Summary
Остеокласты являются ключевыми костно-резорбирующими клетками в организме. Этот протокол описывает надежный метод дифференцировки остеокластов in vitro из моноцитов периферической крови человека. Этот метод может быть использован в качестве важного инструмента для дальнейшего понимания биологии остеокластов в гомеостазе и при болезнях.
Abstract
Остеокласты (ОК) - это костно-резорбирующие клетки, которые играют ключевую роль в развитии скелета и ремоделировании костей взрослого человека. Некоторые заболевания костей вызваны повышенной дифференцировкой и активацией ОК, поэтому ингибирование этой патобиологии является ключевым терапевтическим принципом. Два ключевых фактора стимулируют дифференцировку ОК от миелоидных предшественников: колониестимулирующий фактор макрофагов (М-КСФ) и рецепторный активатор лиганда ядерного фактора каппа-В (RANKL). Давно известно, что циркулирующие человеческие моноциты CD14+ дифференцируются в ОК in vitro. Однако время воздействия и концентрация RANKL влияют на эффективность дифференцировки. Действительно, были описаны протоколы для генерации человеческих ОК in vitro , но они часто приводят к плохому и длительному процессу дифференцировки. Здесь представлен надежный и стандартизированный протокол для своевременной генерации функционально активных ОК зрелого человека. Моноциты CD14+ обогащены мононуклеарными клетками периферической крови человека (PBMC) и заправлены M-CSF для повышения регуляции RANK. Последующее воздействие RANKL генерирует ОК в зависимости от дозы и времени. ОК идентифицируются и количественно оцениваются путем окрашивания тартратной кислотоустойчивой фосфатазой (TRAP) и анализа световой микроскопии. Иммунофлюоресцентное окрашивание ядер и F-актина используется для идентификации функционально активных ОК. Кроме того, зрелые ОК OSCAR+CD14− дополнительно обогащаются с помощью проточной цитометрической сортировки клеток, а функциональность ОК количественно определяется анализами резорбции минералов (или дентина/кости) и образованием актиновых колец. Наконец, известный ингибитор ОК, ротенон, используется на зрелых ОК, демонстрируя, что производство аденозинтрифосфата (АТФ) необходимо для целостности актинового кольца и функции ОК. В заключение, в этой работе установлен надежный анализ для дифференцировки большого количества ОК, который в сочетании с окрашиванием актинового кольца и анализом АТФ обеспечивает полезную модель in vitro для оценки функции ОК и скрининга новых терапевтических соединений, которые могут модулировать процесс дифференцировки.
Introduction
Остеокласты (ОК) представляют собой многоядерные гигантские клетки кроветворного происхождения с уникальной способностью рассасываться в кости. Они отвечают за развитие и непрерывное ремоделирование скелета 1,2. В скелетных фазах развития ОК и тканерезидентные макрофаги происходят из эритро-миелоидных предшественников и колонизируют костную нишу и ткани органов. В физиологических условиях эритро-миелоидные предшественники необходимы для нормального развития кости и прорезывания зубов, в то время как приток циркулирующих моноцитов крови в костную нишу обеспечивает постнатальное поддержание ОК, костной массы и полостикостного мозга 3. При патологических состояниях моноциты рекрутируются к местам активного воспаления и могут способствовать патологической деструкции кости 4,5.
Пациенты с несколькими формами артрита испытывают воспаление суставов, что приводит к прогрессирующему разрушению суставов, вызванному OCs6. Например, при ревматоидном артрите (РА) гиперактивированные ОК ответственны за патологическую эрозию костей и разрушение суставов7,8, а современные методы лечения часто не улучшают и не останавливают повреждение костей9,10,11. Изменения в циркулирующих моноцитах как с точки зрения распределения популяции, так и транскриптомных и эпигенетических сигнатур были зарегистрированы у пациентов с РА12,13,14. Кроме того, сообщалось, что измененные реакции моноцитов на воспалительную стимуляцию влияют на остеокластогенез у пациентов с РА с активным заболеванием15,16,17.
Дифференцировка ОК представляет собой сложный многоступенчатый процесс, включающий приверженность миелоидных клеток-предшественников дифференцировке в предшественники ОК. Во время остеокластогенеза ОК становятся гигантскими и многоядерными в результате слияния клеток с клетками, неполного цитокинеза и процесса ядерной рециркуляции, описанного как деление и слияние18,19,20. Способность дифференцировать ОК in vitro позволила добиться значительного прогресса в понимании биологии костей21. ОК дифференцируются от предшественников при воздействии колониестимулирующего фактора макрофагов (М-КСФ) и рецепторного активатора лиганда ядерного фактора каппа-В (RANKL). Последнее необходимо для нормального развития и функционирования ОК in vitro и in vivo, даже при воспалительных состояниях 6,22,23. RANKL представлен остеобластами и остеоцитами, а также активированными Т-клетками и фибробластами в воспаленной синовиальной оболочкеРА 2,24,25. В процессе дифференцировки ОК моноциты, подвергшиеся воздействию M-CSF, активируют рецептор-активатор экспрессии ядерного фактора каппа-В (RANK) на своей клеточной мембране и при последующей стимуляции RANKL дифференцируются в тартрат-резистентную кислую фосфатазу (TRAP)-положительные мононуклеарные пре-ОК, а затем в многоядерные ОК15,26. ОК продуцируют несколько ферментов, главным из которых является TRAP, который обеспечивает деградацию фосфопротеинов в кости27. Регулятором и маркером дифференцировки ОК является ОК-ассоциированный рецептор (OSCAR). Он активируется на ранней стадии в клетках-предшественниках, связывающихся с линиейOC 28. Зрелые гигантские многоядерные ОК могут разрушать (резорбировать) скелетный матрикс, создавая большую зону герметизации, которая состоит из актинового кольца, окружающего взъерошенную границу21,29,30. Способность ОК к резорбции кости требует реорганизации цитоскелета и, как следствие, поляризации и образования извитой мембраны, которая является так называемой взъерошенной границей. Взъерошенная кайма окружена большой круглой полосой структуры, богатой F-актином, которая является актиновым кольцом или зоной уплотнения. Целостность актинового кольца необходима для резорбции ОК кости как in vitro, так и in vivo, а дефектное образование взъерошенной границы связано с более низкой экспрессией вакуолярной аденозинтрифосфатазы (V-АТФазы)31,32,33. Более того, ОК являются клетками, богатыми митохондриями, а аденозинтрифосфат (АТФ) связывается с митохондриальными структурами в ОК, локализованных на взъерошенной границе31,32,33. Ротенон действует как сильный ингибитор митохондриального комплекса I и влияет на выработку АТФ. Также было показано, что ротенон ингибирует дифференцировку и функциюОК 34.
Этот протокол описывает эффективный и оптимизированный метод остеокластогенеза in vitro из образцов периферической крови человека. В периферической крови человека моноциты CD14+ являются основным источником ОК15,35,36. В этом протоколе кинетика воздействия и концентрации M-CSF и RANKL были скорректированы для оптимального остеокластогенеза. Мононуклеарные клетки сначала отделяются от эритроцитов и гранулоцитов, присутствующих в цельной крови, градиентом плотности; затем они обогащаются моноцитами CD14+ с использованием положительного отбора магнитными шариками. Изолированные моноциты CD14+ затем инкубируют в течение ночи с M-CSF. Это побуждает моноциты повышать экспрессию RANK15,26. Последующее добавление RANKL индуцирует остеокластогенез и многоядерность в зависимости от времени. Активно-резорбирующие ОК показывают характерное распределение F-актиновых колец по краю клеточной мембраны30,32 и окрашивание на TRAP. Зрелые ОК анализируются путем количественного определения многоядерных (более трех ядер) клеток TRAP+. Функциональная способность зрелых ОК может быть оценена по их резорбции, целостности актинового кольца и продукции АТФ. Кроме того, дифференцированные CD14-OSCAR+ OC могут быть обогащены и использованы для оценки влияния определенных соединений на функциональность OC посредством резорбции минералов (или дентина) и организации F-актина. Кроме того, в этой работе известный ингибитор ОК, ротенон, используется в качестве примера соединения, которое влияет на функциональность ОК. Снижение активности резорбции ОК под действием ротенона связано со снижением продукции АТФ и фрагментацией актинового кольца. В заключение, этот протокол устанавливает надежный анализ, который может быть использован в качестве эталонного метода для изучения нескольких биологических аспектов дифференцировки и функции ОК in vitro.
Эта методология может быть использована для оценки (1) способности циркулирующих моноцитов дифференцироваться в ОК в здоровье и при заболеваниях, а также (2) влияния терапевтических кандидатов на дифференцировку и функцию ОК. Этот надежный протокол остеокластогенеза позволяет определить эффективность и механизмы костно-ориентированной терапии как на дифференцировку ОК из клеток-предшественников, так и на функцию зрелых ОК.
Protocol
Пальто Баффи, полученные от Шотландской национальной службы переливания крови (Эдинбург), и лейкоцитарные колбочки, полученные от NHS Blood and Transplant (Ньюкасл), предоставляются исследователям Университета Глазго в полностью анонимной (неидентифицируемой) форме от доноров крови NHS. Компоненты крови с охристой оболочкой и лейкоцитарным колбочком производятся из стандартного донорства крови NHS, сдаваемого в центре доноров крови NHS в Шотландии или Англии. Донор крови дает информированное согласие во время сдачи крови на излишки крови, не используемые в стандартной клинической практике NHS, которые будут использоваться для утвержденных медицинских исследований. Этическое одобрение Комитета по этике исследований NHS и подписанные формы согласия доноров на использование этих доноров крови хранятся в службе донорства крови NHS. Разрешение на доступ и использование этих согласованных доноров крови в утвержденных медицинских исследованиях было запрошено и получено с использованием стандартного внутреннего процесса подачи заявок и рассмотрения Национальной службой переливания крови (Шотландия) и NHS Blood and Transport (Англия). Для использования компонентов крови для утвержденных медицинских исследований не требовалось никакого дополнительного одобрения NHS REC или внутреннего одобрения этического комитета Университета Глазго.
1. Общие замечания перед началом работы
- Приступайте ко всем работам с кровью с осторожностью. Рассмотрите потенциальную опасность различных инфекционных агентов, которые могут присутствовать в образцах.
- Проводите все работы осторожно в лаборатории биобезопасности в стерильных условиях, надевая перчатки и лабораторные халаты.
- Выполняйте утилизацию по биобезопасности в соответствии с местными рекомендациями.
- Получите соответствующее согласие и этические разрешения перед сбором проб в соответствии с правилами местных властей.
- Как правило, 1 мл свежей крови дает 1 миллион PBMC, а моноциты CD14+ составляют примерно 10-30% PBMC. Для сравнения, 10 мл лейкоцитарного конуса может содержать 5 x 10 8-15 x 108 PBMC. Для получения более подробной информации об изоляции PBMC см. предыдущий протокол37.
2. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) из цельной крови
- Соберите необходимый объем свежей крови от здоровых доноров в пробирки для сбора литиевого гепарина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно использовать другие пробирки для сбора с соответствующими антикоагулянтами (например, пробирки с гепарином натрия). Для более высокого количества клеток можно использовать лейкоцитарные колбочки или охристые оболочки. - Чтобы изолировать PBMC, переведите кровь в новую пробирку объемом 50 мл и разбавьте ее стерильным 1x фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) в соотношении 1:1 или 1:3 для свежей крови или лейкоцитарных колбочек / охристой оболочки соответственно.
- Аккуратно перемешайте клетки несколько раз путем инверсии.
- Подготовьте пробирки объемом 15 мл, содержащие 3 мл среды с градиентом плотности. Медленно наложите 8-10 мл разбавленной крови на верхнюю часть среды с градиентом плотности и центрифугу при 400 x g в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) без тормозов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно нанесите кровь поверх среды с градиентом плотности, чтобы предотвратить смешивание. Смешивание может привести к потере PBMC. - Осторожно снимите верхний слой (содержащий плазму) с помощью пипетки Пастера, соберите нижний межфазный слой, содержащий PBMC (белая кольцеобразная структура), и перенесите этот слой в новую пробирку объемом 50 мл.
- Суспендировать клетки стерильным 1x PBS до 50 мл и смыть остаточную среду градиента плотности центрифугированием при 300 x g в течение 10 мин при RT с полным тормозом.
- Чтобы удалить остаточные тромбоциты, повторите процесс с дополнительным более медленным вращением при 200 x g в течение 10 минут при RT без тормоза.
- Дополнительно: Чтобы удалить перенос эритроцитов, разбавьте буфер лизиса эритроцитов (10x, таблица материалов) 1:10 в дистиллированной воде и нанесите 3 мл разбавленного буфера на гранулы. Перемешать и выдержать 3 мин. Промойте гранулы в 50 мл 1x PBS и центрифугу при 300 x g в течение 10 мин при RT с полным тормозом.
- Ресуспендируют выделенные и очищенные PBMC в 20 мл 1x PBS и подсчитывают их с помощью гемацитометра или другими стандартными методами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Методы разбавления и подсчета клеток должны быть соответствующим образом скорректированы в зависимости от плотности ячеек и используемого счетного устройства.
3. Обогащение CD14+ моноцитов из PBMC
- Изолируют моноциты CD14+ из PBMC с помощью набора для отбора CD14+ человека в соответствии с протоколом производителя (таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Классические моноциты CD14 + CD16- являются основным источником предшественниковOC 35; Можно рассмотреть альтернативные методы очистки. - Переложите 1 x 107 PBMC в подходящую полистирольную трубку с круглым дном (т. е. подходящую для магнита набора для выбора) и гранулируйте ячейки в 300 x g в течение 5 минут.
- Выбросьте надосадочную жидкость, ресуспендируйте клеточную гранулу в буфере для разделения клеток (PBS, 2% эмбриональная бычья сыворотка [FBS], 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА]) до конечной концентрации 1 x 108 клеток / мл и инкубируйте с 10 мкл коктейля антител на 100 мкл с закрытой крышкой в течение 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки ресуспендируют в дозе 1 x 108 клеток/мл; Отрегулируйте громкость соответствующим образом. - После инкубации добавляют 10 мкл шариков магнитных наночастиц на 100 мкл и инкубируют в течение 3 минут с закрытой крышкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте объемы коктейля антител и магнитных шариков, чтобы получить концентрацию 10 мкл / мл. - Дополните объем до 2,5 мл буфером для разделения клеток, поместите пробирку в магнит (без крышки) и инкубируйте в течение 3 минут. Отбросьте отрицательную клеточную популяцию одним непрерывным движением путем инверсии, пока трубка все еще находится в магните.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании >2 x 108 PBMC и магнита большего размера долейте буфер для разделения ячеек до 5 мл или 10 мл в соответствии с инструкциями производителя. - Извлеките пробирку из магнита и промойте обогащенные моноциты CD14+ , прикрепленные к магнитным шарикам, ресуспендировав их в 2,5 мл буфера разделения клеток. Инкубируйте в течение 3 минут внутри магнита, как и раньше, откажитесь от отрицательной фракции и повторите еще раз.
- Центрифугируют все собранные клетки в дозе 300 x g в течение 5 мин, отбрасывают надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в 5 мл альфа-минимальной эссенциальной среды (α-MEM; Таблица материалов) дополнен 1% L-глютамином, 1% пенициллином/стрептомицином (полный α-MEM) и 10% FBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проверка чистоты после обогащения с помощью проточной цитометрии, и следует ожидать чистоты ≥96%. Дополнительные этапы промывки (этап 3.6) могут повысить чистоту.
4. Дифференцировка ОК in vitro
- Подсчитайте обогащенные моноциты CD14+ с помощью гемацитометра.
- Гранулируют клетки в дозе 300 x g в течение 5 мин и ресуспендируют в дозе 1 x 106 клеток / мл в полном α-MEM с добавлением 10% FBS.
- Чтобы дифференцировать ОК, добавьте M-CSF в конечной концентрации 25 нг / мл в клеточную суспензию.
ПРИМЕЧАНИЕ: На 1 мл клеточной суспензии добавьте 0,25 мкл М-КСФ из исходной концентрации 100 мкг/мл. - Тщательно перемешайте путем пипетки для гомогенизации клеточной суспензии и пластины 100 мкл / лунка в плоскодонной 96-луночной пластине до конечной плотности ячеек 1 x 105 ячеек / лунка.
- Добавьте 200 мкл / лунку стерильной дистиллированной воды в лунки вокруг покрытых клеток, чтобы предотвратить испарение среды и краевые эффекты в системе культивирования.
- Инкубируйте клетки в течение ночи в течение примерно 18-20 часов при 37 ° C с 5% CO2.
- После ночной инкубации осторожно удалите половину среды (50 мкл / лунка) путем аспирации с помощью пипетки P200, избегая прикосновения ко дну лунки, и замените свежим теплым полным α-MEM, содержащим 10% FBS, 25 нг / мл M-CSF и 50 нг / мл RANKL для конечной концентрации 25 нг / мл
ПРИМЕЧАНИЕ: Для 1 мл среды добавьте 0,25 мкл М-КСФ и 0,5 мкл RANKL из исходной концентрации 100 мкг/мл. - Меняйте среду каждые 3 дня и дифференцируйте клетки в ОК в течение 7-14 дней (рис. 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте концентрацию M-CSF и RANKL на протяжении всей культуры.
Рисунок 1: Рабочий процесс дифференциации OC. Схематический обзор выделения моноцитов CD14+ из PBMC и дифференцировки в зрелые ОК в присутствии M-CSF и RANKL в течение 7-14 дней. RT = комнатная температура. Изображение создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
5. Окрашивание TRAP для остеокластов
- Тщательно удаляют среду, фиксируют дифференцированные адгезивные ОК 100 мкл/лунку заранее приготовленного фиксирующего раствора и инкубируют в течение 1 мин. Не прикасайтесь ко дну лунок, чтобы не поцарапать прилипшие ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксирующий раствор готовят следующим образом: 12,5 мл раствора цитрата (входит в набор для окрашивания TRAP), 32,5 мл ацетона и 5 мл 37% формальдегида. - Трижды промойте лунки 300 мкл стерильной дистиллированной воды. Высушите тарелки после мытья.
- Приготовьте окрашивающий раствор согласно инструкции производителя (Таблица материалов); добавьте 5 мкл быстрого граната и 5 мкл нитрита натрия, чтобы получить раствор быстрого граната; смешать инверсионным способом и инкубировать в течение 3 мин при ЛТ. Приготовьте 1 мл окрашивающего раствора, смешав 900 мкл стерильной дистиллированной воды, 10 мкл нафтола, 40 мкл раствора ацетата, 50 мкл раствора тартрата и 10 мкл раствора быстрого граната.
- Добавьте 100 мкл свежеприготовленного раствора для окрашивания и выдержите пластину при 37 °C в темноте в течение 20 мин.
- После инкубации удалите окрашивающий раствор путем инверсии и трижды промойте тарелку 300 мкл / лунку дистиллированной воды.
- Удалите лишнюю воду, постукивая тарелками по бумажным полотенцам. Оставьте тарелки открытыми и защищенными от света, чтобы они высохли на воздухе на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сухие пластины можно хранить до 6 месяцев. Иногда остаточные буферы могут способствовать развитию плесени, которая видна под микроскопом; Это можно удалить в любое время, промыв пораженные лунки дистиллированной водой и снова дав им высохнуть на воздухе. - Делайте снимки в 10 или 20 раз с помощью светлопольного микроскопа с опцией плитки, чтобы захватить всю поверхность лунки.
- Вручную подсчитайте OC, идентифицированные как окрашенные в фиолетовый цвет клетки TRAP + с более чем тремя ядрами, с помощью программного обеспечения для анализа изображений с плагином счетчика клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество TRAP+ OC на скважину зависит от донора и может варьироваться от ~ 200 до 1,600 OC / скважина, в среднем около 1,000 OC / скважина. Кроме того, для анализа данных необходимо определить количество ОК в трех разных скважинах (технических репликаторах), а среднее значение должно быть рассчитано для каждого состояния и для каждой биологической реплики.
6. Анализ резорбции кости
- Планшетируйте свежеобогащенные моноциты CD14+ на 96-луночных остео-тестовых планшетах, покрытых фосфатом кальция, в концентрации 1 x 105 клеток/лунку и дифференцируйте ОК в течение 7-14 дней, как указано на этапах 4.1-4.8, и меняйте среду каждые 3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы костной ткани дентина/слоновой кости или коры крупного рогатого скота можно использовать вместо пластин для остеоанализа. Если это так, то общее время культуры должно быть продлено до 14-21 дня из-за более сложного субстрата, подлежащего резорбации. - В конце времени осторожно удалите среду, избегая прикосновения к дну колодца, и лизируйте клетки 10% раствором гипохлорита натрия. Трижды промойте лунки дистиллированной водой.
- Отсканируйте сухие пластины с помощью светлопольного микроскопа и проанализируйте/количественно оцените полученные изображения рассасывающих ямок с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
7. Флуоресцентное окрашивание актинового кольца
- Планшет 100 мкл/лунка изолированных моноцитов CD14+ в 18-луночном предметном стекле камеры при плотности клеток 1 x 10,5 клеток/лунка. Дифференцируйте ОК в присутствии M-CSF и RANKL, как описано ранее (этапы 4.1-4.8), включая смену среды каждые 3 дня.
- В конце времени аккуратно удалите среду и дважды промойте каждую скважину 200 мкл / лунку предварительно подогретого PBS, pH 7,4. Не позволяйте лункам высохнуть между шагами.
- Зафиксируйте образец 100 мкл / лунку 4% раствора формальдегида в PBS и инкубируйте в течение 10 мин при RT на орбитальном шейкере с легким встряхиванием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Метанол может нарушить актин в процессе фиксации. Поэтому лучше избегать любых метанолосодержащих фиксаторов. Предпочтительным фиксатором является формальдегид, не содержащий метанола. Орбитальный шейкер, используемый на этом этапе протокола, был установлен на настройку мощности 3 из 10. - Дважды промыть 200 мкл / лунку PBS, проникнуть в клетки 100 мкл / лунку 0,1% раствора Triton X-100, разведенного в PBS, и инкубировать в течение 10 мин при RT на орбитальном шейкере с легким встряхиванием.
- Дважды промойте PBS с 200 мкл на лунку. Чтобы блокировать неспецифическое связывание и увеличивать сигнал, добавьте 100 мкл / лунку блокирующего раствора, приготовленного из 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) / раствора PBS. Инкубация в течение 20 мин при RT на орбитальном шейкере с легким встряхиванием.
- Удалите блокирующий раствор и добавьте 100 мкл / лунку флуоресцентно конъюгированного раствора фаллоидина, разведенного в 2% растворе BSA / PBS. Инкубировать в течение 20 мин при РТ на орбитальном шейкере с легким встряхиванием и в защищенном от света месте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте концентрацию красителя фаллоидина в соответствии с рекомендациями производителя. - Дважды промыть 200 мкл / лунку PBS, окрасить ядра 100 мкл / лунку раствора PBS, содержащего 300 нМ DAPI, и выдержать в течение 10-15 мин при RT на орбитальном шейкере с легким встряхиванием и в защищенном от света месте.
ПРИМЕЧАНИЕ: DAPI разводят в дистиллированной воде для получения исходного раствора DAPI 14,3 мМ (5 мг / мл). Исходный раствор дополнительно разбавляют до конечной концентрации 300 мкМ. Наконец, раствор DAPI 300 мкМ еще раз разбавляют в PBS до конечной концентрации 300 нМ. - Через 10-15 минут удалите раствор DAPI и замените его 100 мкл / лунка PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от выбранных предметных стекол камеры либо храните с соответствующим объемом PBS (100 мкл / лунка для 18-луночных горных супружеских стекол), либо устанавливайте затвор с помощью покровных стекол и соответствующей монтажной среды. Горки камеры можно хранить до 1 недели в холодильнике. Для предметных стекол с 18-луночной камерой используйте объем окрашивания 50-100 мкл и 200-300 мкл для промывки. Соответственно увеличьте масштаб для других размеров направляющих камеры. Чтобы избежать испарения, держите покровные стекла внутри закрытого контейнера во время инкубации. Использование орбитального шейкера рекомендуется, но не обязательно. - Визуализируйте окрашивание с помощью соответствующего иммунофлуоресцентного или конфокального микроскопа и увеличения от 4 до 40 раз.
8. Обогащение зрелых ОК и предшественников ОК с помощью проточной цитометрической сортировки
- Ресуспендируют свежеобогащенные моноциты CD14+ в дозе 1 x 106 клеток/мл и дифференцируют их в зрелые ОК в присутствии M-CSF и RANKL таким же образом, как описано выше (этапы 4.1-4.8).
ПРИМЕЧАНИЕ: При расширении с 96-луночного планшета до планшета большего размера следуйте таблице 1; эти объемы рассчитываются, начиная с 1 x 106 клеток/мл раствора, и обеспечивают оптимальную плотность для слияния клеток с клетками. - На 7-й день один раз промойте лунки теплым PBS и добавьте 50 мкл к 1 мл (объем, определяемый размером используемой пластины) аккутазы. Инкубируют клетки при 37 °C с 5%CO2 в течение 20 мин.
- После инкубации проверьте планшеты под световым микроскопом, чтобы увидеть, не отделились ли клетки. Далее отделите клетки, постукивая по пластинам со всех сторон и пипеткой вверх и вниз.
- Соберите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл. Промойте лунки теплым PBS (без Ca 2+, без Mg2+) и соедините их с клеточной суспензией. Повторите шаги 8.2-8.3 один или два раза, пока большинство ячеек не отсоединится.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аккутаза, рекомендуемый метод перед окрашиванием поверхности для проточного цитометрического анализа, не отделяет очень большие ОК. Скорость восстановления составляет ~ 50% -70%. - Центрифугируют клетки при 300 x g в течение 5 мин, ресуспендируют клеточную гранулу в 1 мл PBS и подсчитывают клетки путем исключения трипанового синего.
- Ресуспендируют клетки при 1 x 106 клетках / мл, удаляют 100 мкл, что соответствует 1 x 105 клеткам, и переносят эти клетки в новую полипропиленовую пробирку. Добавьте 200 мкл буфера для сортировки клеток и отложите его на лед в качестве неокрашенного контроля.
- Остальные клетки окрашивают живым/мертвым красителем, разбавленным в соотношении 1:750, в течение 10 мин при ЛТ и защищенным от света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Живое/мертвое окрашивание необходимо выполнять при отсутствии FBS, чтобы избежать сильного фонового окрашивания. - Дополните пробирку для сбора объемом 15 мл, содержащую суспензию живых/мертвых окрашенных клеток, теплым буфером для сортировки клеток (1x PBS, без Ca 2+, без Mg2+, 1% FBS и 5 мМ ЭДТА) и центрифугу при 300 x g в течение 5 минут, чтобы гранулировать клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая концентрация ЭДТА и низкая концентрация FBS рекомендуются в сортировочном буфере для предотвращения скопления клеток. - Извлеките объем, соответствующий 1 x 105 ячеек, и перенесите их в новую полипропиленовую пробирку для контроля изотипа OSCAR. Перенесите все оставшиеся клетки в другую полипропиленовую пробирку для окрашивания и сортировки клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полипропиленовые пробирки используются для сортировки, так как ячейки с меньшей вероятностью прилипают к этим пробиркам, чем к полистирольным пробиркам. - Вращайте пробирки при 400 x g в течение 5 мин, чтобы гранулировать клетки, и отбрасывайте избыток надосадочной жидкости путем инверсии.
- Ресуспендируют клеточную гранулу в растворе основной смеси антител, приготовленном в соответствии с таблицей 2. Окрасьте контрольную трубку изотипа OSCAR антителом CD14 и контролем изотипа OSCAR вместо антитела OSCAR.
- Инкубировать клетки при температуре 4 °C в защищенном от света месте в течение 30 мин.
- Через 30 мин промывают клетки, добавляя пять объемов буфера для сортировки клеток, и центрифугу при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C.
- Ресуспендируют клетки в 300-1000 мкл холодного буфера для сортировки клеток и получают клетки с помощью сортировочной машины для проточной цитометрии, оснащенной соплом 100 мкМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: OC являются очень липкими клетками, поэтому важно фильтровать их через стерильную мембрану 70 мкм перед сортировкой. - Gate OC и pre-OC как CD14−OSCAR+. Установите затвор OSCAR+ на основе изотипной контрольной трубки OSCAR.
- Соберите отсортированные клетки в полипропиленовые пробирки, содержащие полный α-MEM с добавлением 20% FBS при 8 °C.
- После сортировки гранулируйте ячейки центрифугированием при 300 x g в течение 5 минут при RT, подсчитайте ячейки и ресуспендируйте для последующего применения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно, чтобы получить ~ 1 x 105 отсортированных предварительных OC / OC, начните с ~ 10 x 106 ячеек, нанесенных на 0-й день. На низкую скорость восстановления влияет потеря клеток во время отслойки аккутазой, а также обработка для окрашивания и сортировки. Рекомендуется проводить всю процедуру с использованием стерильных буферов и реагентов, и работать в стерильных условиях.
9. Анализ АТФ на митохондриальную активность
- Инкубируют обогащенные моноциты CD14+ в присутствии M-CSF и RANKL в 96-луночном планшете таким же образом, как описано ранее (этапы 4.1-4.8). Табличка с четырьмя дополнительными условиями в трех экземплярах для использования в качестве элементов управления.
- Проведите анализ АТФ с помощью набора для анализа люминесценции АТФ в соответствии с руководством производителя. Вкратце, чтобы приготовить раствор АТФ, добавьте 10 мл буферного раствора субстрата к лиофилизированному субстрату и оставьте его для инкубации при РТ в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения внутриклеточной продукции АТФ можно использовать различные методы. Здесь мы использовали детектирование продукции АТФ путем люминесценции. - Во время инкубации готовят и добавляют контрольные элементы непосредственно в контрольные лунки следующим образом: 2-дезокси-D-глюкоза (2DG) при 10 мМ и 100 мМ, олигомицин при 1 мкМ и 100 мМ 2DG в комбинации с 1 мкМ олигомицином. Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C с 5%CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: 2DG блокирует гликолиз, в то время как олигомицин является ингибитором окислительного фосфорилирования. Объединение этих двух ингибиторов приводит к полной потере продукции АТФ посредством гликолиза и окислительного фосфорилирования, что означает, что они служат внутренним контролем для анализа АТФ. Для контроля 10 мМ и 100 мМ 2ДГ добавляют 0,5 мкл и 5 мкл исходного раствора 2М 2ДГ на 100 мкл посевной лунки соответственно. Для олигомицина 1 мкМ разбавьте исходный раствор 5 мМ 1:100 в среде и добавьте 2 мкл / лунку в специальные контрольные лунки. Для последнего контроля добавляют 5 мкл 2DG и 2 мкл разбавленного раствора олигомицина на лунку. - Добавьте 50 мкл раствора АТФ в каждую лунку, чтобы остановить реакцию, и инкубируйте при RT на шейкере при 700 об/мин в течение 5-10 мин в защищенном от света месте.
- Перенесите 100 мкл надосадочной жидкости на 96-луночную пластину с белым дном, предназначенную для анализа АТФ, и считайте пластину с помощью люминесцентного считывателя.
Representative Results
Генерация ОК из моноцитов CD14+
Этот метод был направлен на легкую дифференциацию большого количества ОК из CD14+ моноцитов периферической крови человека in vitro, как правило, за 1 неделю. Во-первых, моноциты CD14+ были обогащены PBMC и в течение ночи заправлены M-CSF для повышения регуляции RANK, как сообщалось ранее15. После прайминга моноцитов для определения оптимальной концентрации RANKL для дифференцировки и созревания ОК использовали концентрации RANKL 1 нг/мл, 25 нг/мл, 50 нг/мл и 100 нг/мл, а также 25 нг/мл м-КСФ. Добавление RANKL приводило к увеличению числа крупных TRAP-положительных многоядерных ОК дозозависимым образом, и это оценивалось с помощью окрашивания TRAP. Зрелые ОК определяются как TRAP-положительные клетки с несколькими ядрами (обычно более трех; Рисунок 2А, В и дополнительный рисунок 1). Кроме того, кинетику дифференцировки ОК из моноцитов исследовали с помощью окрашивания TRAP и световой микроскопии в течение 2-14-дневного периода культивирования. В этом случае дифференцировка ОК с использованием промежуточной концентрации 50 нг / мл RANKL была выбрана для оценки того, насколько быстро ОК дифференцируются в культуре. В этих условиях культивирования многоядерные ОК были видны с 5-го дня и далее, а оптимальная дифференцировка была достигнута на 7-й день (рис. 2C). Длительная инкубация культур более 10 дней на пластике привела к аномально гигантским слитым клеткам. В этом протоколе обычно используются 6-8 дни в качестве оптимальной конечной точки генерации ОК. OC могут быть количественно определены или использованы для последующих анализов.
Функциональная оценка дифференцированных ОК
Для определения функциональной активности генерируемых ОК мы исследовали их резорбтивную активность путем дифференциации ОК на минерализованной поверхности. Поскольку большие ОК образуются только после 7-дневного периода культивирования, и чтобы дать достаточно времени для резорбции минерального субстрата, культуры поддерживали до 10-го дня. Образование круглых отверстий, или резорбционных ям, наблюдалось только на минерализованных поверхностях лунок, содержащих клетки, обработанные как M-CSF, так и RANKL (рис. 3). Таким образом, процент растворенной минерализованной поверхности (рассасывающих ям) позволяет определить резорбтивную способность ОК. Кроме того, ОК, дифференцированные в соответствии с этим протоколом до 7-го дня, как на пластиковых, так и на стеклянных предметных стеклах, демонстрировали хорошо организованную структуру актинового кольца, которую можно было визуализировать с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания (дополнительный рисунок 2).
Влияние ингибитора на зрелую функцию ОК
Вышеупомянутые условия культивирования были использованы для определения функциональной способности ОК, генерируемых in vitro в присутствии известного ингибитора ОК, ротенона34. ОК дифференцировали в течение 6-8 дней, а ОК CD14−OSCAR+ и предшественники ОК обогащали с помощью проточной цитометрии (рис. 4). Затем обогащенные клетки наносили в концентрации 50 000 клеток на лунку на 96-луночную пластину с минеральным покрытием в проостеокластогенной среде (25 нг/мл m-CSF и RANKL) в течение 3 дней. Обработка ротеноном (рис. 5А, Б) дозозависимо ингибировала резорбцию минерализованной поверхности по сравнению с необработанной контрольной скважиной, что согласуется с предыдущими исследованиями34. Кроме того, функциональность ОК оценивалась с помощью производства АТФ и формирования актинового кольца. Ротенон-зависимое ингибирование резорбции ОК ассоциировалось с ингибированием продукции АТФ (рис. 5С). Резорбирующие ОК представляют собой высокополяризованные клетки, которые регулируют свою резорбтивную способность, способствуя цитоскелетной организации. Конъюгированный фаллоидин Alexa fluor 647 использовали для маркировки цитоскелета F-актина зрелых ОК, культивируемых в присутствии или отсутствии ротенона. Ротенон вызвал фрагментацию актинового кольца, полученного из RANKL, зрелых ОК (рис. 5D).
Рисунок 2: ОК эффективно дифференцируются от предшественников моноцитов CD14+ . Моноциты CD14+ были магнитно обогащены, покрыты в 1 x 105 клеток / лунка в 96-луночных планшетах и инкубированы в течение ночи с 25 нг / мл м-CSF. (A) Моноциты, праймированные M-CSF, стимулировали повышением концентрации RANKL (1 нг/мл, 25 нг/мл, 50 нг/мл и 100 нг/мл), фиксировали и окрашивали для TRAP на 7-й день. Были получены изображения и подсчитаны многоядерные клетки TRAP+ (MNC). Репрезентативные изображения окрашивания TRAP показаны на дополнительном рисунке 1. Столбцы погрешности показывают среднее значение ± SD (n = 3). Данные были проанализированы с помощью одностороннего теста ANOVA и множественных сравнений Холма-Сидака для парных данных; * P ≤ 0,05 и ** P ≤ 0,005. (B) Репрезентативное изображение окрашенной TRAP лунки на 96-луночной пластине, показывающее типичное количество OC / ожидаемого колодца и их морфологию ниже 25 нг / мл RANK-L по сравнению с макрофагами, полученными из M-CSF, на 7-й день. Масштабные линейки: 1000 мкм. (C) Репрезентативные изображения образования OC при RANKL 50 нг/мл, оцениваемые с помощью окрашивания TRAP со 2-го по 14-й день. ОК видны с 5-го дня. Гигантские аномально сросшиеся OC присутствуют через 10 дней. Масштабные линейки: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Резорбтивные ОК, дифференцированные от моноцитов CD14+ . Клетки CD14+ , выделенные из PBMC, дифференцировали в течение 10 дней в ОК в присутствии 25 нг/мл м-КСФ (М) и RANKL (R) на планшетах с поверхностью минерального анализа (остео-анализ). (A) Изображения репрезентативных реконструированных скважин, сделанные с 10-кратным увеличением для анализа резорбции на 10-й день (минеральный субстрат серого цвета; резорбционные ямы белого цвета). Масштабные линейки: 1000 мкм. (B) Количественная оценка процентной доли резорбированной площади. Данные о резорбции были проанализированы с помощью парного анализа Уилкоксона. Столбцы погрешности показывают среднее значение ± SD (n = 7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Обогащение проточной цитометрией ОК CD14−OSCAR+. Моноциты CD14+ были обогащены из PBMC, а OC были дифференцированы, как описано ранее. Адгезивные культуры ОК отделяли аккутазой и окрашивали для проточной цитометрии. (А-С) ОК на 8-й день были отсортированы на основе экспрессии CD14 и OSCAR. (А) Репрезентативная стратегия сортировки ворот. Клетки были закрыты как синглеты, отрицательные для мертвого окрашивания, и были отсортированы подмножества CD14+ OSCAR+ (красный) и CD14- OSCAR+ (синий). (B) Репрезентативные графики, показывающие перекрывающееся окрашивание OSCAR ОК, полученных из RANKL (голубой), и контрольных макрофагов, полученных из M-CSF (оранжевый). Красным цветом выделен окрашенный изотипом OSCAR контроль ОК, полученных из RANKL. (C) Отсортированные популяции наносили на пластик и давали прилипать в течение 2 ч в среде pro-OC (25 нг/мл m-CSF и 50 нг/мл RANKL) с последующим окрашиванием и визуализацией TRAP. Репрезентативные изображения показывают отсутствие клеток TRAP+ в подмножестве CD14+ (красный) и моно- и многоядерных TRAP+ pre-OC и OC в подмножестве CD14- (синий). Масштабные линейки: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Анализы для оценки функции зрелых ОК. Для оценки функции зрелых ОК клетки CD14+, выделенные из PBMC, культивировали либо с M-CSF (M) отдельно, либо в сочетании с RANKL (R) в течение 7 дней, OC обогащали с помощью проточной цитометрии, а затем OC обрабатывали ингибитором ротеноном в течение 24 часов. (A) Зрелые OC сортировали с помощью проточной цитометрии (CD14-OSCAR+) и культивировали на поверхности минерального анализа в присутствии или отсутствии ротенона в течение 3 дней, после чего клетки отбеливали и визуализировали в 10 раз, чтобы выявить резорбированную область (ямки резорбции белого цвета). (А) Репрезентативные реконструированные изображения колодцев. Масштабные линейки: 1000 мкм. (B) Количественная оценка процентной доли резорбированной площади. Данные в (B) были проанализированы с помощью одностороннего ANOVA с тестом множественных сравнений Данна (n = 7); * P ≤ 0,05 и** P ≤ 0,01. Столбцы погрешности показывают среднее ±значение SD. (C) Общее внутриклеточное содержание АТФ недифференцированных и дифференцированных на 7-й день зрелых ОК, дифференцированных с помощью RANKL и обработанных либо носителем, либо ротеноном (10 нМ и 30 нМ). Здесь 2DG и олигомицин использовались в качестве положительного контроля для анализа и добавлялись за 30 минут до лизиса клеток и количественного определения АТФ. Полосы погрешности показывают среднее значение ± SD (n = 4). Данные были проанализированы с помощью одностороннего ANOVA и множественного сравнительного теста Даннетта для парных данных. ** P ≤ 0,01. (D) Репрезентативное 20-кратное изображение зрелых ОК, окрашенных для образования актинового кольца (красный) и ядер (синий), показывающее потерю актинового кольца с ингибитором. Масштабные линейки: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Формат пластины | 96 скважинная плита | 48 скважин | 24 скважины | 12 колодезная плита | 6 колодезная плита |
| том | 100 мкл | 225–250 мкл | 450–500 мкл | 0,8–1 мл | 1,8–2 мл |
Таблица 1: Объем суспензии ячеек для различных форматов пластин. Объемы рассчитываются исходя из раствора 1 x 106 клеток/мл и обеспечивают оптимальную плотность для слияния клеток с клетками.
| Флуорофор, клон | Объем (мкл) на 106 клеток | |
| КД14 | ПЭ/цианин7, HCD14 | 5 мкл |
| ОСКАР | ФИТК, РЭА494 | 10 мкл |
| Буфер сортировки ячеек | 80 мкл |
Таблица 2: Раствор для основной смеси антител.
Дополнительный рисунок 1: Окрашивание TRAP реакции на дозу RINKL. Моноциты CD14+ обогащали магнитным способом, наносили на 1 x 105 клеток/лунку в 96-луночных планшетах и инкубировали в течение ночи с 25 нг/мл м-КСФ, как показано на рисунке 2. Репрезентативные изображения окрашивания TRAP показывают, что моноциты, праймированные MCSF, стимулировались повышением концентрации RANKL (1 нг / мл, 25 нг / мл, 50 нг / мл и 100 нг / мл), фиксировались и окрашивались для TRAP на 7-й день. Масштабные линейки: 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Окрашивание действующих колец в полностью дифференцированных ОК. (A) 10-кратное увеличение OC, дифференцированных на пластике TC и окрашенных фаллоидином AF647 (красным цветом). Масштабная линейка: 400 мкм. (B) 40-кратное увеличение OC, дифференцированное на предметных стеклах камеры и окрашенное фаллоидином AF488 (желтый цвет). Масштабная линейка: 100 мкм. Ядра окрашены DAPI, показанным синим цветом в (A) и голубым цветом в (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Влияние различных партий FBS на эффективность дифференциации OC. ОК дифференцировали из моноцитов CD14+ в присутствии 25 нг/мл м-КСФ и 50 нг/мл РАНКЛ (МР) в течение 7 дней. Контрольные скважины имели только М-КСФ (М). (A) репрезентативное 10-кратное увеличение (масштабные линейки: 400 мкм) и (B) количественное определение ОК, окрашенных TRAP, дифференцированных от одного донора в двух разных партиях FBS. Полосы погрешностей показывают среднее значение ± SD трех технических реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Легкое культивирование и выделение большого количества функциональных ОК in vitro важны для углубления понимания биологии костей и ОК-опосредованных заболеваний. Классически ОК генерировались в кокультурах с остеобластами или стромальными клетками и кроветворными клетками селезенки или костного мозга38,39. Значительным прорывом в понимании остеокластогенеза стало выделение RANKL как основного регулятора образования, дифференцировки и выживаемости ОК40. Ранние протоколы RANKL-зависимых культуральных систем использовали PBMC для генерацииOC 21,41,42. Тем не менее, эти смешанные культуры являются длительными и представляют множество смешанных факторов, которые ограничивают способность проверять прямое влияние на дифференцировку и функцию ОК. Этот протокол описывает эффективную и надежную модель остеокластогенеза in vitro из периферических моноцитов CD14+ человека, в которой оптимальный остеокластогенез может быть получен в течение 7 дней (рис. 1 и рис. 2), что значительно быстрее по сравнению с некоторыми другими протоколами43,44,45,46. Основными отличительными особенностями этого протокола являются: (1) использование очищенных CD14+ моноцитов, (2) праймирование моноцитов М-КСФ перед воздействием RANKL, (3) продолжительность посева (<7 дней) и (4) достоверное обнаружение ингибирования образования ОК (окрашивание TRAP) и функции (резорбция, продукция АТФ, реорганизация актинового кольца) ингибиторами.
В ходе оптимизации методики было выявлено несколько критических моментов. Было замечено, что дифференцировка ОК in vitro в значительной степени зависит от плотности посева моноцитов CD14+. Таким образом, в этом протоколе клетки засеваются с высокой плотностью (1 x 105 ячеек / лунка 96-луночной пластины, в 100 мкл среды), так как важно, чтобы клетки могли взаимодействовать друг с другом и находиться в непосредственной близости к слиянию и превращению в зрелые OC. Точно так же посев клеток при слишком высокой плотности ограничивает их дифференцировку и рост из-за ограничений среды и нехватки необходимого пространства. Кроме того, для достижения максимального успеха с этим протоколом важно тщательно выполнять разделение градиента плотности и следить за тем, чтобы обогащенная популяция клеток CD14+ была как можно более чистой. Например, неадекватные стадии промывки приводят к отсутствию удаления тромбоцитов, что, следовательно, ингибирует дифференцировку ОК47,48. Аналогичным образом, наличие незначительного загрязнения Т-клетками в изолированных препаратах CD14+, стимулированных только M-CSF, может привести к дифференцировке OC, потенциально через секрецию RANKL Т-клетками49. Поэтому важно включать элемент управления M-CSF для каждого эксперимента. Также рекомендуется регулярная проверка чистоты, особенно при использовании нового комплекта для изоляции, чтобы убедиться в чистоте образца.
Оптимальные числа ОК (диапазон: ~200-1,600 ОКс/лунка) достигаются с использованием среды α-MEM, обогащенной нуклеозидами и L-глютамином. Другие традиционные питательные среды, в том числе модифицированная среда орла Дульбекко (DMEM) и среда Мемориального института Розуэлл-Парка (RPMI) 1640, влияют на выход OC. Источник FBS также может влиять на остеокластогенез. Различные партии FBS могут привести к снижению остеокластогенеза, полученного из RANK-L, а также к появлению небольшого количества многоядерных клеток TRAP + в контрольной группе M-CSF (дополнительный рисунок 3). Поэтому для достижения стабильных результатов рекомендуется тестировать новые партии FBS перед использованием и продолжать использовать одну и ту же партию на протяжении всех экспериментов, чтобы свести к минимуму изменения в процессе дифференциации. Кроме того, вариабельность от донора к донору с точки зрения общего количества дифференцированных ОК, полученных в конечный момент времени, представляет собой ограничение при использовании этого протокола для сравнения, например, здоровых доноров с пациентами. В этих случаях обязательно нужно использовать точно такие же условия и одинаковую партию среды, ФБС и других реагентов.
Другим необходимым этапом для оптимальной дифференцировки и созревания ОК является праймирование моноцитов М-КСФ перед добавлением RANKL. Воздействие на клетки M-CSF за 18-24 ч до RANKL подготавливает моноциты к усилению экспрессии RANK15,26. Добавление RANKL в этот момент времени обеспечивает оптимальную дифференцировку ОК дозозависимым образом. Степень дифференциации ОК варьируется от донора к донору; однако 25 нг/мл RANKL обычно достаточно для дифференциации большого числа ОК у большинства доноров. Кроме того, 25 нг/мл RANKL можно использовать в анализах для первоначального скрининга соединений, поскольку он облегчает оценку как усиливающего, так и ингибирующего эффектов тестируемых соединений. В других культуральных системах использовалось более длительное время предварительной инкубации M-CSF до добавления RANKL, но это приводит к более длительному времени культивирования остеокластогенеза50. Кроме того, оставление праймированных моноцитов для инкубации на ночь позволяет им прикрепляться к пластине, хотя и не в полностью адгезивном состоянии. Поэтому, когда RANKL вводится впервые, среда должна быть наполовину изменена очень осторожно, а не полностью изменена, чтобы предотвратить отслоение и потерю праймированных моноцитов. Среду также необходимо обновлять каждые 3-4 дня, чтобы избежать истощения среды и предотвратить гибель клеток. Кроме того, из-за небольшого объема, используемого в этом анализе (100 мкл / лунка в 96-луночном планшете), крайне важно иметь рамку из пустых лунок, заполненных водным раствором (т.е. стерильным дистиллированным H2O или PBS) вокруг пробирных скважин. Это предотвращает испарение среды и краевые эффекты.
Наконец, для метаболических анализов (например, анализов АТФ) крайне важно, чтобы клетки были жизнеспособными, чтобы избежать огромного стандартного отклонения между репликами (рис. 5). Высокая жизнеспособность клеток также важна для сортировки клеток и для дальнейшего культивирования отсортированных ОК (рис. 4). Этот метод, однако, имеет несколько ограничений. Полностью зрелые ОК очень прилипают и их трудно отделить от пластин. Более крупные OC часто невозможно отделить, что может привести к снижению выхода клеток. Поэтому клетки нужно подсчитывать после сортировки и перед нанесением покрытия в необходимой концентрации. Кроме того, в настоящем протоколе неферментативный способ (аккутаза) для отделения ОК используется для предотвращения изменений мембраны при окрашивании поверхности ниже по течению для проточной цитометрии. Использование клеточных скребков (как с мягкими, так и с твердыми окончаниями) также было протестировано и привело к высокой гибели клеток. Ферментативная отслойка с использованием 0,05% растворов трипсина/ЭДТА может быть использована для более высокого выхода отделенных ОК, когда целостность мембраны не требуется для последующих применений. Кроме того, для предотвращения слипания ОК настоятельно рекомендуется использовать высокую концентрацию ЭДТА во всех буферах после отслоения клеток, а также соответствующую фильтрацию перед получением проточной цитометрии. Важно отметить, что культуры ОК представляют собой гетерогенную популяцию клеток, состоящую из зрелых ОК, предшественников ОК и макрофагов. Макрофаги можно легко отличить от ОК, хотя как мононуклеарные пре-ОК, так и многоядерные ОК экспрессируют ОСКАР и не могут быть дифференцированы с помощью настоящего метода (рис. 4). Действительно, этот последний вопрос представляет собой основное ограничение этого метода. Кроме того, низкая экспрессия OSCAR также присутствует в культурах M-CSF (рис. 4B) и может указывать на макрофаги, которые подготовлены к приверженности линии OC. Важно установить затвор для ячеек OSCAR+ на основе сигнала окрашивания FMO, как показано на рисунке 4B.
Таким образом, этот протокол описывает оптимизированный и надежный метод эффективного производства активных и функционально зрелых ОК из циркулирующих первичных моноцитов человека. Сильной стороной этого протокола является его способность генерировать OC за короткий промежуток времени и давать большое количество дифференцированных OC. Этот метод открывает путь к исследованию основных механизмов, лежащих в основе дифференциации и функционирования ОК.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Flow Core Facility и Glasgow Imaging Facility (GIF) в Школе инфекций и иммунитета за их поддержку и помощь в этой работе.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 18 well chamber slides | ibidi | 81816 | |
| 8-well glass chamber slides | Ibidi | 80807 | |
| 96-well TC plate | Corning | 3596 | |
| 96-well osteo assay stripwell plate | Corning | 3989 | |
| Acetate solution | Sigma Aldrich | 386-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Acetone | VWR | 20066.330 | |
| Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit | SIGMA-ALDRICH | 387A-1KT | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Theremo Fisher - Invitrogen | A12379 | AF488 |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher - Invitrogen | A22287 | AF647 |
| Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose | Fisher Scientific | 11321867 | 2DG, 98% |
| Alpha minimum essential medium | gibco | 22571-020 | |
| ATPlite 1step | PerkinElmer | 6016731 | Luminiscence ATP detection assay system |
| BD FACSAria III cell sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom | Greiner bio-one | 655083 | White-bottom plates |
| Citrate solution | Sigma Aldrich | 91-5 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
| Corning osteo assay surface multiple well plate | Sigma-Aldrich | CLS3989 | |
| Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell | Corning | CLS3989-2EA | |
| DAPI | Theremo Fisher | D3571 | |
| EasySep human CD14 positive selection kit | STEMCELL Technologies | 17858 | |
| EasySep red blood cell lysis buffer (10x) | StemCell Technologies | 20110 | |
| eBioscience fixable viability dye eFluor 780 | Theremo Fisher - Invitrogen | 65-0865-14 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E7889-100ML | |
| EVOS FL auto imaging system | Thermo Fisher | A32678 | |
| Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap | Fisher Scientific | 10314791 | |
| Falcon tubes 15 mL | Corning | 430790 | |
| Falcon tubes 50 mL | Corning | 430828 | |
| Fast Garnet GBC base solution | Sigma Aldrich | 387-2 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Fetal bovine serum | gibco | 10500-064 | FBS |
| Ficoll-Paque Plus | cytiva | 17144003 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F-8775 | |
| Human sRANK ligand | PEPROTECH | 310-01-100UG | Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) |
| ImageJ Image analysis software | Image J | version 2.9.0 | |
| L-glutamine | gibco | 25030-024 | |
| Lithium heparin tubes (9 mL) | VACUETTE | 455084 | |
| Macrophage colony-stimulating factor | PEPROTECH | 300-25-100UG | M-CSF |
| Napthol AS-BI phosphoric acid solution | Sigma Aldrich | 387-1 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Neubauer hemacytometer counting chamber | Camlab | SKU 1127885 | |
| Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes | Sigma-Aldrich | Q4876-5MG | |
| OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit | Miltenyi Biotec | 130-107-661 and 130-107-617 | Clone REA494 |
| PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody | Biolegend | 325618 | Clone HCD14 |
| Penicilin/streptomycin | SIGMA | P0781 | |
| PHERAstar machine and software | BMG LABTECH | ||
| Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x) | gibco | 14190-094 | |
| REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-443 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044-1L | |
| Sodium nitrite solution | Sigma Aldrich | 91-4 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Tartrate solution | Sigma Aldrich | 387-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L.
- Boyce, B. F., Xing, L. Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling and remodeling. Archives Of Biochemistry and Biophysics. 473 (2), 139-146 (2008).
- Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
- Agemura, T., Hasegawa, T., Yari, S., Kikuta, J., Ishii, M. Arthritis-associated osteoclastogenic macrophages (AtoMs) participate in pathological bone erosion in rheumatoid arthritis. Immunological Medicine. 45 (1), 22-26 (2022).
- Hasegawa, T., et al. Identification of a novel arthritis-associated osteoclast precursor macrophage regulated by FoxM1. Nature Immunology. 20 (12), 1631-1643 (2019).
- Walsh, N. C., Crotti, T. N., Goldring, S. R., Gravallese, E. M. Rheumatic diseases: The effects of inflammation on bone. Immunological Reviews. 208 (1), 228-251 (2005).
- Gravallese, E. M., et al. Identification of cell types responsible for bone resorption in rheumatoid arthritis and juvenile rheumatoid arthritis. The American Journal of Pathology. 152 (4), 943-951 (1998).
- Bromley, M., Woolley, D. E. Chondroclasts and osteoclasts at subchondral sites of erosion in the rheumatoid joint. Arthritis & Rheumatism. 27 (9), 968-975 (1984).
- Kleyer, A., Schett, G. Arthritis and bone loss: A hen and egg story. Current Opinion in Rheumatology. 26 (1), 80-84 (2014).
- Kawai, V. K., Stein, C. M., Perrien, D. S., Griffin, M. R. Effects of anti-tumor necrosis factor α (anti-TNF) agents on bone. Current Opinion in Rheumatology. 24 (5), 576-585 (2012).
- Siebert, S., Tsoukas, A., Robertson, J., McInnes, I. Cytokines as therapeutic targets in rheumatoid arthritis and other inflammatory diseases. Pharmacological Reviews. 67 (2), 280-309 (2015).
- Smiljanovic, B., et al. Monocyte alterations in rheumatoid arthritis are dominated by preterm release from bone marrow and prominent triggering in the joint. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (2), 300-308 (2018).
- Anderson, J. R., et al. 1H NMR metabolomics identifies underlying inflammatory pathology in osteoarthritis and rheumatoid arthritis synovial joints. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3780-3790 (2018).
- McGarry, T., et al. Rheumatoid arthritis CD14+ monocytes display metabolic and inflammatory dysfunction, a phenotype that precedes clinical manifestation of disease. Clinical & Translational Immunology. 10 (1), 1237 (2021).
- Ansalone, C., et al. TNF is a homoeostatic regulator of distinct epigenetically primed human osteoclast precursors. Annals of the Rheumatic Diseases. 80 (6), 748-757 (2021).
- Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
- Allard-Chamard, H., et al. Osteoclasts and their circulating precursors in rheumatoid arthritis: Relationships with disease activity and bone erosions. Bone Reports. 12, 100282 (2020).
- Takegahara, N., et al. Involvement of receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced incomplete cytokinesis in the polyploidization of osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (7), 3439-3454 (2016).
- Jansen, I. D. C., Vermeer, J. A. F., Bloemen, V., Stap, J., Everts, V.
- McDonald, M. M., et al. Osteoclasts recycle via osteomorphs during RANKL-stimulated bone resorption. Cell. 184 (5), 1330-1347 (2021).
- Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: Elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (5), 401-419 (2012).
- Zhao, B., Grimes, S. N., Li, S., Hu, X., Ivashkiv, L. B. TNF-induced osteoclastogenesis and inflammatory bone resorption are inhibited by transcription factor RBP-J. The Journal of Experimental Medicine. 209 (2), 319-334 (2012).
- Zhao, B. Does TNF promote or restrain osteoclastogenesis and inflammatory bone resorption. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 253-261 (2018).
- Crotti, T. N., et al. Receptor activator NF-κB ligand (RANKL) expression in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis, spondyloarthropathy, osteoarthritis, and from normal patients: semiquantitative and quantitative analysis. Annals of the Rheumatic Diseases. 61 (12), 1047-1054 (2002).
- Kim, H. R., et al. Reciprocal activation of CD4+ T cells and synovial fibroblasts by stromal cell-derived factor 1 promotes RANKL expression and osteoclastogenesis in rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatology. 66 (3), 538-548 (2014).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor κB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
- Hayman, A. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).
- Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in osteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 780 (2021).
- Boyce, B. F., Yoneda, T., Lowe, C., Soriano, P., Mundy, G. R. Requirement of pp60c-src expression for osteoclasts to form ruffled borders and resorb bone in mice. The Journal of Clinical Investigation. 90 (4), 1622-1627 (1992).
- Matsubara, T., et al. Regulation of osteoclast differentiation and actin ring formation by the cytolinker protein plectin. Biochemical and Biophysical Research Communications. 489 (4), 472-476 (2017).
- Roscher, A., et al. The F-actin modulator SWAP-70 controls podosome patterning in osteoclasts. Bone Reports. 5, 214-221 (2016).
- Jurdic, P., Saltel, F., Chabadel, A., Destaing, O. Podosome and sealing zone: Specificity of the osteoclast model. European Journal of Cell Biology. 85 (3-4), 195-202 (2006).
- Francis, M. J. O., et al. ATPase pumps in osteoclasts and osteoblasts. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (5), 459-476 (2002).
- Kwak, H. B., et al. Inhibition of osteoclast differentiation and bone resorption by rotenone, through down-regulation of RANKL-induced c-Fos and NFATc1 expression. Bone. 46 (3), 724-731 (2010).
- Massey, H. M., Flanagan, A. M. Human osteoclasts derive from CD14-positive monocytes. British Journal of Haematology. 106 (1), 167-170 (1999).
- Xue, J., et al. CD14+CD16-monocytes are the main precursors of osteoclasts in rheumatoid arthritis via expressing Tyro3TK. Arthritis Research and Therapy. 22 (1), 221 (2020).
- Marco-Casanova, P., et al. Preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis. Journal of Visualized Experiments. (169), e60776 (2021).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (1), 199-204 (1998).
- Shalhoub, V., et al. Osteoprotegerin and osteoprotegerin ligand effects on osteoclast formation from human peripheral blood mononuclear cell precursors. Journal of Cellular Biochemistry. 72 (2), 251-261 (1999).
- Neale, S. D., Smith, R., Wass, J. A. H., Athanasou, N. A. Osteoclast differentiation from circulating mononuclear precursors in Paget's disease is hypersensitive to 1,25-dihydroxyvitamin D3 and RANKL. Bone. 27 (3), 409-416 (2000).
- Abdallah, D., et al. An optimized method to generate human active osteoclasts from peripheral blood monocytes. Frontiers in Immunology. 9, 632 (2018).
- Komano, Y., Nanki, T., Hayashida, K., Taniguchi, K., Nobuyuki, M. Identification of a human peripheral blood monocyte subset that differentiates into osteoclasts. Arthritis Research and Therapy. 8 (5), 152 (2006).
- Kylmäoja, E., et al. Peripheral blood monocytes show increased osteoclast differentiation potential compared to bone marrow monocytes. Heliyon. 4 (9), 00780 (2018).
- Wang, D., et al. Platelet-rich plasma inhibits RANKL-induced osteoclast differentiation through activation of Wnt pathway during bone remodeling. International Journal of Molecular Medicine. 41 (2), 729-738 (2018).
- Cenni, E., Avnet, S., Fotia, C., Salerno, M., Baldini, N. Platelet-rich plasma impairs osteoclast generation from human precursors of peripheral blood. Journal of Orthopaedic Research. 28 (6), 792-797 (2010).
- D'Amico, L., Roato, I. Cross-talk between T cells and osteoclasts in bone resorption. BoneKEy Reports. 1 (6), 82 (2012).
- Quinn, J. M. W., Elliott, J., Gillespie, M. T., Martin, T. J. A combination of osteoclast differentiation factor and macrophage-colony stimulating factor is sufficient for both human and mouse osteoclast formation in vitro. Endocrinology. 139 (10), 4424-4427 (1998).
