异（即，将试剂添加到细菌中和读取发光之间的时间）都将导致相同浓度细菌的读数不一致。根据制造商的说明在孵育5分钟后1分钟内拍摄时，观察到发光信号差异为5%（补充图 2）。考虑到这些数据，在整个研究过程中1分钟内记录发光读数，以确保信号损失不超过5%。此外，重要的是限制每个板的样品数量，以减少由于从第一个孔到最后一个孔的发光衰减而引入的误差。
在整个研究过程中维持细菌种群
该方法试图通过在每个时间点使用10，000 x g 高速离心10 min35将用过的培养基与细菌群体连续分离来模拟药物清除率和滑膜体积周转。这一关键步骤可确保所有活的和无活的细菌细胞沉降。此外，沉淀的细菌在新鲜的MHB中均匀复溶并转移到注射器设置中，从而促进受影响的微生物种群完全携带回实验设置。该方法的可重复性和可靠性在很大程度上依赖于模拟抗生素对初始接种物产生的微生物种群的持续暴露。
该方法的一个关键局限性是它是一种半静态测定，不能准确模拟药物半衰期和连续滑膜周转。然而，持续的培养基更换部分弥补了这一限制。微生物活力测定的灵敏度取决于菌株，范围为1 x 102-1 x 104 CFU/mL，这限制了检测能力。此外，需要为每个生物体绘制标准曲线，因为菌株类型有助于发光试剂的灵敏度和性能。细菌生长动力学和所用药物化合物的活性都可能受到培养基成分的影响，应进一步研究。
Disclosures
资深作者（E.O.）从以下公司获得知识产权许可产生的特许权使用费：Corin，Iconacy，Renovis，Arthrex，ConforMIS，Meril Healthcare，Exactech。与此处介绍的任何研究都没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作部分由美国国立卫生研究院拨款编号AR077023（R01）和哈里斯骨科实验室资助。作者感谢罗德岛大学的Kerry Laplante博士和她的团队提供临床菌株L1101和L1163。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plates - polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs | Corning, NY, USA | CLS3922-100EA | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich, Germany | ||
| ATCC 12600 | American Type culture Collection, VA, USA | ||
| BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay | Promega Corporation, USA | G8231 | |
| BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) | Becton-Dickinson, USA | BD 211825 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL | BD, USA | 309657 | |
| BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G | BD, USA | 305122 | |
| BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton-Dickinson, USA | B12322 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) | Becton-Dickinson, USA | DF0369-17-6 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| Boric Acid | Fisher Chemical, NJ, USA | ||
| Branson 1800 ultrasonic bath | Emerson, MO, USA | ||
| Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid | Fisher Scientific, USA | 08-757-100D | |
| Gentamicin Sulfate | Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China | ||
| Greiner UV-Star 96 well plates | Sigma Aldrich, Germany | M3812-40EA | |
| Hydraulic press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| L1101 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| L1163 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| LSE benchtop shaking incubator | Corning, NY, USA | ||
| Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical | Fisher Scientific, NJ, USA | A454-1 | |
| Napco CO2 6000 | Thermo Scientific, MA, USA | ||
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents | Fisher Scientific, USA | BP24384 | |
| Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) | Sigma Aldrich, Germany | P1378-5g | |
| Plate reader (Synergy H1 | Biotek, VT, USA | ||
| press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| shaker Innova 2100 | New Brunswick Scientific, NJ, USA | ||
| ShopBot D2418 | ShopBot Tools, Inc., NC, USA | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich, Germany | ||
| Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water | Fisher Scientific, USA | 23-751628 | |
| UHMWPE | GUR1020, Celanese, TX, USA | ||
| Vancomycin Hydrochloride | Fagron, The Netherlands | 804148 | |
| WAB Turbula | WAB Turbula, Switzerland |
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