Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a eficácia antibacteriana de um polímero eluidor de antibióticos para simular aplicação clínica profilática usando um ensaio de viabilidade microbiana luminescente baseado em ATP disponível comercialmente em tempo real. Esse método permite o monitoramento da atividade longitudinal de materiais farmacológicos e pode ser amplamente adaptado para testar plataformas de liberação de fármacos antimicrobianos.
Abstract
O polietileno de ultra-alto peso molecular (UHMWPE) é amplamente utilizado em artroplastias totais de articulações como superfície de suporte de carga. As infecções articulares periprotéticas, a maioria das quais ocorre logo após a substituição articular, constituem quase 25% do total de cirurgias de revisão do joelho, e a erradicação completa da infecção bacteriana representa um grande desafio. Uma maneira promissora de enfrentar esse problema é garantir a entrega local sustentada de concentrações de antibióticos suficientes para inibir as bactérias para apoiar a profilaxia antibiótica sistêmica de rotina. Há um aumento da pesquisa para o desenvolvimento de dispositivos locais eficientes de liberação de fármacos. Embora métodos de teste antibacterianos estabelecidos para drogas possam ser usados para testar a eficácia antibacteriana de materiais farmacológicos, eles são insuficientes em termos de fornecer dados de eficácia antibacteriana em tempo real e longitudinais que possam ser correlacionados com os perfis de eluição de antibióticos desses dispositivos. Aqui, relatamos uma metodologia direta e versátil para determinar a eficácia antibacteriana de implantes UHMWPE eluidores de antibióticos. Esta metodologia pode ser usada como uma plataforma para evitar a cultura bacteriana em cada ponto de tempo de um longo experimento e também pode ser adaptada a outros dispositivos locais de liberação de drogas.
Introduction
A osteoartrite é uma importante condição degenerativa que acomete 500 milhões de adultos em todo o mundo1. O padrão-ouro no tratamento da artrite terminal é a substituição total articular, que deve ser realizada em mais de 2 milhões de pacientes anualmente somente nos Estados Unidos até 20302, com a demanda mundial também aumentando enormemente 3,4. O procedimento envolve a substituição das superfícies cartilaginosas articuladas das juntas por materiais sintéticos de suporte de carga feitos de metal/cerâmica e polietileno de ultra-alto peso molecular reticulado (UHMWPE). As substituições articulares totais melhoram significativamente a qualidade de vida dos pacientes com artrite5, mas uma complicação significativa que coloca em risco o desempenho dos implantes e a satisfação dos pacientes é a infecção articular periprotética (INJ), responsável por 15%-25% das cirurgias derevisão6. Acredita-se que a causa da infecção, na maioria dos casos, seja a contaminação microbiana do local do implante durante a cirurgia7. A população contaminante então se expande sobre as superfícies do implante e dos tecidos8. O sistema imune do hospedeiro é acionado em resposta, mas a taxa de crescimento e a formação de biofilme dos organismos contaminantes podem permitir que eles escapem das células imunes, o que pode levar a uma maior tempestade de citocinas e quimiocinas sem a erradicação da bactéria 9,10,11. A infecção profunda resultante do osso compromete a fixação e o desempenho do implante, bem como a saúde do paciente12.
Staphylococcus aureus e estafilococos coagulase-negativos são os organismos causadores predominantes da PJI13. A gravidade das infecções estafilocócicas é alta devido à sua maior resistência aos antibióticos, formação de biofilme e capacidade de persistir como pequenas variantes de colônias14,15,16. As infecções associadas ao implante ocorrem devido à adesão de microrganismos na superfície do implante e ao estabelecimento de uma complexa matriz de biofilme que permite às bactérias escapar de fatores imunes deletérios do hospedeiro e concentrações efetivas de antibióticos14,15,16. Os métodos convencionais de tratamento incluem combinações de antibióticos intravenosos e orais por período prolongado17. Uma das principais desvantagens dessa abordagem é a baixa biodisponibilidade do fármaco no local da infecção e a dificuldade de se obter concentrações suficientes de antibióticos para erradicar a bactéria de forma consistente ao longo do período de tratamento, o que muitas vezes resulta em desfechos desfavoráveis18. Para resolver essas deficiências, um implante UHMWPE totalmente funcional e farmacológico foi projetado para garantir uma liberação sustentada de concentrações eficazes de antibióticos no espaço articular19. A eluição local do implante farmacológico é utilizada como ferramenta complementar para prevenir o crescimento e a colonização de quaisquer bactérias remanescentes após a remoção do implante e desbridamento do tecido. O teste antibacteriano in vitro desse UHMWPE eluidor de antibiótico pode ser realizado incubando-se o material diretamente com as bactérias e quantificando-as pelo método de placa de espalhamento20,21. Alternativamente, alíquotas de meios eluentes podem ser testadas contra bactérias usando métodos como o método de difusão em disco de ágar, métodos de diluição em caldo e teste de morte por tempo22. Todos esses métodos baseiam-se na observação do crescimento cerca de 16-18 h após a coleta das alíquotas por meio da contagem de colônias e medidas de turbidez. A eluição de antibióticos a partir desses dispositivos pode ser quantificada longitudinalmente usando esses métodos in vitro; No entanto, para determinar o valor translacional desses perfis de concentração, é necessário um método robusto in vitro em tempo real para avaliar a atividade antibacteriana.
O ensaio de viabilidade microbiana utilizado neste estudo foi desenvolvido para a quantificação de bactérias viáveis através da medição da luminescência correspondente ao trifosfato de adenosina (ATP) liberado de uma célula bacteriana viva usando a tecnologia de detecção baseada em luciferina-luciferase. ATP, como a moeda de energia das células vivas, serve como um indicador direto de células fisiologicamente viáveis. O reagente realiza a lise celular, que libera moléculas de ATP de células viáveis que são então detectadas na forma de luminescência. Essa luminescência tem correlação direta com a proporção de células bacterianas viáveis dentro da amostra23. Este é um ensaio em tempo real, simples, versátil, rápido e baseado em reagente único que pode ser adaptado em uma variedade de projetos e condições de ensaio com microrganismos gram-positivos e gram-negativos. Aqui relatamos um método para determinar a atividade antibacteriana em tempo real de UHMWPE com eluição de antibiótico incubado com cepas laboratoriais e clínicas de S. aureus usando um ensaio de morte por tempo modificado baseado no ensaio de viabilidade microbiana (por exemplo, BacTiter Glo). Embora a metodologia seja descrita com um material de implante específico e uma aplicação ortopédica específica, o método pode fornecer uma plataforma para testar outros dispositivos de liberação com eluição de antibióticos com aplicações clínicas.
Protocol
1. Preparação dos reagentes
- Preparação do caldo Mueller-Hinton (MHB): Dissolver 22 g de MHB ajustado para cátions em 1 L de água deionizada. Autoclave o meio a 121 °C e pressão de 15 lb por 20 min, certificando-se de que o frasco esteja frouxamente tampado. Conservar o caldo estéril preparado a 4 °C até à utilização.
- Preparação de ágar tríptico de soja (TSA): Dissolver 20 g de pó de TSA em 500 mL de água deionizada. Autoclave a mistura de ágar a 121 °C e 15 lb por 20 min. Transfira o meio estéril para banho-maria a 55 °C para baixar a temperatura do ágar fundido. Despeje o ágar preparado resfriado em placas de Petri estéreis (~15 mL) e deixe solidificar. Armazene as placas de ágar solidificadas invertidas para evitar condensação.
- Preparação do caldo de soja tríptico (TSB): Dissolver 15 g de pó de TSB em 500 mL de água deionizada. Autoclave a mistura de caldo a 121 °C e 15 lb por 20 min. Conservar o caldo estéril preparado a 4 °C até à utilização.
- Solução salina tamponada com fosfato (PBS): Autoclave comprada comercialmente 1x PBS a 121 °C e 15 lb por 20 min antes do uso estéril.
- Preparação do reagente para ensaio de viabilidade microbiana: Equilibrar o conteúdo do ensaio à temperatura ambiente. Misturar 10 ml de tampão com o pó de reagente luminescente liofilizado e armazenar o reagente preparado a -20 °C como alíquotas de 1 ml. Antes de cada ponto de tempo, descongele o reagente sensível à luz e leve-o à temperatura ambiente.
- Solução estoque de sulfato de gentamicina: Dissolver 80 mg de sulfato de gentamicina (SG) em 10 mL de 1x PBS. Vórtice a solução do fármaco completamente para obter uma solução-estoque de 8 mg/mL GS.
- Solução estoque de cloridrato de vancomicina: Dissolver completamente 10 mg de pó de cloridrato de vancomicina em 10 mL de água deionizada para obter uma solução-mãe de 1 mg/mL.
- Solução tampão de ácido bórico: Dissolver 24,7 g (0,4 M) de ácido bórico em 900 mL de água deionizada. Ajustar o pH da solução para 10,4 com uma solução de hidróxido de sódio a 50% (p/v). Além disso, adicione água deionizada para chegar a 1 L.
- Reagente de O-pthaldialdeído (OPA): Dissolver 0,2 g de OPA em 1 mL de metanol. Adicionar 19 mL de tampão de ácido bórico 0,4 M (pH 10,4) à solução de OPA. Adicionar 0,4 ml de 2-mercaptoetanol à mistura OPA-ácido bórico. Cubra o frasco para injetáveis de reagente em papel alumínio e guarde a 4 °C para utilização até 2-3 dias após a preparação.
CUIDADO: Evite o contato com a pele, olhos e roupas. O manuseio dos reagentes OPA e 2 mercaptoetanol deve ser realizado apenas sob um exaustor com ventilação apropriada do exaustão e com o uso de equipamentos de proteção individual adequados. Evite respirar vapores, poeira ou aerossóis.
2. Preparação de UHMWPE virgem e drogado
- Peneire 2 g cada um de sulfato de gentamicina e cloridrato de vancomicina em pó com uma peneira (tamanho de poro de 75 μm) e desidrate a 45 °C em forno a vácuo (<0,1 atm) por 18-24 h.
- Misturar o fármaco desidratado com o pó UHMWPE a 7% p/p (1,12 g de antibiótico + 14,88 g de UHMWPE) em um recipiente usando um misturador mecânico por 5 min.
- Pré-aqueça um molde personalizado de bronze de alumínio (85 mm x 50 mm) com placas de inserção de aço inoxidável a 180 °C em um forno de convecção por 1 h. Pré-aqueça as placas da prensa a 170 °C.
- Adicione o pó misturado ao molde e comprima a 10 MPa, 170 °C por 10 min, seguido de um ciclo de resfriamento a água de 45 min a 10 MPa.
- Remova o bloco UHMWPE moldado (~3,5 mm) da prensa usando uma prensa hidráulica.
- Moer as superfícies superior e inferior do bloco usando um controle numérico computadorizado (CNC) para remover quaisquer irregularidades e contaminantes superficiais.
- Corte o bloco em tiras de 3 mm x 5 mm x 20 mm usando o CNC.
- Preparar UHMWPE virgem (sem adição de antibióticos) usando a mesma metodologia descrita como controle para o estudo.
Figura Suplementar 1: Partes do molde utilizado para moldagem das amostras UHMWPE. (A) Placa de inserção de aço inoxidável; (B) cavidade do molde; (C) êmbolo; (D) placa traseira Clique aqui para baixar este arquivo.
3. Determinação da cinética de eluição de UHMWPE farmacológico
- Coloque uma tira de 3 mm x 5 mm x 20 mm numa seringa de 3 ml com uma trava Luer e uma agulha de 25 G.
- Lave a tira enchendo a seringa com água deionizada e invertendo a seringa várias vezes.
- Encha a seringa com água deionizada até à graduação de 2 ml.
- Coloque a configuração da seringa num agitador a 100 rpm à temperatura ambiente.
- Em cada momento (6 h, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 1 semana), colete o eluente em um frasco para injetáveis de 2 mL.
- Em cada momento, lave a tira enchendo a seringa com água deionizada e invertendo a seringa. Eliminar a solução e encher a seringa com água desionizada até à graduação de 2 ml para continuar a experiência até ao próximo momento.
4. Determinação da concentração de vancomicina
- Detectar espectrofotometricamente a concentração de vancomicina em água deionizada com comprimento de onda de pico de absorção de 280 nm.
- Preparar padrões conhecidos de intervalo de concentração adicionando 100 μL de 1 mg/mL de solução-mãe à placa UV de 96 poços e diluindo em série usando 100 μL de água deionizada para obter seis níveis de concentrações conhecidas (1 mg/mL a 0,03125 mg/mL).
- Transfira 100 μL dos eluentes para placas UV-clear de 96 poços e determine a concentração a 280 nm usando um leitor de microplacas.
- Gere uma curva de calibração plotando as concentrações conhecidas do fármaco contra os valores de absorbância correspondentes. Calcular a concentração desconhecida do fármaco no eluente utilizando a equação linear gerada pela curva de calibração.
- Determinar a massa do fármaco multiplicando a concentração pelo volume eluente (~1,7 mL).
- Calcule a liberação cumulativa do medicamento (mg) em um ponto de tempo, somando a liberação do medicamento de todos os pontos de tempo anteriores.
- Normalizar a liberação do fármaco para a área superficial da tira (3,5 cm 2) para determinar a liberação cumulativa do fármaco por centímetro quadrado (cm2) do implante.
5. Determinação da concentração de gentamicina pelo método de marcação OPA 27
- Preparar soluções padrão GS para realizar o ensaio OPA.
- Transferir 1 mL da solução de 80 μg/mL de GS para um tubo de centrífuga.
- Adicionar 500 μL de PBS a mais cinco tubos de centrífuga.
- Realizar uma diluição seriada com esses tubos para obter concentrações de SG de 80 μg/mL, 40 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL e 2,5 μg/mL. Estes servem como as soluções de calibração para o ensaio.
- Em uma placa transparente de 96 poços, adicionar 80 μL de PBS ao poço A-1 e 80 μL das soluções de calibração aos poços A-2 a A-7 em concentração ascendente. Isso serve como uma calibração interna para o ensaio.
- Adicionar 80 μL de cada amostra aos poços vazios em triplicata para análise na mesma placa de 96 poços. Limitar o número de amostras por placa de poço a <50, de modo a que o tempo de adição da solução OPA às amostras seja aproximadamente o mesmo para todas as amostras e para evitar a evaporação.
- Adicione o reagente OPA a todos os padrões e soluções de amostra.
- Em uma capela de fumaça, encha um reservatório de reagente de 25 mL com metanol.
- Adicionar 8 ml de metanol e 1 ml da solução preparada de OPA a um segundo reservatório de reagente (secção 1.8). Misture bem a solução pipetando para cima e para baixo.
- Com uma micropipeta multicanal de 100 μL, adicione 48 μL de metanol do primeiro reservatório a todos os poços contendo amostras na placa de 96 poços.
- Após esta etapa, adicionar 72 μL de solução de OPA diluída do segundo reservatório a todos os poços contendo amostra na placa de 96 poços. Incubar a placa do poço durante 10 min à temperatura ambiente.
- Medir a intensidade da fluorescência (excitação de 340 nm, emissão de 455 nm) usando um leitor de microplacas imediatamente após os 10 min de incubação.
- Traçar a curva de calibração usando as leituras de intensidade para as soluções com concentrações conhecidas de SG. Adicione uma linha linear para determinar o melhor ajuste e gerar a equação correspondente.
- Calcular a concentração do fármaco no eluente a partir das curvas de calibração geradas pela plotagem das concentrações conhecidas do fármaco contra os valores de absorbância correspondentes.
- Calcular a massa do fármaco multiplicando a concentração pelo volume eluente (~1,7 mL).
- Determine a liberação cumulativa do medicamento (mg) em um ponto de tempo, somando a liberação do medicamento de todos os pontos de tempo anteriores.
- Normalizar a liberação do fármaco para a área superficial da tira (3,5 cm 2) para determinar a liberação cumulativa do fármaco por centímetro quadrado (cm2) do implante.
6. Preparação de bactérias
NOTA: As seguintes cepas de S. aureus foram utilizadas neste estudo: cepa tipo 12600, cepas clínicas L1101 e L1163 (obtidas do Dr. Kerry LaPlante da Universidade de Rhode Island). Os perfis de suscetibilidade dessas cepas são apresentados na Tabela 1.
| Cepas bacterianas | Gentamicina MIC | Vancomicina MIC | |
| ATCC 12600 | | ≤1 μg/mL (Sensível) | ≤0,5 μg/mL (Sensível) | |
| L1101 (Estirpe clínica) | ≥16 μg/mL (Resistente) | 8 μg/mL (Intermediário) | |
| L1163 (Tensão clínica) | ≤1 μg/mL (Sensível) | 8 μg/mL (Intermediário) | |
Tabela 1: Perfis de suscetibilidade a antibióticos das cepas controle e clínicas de S. aureus.
CUIDADO: Todas as etapas que envolveram o manuseio de culturas bacterianas e suspensões foram realizadas em um espaço de laboratório BSL-2 dentro de uma Cabine de Biossegurança Tipo A2 Classe II.
- Descongelar os estoques bacterianos de -80 °C em placas de TSA para facilitar o crescimento de S. aureus. Incubar estaticamente as placas durante a noite a 35 °C.
- Transferir duas a três colônias das culturas de placas de ágar cultivadas durante a noite para 1 mL de TSB estéril e incubar estaticamente durante a noite a 35 °C.
- Transferir 100 μL de bactérias para uma placa transparente de 96 poços para medir espectrofotometricamente a turbidez determinando a absorbância a 600 nm.
- Diluir as bactérias 10.000x usando MHB estéril antes de determinar a contagem de bactérias viáveis usando o ensaio luminescente.
7. Realização do ensaio de viabilidade microbiana em tempo real
- Realize o ensaio baseado em luminescência usando placas brancas de fundo opaco de 96 poços.
- Misturar 100 μL de suspensões bacterianas diluídas com 100 μL de reagente de ensaio preparado no ponto 1.5.
- Coloque uma tampa coberta com papel alumínio sobre a placa de 96 poços preparada e incube por 5 minutos com agitação de 100 rpm.
- Meça a luminescência imediatamente com um leitor de microplacas usando as seguintes configurações no software Gen5 3.11.
- Clique em Novo para configurar um protocolo na janela Gerenciador de Tarefas .
- Selecione Costar 96 branco opaco no menu suspenso para Tipo de placa.
- Clique em Ler no menu Selecionar etapas > ações .
- Clique em Luminescência na janela Método de leitura. Mantenha as opções de fibra Endpoint/cinética e Luminescência selecionadas em tipo de leitura e tipo óptico, respectivamente. Clique em OK.
- Mantenha as configurações
na janela Etapa de leitura (ganho = 135; tempo de integração = 1 seg; altura de leitura = 4,5 mm). Clique em OK. - A janela de layout da placa aparece pronta para a execução. Marque a caixa Usar tampa na janela da placa de carga e clique em OK.
- Coloque a placa de 96 poços na máquina para ler os valores de luminescência.
8. Geração de uma curva padrão de luminescência versus contagem viável para cada cepa bacteriana
NOTA: Cultivar e enumerar todas as estirpes de S. aureus de acordo com a metodologia descrita na secção 6.
- Preparar suspensões bacterianas diluídas em série para servir como padrões.
- Enumerar a suspensão bacteriana cultivada durante a noite medindo espectrofotometricamente a turbidez.
- Centrifugar a 6.000 × g por 5 minutos para peletizar as bactérias e ressuspender o pellet em MHB estéril para ajustar a concentração para 1 x 109 UFC/mL.
- Diluir 100 μL de suspensão limpa usando 900 μL de MHB e realizar uma diluição seriada de 10 vezes para atingir 1 x 101 UFC/mL.
- Efectuar o ensaio de luminescência nas suspensões bacterianas preparadas, tal como descrito no ponto 7.
- Use MHB estéril como um controle em branco para o experimento e subtraia o valor de luminescência em branco dos valores de luminescência da amostra de teste.
- Plote o log (CFU) contra o log (luminescência) para gerar uma curva padrão. Registre a equação e o valor de R2 .
- Determinar a UFC/mL correspondente aos valores de luminescência usando a equação específica de deformação ao longo do estudo.
9. Configuração do estudo de atividade antibacteriana dependente do tempo
Figura 1: Representação esquemática do arranjo experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Cultivar as bactérias durante a noite em 1 mL de caldo TSB.
- Diluir a suspensão bacteriana cultivada durante a noite para 105 UFC/mL em MHB estéril (seção 6) e verificar a contagem bacteriana viável usando as unidades de luminescência antes do início do experimento (seção 7).
- Coloque as tiras UHMWPE virgens e UHMWPE carregadas com medicamentos (3 mm x 5 mm x 10 mm, metade da dimensão das tiras preparadas para os estudos de eluição na secção 2) dentro de uma seringa de 3 ml.
- Aspirar MHB contendo 10 a 5 UFC/mL para dentro da seringa através da agulha acoplada até a marca de1,5 mL, o que equivale a 1,35 mL de MHB (Figura 1: Passo 1).
- Coloque a configuração da seringa em uma incubadora de agitação (100 rpm) a 37 °C até os pontos de tempo indicados de 6 h, Dia 1, Dia 2, Dia 3, Dia 4, Dia 5, Dia 6 e Dia 7 (Figura 1: Passo 2).
- Em cada momento indicado, retire a configuração da seringa e realize um ensaio de viabilidade microbiana em tempo real, de acordo com a seção 7, em 100 μL de suspensão bacteriana (Figura 1: Passo 3-4).
- Determine a contagem de bactérias viáveis para os pontos de tempo 6 h, Dia 1, Dia 2, Dia 3 e Dia 7. Determinar a UFC/mL a partir das unidades de luminescência usando a curva padrão correspondente.
- Verificar a ausência de bactérias viáveis nas amostras que apresentaram valores de luminescência abaixo do limite de detecção, realizando o método de espalhamento em placas de TSA e incubando a 35 °C durante a noite. Verifique a presença de colônias no dia seguinte.
- Centrifugar a suspensão bacteriana restante a 10.000 × g por 10 min e aspirar suavemente o meio gasto. Para tubos em que os pellets não são visualmente observados devido à atividade antibacteriana dos medicamentos, deixe 100 μL no tubo para garantir que o pellet invisível não seja perturbado (Figura 1: Passo 5).
- Ressuspender as bactérias peletizadas em MHB fresco e retirar a suspensão bacteriana para a mesma configuração da seringa através da agulha acoplada (Figura 1: Passo 6).
10. Quantificação de bactérias aderentes na superfície UHMWPE
- Recupere superfícies UHMWPE virgens e UHMWPE carregadas com medicamentos da configuração da seringa após a conclusão do estudo no dia 7.
- Transfira as superfícies para tubos de 1,5 mL e enxágue com 1 mL de PBS estéril (três vezes).
- Sonicar a superfície por 40 min em 1 mL de PBS estéril. Determinar a viabilidade das bactérias aderentes através da realização de um ensaio de luminescência em 100 μL da amostra sonicada, conforme descrito na secção 7.
Representative Results
Seguindo o protocolo, a UHMWPE foi moldada com gentamicina e vancomicina a 7% p/p e eluída em água deionizada. A concentração do fármaco no eluente do material foi determinada em 6 h, 1 dia, 2 dias, 3 dias e 1 semana. A liberação do fármaco a partir de vancomicina e UHMWPE com gentamicina demonstrou uma liberação de burst em 6 h seguida de uma taxa de liberação constante com uma concentração de liberação maior que a concentração inibitória mínima (CIM) até 7 dias (Figura 2, Tabela 2).
Antes do estudo antibacteriano, uma curva padrão foi gerada para correlacionar as unidades de luminescência com a UFC/mL das bactérias para cada cepa de S. aureus (ATCC 12600, L1101 e L1163). Os valores logarítmicos (luminescência) correspondentes foram plotados contra o log (UFC/mL) para gerar uma curva padrão (Figura 3). Os valores de R2 calculados foram 0,997, 0,996 e 0,994 para ATCC 12600, L1101 e L1163, respectivamente, indicando um forte ajuste para a faixa de concentração. A equação derivada foi posteriormente utilizada para calcular a viabilidade bacteriana em todos os experimentos. ATCC 12600 e L1101 demonstraram um limite de detecção dentro de um intervalo de 1 x 102-1 x 103 UFC/mL. Por outro lado, o limite de detecção para a cepa L1163 mostrou-se de 1 x 104 UFC/mL.
O ensaio de atividade antibacteriana tempo-dependente foi realizado usando 1 x 105 UFC/mL como inóculo inicial para 12600, L1163 e L1101, que foram expostos a 7% p/p de materiais farmacológicos por um período de 1 semana. Em cada momento (6 h, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 1 semana), o meio foi revigorado e a população bacteriana foi ressuspensa. A exposição da bactéria à liberação subsequente de fármacos do material foi continuada até o próximo momento. UHMWPE com 7% p/p de vancomicina e UHMWPE com 7% p/p de gentamicina demonstraram redução de >3log para ATCC 12600 suscetível a partir de 6 h, e erradicação completa (sem crescimento de colônias) foi observada ao final de 3 dias (Figura 4A). Para a linhagem L1163 suscetível à gentamicina e intermediária à vancomicina, ambos os materiais eluídos causaram redução de >3log em 6 h, e a erradicação completa (sem crescimento da colônia) foi observada no 1º dia do experimento (Figura 4B). Para a cepa L1101 resistente à gentamicina e intermediária com vancomicina, a eluição de gentamicina a partir de UHMWPE não afetou a viabilidade bacteriana de L1101 (Figura 4C). A bactéria proliferou, e a população estabilizou-se em 6 h na presença de UHMWPE virgem sem eluição de antibiótico. Na presença de UHMWPE eluidor de gentamicina, a população atingiu um nível de crescimento semelhante no dia 2. Pelo contrário, a eluição de vancomicina a partir de UHMWPE reduziu significativamente a viabilidade bacteriana (>3log) em 6 h, e a perda completa de viabilidade (sem crescimento de colônias) foi demonstrada no dia 4.
As superfícies dos UHMWPE eluidores de gentamicina e vancomicina não mostraram bactérias aderentes viáveis quando expostas a cepas suscetíveis e resistentes a intermediários após o 7º dia ou erradicação completa, o que ocorrer primeiro. Algumas bactérias viáveis (1 x 105 UFC/mL) estavam presentes em UHMWPE eluidores de gentamicina expostos à L1101 resistente à gentamicina. Da mesma forma, aproximadamente 1 x10 5 UFC/mL de bactérias aderentes viáveis foram recuperadas do PE virgem controle (Figura 5).
Figura 2: Liberação média de antibióticos dependente do tempo a partir de 7% p/p de tira UHMWPE carregada com antibiótico. A liberação média de antibiótico entre os pontos de tempo de uma tira UHMWPE carregada com gentamicina a 7% e vancomicina (3 mm, 3 x 5 mm, 3 x 10 mm,3 ~ 2 cm, 2 cm2 de área de superfície). A CIM contra a cepa de controle ATCC 12600 é mostrada como uma linha pontilhada para gentamicina e uma linha sólida para vancomicina. As barras de erro representam o desvio padrão da média de seis repetições (n = 6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Curva padrão do ensaio luminescente em tempo real para todas as cepas de S. aureus. Log (luminescência) foi plotado contra log (UFC/mL) para gerar curvas padrão para controle, (A) ATCC 12600, e cepas clínicas, (B) L1101 e (C) L1163. As equações que descrevem a reta de melhor ajuste e os valores correspondentes de R2 são indicadas nos gráficos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Viabilidade bacteriana determinada usando um ensaio luminescente para 7% p/p com gentamicina e 7% p/p com vancomicina UHMWPE. A atividade antibacteriana tempo-dependente da gentamicina e vancomicina eluídas de UHMWPE contra cepas controle, (A) ATCC 12600, e cepas clínicas, (B) L1163 e (C) L1101, são mostradas. O PE Virgin 1020 serviu como controle para o experimento. A linha amarela nos gráficos indica o limite de detecção para a respectiva cepa de S. aureus. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Viabilidade de bactérias aderentes determinada usando o ensaio luminescente Glo para 7% p/p de gentamicina e 7% p/p de vancomicina UHMWPE contra todas as cepas de S. aureus. O gráfico de barras indica bactérias aderentes (UFC) recuperadas por centímetro ao quadrado (cm2) de UHMWPE com gentamicina a 7% e vancomicina a 7% ao final do período de estudo para todas as cepas testadas. As barras mostram os dados como média ± desvio padrão (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Pontos de tempo | Vancomicina | Gentamicina |
| Concentração de pico (μg/mL) | Concentração de pico (μg/mL) | |
| 0 - 6 h | 336 ± 72 | 263 ± 24 |
| 6 h -1 dia | 57 ± 18 | 16 ± 2 |
| 1 dia - 2 dias | 60 ± 18 | 7 ± 1 |
| 2 dia - 3 dia | 23 ± 6 | 5 ± 0.4 |
| 3 dias - 7 dias | 49 ± 20 | 15 ± 1 |
Tabela 2: Concentração máxima do fármaco (μg/mL) nos diferentes momentos. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (n = 6).
Figura suplementar 2: Decaimento do sinal de luminescência durante um período de 10 min a partir da adição do reagente de ensaio à amostra. Uma diferença de ±5% no sinal é mostrada como uma linha pontilhada Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
A administração sustentada localizada de antibióticos é uma ferramenta necessária no manejo de infecções articulares periprotéticas. Os antibióticos sistêmicos são a principal estratégia na erradicação da infecção bacteriana, e a eluição local é usada como uma ferramenta complementar para prevenir o crescimento e a colonização de quaisquer bactérias remanescentes após a remoção do implante e desbridamento do tecido. O objetivo para a área sob a curva efetiva (concentração ao longo de um período) para antibióticos com administração local não é bem compreendido. A eluição de antibióticos a partir desses dispositivos pode ser quantificada longitudinalmente in vitro; No entanto, para determinar o valor translacional desses perfis de concentração, um método in vitro robusto para avaliar a atividade antibacteriana é necessário. Neste trabalho, um desses métodos em tempo real é descrito para determinar a atividade antibacteriana do UHMWPE farmacológico para ser usado como um dispositivo de liberação sustentada em substituições articulares.
O monitoramento em tempo real da viabilidade bacteriana é um parâmetro crucial de interesse, e os métodos microbiológicos convencionais carecem de estrutura para acomodar esse aspecto específico do estudo. O ensaio de viabilidade microbiana utilizado neste estudo foi desenvolvido para a quantificação de bactérias viáveis por meio da mensuração da luminescência correspondente à adenosina trifosfato (ATP). Para investigar diretamente a atividade tempo-dependente dos antibióticos eluídos dos materiais de implante, três diferentes cepas com perfis distintos de suscetibilidade aos antibióticos foram incubadas com eles. A justificativa para o uso de cepas laboratoriais e clínicas com resistências variadas à gentamicina e vancomicina foi entender a faixa de atividade de uma determinada formulação de implante. Além disso, a atividade antibacteriana e a eficácia contra essas populações distintas são dependentes do momento da administração. O método enfoca a viabilidade da profilaxia contra essas cepas com base em >70% das infecções articulares periprotéticas serem causadas pela contaminação da ferida no momento da cirurgia24.
Como inóculo inicial para o desenvolvimento deste método, utilizou-se 1 x 105 UFC/mL. Diferentes concentrações de contaminação têm sido usadas para modelos animais, embora pouco se saiba sobre a carga de infecção clinicamente relevante para PJI. Modelos de infecção animal para PJI têm sido rotineiramente estabelecidos usando 1 x 105 UFC, e uma faixa semelhante é amplamente utilizada em métodos padronizados (CLSI) para determinar a atividade antibacteriana25,26,27. O uso de 1 x 105 UFC/mL como concentração inicial de contaminação permitiu avaliar os parâmetros de crescimento e erradicação ao mesmo tempo.
Convencionalmente, os valores de CIM são determinados para uma concentração constante de antibiótico para um número específico de bactérias, e eles não conseguem demonstrar a taxa de ação antibacteriana. Devido a esse aspecto, os valores da CIM não fornecem uma diferenciação quantitativa para descrever o perfil de atividade antimicrobiana28. Os dados do método atual enfatizam a vantagem de avaliar a cinética de morte dependente da cepa dos antibióticos em vez de usar a CIM para tomar decisões de dosagem. Com esse método, foi possível diferenciar tanto a extensão quanto a velocidade com que os materiais de implante afetaram as diferentes cepas. A gentamicina eluída das tiras de material do implante foi eficaz em erradicar L1163 em 1 dia e erradicar ATCC 12600 em 2-3 dias, mas foi ineficaz em erradicar L1101 (Figura 4). Além da esperada falta de atividade da eluição da gentamicina contra L1101 (CIM >32 μg/mL) devido à sua inerente resistência à gentamicina (Figura 4C), observou-se a persistência de subpopulações quando expostas à vancomicina, para as quais L1101 apresenta resistência intermediária. Em contraste, L1163 foi definitivamente erradicado na presença de UHMWPE eluidor de vancomicina, apesar de exibir resistência intermediária à vancomicina semelhante à L1101 (uma CIM de 8 μg/mL foi observada para ambas as cepas).
As observações de que a taxa de atividade da gentamicina contra 12600 e L1163, que são gentamicina-suscetíveis com valores de CIM semelhantes (uma CIM de 1μg/mL foi observada para ambas as cepas), foi diferente, bem como que a extensão da atividade da vancomicina contra L1101 e L1163 resistentes a intermediários foi diferente (Figura 4A,B), sustentaram a hipótese de que esse método em tempo real na presença do material eluído poderia diferenciar diferenças longitudinais na atividade.
Além do valor translacional dos resultados na interpretação da eficácia de uma dada concentração eluída contra essas bactérias, existem várias vantagens metodológicas experimentais. (1) A concentração bacteriana é determinada instantaneamente em um determinado momento, ao contrário dos métodos convencionais em que as bactérias são incubadas em caldo ou em ágar por 18-24 h para determinar a viabilidade. Esse período de crescimento pode proporcionar tempo adicional para que as bactérias se recuperem do estresse antibiótico, introduzindo uma possível fonte adicional de erro/variabilidade. (2) O meio é continuamente substituído enquanto retém a bactéria, o que mais se assemelha a condições in vivo do que condições estáticas. (3) Este ensaio inclui inerentemente a cinética de liberação do fármaco do implante, o que permite uma melhor predição de desempenho. (4) O método foi desenvolvido utilizando consumíveis comumente disponíveis sem a necessidade de qualquer maquinaria específica ou cara.
Métodos de teste in vitro robustos para avaliar aplicações de liberação de fármacos são necessários antes de prosseguir para estudos in vivo em animais e ensaios clínicos. Este ensaio pode ser modificado e adaptado para acomodar várias abordagens e plataformas de liberação de fármacos, como partículas, géis, filmes e outros materiais farmacológicos para determinar a eficiência da erradicação bacteriana em uma configuração in vitro simulada. Modificações podem ser realizadas para o arranjo da amostra alterando-se para um ambiente adequado in vitro, o que tem demonstrado influenciar a atividade de vários antibióticos29,30.
O método também facilita a determinação de bactérias aderentes viáveis, o que é promissor, já que os métodos convencionais para determinar a concentração mínima de erradicação do biofilme são demorados e fornecem resultados inconsistentes. No entanto, o método deve ser rigorosamente testado em biofilmes para desenvolver uma metodologia confiável e robusta para determinar sua sensibilidade. O método luminescente baseado em ATP pode ser sensível o suficiente para detectar formas viáveis de bactérias em biofilmes, incluindo persistentes, que podem ou não ser detectados em uma placa de ágar como colônias visíveis. Em conjunto, esta plataforma versátil tem o potencial de incorporar parâmetros relevantes para registrar observações em tempo real sobre a atividade antibacteriana e antibiofilme de drogas de interesse.
A eficácia deste método é regida pelos seguintes aspectos:
Características de eluição e tamanho de amostra pré-determinados
O perfil de eluição do material eluidor de antibióticos pode ser identificado em um experimento separado antes dessa medição da atividade antibacteriana, de modo que a quantidade de material necessária para conduzir ativamente o experimento dentro de um tempo estipulado possa ser determinada.
Determinação do recipiente e do volume
É importante elaborar uma configuração na qual o volume do meio do experimento possa acomodar toda a área de superfície do mesmo material e garantir volume suficiente para a liberação desobstruída do fármaco da superfície carregada do medicamento. O arranjo utilizado foi baseado em experimentação prévia, garantindo condições de "sumidouro perfeitas" para esses fármacos hidrofílicos, de modo que sua difusão não seja prejudicada por limitações de solubilidade.
Características dos meios de crescimento
A seleção dos meios de crescimento deve ser investigada para garantir a estabilidade e o ótimo desempenho do(s) fármaco(s) selecionado(s)29. O caldo Mueller Hinton ajustado por cátions (CAMHB), que é amplamente utilizado no método de diluição em caldo, foi usado para determinar a CIM de antibióticos conhecidos. O meio permite ótima atividade do fármaco sem a interferência do acúmulo de metabólitos secundários tóxicos31. O ensaio reagente tem sido testado e relatado estável em diferentes tipos de meios, incluindo aqueles com componentes séricos23,28. Embora os valores das unidades de luminescência relativas possam variar entre diferentes meios, demonstrou-se que os componentes do meio não interferem no ensaio32,33. O volume experimental foi ainda otimizado para 1,5 mL, que se aproxima do volume de líquido sinovial presente no espaço articular do joelhoadulto34.
Estabilidade de temperatura para o ensaio
O manuseio e a adição do reagente luminescente ao ensaio devem ser realizados de maneira consistente ao longo dos experimentos. Mudanças de temperatura alteram a sensibilidade do ensaio, por isso é importante incubar o reagente à temperatura ambiente por 2 h antes de adicioná-lo às bactérias23.
Tempo de incubação do reagente
A luminescência do reagente decai com o tempo. O sinal luminescente tem meia-vida superior a 30 min, que é largamente dependente do meio e do tipo de bactéria utilizada no experimento23. Além disso, quaisquer diferenças no tempo de incubação (ou seja, o tempo entre a adição do reagente às bactérias e a leitura da luminescência) resultarão em leituras inconsistentes para a mesma concentração de bactérias. Uma diferença de 5% no sinal luminescente foi observado dentro de 1 min após o tempo de incubação de 5 min de acordo com as instruções do fabricante (Figura 2 suplementar). Levando em consideração esses dados, as leituras de luminescência foram registradas em até 1 min durante todo o estudo para garantir que a perda de sinal não fosse superior a 5%. Além disso, é importante limitar o número de amostras por placa para reduzir o erro introduzido devido ao decaimento da luminescência do primeiro para o último poço.
Manutenção da população bacteriana ao longo do estudo
O método tentou modelar a depuração do fármaco e o turnover do volume sinovial separando continuamente o meio gasto da população bacteriana em cada momento usando centrifugação de alta velocidade a 10.000 x g por 10 min35. Esta etapa crítica garante a sedimentação de todas as células bacterianas viáveis e não viáveis. Além disso, as bactérias sedimentadas são uniformemente reconstituídas em MHB fresco e transferidas para a instalação da seringa, facilitando o transporte completo da população microbiana afetada de volta para o arranjo experimental. A reprodutibilidade e a confiabilidade desse método dependem fortemente da simulação da exposição sustentada de antibióticos à população microbiana derivada do inóculo inicial.
Uma limitação importante deste método é que ele é um ensaio semi-estático que não simula com precisão meias-vidas de drogas e turnover sinovial contínuo. No entanto, a reposição contínua do meio compensa parcialmente essa limitação. A sensibilidade do ensaio de viabilidade microbiana foi dependente do estiramento, variando de 1 x 102-1 x 104 UFC/mL, o que limita a capacidade de detecção. Além disso, uma curva padrão precisa ser traçada para cada organismo, pois o tipo de cepa contribui para a sensibilidade e o desempenho do reagente luminescente. Tanto a dinâmica de crescimento bacteriano quanto a atividade do composto do fármaco utilizado podem ser afetadas pelos componentes do meio, o que deve ser mais bem investigado.
Disclosures
O autor sênior (E.O.) recebe royalties provenientes do licenciamento de propriedade intelectual para as seguintes empresas: Corin, Iconacy, Renovis, Arthrex, ConforMIS, Meril Healthcare, Exactech. Não há conflito de interesses com nenhum dos estudos aqui apresentados.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health Grant No. AR077023 (R01) e pelo Harris Orthopaedic Laboratory. Os autores agradecem à Dra. Kerry Laplante e sua equipe da Universidade de Rhode Island por fornecer as cepas clínicas L1101 e L1163.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plates - polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs | Corning, NY, USA | CLS3922-100EA | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich, Germany | ||
| ATCC 12600 | American Type culture Collection, VA, USA | ||
| BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay | Promega Corporation, USA | G8231 | |
| BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) | Becton-Dickinson, USA | BD 211825 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL | BD, USA | 309657 | |
| BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G | BD, USA | 305122 | |
| BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton-Dickinson, USA | B12322 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) | Becton-Dickinson, USA | DF0369-17-6 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| Boric Acid | Fisher Chemical, NJ, USA | ||
| Branson 1800 ultrasonic bath | Emerson, MO, USA | ||
| Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid | Fisher Scientific, USA | 08-757-100D | |
| Gentamicin Sulfate | Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China | ||
| Greiner UV-Star 96 well plates | Sigma Aldrich, Germany | M3812-40EA | |
| Hydraulic press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| L1101 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| L1163 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| LSE benchtop shaking incubator | Corning, NY, USA | ||
| Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical | Fisher Scientific, NJ, USA | A454-1 | |
| Napco CO2 6000 | Thermo Scientific, MA, USA | ||
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents | Fisher Scientific, USA | BP24384 | |
| Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) | Sigma Aldrich, Germany | P1378-5g | |
| Plate reader (Synergy H1 | Biotek, VT, USA | ||
| press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| shaker Innova 2100 | New Brunswick Scientific, NJ, USA | ||
| ShopBot D2418 | ShopBot Tools, Inc., NC, USA | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich, Germany | ||
| Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water | Fisher Scientific, USA | 23-751628 | |
| UHMWPE | GUR1020, Celanese, TX, USA | ||
| Vancomycin Hydrochloride | Fagron, The Netherlands | 804148 | |
| WAB Turbula | WAB Turbula, Switzerland |
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