Summary
Hier presenteren we een protocol om de antibacteriële werkzaamheid van een antibioticum-eluterend polymeer te evalueren om profylactische klinische toepassing te simuleren met behulp van een commercieel beschikbare real-time ATP-gebaseerde luminescerende microbiële levensvatbaarheidstest. Deze methode maakt het mogelijk om de longitudinale activiteit van geneesmiddel-eluterende materialen te monitoren en kan op grote schaal worden aangepast om antimicrobiële toedieningsplatforms voor geneesmiddelen te testen.
Abstract
Polyethyleen met ultrahoog molecuulgewicht (UHMWPE) wordt veel gebruikt in totale gewrichtsarthroplastieken als een dragend oppervlak. Periprosthetische gewrichtsinfecties, waarvan de meerderheid kort na gewrichtsvervanging optreedt, vormen bijna 25% van de totale knierevisieoperaties en de volledige uitroeiing van bacteriële infecties vormt een grote uitdaging. Een veelbelovende manier om dit probleem aan te pakken, is door te zorgen voor de lokale aanhoudende afgifte van antibioticaconcentraties die voldoende zijn om de bacteriën te remmen om routinematige systemische antibioticaprofylaxe te ondersteunen. Er is meer onderzoek gedaan naar de ontwikkeling van efficiënte lokale hulpmiddelen voor de toediening van geneesmiddelen. Hoewel gevestigde antibacteriële testmethoden voor geneesmiddelen kunnen worden gebruikt om de antibacteriële werkzaamheid van geneesmiddelen te testen, ontbreken ze in termen van het verstrekken van real-time en longitudinale antibacteriële werkzaamheidsgegevens die kunnen worden gecorreleerd aan de elutieprofielen van antibiotica van deze apparaten. Hier rapporteren we een directe en veelzijdige methodologie om de antibacteriële werkzaamheid van antibiotica-eluterende UHMWPE-implantaten te bepalen. Deze methodologie kan worden gebruikt als een platform om bacteriecultuur te vermijden op elk tijdstip van een langdurig experiment en kan ook worden aangepast aan andere lokale apparaten voor medicijnafgifte.
Introduction
Artrose is een belangrijke degeneratieve aandoening die wereldwijd 500 miljoen volwassenen treft1. De gouden standaard in de behandeling van artritis in het eindstadium is totale gewrichtsvervanging, die naar verwachting tegen 2030 alleen al in de Verenigde Staten bij meer dan 2 miljoen patiënten per jaar zal worden uitgevoerd2, waarbij de wereldwijde vraag ook enorm zal toenemen 3,4. De procedure omvat de vervanging van de scharnierende kraakbeenoppervlakken van de verbindingen door dragende synthetische materialen van metaal / keramiek en sterk verknoopt polyethyleen met ultrahoog moleculair gewicht (UHMWPE). Totale gewrichtsvervangingen verbeteren de kwaliteit van leven voor patiënten die lijden aan artritis5 aanzienlijk, maar een belangrijke complicatie die de prestaties van de implantaten en de tevredenheid van de patiënten in gevaar brengt, is periprothetische gewrichtsinfectie (PJI), die goed is voor 15% -25% van de revisieoperaties6. De oorzaak van infectie wordt in de meeste gevallen verondersteld de microbiële besmetting van de implantaatplaats tijdens operatie7 te zijn. De vervuilende populatie breidt zich vervolgens uit op het implantaat en de weefseloppervlakken8. Het immuunsysteem van de gastheer wordt geactiveerd als reactie, maar de groeisnelheid en biofilmvorming van de verontreinigende organismen kunnen hen in staat stellen de immuuncellen te ontwijken, wat kan leiden tot een verhoogde cytokine- en chemokinestorm zonder de uitroeiing van de bacteriën 9,10,11. De resulterende diepe infectie van het bot brengt de fixatie en prestaties van het implantaat in gevaar, evenals de gezondheid van de patiënt12.
Staphylococcus aureus en coagulase-negatieve stafylokokken zijn de overheersende veroorzakers van PJI13. De ernst van stafylokokkeninfecties is hoog vanwege hun verhoogde resistentie tegen antibiotica, biofilmvorming en het vermogen om te blijven bestaan als kleine kolonievarianten14,15,16. Implantaat-geassocieerde infecties treden op als gevolg van de hechting van micro-organismen op het oppervlak van het implantaat en de oprichting van een complexe biofilmmatrix die de bacteriën in staat stelt om schadelijke immuunfactoren van de gastheer en effectieve concentraties antibiotica te ontwijken14,15,16. Conventionele behandelingsmethoden omvatten intraveneuze en orale antibioticacombinaties gedurende een langere periode17. Een groot nadeel van deze aanpak is de lage biologische beschikbaarheid van het geneesmiddel op de infectieplaats en de moeilijkheid om voldoende concentraties antibiotica te bereiken om de bacteriën consistent uit te roeien gedurende de behandelingsperiode, wat vaak resulteert in slechte resultaten18. Om deze tekortkomingen aan te pakken, werd een volledig functioneel gelokaliseerd geneesmiddel-eluterend UHMWPE-implantaat ontworpen om een aanhoudende afgifte van effectieve concentraties antibiotica in de gewrichtsruimte te garanderen19. Lokale elutie van het geneesmiddel-eluting implantaat wordt gebruikt als een aanvullend hulpmiddel om de groei en kolonisatie van eventuele bacteriën die overblijven na de verwijdering van het implantaat en debridement van het weefsel te voorkomen. In vitro antibacterieel testen van deze antibioticum-eluterende UHMWPE kan worden uitgevoerd door het materiaal rechtstreeks met de bacteriën te incuberen en de bacteriën te kwantificeren volgens de spread-plate methode20,21. Als alternatief kunnen aliquots van eluentmedia worden getest tegen bacteriën met behulp van methoden zoals de agarschijfdiffusiemethode, bouillonverdunningsmethoden en time-kill-tests22. Al deze methoden zijn gebaseerd op groeiobservatie ongeveer 16-18 uur na het verzamelen van de aliquots door middel van kolonietelling en troebelheidsmetingen. De elutie van antibiotica uit dergelijke apparaten kan longitudinaal worden gekwantificeerd met behulp van deze in vitro methoden; Om de translationele waarde van deze concentratieprofielen te bepalen, is echter een robuuste real-time in vitro methode nodig om antibacteriële activiteit te beoordelen.
De microbiële levensvatbaarheidstest die in deze studie wordt gebruikt, is ontwikkeld voor de kwantificering van levensvatbare bacteriën door de luminescentie te meten die overeenkomt met adenosinetrifosfaat (ATP) dat vrijkomt uit een levende bacteriële cel met behulp van op luciferine en luciferase gebaseerde detectietechnologie. ATP, als de energievaluta van levende cellen, dient als een directe indicator van fysiologisch levensvatbare cellen. Het reagens voert cellysis uit, waarbij ATP-moleculen vrijkomen uit levensvatbare cellen die vervolgens worden gedetecteerd in de vorm van luminescentie. Deze luminescentie heeft een directe correlatie met het aandeel levensvatbare bacteriële cellen in het monster23. Dit is een real-time, eenvoudige, veelzijdige, snelle, op één reagens gebaseerde test die kan worden aangepast aan een verscheidenheid aan testontwerpen en -omstandigheden met zowel grampositieve als gramnegatieve micro-organismen. Hier rapporteren we een methode om de real-time antibacteriële activiteit van antibiotica-eluting UHMWPE geïncubeerd met laboratorium- en klinische stammen van S. aureus te bepalen met behulp van een gemodificeerde time-kill assay op basis van de microbiële levensvatbaarheidstest (bijv. BacTiter Glo). Hoewel de methodologie wordt beschreven met een specifiek implantaatmateriaal en een specifieke orthopedische toepassing, kan de methode een platform bieden voor het testen van andere antibiotica-eluterende toedieningsapparaten met klinische toepassingen.
Protocol
1. Bereiding van reagentia
- Mueller-Hinton bouillon (MHB) preparaat: Los 22 g kation-aangepaste MHB op in 1 L gedeïoniseerd water. Autoclaaf de media bij 121 °C en 15 lb druk gedurende 20 minuten, zorg ervoor dat de fles losjes is afgedekt. Bewaar de bereide steriele bouillon bij 4 °C tot gebruik.
- Tryptische soja agar (TSA) preparaat: Los 20 g TSA-poeder op in 500 ml gedeïoniseerd water. Autoclaaf het agarmengsel bij 121 °C en 15 lb gedurende 20 min. Breng de steriele media over in een waterbad van 55 °C om de temperatuur van de gesmolten agar te verlagen. Giet de afgekoelde bereide agar op steriele petrischaaltjes (~ 15 ml) en laat het stollen. Bewaar de gestolde agarplaten omgekeerd om condensatie te voorkomen.
- Tryptische sojabouillon (TSB) bereiding: Los 15 g TSB-poeder op in 500 ml gedeïoniseerd water. Autoclaaf het bouillonmengsel bij 121 °C en 15 lb gedurende 20 min. Bewaar de bereide steriele bouillon bij 4 °C tot gebruik.
- Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS): Autoclaaf commercieel gekocht 1x PBS bij 121 ° C en 15 lb gedurende 20 minuten voor steriel gebruik.
- Microbiële levensvatbaarheidstest reagenspreparaat: Breng de inhoud van de test in evenwicht met kamertemperatuur. Meng 10 ml buffer met het gelyofiliseerde luminescerende reagenspoeder en bewaar het bereide reagens bij −20 °C als 1 ml aliquots. Ontdooi het lichtgevoelige reagens vóór elk tijdstip en breng het op kamertemperatuur.
- Gentamicinesulfaat stockoplossing: Los 80 mg gentamicinesulfaat (GS) op in 10 ml 1x PBS. Vortex de geneesmiddeloplossing grondig om een 8 mg / ml GS-stamoplossing te verkrijgen.
- Vancomycine hydrochloride stockoplossing: Los 10 mg vancomycinehydrochloridepoeder grondig op in 10 ml gedeïoniseerd water om een stamoplossing van 1 mg/ml te verkrijgen.
- Boorzuurbufferoplossing: Los 24,7 g (0,4 M) boorzuur op in 900 ml gedeïoniseerd water. Stel de pH van de oplossing in op 10,4 met een natriumhydroxideoplossing van 50% (m/v). Voeg na deze stap gedeïoniseerd water toe om het tot 1 L te maken.
- O-pthaldialdehyde reagens (OPA): Los 0,2 g OPA op in 1 ml methanol. Voeg 19 ml boorzuurbuffer van 0,4 M (pH 10,4) toe aan de OPA-oplossing. Voeg 0,4 ml 2-mercaptoethanol toe aan het OPA-boorzuurmengsel. Bedek de injectieflacon met aluminiumfolie en bewaar bij 4 °C voor gebruik tot 2-3 dagen na bereiding.
LET OP: Vermijd contact met de huid, ogen en kleding. Het hanteren van de OPA en 2 mercaptoethanolreagentia mag alleen worden uitgevoerd onder een zuurkast met passende afzuigventilatie met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. Vermijd het inademen van de dampen, stof of aerosolen.
2. Bereiding van virgin en drug-loaded UHMWPE
- Zeef 2 g elk gentamicinesulfaat en vancomycinehydrochloridepoeders met een zeef (poriegrootte van 75 μm) en droog bij 45 °C in een vacuümoven (<0,1 atm) gedurende 18-24 uur.
- Meng het gedehydrateerde geneesmiddel met UHMWPE-poeder van 7% w / w (1,12 g antibioticum + 14,88 g UHMWPE) in een container met behulp van een mechanische mixer gedurende 5 minuten.
- Verwarm een aluminium bronzen mal (85 mm x 50 mm) met roestvrijstalen inzetplaten voor op 180 °C in een heteluchtoven gedurende 1 uur. Verwarm de platen van de pers voor op 170 °C.
- Voeg het gemengde poeder toe aan de vorm en comprimeer bij 10 MPa, 170 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door een waterkoelingscyclus van 45 minuten bij 10 MPa.
- Verwijder het gegoten UHMWPE-blok (~ 3,5 mm) uit de pers met behulp van een hydraulische pers.
- Fres de boven- en onderkant van het blok met behulp van een geautomatiseerde numerieke besturing (CNC) om eventuele oppervlakte-onregelmatigheden en verontreinigingen te verwijderen.
- Snijd het blok in stroken van 3 mm x 5 mm x 20 mm met behulp van de CNC.
- Bereid virgin UHMWPE (zonder toevoeging van antibiotica) met behulp van dezelfde methodologie als beschreven als een controle voor het onderzoek.
Aanvullende figuur 1: Delen van de mal die worden gebruikt voor het vormen van de UHMWPE-monsters. (A) Inzetplaat van roestvrij staal; B) schimmelholte; C) plunjer; (D) achterplaat Klik hier om dit bestand te downloaden.
3. Bepaling van de elutiekinetiek van geneesmiddel-eluterende UHMWPE
- Plaats een strip van 3 mm x 5 mm x 20 mm in een spuit van 3 ml met een Luer-slot en een naald van 25 G.
- Was de strip door de spuit te vullen met gedeïoniseerd water en de spuit meerdere keren om te keren.
- Vul de spuit met gedeïoniseerd water tot de schaalverdeling van 2 ml.
- Plaats de opstelling van de spuit op een schudder bij 100 rpm bij kamertemperatuur.
- Verzamel op elk tijdstip (6 uur, 1 dag, 2 dagen, 3 dagen, 1 week) het eluent in een injectieflacon van 2 ml.
- Was de strip op elk tijdstip door de spuit te vullen met gedeïoniseerd water en de spuit om te keren. Gooi de oplossing weg en vul de spuit met gedeïoniseerd water tot de schaalverdeling van 2 ml om het experiment voort te zetten tot het volgende tijdstip.
4. Bepaling van de vancomycineconcentratie
- Detecteer vancomycineconcentratie spectrofotometrisch in gedeïoniseerd water bij een piekabsorptiegolflengte van 280 nm.
- Bereid bekende concentratiebereiknormen voor door 100 μL 1 mg/ml stamoplossing toe te voegen aan de UV 96-putplaat en serieel te verdunnen met 100 μL gedeïoniseerd water om zes niveaus van bekende concentraties te verkrijgen (1 mg/ml tot 0,03125 mg/ml).
- Breng 100 μL van de eluenten over op UV-heldere 96-putplaten en bepaal de concentratie bij 280 nm met behulp van een microplaatlezer.
- Genereer een kalibratiecurve door de bekende geneesmiddelconcentraties uit te zetten tegen de overeenkomstige absorptiewaarden. Bereken de onbekende geneesmiddelconcentratie in het eluent met behulp van de lineaire vergelijking die wordt gegenereerd door de kalibratiecurve.
- Bepaal de medicijnmassa door de concentratie te vermenigvuldigen met het eluentvolume (~ 1,7 ml).
- Bereken de cumulatieve medicijnafgifte (mg) op een tijdstip door de medicijnafgifte van alle voorgaande tijdspunten op te tellen.
- Normaliseer de medicijnafgifte naar het oppervlak van de strip (3,5 cm 2) om de cumulatieve medicijnafgifte per vierkante centimeter (cm2) van het implantaat te bepalen.
5. Bepaling van de gentamicineconcentratie met behulp van de OPA-etiketteringsmethode 27
- Bereid GS-standaardoplossingen voor om de OPA-test uit te voeren.
- Breng 1 ml van de 80 μg/ml GS-oplossing over in een centrifugebuis.
- Voeg 500 μL PBS toe aan nog eens vijf centrifugebuizen.
- Voer een seriële verdunning uit met deze buizen om GS-concentraties van 80 μg / ml, 40 μg / ml, 20 μg / ml, 10 μg / ml, 5 μg / ml en 2, 5 μg / ml te verkrijgen. Deze dienen als kalibratieoplossingen voor de test.
- Voeg in een heldere plaat met 96 putten 80 μL PBS toe aan put A-1 en 80 μL van de ijkoplossingen aan de putjes A-2 tot en met A-7 in oplopende concentratie. Dit dient als een interne kalibratie voor de test.
- Voeg 80 μL van elk monster toe aan de lege putten in drievoud om te worden geanalyseerd in dezelfde plaat met 96 putten. Beperk het aantal monsters per putplaat tot <50, zodat het tijdstip van het toevoegen van de OPA-oplossing aan de monsters voor alle monsters ongeveer gelijk is en om verdamping te voorkomen.
- Voeg OPA-reagens toe aan alle standaarden en monsteroplossingen.
- Vul in een zuurkast een reagensreservoir van 25 ml met methanol.
- Voeg 8 ml methanol en 1 ml van de bereide OPA-oplossing toe aan een tweede reagensreservoir (rubriek 1.8). Meng de oplossing grondig door op en neer te pipetteren.
- Voeg met een meerkanaals micropipet van 100 μL 48 μL methanol uit het eerste reservoir toe aan alle monsterhoudende putten in de 96-putplaat.
- Voeg na deze stap 72 μl verdunde OPA-oplossing uit het tweede reservoir toe aan alle monsterhoudende putten in de plaat met 96 putten. Incubeer de putplaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Meet de fluorescentie-intensiteit (excitatie van 340 nm, emissie van 455 nm) met behulp van een microplaatlezer onmiddellijk na de incubatie van 10 minuten.
- Zet de kalibratiecurve uit met behulp van de intensiteitsmetingen voor de oplossingen met bekende concentraties GS. Voeg een lineaire lijn toe om de beste pasvorm te bepalen en genereer de bijbehorende vergelijking.
- Bereken de geneesmiddelconcentratie in het eluent aan de hand van de kalibratiecurven die worden gegenereerd door de bekende geneesmiddelconcentraties uit te zetten tegen de overeenkomstige absorptiewaarden.
- Bereken de medicijnmassa door de concentratie te vermenigvuldigen met het eluentvolume (~ 1,7 ml).
- Bepaal de cumulatieve medicijnafgifte (mg) op een tijdstip door de medicijnafgifte van alle voorgaande tijdstippen op te tellen.
- Normaliseer de medicijnafgifte naar het oppervlak van de strip (3,5 cm 2) om de cumulatieve medicijnafgifte per vierkante centimeter (cm2) van het implantaat te bepalen.
6. Bereiding van bacteriën
OPMERKING: De volgende S. aureus-stammen werden in deze studie gebruikt: typestam 12600, klinische stammen L1101 en L1163 (verkregen van Dr. Kerry LaPlante aan de Universiteit van Rhode Island). De gevoeligheidsprofielen van deze stammen zijn weergegeven in tabel 1.
| Bacteriestammen | Gentamicine MIC | Vancomycine MIC | |
| Atcc 12600 | ≤1 μg/ml (gevoelig) | ≤0,5 μg/ml (gevoelig) | |
| L1101 (Klinische stam) | ≥16 μg/ml (resistent) | 8 μg/ml (gemiddeld) | |
| L1163 (Klinische stam) | ≤1 μg/ml (gevoelig) | 8 μg/ml (gemiddeld) | |
Tabel 1: Antibiotische gevoeligheidsprofielen van controle- en klinische S. aureusstammen.
LET OP: Alle stappen met betrekking tot het hanteren van bacterieculturen en suspensies werden uitgevoerd in een BSL-2 laboratoriumruimte binnen een klasse II, Type A2 Biosafety Cabinet.
- Ontdooi de bacterievoorraden vanaf −80 °C op TSA-platen om de groei van S. aureus te vergemakkelijken. Incubeer de platen statisch gedurende een nacht bij 35 °C.
- Breng twee tot drie kolonies van de 's nachts gekweekte agarplaatculturen over in 1 ml steriele TSB en incubeer statisch 's nachts bij 35 °C.
- Breng 100 μL bacteriën over naar een heldere plaat met 96 putten om de troebelheid spectrofotometrisch te meten door de absorptie bij 600 nm te bepalen.
- Verdun de bacteriën 10.000x met steriele MHB voordat u het aantal levensvatbare bacteriën bepaalt met behulp van de luminescerende test.
7. Het uitvoeren van de real-time microbiële levensvatbaarheidstest
- Voer de op luminescentie gebaseerde test uit met behulp van witte ondoorzichtige bodemplaten met 96 putten.
- Meng 100 μl verdunde bacteriële suspensies met 100 μl testreagens bereid in rubriek 1.5.
- Plaats een deksel bedekt met aluminiumfolie over de voorbereide 96-putplaat en incuber gedurende 5 minuten met 100 tpm schudden.
- Meet de luminescentie onmiddellijk met een microplaatlezer met behulp van de volgende instellingen in Gen5 3.11-software.
- Klik op Nieuw om een protocol in te stellen in het venster Taakbeheer .
- Selecteer Costar 96 wit ondoorzichtig in het vervolgkeuzemenu voor Plaattype.
- Klik op Lezen onder het menu Stappen > Acties selecteren .
- Klik op Luminescentie in het venster Leesmethode. Houd de opties Endpoint/kinetic en Luminescence fiber geselecteerd onder respectievelijk leestype en optiektype. Klik op OK.
- Houd de
instellingen in het venster Leesstap (versterking = 135; integratietijd = 1 sec; leeshoogte = 4,5 mm). Klik op OK. - Het plaatindelingsvenster lijkt klaar voor de uitvoering. Vink het vakje Deksel gebruiken in het laadplaatvenster aan en klik op OK.
- Plaats de 96-putplaat in de machine om de luminescentiewaarden af te lezen.
8. Het genereren van een luminescentie versus levensvatbare telling standaardcurve voor elke bacteriestam
OPMERKING: Kweek en inventariseer alle S. aureus-stammen volgens de in rubriek 6 beschreven methode.
- Bereid serieel verdunde bacteriële suspensies voor om als standaard te dienen.
- Inventariseer de 's nachts gekweekte bacteriële suspensie door spectrofotometrisch de troebelheid te meten.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 6.000 × g om de bacteriën te pelleteren en resuspensie van de pellet in steriele MHB om de concentratie aan te passen aan 1 x 109 CFU / ml.
- Verdun 100 μL nette suspensie met 900 μL MHB en voer een 10-voudige seriële verdunning uit om 1 x 101 CFU / ml te bereiken.
- Voer de luminescentietest uit op de bereide bacteriële suspensies zoals beschreven in rubriek 7.
- Gebruik steriele MHB als blanco controle voor het experiment en trek de lege luminescentiewaarde af van de luminescentiewaarden van het testmonster.
- Zet het logboek (CFU) uit tegen het logboek (luminescentie) om een standaardcurve te genereren. Noteer de vergelijking en de R2-waarde .
- Bepaal de CFU/ml die overeenkomt met de luminescentiewaarden met behulp van de spanningsspecifieke vergelijking gedurende het hele onderzoek.
9. Tijdsafhankelijke opzet van antibacteriële activiteitsstudies
Figuur 1: Een schematische weergave van de experimentele opstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Kweek de bacteriën 's nachts in 1 ml TSB-bouillon.
- Verdun de 's nachts gekweekte bacteriële suspensie tot 105 kve/ml in steriele MHB (rubriek 6) en controleer het aantal levensvatbare bacteriën met behulp van de luminescentie-eenheden vóór het begin van het experiment (rubriek 7).
- Plaats de nieuwe UHMWPE- en geneesmiddelgeladen UHMWPE-strips (3 mm x 5 mm x 10 mm, de helft van de afmetingen van de strips die zijn voorbereid voor het elutieonderzoek in rubriek 2) in een spuit van 3 ml.
- Zuig MHB met 10 5 kve/ml in de spuit door de aangesloten naald tot1,5 ml, wat overeenkomt met 1,35 ml MHB (figuur 1: stap 1).
- Plaats de opstelling van de spuit op een schudincubator (100 rpm) bij 37 °C tot de aangegeven tijdstippen van 6 uur, dag 1, dag 2, dag 3, dag 4, dag 5, dag 6 en dag 7 (figuur 1: stap 2).
- Haal op elk aangegeven tijdstip de opstelling van de spuit eruit en voer een real-time microbiële levensvatbaarheidstest uit volgens rubriek 7 op 100 μL bacteriële suspensie (figuur 1: Stap 3-4).
- Bepaal het aantal levensvatbare bacteriën voor de 6 uur, dag 1, dag 2, dag 3 en dag 7. Bepaal de CFU/ml uit de luminescentie-eenheden met behulp van de overeenkomstige standaardcurve.
- Controleer de afwezigheid van levensvatbare bacteriën in de monsters die luminescentiewaarden onder de detectiegrens vertoonden door de spreidplaatsmethode op TSA-platen uit te voeren en 's nachts bij 35 °C te broeden. Controleer de volgende dag op de aanwezigheid van kolonies.
- Centrifugeer de resterende bacteriële suspensie gedurende 10.000 × g gedurende 10 minuten en zuig de gebruikte media voorzichtig op. Voor buizen waarin pellets niet visueel worden waargenomen vanwege de antibacteriële activiteit van de geneesmiddelen, laat u 100 μL in de buis om ervoor te zorgen dat de onzichtbare pellet niet wordt verstoord (figuur 1: stap 5).
- Resuspendien de gepelletiseerde bacteriën in verse MHB en trek de bacteriële suspensie terug in dezelfde spuitopstelling via de aangehechte naald (figuur 1: stap 6).
10. Kwantificering van aanhangende bacteriën op het UHMWPE-oppervlak
- Haal virgin UHMWPE en geneesmiddelgeladen UHMWPE-oppervlakken op uit de spuitopstelling na de voltooiing van het onderzoek op dag 7.
- Breng de oppervlakken over in buisjes van 1,5 ml en spoel af met 1 ml steriele PBS (drie keer).
- Soniceer het oppervlak gedurende 40 minuten in 1 ml steriele PBS. Bepaal de levensvatbaarheid van adherente bacteriën door een luminescentietest uit te voeren op 100 μL van het gesonificeerde monster, zoals beschreven in rubriek 7.
Representative Results
Volgens het protocol werd UHMWPE gegoten met gentamicine en vancomycine bij 7% w / w en geëlueerd in gedeïoniseerd water. De geneesmiddelconcentratie in het eluent uit het materiaal werd bepaald na 6 uur, 1 dag, 2 dagen, 3 dagen en 1 week. De geneesmiddelafgifte van vancomycine en gentamicine-geladen UHMWPE toonde een burst-afgifte na 6 uur, gevolgd door een gestage afgiftesnelheid met een afgifteconcentratie groter dan de minimale remmende concentratie (MIC) tot 7 dagen (figuur 2, tabel 2).
Voorafgaand aan de antibacteriële studie werd een standaardcurve gegenereerd om de luminescentie-eenheden te correleren met de CFU / ml van de bacteriën voor elke S. aureus-stam (ATCC 12600, L1101 en L1163). De overeenkomstige log (luminescentie) waarden werden uitgezet tegen de log (CFU/ml) om een standaardcurve te genereren (figuur 3). De berekende R2-waarden waren 0,997, 0,996 en 0,994 voor respectievelijk ATCC 12600, L1101 en L1163, wat wijst op een sterke pasvorm voor het concentratiebereik. De afgeleide vergelijking werd vervolgens gebruikt om de bacteriële levensvatbaarheid van alle experimenten te berekenen. ATCC 12600 en L1101 toonden een detectiegrens binnen een bereik van 1 x 102-1 x 103 CFU / ml. Aan de andere kant bleek de detectiegrens voor de L1163-stam 1 x 104 CFU / ml te zijn.
De tijdsafhankelijke antibacteriële activiteitstest werd uitgevoerd met behulp van 1 x 105 CFU / ml als het startentmateriaal voor 12600, L1163 en L1101, die gedurende een periode van 1 week werden blootgesteld aan 7% w / w medicijn-eluterende materialen. Op elk tijdstip (6 uur, 1 dag, 2 dagen, 3 dagen, 1 week) werd het medium ververst en werd de bacteriepopulatie opnieuw gesuspendeerd. De blootstelling van de bacteriën aan de daaropvolgende afgifte van geneesmiddelen uit het materiaal werd voortgezet tot het volgende tijdstip. UHMWPE met 7% m/m vancomycine en UHMWPE met 7% m/w gentamycine toonden >3log reductie voor gevoelige ATCC 12600 vanaf 6 uur, en volledige uitroeiing (geen koloniegroei) werd waargenomen aan het einde van 3 dagen (figuur 4A). Voor de gentamicine-gevoelige en vancomycine-intermediaire stam L1163 veroorzaakten beide geneesmiddel-eluterende materialen >3log reductie na 6 uur, en volledige uitroeiing (geen koloniegroei) werd waargenomen op dag 1 van het experiment (figuur 4B). Voor de gentamicineresistente en vancomycine-intermediaire stam L1101 had gentamicine-elutie van UHMWPE geen invloed op de bacteriële levensvatbaarheid van L1101 (figuur 4C). De bacteriën vermenigvuldigden zich en de populatie stabiliseerde binnen 6 uur in de aanwezigheid van virgin UHMWPE zonder antibiotica-elutie. In aanwezigheid van gentamicine-eluting UHMWPE bereikte de populatie op dag 2 een vergelijkbaar groeiniveau. Integendeel, vancomycine-elutie uit UHMWPE verminderde de bacteriële levensvatbaarheid (>3log) significant na 6 uur, en volledig levensvatbaarheidsverlies (geen koloniegroei) werd aangetoond op dag 4.
De oppervlakken van zowel gentamicine-eluting als vancomycine-eluting UHMWPE vertoonden geen levensvatbare adherente bacteriën bij blootstelling aan gevoelige en intermediaire resistente stammen na dag 7 of volledige uitroeiing, afhankelijk van wat zich het eerst voordeed. Sommige levensvatbare bacteriën (1 x 105 CFU / ml) waren aanwezig op gentamicine-eluting UHMWPE blootgesteld aan gentamicine-resistente L1101. Evenzo werd ongeveer 1 x 10 5 CFU / ml levensvatbare adherente bacteriën teruggevonden uit de controle maagdelijke PE (figuur 5).
Figuur 2: Tijdsafhankelijke gemiddelde antibioticaafgifte van 7% m/w antibiotica-geladen UHMWPE-strip. De gemiddelde antibioticaafgifte tussen tijdspunten van één 7% w / w gentamicine en vancomycine-geladen UHMWPE-strip (3 mm 3 x 5 mm 3 x 10 mm3 ~ 2 cm 2 oppervlak). De MIC tegen controlestam ATCC 12600 wordt weergegeven als een stippellijn voor gentamicine en een ononderbroken lijn voor vancomycine. De foutbalken vertegenwoordigen de standaardafwijking van het gemiddelde van zes replicaten (n = 6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Real-time luminescerende assay standaardcurve voor alle S. aureus stammen. Log (luminescentie) werd uitgezet tegen log (CFU/ml) om standaardcurven te genereren voor controle, (A) ATCC 12600, en klinische stammen, (B) L1101 en (C) L1163. De vergelijkingen die de lijn van de beste pasvorm en de bijbehorende R2-waarden beschrijven, worden op de waarnemingspunten aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Bacteriële levensvatbaarheid bepaald met behulp van een luminescerende assay voor 7% w/w gentamicine-eluting en 7% w/w vancomycine-eluting UHMWPE. De tijdsafhankelijke antibacteriële activiteit van gentamicine en vancomycine geëlueerd uit UHMWPE tegen controlestammen, (A) ATCC 12600, en klinische stammen, (B) L1163 en (C) L1101, worden getoond. Virgin 1020 PE diende als controle voor het experiment. De gele lijn in de waarnemingspunten geeft de detectiegrens voor de respectieve S. aureus-stam aan. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardafwijking (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: De levensvatbaarheid van adherente bacteriën bepaald met behulp van de luminescerende test Glo-assay voor 7% w/w gentamicine-eluting en 7% w/w vancomycine-eluting UHMWPE tegen alle S. aureus-stammen. Het staafdiagram geeft aan dat adherente bacteriën (CFU) worden teruggevonden per vierkante centimeter (cm2) van 7% gentamicine-geladen en 7% vancomycine-geladen UHMWPE aan het einde van de onderzoeksperiode voor alle geteste stammen. De balken tonen gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Tijdstippen | Vancomycine | Gentamicine |
| Piekconcentratie (μg/ml) | Piekconcentratie (μg/ml) | |
| 0 - 6 uur | 336 ± 72 | 263 ± 24 |
| 6 h -1 dag | 57 ± 18 | 16 ± 2 |
| 1 dag - 2 dagen | 60 ± 18 | 7 ± 1 |
| 2 dagen - 3 dagen | 23 ± 6 | 5 ± 0,4 |
| 3 dagen - 7 dagen | 49 ± 20 | 15 ± 1 |
Tabel 2: Piekconcentratie van het geneesmiddel (μg/ml) op verschillende tijdstippen. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (n = 6).
Aanvullende figuur 2: Verval van het luminescentiesignaal gedurende een periode van 10 minuten vanaf de toevoeging van testreagens aan het monster. Een verschil van ±5% in het signaal wordt weergegeven als een stippellijn Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De gelokaliseerde aanhoudende toediening van antibiotica is een noodzakelijk hulpmiddel bij het beheer van periprothetische gewrichtsinfecties. Systemische antibiotica zijn de primaire strategie bij het uitroeien van bacteriële infecties en de lokale elutie wordt gebruikt als een aanvullend hulpmiddel om de groei en kolonisatie van bacteriën die overblijven na de verwijdering van het implantaat en debridement van het weefsel te voorkomen. Het doel voor het effectieve gebied onder de curve (concentratie over een periode) voor antibiotica met lokale toediening is niet goed begrepen. De elutie van antibiotica uit dergelijke apparaten kan in vitro longitudinaal worden gekwantificeerd; Om de translatiewaarde van deze concentratieprofielen te bepalen, is echter een robuuste in vitro methode nodig om antibacteriële activiteit te beoordelen. In dit artikel wordt een dergelijke real-time methode beschreven om de antibacteriële activiteit van geneesmiddel-eluterende UHMWPE te bepalen om te worden gebruikt als een langdurig toedieningsapparaat in gewrichtsvervangingen.
De real-time monitoring van bacteriële levensvatbaarheid is een cruciale parameter van belang, en conventionele microbiologische methoden missen het kader om dit specifieke aspect van de studie te accommoderen. De microbiële levensvatbaarheidstest die in deze studie werd gebruikt, werd ontwikkeld voor de kwantificering van levensvatbare bacteriën door de luminescentie te meten die overeenkomt met adenosinetrifosfaat (ATP). Om direct de tijdsafhankelijke activiteit van de antibiotica uit de implantaatmaterialen te onderzoeken, werden drie verschillende stammen met verschillende antibioticagevoeligheidsprofielen ermee geïncubeerd. De reden voor het gebruik van laboratorium- en klinische stammen met verschillende resistenties tegen gentamicine en vancomycine was om het bereik van de activiteit voor een bepaalde implantaatformulering te begrijpen. Verder zijn de antibacteriële activiteit en werkzaamheid tegen deze verschillende populaties afhankelijk van de timing van toediening. De methode richt zich op de haalbaarheid van profylaxe tegen deze stammen op basis van >70% van de periprothetische gewrichtsinfecties die worden veroorzaakt door de besmetting van de wond op het moment van de operatie24.
Als startend entmateriaal om deze methode te ontwikkelen werd 1 x 105 CFU/ml gebruikt. Verschillende verontreinigende concentraties zijn gebruikt voor diermodellen, hoewel er niet veel bekend is over de klinisch relevante infectiebelasting voor PJI. Dierinfectiemodellen voor PJI zijn routinematig vastgesteld met behulp van 1 x 105 CFU, en een vergelijkbaar bereik wordt veel gebruikt in gestandaardiseerde methoden (CLSI) om antibacteriële activiteitte bepalen 25,26,27. Met behulp van 1 x 105 CFU / ml als een initiële verontreinigende concentratie konden we zowel de groei- als de uitroeiingsparameters tegelijkertijd evalueren.
Conventioneel worden MIC-waarden bepaald voor een constante antibioticaconcentratie voor een specifiek aantal bacteriën en ze kunnen de snelheid van antibacteriële werking niet aantonen. Vanwege dit aspect bieden MIC-waarden geen kwantitatieve differentiatie om het antimicrobiële activiteitsprofielte beschrijven 28. De gegevens van de huidige methode benadrukken het voordeel van het evalueren van de stamafhankelijke dodingskinetiek van antibiotica in plaats van het gebruik van de MIC om doseringsbeslissingen te nemen. Met behulp van deze methode was het mogelijk om zowel de mate als de snelheid waarmee de implantaatmaterialen de verschillende stammen beïnvloedden, te onderscheiden. Gentamicine geëlueerd uit de materiaalstrips van het implantaat was effectief in het uitroeien van L1163 in 1 dag en het uitroeien van ATCC 12600 in 2-3 dagen, maar het was niet effectief in het uitroeien van L1101 (figuur 4). Naast het verwachte gebrek aan activiteit van gentamicine-elutie tegen L1101 (MIC >32 μg/ml) vanwege de inherente gentamicineresistentie (figuur 4C), werd de persistentie van subpopulaties waargenomen bij blootstelling aan vancomycine, waarvoor L1101 intermediaire resistentie vertoont. L1163 daarentegen werd definitief uitgeroeid in aanwezigheid van vancomycine-eluting UHMWPE ondanks het vertonen van vergelijkbare intermediaire resistentie tegen vancomycine als L1101 (een MIC van 8 μg / ml is waargenomen voor beide stammen).
De waarnemingen dat de activiteitssnelheid van gentamicine tegen 12600 en L1163, die gentamicinegevoelig zijn met vergelijkbare MIC-waarden (een MIC van 1μg/ml is waargenomen voor beide stammen), verschillend was, evenals dat de mate van activiteit van vancomycine tegen intermediair resistent L1101 en L1163 verschillend was (figuur 4A,B), ondersteunde de hypothese dat deze real-time methode in aanwezigheid van het eluerende materiaal longitudinale verschillen in de activiteit zou kunnen onderscheiden.
Naast de translationele waarde van de resultaten bij het interpreteren van hoe effectief een bepaalde geëlueerde concentratie kan zijn tegen deze bacteriën, zijn er verschillende experimentele methodologische voordelen. (1) De bacteriële concentratie wordt onmiddellijk op een bepaald tijdstip bepaald, in tegenstelling tot conventionele methoden waarbij de bacteriën gedurende 18-24 uur in bouillon of op agar worden geïncubeerd om de levensvatbaarheid te bepalen. Deze periode van groei kan de bacteriën extra tijd geven om te herstellen van antibioticastress, waardoor een extra mogelijke bron van fouten / variabiliteit wordt geïntroduceerd. (2) De media worden voortdurend vervangen met behoud van de bacteriën, die meer lijken op in vivo omstandigheden dan op statische omstandigheden. (3) Deze test omvat inherent de kinetiek van de geneesmiddelafgifte van het implantaat, wat een betere prestatievoorspelling mogelijk maakt. (4) De methode is ontwikkeld met behulp van algemeen verkrijgbare verbruiksartikelen zonder dat er specifieke of dure machines nodig zijn.
Robuuste in vitro testmethoden om toepassingen voor medicijnafgifte te evalueren zijn noodzakelijk voordat wordt overgegaan tot in vivo dierstudies en klinische proeven. Deze test kan worden aangepast en aangepast aan verschillende benaderingen en platforms voor medicijnafgifte, zoals deeltjes, gels, films en andere materialen voor het eluteren van geneesmiddelen om de efficiëntie van bacteriële uitroeiing in een gesimuleerde in vitro opstelling te bepalen. Modificaties kunnen worden uitgevoerd voor de monsteropstelling door over te schakelen naar een geschikte in vitro mediumomgeving, waarvan is aangetoond dat deze de activiteit van verschillende antibiotica beïnvloedt29,30.
De methode vergemakkelijkt ook de bepaling van levensvatbare adherente bacteriën, wat veelbelovend is, omdat conventionele methoden om de minimale biofilmuitroeiingsconcentratie te bepalen tijdrovend zijn en inconsistente resultaten opleveren. De methode moet echter grondig worden getest op biofilms om een betrouwbare en robuuste methodologie te ontwikkelen om de gevoeligheid ervan te bepalen. De op ATP gebaseerde luminescerende methode zou gevoelig genoeg kunnen zijn om levensvatbare vormen van bacteriën in biofilms te detecteren, waaronder persisters, die al dan niet op een agarplaat als zichtbare kolonies kunnen worden gedetecteerd. Alles bij elkaar heeft dit veelzijdige platform het potentieel om relevante parameters op te nemen om real-time observaties vast te leggen op de antibacteriële en anti-biofilmactiviteit van geneesmiddelen van belang.
De effectiviteit van deze methode wordt bepaald door de volgende aspecten:
Vooraf bepaalde elutiekenmerken en monstergrootte
Het elutieprofiel van het antibioticum-eluterende materiaal kan voorafgaand aan deze antibacteriële activiteitsmeting in een afzonderlijk experiment worden geïdentificeerd, zodat de hoeveelheid materiaal die nodig is om het experiment binnen een bepaalde tijd actief uit te voeren, kan worden bepaald.
Container- en volumebepaling
Het is belangrijk om een opstelling te bedenken waarin het mediavolume van het experiment het volledige oppervlak van hetzelfde materiaal kan herbergen en om voldoende volume te garanderen voor de onbelemmerde afgifte van het medicijn van het met drugs beladen oppervlak. De gebruikte opstelling was gebaseerd op eerdere experimenten en zorgde voor "perfecte zink" -omstandigheden voor deze hydrofiele geneesmiddelen, zodat hun diffusie niet wordt belemmerd door oplosbaarheidsbeperkingen.
Kenmerken van groeimedia
De selectie van groeimedia moet worden onderzocht om de stabiliteit en de optimale prestaties van het (de) geselecteerde geneesmiddel(en)29 te waarborgen. Kation-adjusted Mueller Hinton bouillon (CAMHB), die veel wordt gebruikt in de bouillonverdunningsmethode, werd gebruikt om de MIC van bekende antibiotica te bepalen. Het medium maakt optimale geneesmiddelactiviteit mogelijk zonder de interferentie van toxische accumulatie van secundaire metabolieten31. Het testreagens is getest en stabiel gerapporteerd in verschillende soorten media, waaronder die met serumcomponenten23,28. Hoewel de relatieve luminescentie-eenheidswaarden kunnen variëren tussen verschillende media, is aangetoond dat de componenten van de media niet interfereren met de test32,33. Het experimentele volume werd verder geoptimaliseerd tot 1,5 ml, wat dicht bij het synoviale vloeistofvolume ligt dat aanwezig is in een volwassen kniegewrichtsruimte34.
Temperatuurstabiliteit voor de test
De hantering en toevoeging van het luminescerende reagens aan de bepaling moeten in alle experimenten op consistente wijze worden uitgevoerd. Temperatuurveranderingen veranderen de gevoeligheid van de test, dus het is belangrijk om het reagens gedurende 2 uur bij kamertemperatuur te incuberen voordat het aan de bacteriën wordt toegevoegd23.
Reagensincubatietijd
De luminescentie van het reagens vervalt met de tijd. Het luminescerende signaal heeft een halfwaardetijd van meer dan 30 min, die grotendeels afhankelijk is van het medium en het type bacterie dat in het experiment wordt gebruikt23. Bovendien zullen eventuele verschillen in incubatietijd (d.w.z. de tijd tussen het toevoegen van het reagens aan de bacteriën en het aflezen van de luminescentie) resulteren in inconsistente metingen voor dezelfde concentratie bacteriën. Een verschil van 5% werd waargenomen in het luminescerende signaal wanneer het werd genomen binnen 1 minuut na de incubatietijd van 5 minuten volgens de instructies van de fabrikant (aanvullende figuur 2). Rekening houdend met deze gegevens, werden de luminescentiemetingen binnen 1 minuut gedurende het onderzoek geregistreerd om ervoor te zorgen dat het signaalverlies niet meer dan 5% was. Verder is het belangrijk om het aantal monsters per plaat te beperken om de fout te verminderen die wordt geïntroduceerd als gevolg van luminescentieverval van de eerste put tot de laatste put.
Onderhoud van de bacteriepopulatie gedurende het hele onderzoek
De methode probeerde de geneesmiddelklaring en synoviale volumeomzet te modelleren door de gebruikte media op elk tijdstip voortdurend te scheiden van de bacteriële populatie met behulp van snelle centrifugatie bij 10.000 x g gedurende 10 min35. Deze kritische stap zorgt voor de sedimentatie van alle levensvatbare en niet-levensvatbare bacteriële cellen. Verder worden de gesedimenteerde bacteriën uniform gereconstitueerd in verse MHB en overgebracht naar de spuitopstelling, waardoor de volledige overdracht van de aangetaste microbiële populatie naar de experimentele opstelling wordt vergemakkelijkt. De reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van deze methode zijn sterk afhankelijk van het simuleren van de aanhoudende blootstelling van antibiotica aan de microbiële populatie afkomstig van het initiële entmateriaal.
Een belangrijke beperking van deze methode is dat het een semi-statische test is die de halfwaardetijden van geneesmiddelen en continue synoviale omzet niet nauwkeurig simuleert. Voortdurende mediumvervanging compenseert deze beperking echter gedeeltelijk. De gevoeligheid van de microbiële levensvatbaarheidstest was stamafhankelijk, variërend van 1 x 102-1 x10 4 CFU / ml, wat het detectievermogen beperkt. Bovendien moet voor elk organisme een standaardcurve worden uitgezet, aangezien het stamtype bijdraagt aan de gevoeligheid en prestaties van het luminescerende reagens. Zowel de groeidynamiek van de bacteriën als de activiteit van de gebruikte geneesmiddelverbinding kunnen worden beïnvloed door de mediumcomponenten, die verder moeten worden onderzocht.
Disclosures
De senior auteur (E.O.) ontvangt royalty's afkomstig van de licentieverlening van intellectueel eigendom aan de volgende bedrijven: Corin, Iconacy, Renovis, Arthrex, ConforMIS, Meril Healthcare, Exactech. Er is geen belangenconflict met een van de hier gepresenteerde studies.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door National Institutes of Health Grant No. AR077023 (R01) en door het Harris Orthopaedic Laboratory. De auteurs bedanken Dr. Kerry Laplante en haar team aan de Universiteit van Rhode Island voor het leveren van de klinische stammen L1101 en L1163.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plates - polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs | Corning, NY, USA | CLS3922-100EA | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich, Germany | ||
| ATCC 12600 | American Type culture Collection, VA, USA | ||
| BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay | Promega Corporation, USA | G8231 | |
| BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) | Becton-Dickinson, USA | BD 211825 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL | BD, USA | 309657 | |
| BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G | BD, USA | 305122 | |
| BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton-Dickinson, USA | B12322 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) | Becton-Dickinson, USA | DF0369-17-6 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| Boric Acid | Fisher Chemical, NJ, USA | ||
| Branson 1800 ultrasonic bath | Emerson, MO, USA | ||
| Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid | Fisher Scientific, USA | 08-757-100D | |
| Gentamicin Sulfate | Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China | ||
| Greiner UV-Star 96 well plates | Sigma Aldrich, Germany | M3812-40EA | |
| Hydraulic press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| L1101 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| L1163 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| LSE benchtop shaking incubator | Corning, NY, USA | ||
| Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical | Fisher Scientific, NJ, USA | A454-1 | |
| Napco CO2 6000 | Thermo Scientific, MA, USA | ||
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents | Fisher Scientific, USA | BP24384 | |
| Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) | Sigma Aldrich, Germany | P1378-5g | |
| Plate reader (Synergy H1 | Biotek, VT, USA | ||
| press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| shaker Innova 2100 | New Brunswick Scientific, NJ, USA | ||
| ShopBot D2418 | ShopBot Tools, Inc., NC, USA | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich, Germany | ||
| Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water | Fisher Scientific, USA | 23-751628 | |
| UHMWPE | GUR1020, Celanese, TX, USA | ||
| Vancomycin Hydrochloride | Fagron, The Netherlands | 804148 | |
| WAB Turbula | WAB Turbula, Switzerland |
References
- Hunter, D. J., March, L., Chew, M. Osteoarthritis in 2020 and beyond: A Lancet Commission. Lancet. 396 (10264), 1711-1712 (2020).
- Sloan, M., Premkumar, A., Sheth, N. P. Projected volume of primary total joint arthroplasty in the U.S., 2014 to 2030. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 100 (17), 1455-1460 (2018).
- Gao, J., Xing, D., Dong, S., Lin, J. The primary total knee arthroplasty: A global analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 190 (2020).
- UpToDate. Prosthetic joint infection: Treatment. , Available from: https://www.uptodate.com/contents/prosthetic-joint-infection-treatment (2022).
- Dapunt, U., Radzuweit-Mihaljevic, S., Lehner, B., Haensch, G. M., Ewerbeck, V. Bacterial infection and implant loosening in hip and knee arthroplasty: Evaluation of 209 cases. Materials. 9 (11), 871 (2016).
- Kamath, A. F., et al. Quantifying the burden of revision total joint arthroplasty for periprosthetic infection. The Journal of Arthroplasty. 30 (9), 1492-1497 (2015).
- Tande, A. J., Patel, R.
- Davidson, D. J., Spratt, D., Liddle, A. D. Implant materials and prosthetic joint infection: The battle with the biofilm. EFORT Open Reviews. 4 (11), 633-639 (2019).
- de Vor, L., Rooijakkers, S. H. M., van Strijp, J. A. G. Staphylococci evade the innate immune response by disarming neutrophils and forming biofilms. FEBS Letters. 594 (16), 2556-2569 (2020).
- Dapunt, U., Giese, T., Stegmaier, S., Moghaddam, A., Hänsch, G. M. The osteoblast as an inflammatory cell: Production of cytokines in response to bacteria and components of bacterial biofilms. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 243 (2016).
- González, J. F., Hahn, M. M., Gunn, J. S. Chronic biofilm-based infections: Skewing of the immune response. Pathogens and Disease. 76 (3), 023 (2018).
- Dapunt, U., Giese, T., Prior, B., Gaida, M. M., Hänsch, G. M. Infectious versus non-infectious loosening of implants: activation of T lymphocytes differentiates between the two entities. International Orthopaedics. 38 (6), 1291-1296 (2014).
- Tai, D. B. G., Patel, R., Abdel, M. P., Berbari, E. F., Tande, A. J. Microbiology of hip and knee periprosthetic joint infections: A database study. Clinical Microbiology and Infection. 28 (2), 255-259 (2022).
- Foster, T. J. Antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Current status and future prospects. FEMS Microbiology Reviews. 41 (3), 430-449 (2017).
- Kranjec, C., et al. Staphylococcal biofilms: challenges and novel therapeutic perspectives. Antibiotics. 10 (2), 131 (2021).
- Kahl, B. C., Becker, K., Löffler, B. Clinical significance and pathogenesis of staphylococcal small colony variants in persistent infections. Clinical Microbiology Reviews. 29 (2), 401-427 (2016).
- Li, C., Renz, N., Trampuz, A.
- Davis, J. S., et al. Predictors of treatment success after periprosthetic joint infection: 24-month follow up from a multicenter prospective observational cohort study of 653 patients. Open Forum Infectious Diseases. 9 (3), (2022).
- Suhardi, V. J., et al. A fully functional drug-eluting joint implant. Nature Biomedical Engineering. 1, 0080 (2017).
- Gil, D., Grindy, S., Muratoglu, O., Bedair, H., Oral, E. Antimicrobial effect of anesthetic-eluting ultra-high molecular weight polyethylene for post-arthroplasty antibacterial prophylaxis. Journal of Orthopaedic Research. 37 (4), 981-990 (2019).
- Robu, A., et al. Additives imparting antimicrobial properties to acrylic bone cements. Materials. 14 (22), 7031 (2021).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- BacTiter-Glo microbial cell viability assay instructions for use of products G8230, G8231, G8232 and G8233. <101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol. Promega Corporation. , Available from: https://www.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol/ (2022).
- Izakovicova, P., Borens, O., Trampuz, A. Periprosthetic joint infection: Current concepts and outlook. EFORT Open Reviews. 4 (7), 482-494 (2019).
- López-Torres, I. I., Sanz-Ruíz, P., Navarro-García, F., León-Román, V. E., Vaquero-Martín, J. Experimental reproduction of periprosthetic joint infection: Developing a representative animal model. The Knee. 27 (3), 1106-1112 (2020).
- Carli, A. v, et al. Quantification of peri-implant bacterial load and in vivo biofilm formation in an innovative, clinically representative mouse model of periprosthetic joint infection. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 99 (6), 25 (2017).
- Humphries, R. M., et al. CLSI Methods Development and Standardization Working Group best practices for evaluation of antimicrobial susceptibility tests. Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), 01934 (2018).
- Mueller, M., de la Peña, A., Derendorf, H. Issues in pharmacokinetics and pharmacodynamics of anti-infective agents: Kill curves versus MIC. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (2), 369-377 (2004).
- Wijesinghe, G., et al. Influence of laboratory culture media on in vitro growth, adhesion, and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Medical Principles and Practice. 28 (1), 28-35 (2019).
- Steixner, S. J. M., et al. Influence of nutrient media compared to human synovial fluid on the antibiotic susceptibility and biofilm gene expression of coagulase-negative Staphylococci In vitro. Antibiotics. 10 (7), 790 (2021).
- Sigma Aldrich. Mueller Hinton Broth (M-H Broth). Sigma Aldrich. , 70192 (2018).
- Thiriard, A., Raze, D., Locht, C. Development and standardization of a high-throughput Bordetella pertussis growth-inhibition assay. Frontiers in Microbiology. 11, 777 (2020).
- Clow, F., O'Hanlon, C. J., Christodoulides, M., Radcliff, F. J. Feasibility of using a luminescence-based method to determine serum bactericidal activity against Neisseria gonorrhoeae. Vaccines. 7 (4), 191 (2019).
- Kraus, V. B., Stabler, T. v, Kong, S. Y., Varju, G., McDaniel, G. Measurement of synovial fluid volume using urea. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (10), 1217-1220 (2007).
- Gonçalves, F. D. A., de Carvalho, C. C. C. R. Phenotypic modifications in Staphylococcus aureus cells exposed to high concentrations of vancomycin and teicoplanin. Frontiers in Microbiology. 7, 13 (2016).
